CN101691579A - 海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用 - Google Patents
海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101691579A CN101691579A CN200910034973A CN200910034973A CN101691579A CN 101691579 A CN101691579 A CN 101691579A CN 200910034973 A CN200910034973 A CN 200910034973A CN 200910034973 A CN200910034973 A CN 200910034973A CN 101691579 A CN101691579 A CN 101691579A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- amylase
- low temperature
- temperature alpha
- alpha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
本发明属于生物工程领域，涉及将一种低温α-淀粉酶基因重组到表达载体上，并转化至表达宿主构成的工程菌、利用工程菌表达的重组酶及该酶在工业中的应用。本发明采用分子操作技术，通过细菌基因组的提取确规定、目的基因的扩增、表达载体的构建及重组载体转化受体细胞构建了一株工程菌EPGS230，工程菌经过培养，诱导、离心、超声破碎、离子交换和亲和层析等步骤获得纯化的重组低温α-淀粉酶。本发明所述制备工艺简单、酶活力高、作用温度低等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域。涉及一种低温α-淀粉酶基因的表达载体；本发明还涉及其基因工程菌株大肠埃希氏菌Escherichia coli EGPS230；本发明还涉及该菌株产重组低温α-淀粉酶的方法与产品。
背景技术
α-淀粉酶为α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan-4-glucanohydrolaseEC.3.2.1.1)，是最重要的工业酶制剂之一，已被广泛应用在食品、发酵、纺织、造纸和制药等诸多行业。低温淀粉酶一般来源于低温微生物，Feller等人在1992年筛选到一株产淀粉酶的南极嗜冷海豚毒素交替单胞菌Alteramonashaloplanctis A23，该菌在4℃生长良好，在18℃细胞繁殖和酶分泌将会受到影响。在0-30℃，该菌的淀粉酶活力比来自恒温的动物淀粉酶活力高7倍。通常情况下，在相对较低温度范围内，低温淀粉酶的活性比相应的嗜温淀粉酶要高。例如，嗜冷性海洋微生物中分离的淀粉酶在60℃时活性约为40℃时的50％。最适反应温度与嗜温淀粉酶相比要低20-30℃。当超过最适反应温度时，该酶极易失活。美国Genencor是开发用于工业应用的新酶的领先者，该公司宣称其Optisize(R)淀粉酶在低温下有高活性。
低温淀粉酶的特殊性质使其在工业生产应用中具有一定的优势，食品行业是低温淀粉酶的一个重要应用领域，很多风味物质为保持其风味不丢失，常常需要在低温条件下发酵。0-20℃温度范围内(此时同源的嗜温型酶不活泼)，低温微生物具有高生长速率、高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热等系统，因此在节能方面有相当大的优势。与此同时低温发酵还能够减少中温菌的污染的危险，尤其是在连续发酵操作中。
环境治理是低温酶又一个应用领域，在低温条件下来自低温微生物的淀粉酶催化速度较嗜温型淀粉酶更快，低温微生物及其产生的淀粉酶还可替代化学方法，这些特点可以使废水处理费用降到最低程度。另外在一些季节性变化幅度大的地区，温度变化很大，这就使微生物分解有机污染物如大分子碳水化合物和类脂的效率降低。将能够分泌低温淀粉酶等酶类的低温微生物接种到这种环境里去，则有助于提高对难处理化学物质的生物降解能力。这些微生物具有高催化活性酶及它们在较低温度下的特殊专一性，使得低温微生物及其产生的低温淀粉酶成为生物治理的理想工具。另外，由于低温淀粉酶在0-20℃的温度范围内具有高活性的特点，因此，其在饲料、纺织和洗涤工业的应用方面同样具有较大的潜力。
相信随着研究的持续深入以及生物工程技术的充分利用，低温淀粉酶工业应用前景将会更广阔。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种通过分子生物学技术将从海洋耐冷细菌中克隆的一种低温α-淀粉酶的基因联入表达载体，进行表达。
本发明是通过聚合酶链式反应(PCR)的方法获得了海洋耐冷细菌Pseudoalteromonas arctica GS230的α-淀粉酶基因，并通过分子生物学技术将上述低温α-淀粉酶基因与表达载体连接。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种基因工程菌株大肠埃希氏菌EPGS230(Escherichia coli EPGS230)，CGMCC No.2700。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备重组低温α-淀粉酶的方法，其包括用上述本发明表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的低温α-淀粉酶。
本发明涉及的低温α-淀粉酶基因来源于海洋细菌Pseudoalteromonasarctica GS230，其基因序列已在GenBank公开，登录号为EU849122，公众如果需要，淮海工学院海洋学院可以对外提供。
本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达重组表达载体即可，优选大肠杆菌，进一步优选大肠杆菌BL21(DE3)。
以上技术方案中所有基本分子生物操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)
本发明的低温α-淀粉酶不仅可以水解淀粉，对于由葡萄糖以α-1，4糖苷键聚合的多糖都有一定的催化能力。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种核苷酸序列的表达载体，其特点是，它是含有来源于海洋细菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低温α-淀粉酶基因序列的表达载体pEtac-His6-amy；它由下列方法制得：将海洋细菌Pseudoalteromonas arctiacGS230低温α-淀粉酶基因的核苷酸序列扩增，与质粒pMD18-T载体连接，得到克隆载体pMD18-T-amy，再将克隆载体pMD18-T-amy和表达载体pEtac-His6分别经EcoR I和Sal I双酶切后连接得到表达载体pEtac-His6-amy。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来实现。本发明还公开了一种用于表达海洋细菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低温α-淀粉酶的基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700。该基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coliEGPS230)CGMCC No.2700是将前述的表达载体pEtac-His6-amy转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达得到。该基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700，已于2008年10月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2700，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来实现。本发明还公开了一种用前述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coliEGPS230)CGMCC No.2700产重组低温α-淀粉酶的方法，其特点是，其步骤如下，
(1)将基因工程菌株以1％的接种量接入装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，在37℃，180rpm下摇床培养，当培养菌液的OD600达到1.0时，再加入浓度为1mmol·L-1诱导剂IPTG，20℃诱导16h，得发酵液；
(2)将发酵液13000×g离心5min后去掉上清，用3mL生理盐水悬浮细胞，13000×g离心5min去掉上清，重复此操作一次；用3mL蒸馏水充分悬浮细胞，0℃水浴中经超声波破碎5min，13000×g离心10min取上清液即得重组低温α-淀粉酶的粗酶液；
(3)将粗酶液用DEAE离子交换层析和Ni亲和层析的方法对重组酶进行纯化，即得纯化的重组低温α-淀粉酶。
取上述的重组低温α-淀粉酶，应用大肠杆菌工程菌MCA1表达的低温蛋白经活性实验鉴定，具有α-淀粉酶活性，证明该低温蛋白即为所述的重组低温α-淀粉酶。
以上所述方法得到的重组低温α-淀粉酶具有以下特征：该酶的分子量为51.5KD；适合作用温度30℃，在0℃下有34.5％的酶活力；Ca2+有助于提高该酶的热稳定性，酶液分别在20℃保温2.5h后，其残余酶活为73％；该酶的最适作用pH为7.5，金属离子Mn2+、K+、Na+对酶有激活作用，Hg2+、pb2+、Al3+、Cu2+、Fe3+和Zn2+能够抑制酶活性；1％的曲通对酶有激活作用，1mmol/L的N-溴代丁酰亚胺对酶有强烈抑制作用，SDS、EDTA、碘乙酸和三氯乙酸对酶有一定的抑制作用；该酶的Km为7.28mg/mL，Vmax为13.07mg·mL-1·min-1；该酶分解马铃薯淀粉为麦芽糖和麦芽二、三、四糖。
本发明所述的用基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coliEGPS230)CGMCC No.2700产重组低温α-淀粉酶的方法制备工艺简单，所得到的酶具有活力高、作用温度低等优点。
附图说明
图1为pMD18-T-amy的构建图。
图2为本发明热稳定低温酸性α-淀粉酶基因的PCR扩增图谱，其中，1：DNA Marker；2：α-淀粉酶基因的PCR扩增产物。
图3为重组表达载体pEt-28a-His6-amy的构建图。
图4为本发明表达质粒pEt-28a-His6-amy经EcoR I和Sal I双酶切分析图谱，其中，M：DNA Marker；1：EcoR I&Sal I；2：pEt-28a-His6-amy/EcoR I。
图5为本发明基因工程菌株表达产物重组热稳定低温酸性α-淀粉酶的SDS-PAGE电泳图，其中，1：为标准蛋白；2：粗酶液；3：DEAE离子交换层析；4：Ni亲和层析；5：活性带。
图6为温度对重组热稳定低温酸性α-淀粉酶酶活力的影响图。
图7为pH温度对重组热稳定低温酸性α-淀粉酶酶活力的影响图。
图8为重组热稳定低温酸性α-淀粉酶的温度稳定性图。
图9为重组热稳定低温酸性α-淀粉酶的pH稳定性图。
图10为重组α-淀粉酶水解可溶性淀粉的Lineweaver-Burk图。
图11为重组热稳定低温酸性α-淀粉酶水解马铃薯淀粉产物薄层层析图；其中，M：Marker；G1：葡萄糖；G2：麦芽糖；G3：麦芽三糖；G4：麦芽四糖；G5：麦芽五糖；G6：麦芽六糖；G7：麦芽七糖。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
下列实施例中的材料与方法为：
所采用的分子克隆技术参见J.莎亩布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
所使用的工具酶购自大连宝生物公司和上海生工生物工程公司，具体的反应条件和使用方法均参考商品说明书。
所使用的胶回收试剂盒购自大连宝生物公司，使用方法均参考商品说明书。
实施例1。克隆质粒pMD18-T-amy的构建。
设计低温α-淀粉酶基的引物正向引物1和反向引物2。在引物1加上EcoR I酶切位点，在引物2加上Sal I酶切位点。
引物1序列：5’-GCGCGAATTCATGAACAGGGGTATAT-3’，划线部分为EcoR I位点。
引物2序列：5’-TAGTCGACTCAGCCCACCCCACAG-3’划线部分为Sal I位点。
以Pseudoalteromonas arctica GS230的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物电泳，利用TaKaRa公司Gel Extraction Kit试剂盒割胶回收纯化。与pMD18-T载体连接，构建了克隆质粒pMD18-T-amy(见图1)，转化大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白菌落初步筛选阳性克隆，进一步将重组质粒用EcoR I和Sal I同时进行双酶切后电泳检测，在1.5kb左右处有一条特异性亮带(见图2)，证明所选重组子为阳性克隆，与已经获得的淀粉酶基因序列对比表明序列完全正确。
实施例2。表达载体pEtac-His6-amy的构建。
重组T-载体(pMD18-T-amy)和pEt-28a-His6分别进行EcoR I和Sal I双酶切，其酶切反应体系(20μL)如下：
10×buffer H 2μL
EcoR I(或Sal I)(10U·μL-1) 1μL
pEtac-His6(或PCR产物) 14μL
将pMD18-T-amy进行EcoR I和Sal I双酶切，胶回收1.5kb条带，对pEac质粒进行EcoR I和Sal I双酶切，胶回收5.6kb的条带；将前后两次胶回收产物混合，16℃连接18h(如图3)，构建了N端含有六个组氨酸标签的表达载体pEtac-His6-amy。外源基因在E.coli表达时，为了简化表达产物的纯化步骤，通常添加His、MBP等标签，使表达产物可以通过Ni-NTA层析柱纯化(Schlieben et al.，2004)。因此在构建表达载体时在N端添加了His6标签。重组质粒pEtac-His6-amy经EcoR I和Sal I双酶切，电泳验证发现在1.5kb左右处出现一条亮带，证明重组正确，见图4。
实施例3。一种用于表达实施例2所述的重组低温α-淀粉酶重组表达载体的基因工程菌株大肠埃希氏菌EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700，它是将实施例2所述的表达载体pEtac-His6-amy转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到的基因工程菌株大肠埃希氏菌EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700。
实施例4。一种用实施例3所述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700产重组低温α-淀粉酶的制备方法，其步骤如下：
(1)将基因工程菌株以1％的接种量接入装有50mL LB(蛋白胨，1％；酵母粉，0.5％；NaCl，1％；pH 7.0)培养基的250mL三角瓶中，在37℃，180rpm下摇床培养，当培养菌液的OD600达到1.0时，再加入浓度为1mmol·L-1诱导剂IPTG，20℃诱导16h，得发酵液；
(2)将发酵液13000×g离心5min后去掉上清，用3mL生理盐水悬浮细胞，13000×g离心5min去掉上清，重复此操作一次；用3mL蒸馏水充分悬浮细胞，0℃水浴中经超声波破碎5min，13000×g离心10min取上清液即得重组低温α-淀粉酶的粗酶液；
(3)将制取的粗酶液用DEAE离子交换层析和Ni亲和层析的方法对重组酶进行纯化，即得纯化的重组低温α-淀粉酶。见表1，在SDS-PAGE上α-淀粉酶的活性染色带与考马斯亮蓝染色带一致，其分子量为51.7KDa(见图5)。
表1粗酶液的纯化
实施例5。实施例4所制得的重组低温酸性α-淀粉酶的酶学性质研究。
(1)温度对酶活力的影响。
将酶分别在在0℃-50℃水浴中进行酶活测定。用pH 7.5的Tris-HCl溶液配置的1％(w·v-1)淀粉溶液作为作用底物。重组α-淀粉酶的最适作用温度30℃时，在0℃仍有34％的酶活力(见图6)。
(2)pH对酶活力的影响。
将酶液与在不同pH的1％(w·v-1)的可溶性淀粉溶液中在30℃下进行酶活力测定。采用两种方法配制不同pH的1％(w·v-1)的可溶性淀粉溶液，第一种方法为不同pH值的缓冲液为：50mmol·L-1柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～4.0)；50mmol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液分别调节pH5-9，最适作用pH为7.5(见图7)。
(3)温度对酶热稳定性的影响。
将酶分别在20、30和40℃的水浴中保温进行温度对酶稳定性的实验，每个温度保温2.5h，每隔1h取出一组样品，迅速置于冰水中，待保温结束后统一进行酶活力测定，以未处理酶液作为对照。酶液分别在20、30、40℃分别保温5h后，其残余活性分别为73％、28％和0％(见图8)。
(4)pH对酶稳定性的影响。
将20μL酶液与180μL浓度为0.04mol/L的各种不同pH(4.5-9)的通用缓冲液混合，分别在30℃的水浴中保温1h后，取10μL保温后的酶液测定残余酶活，对照组为20μL酶液与180μL蒸馏水混合物。，见图9。
(5)金属离子或化学试剂对酶活性的影响。
将各种金属离子与酶液混合，使其最终浓度分别达到1.0mmol·L-1和5.0mmol·L-1，然后在90℃下测酶活。将各种常用化学试剂与酶液混合，使其最终浓度分别为1mmol·L-1和5mmol·L-1测酶活，均以未处理的酶液的酶活设为100％。金属离子Mn2+、K+、Na+对酶有激活作用，Hg2+、Pb2+、Al3+、Cu2+、Fe3+和Zn2+等能够强烈的抑制酶活性。1％的曲通对酶有激活作用，1mmol/L的N-溴代丁酰亚胺对酶有强烈抑制作用，SDS、EDTA、碘乙酸和三氯乙酸对酶有一定的抑制作用，(见表2)。
表2金属离子和化学试剂对重组低温α-淀粉酶影响
(6)酶动力学研究。
以不同浓度(3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10、15.0mg/mL)的可溶性淀粉作为底物，对重组低温淀粉酶进行酶动力学研究，测定底物不同浓度时的酶活，反应体系为取190μL不同浓度的淀粉溶液加入淀粉酶10μL，于90℃下准确反应10min，取出后迅速加入200μLDNS沸水浴5min，加入3mL蒸馏水，在520nm下测定吸光值。以不同浓度的可溶性淀粉作为底物，对重组的纯化淀粉酶进行酶动力学测定，根据Lineweaver-Burk理论，由方程V-1＝Km·Vmax-1·S-1+Vmax-1求得该酶的7.28mg/mL，Vmax为13.07mg/mL·min(见图10)。
(7)重组热稳定低温酸性α-淀粉酶水解产物特异性研究。
以1％(w·v-1)的马铃薯淀粉作为底物，每毫升底物溶液中加入100μL稀释的酶液，置于20℃水浴中，分别反应1、4、8和16h，取不同反应时间的产物进行高效薄层层析，展剂使用正丁醇、乙酸和水的混合物，显色剂为5％浓硫酸和乙醇溶液，使用喷雾器将显色剂均匀喷撒到干燥后的薄层板上，置于105℃下显色20～30min。该重组超低温α-淀粉酶可以很好的水解马铃薯淀粉，在作用1h后既已将马铃薯淀粉糊精化，继续反应后形成含麦芽糖在内的一系列寡糖，随着水解时间的延长糊精逐渐减少，麦芽寡糖含量逐渐升高，连续作用16h后层析图中有少量葡萄糖生成(见图11)，表明该重组α-淀粉酶分解马铃薯淀粉，其主要产物是麦芽糖和麦芽二、三和四糖。
Claims (6)
1.一种核苷酸序列的表达载体，其特征在于，它是含有来源于海洋细菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低温α-淀粉酶基因序列的表达载体pEtac-His6-amy；它由下列方法制得：将海洋细菌Pseudoalteromonasarctiac GS230低温α-淀粉酶基因的核苷酸序列扩增，与质粒pMD18-T载体连接，得到克隆载体pMD18-T-amy，再将克隆载体pMD18-T-amy和表达载体pEtac-His6分别经EcoRI和SalI双酶切后连接得到表达载体pEtac-His6-amy。
2.一种用于表达海洋细菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低温α-淀粉酶的基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coliEGPS230)CGMCC No.2700，它是将权利要求1所述的表达载体pEtac-His6-amy转化到大肠杆菌中进行IPTG诱导表达得到。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700，其特征在于，所述的大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
4.一种用权利要求2或3所述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700产重组低温α-淀粉酶的方法，其特征在于，其步骤如下，
(1)将基因工程菌株以1％的接种量接入装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，在37℃，180rpm下摇床培养，当培养菌液的OD600达到1.0时，再加入浓度为1mmol·L-1诱导剂IPTG，20℃诱导16h，得发酵液；
(2)将发酵液13000×g离心5min后去掉上清，用3mL生理盐水悬浮细胞，13000×g离心5min去掉上清，重复此操作一次；用3mL蒸馏水充分悬浮细胞，0℃水浴中经超声波破碎5min，13000×g离心10min取上清液即得重组低温α-淀粉酶的粗酶液；
(3)将粗酶液用DEAE离子交换层析和Ni亲和层析的方法对重组酶进行纯化，即得纯化的重组低温α-淀粉酶。
5.一种如权利要求4所述方法得到的重组低温α-淀粉酶，其特征在于：该酶的分子量为51.5KD；适合作用温度30℃，在0℃下有34.5％的酶活力；Ca2+有助于提高该酶的热稳定性，酶液分别在20℃保温2.5h后，其残余酶活为73％；该酶的最适作用pH为7.5，金属离子Mn2+、K+、Na+对酶有激活作用，Hg2+、Pb2+、Al3+、Cu2+、Fe3+和Zn2+能够抑制酶活性；1％的曲通对酶有激活作用，1mmol/L的N-溴代丁酰亚胺对酶有强烈抑制作用，SDS、EDTA、碘乙酸和三氯乙酸对酶有一定的抑制作用；该酶的Km为7.28mg/mL，Vmax为13.07mg·mL-1·min-1；该酶分解马铃薯淀粉为麦芽糖和麦芽二、三、四糖。
6.一种如权利要求5所述重组低温α-淀粉酶在淀粉水解中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910034973A CN101691579A (zh) | 2009-09-16 | 2009-09-16 | 海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910034973A CN101691579A (zh) | 2009-09-16 | 2009-09-16 | 海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101691579A true CN101691579A (zh) | 2010-04-07 |
Family
ID=42080295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910034973A Pending CN101691579A (zh) | 2009-09-16 | 2009-09-16 | 海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101691579A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104059935A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-09-24 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种重组表达淀粉酶的工程菌及其应用 |
| CN104560914A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-29 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一种α-淀粉酶Amy16及其基因和应用 |
| CN106566819A (zh) * | 2016-06-03 | 2017-04-19 | 哈尔滨工业大学（威海） | 一种低温嗜盐α‑淀粉酶的基因克隆、表达及应用 |
| CN106755040A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 南京晓庄学院 | 产适冷α‑淀粉酶菌株、构建方法和生产α‑淀粉酶的方法 |
| CN108410764A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-08-17 | 中国海洋大学 | 一种用于帝王蟹暂养的冷水菌 |
| CN108588056A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-09-28 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种低温α-淀粉酶Tcamy及其基因和应用 |
-
2009
- 2009-09-16 CN CN200910034973A patent/CN101691579A/zh active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104059935A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-09-24 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种重组表达淀粉酶的工程菌及其应用 |
| CN104059935B (zh) * | 2013-12-10 | 2016-05-18 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种重组表达淀粉酶的工程菌及其应用 |
| CN104560914A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-29 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一种α-淀粉酶Amy16及其基因和应用 |
| CN106566819A (zh) * | 2016-06-03 | 2017-04-19 | 哈尔滨工业大学（威海） | 一种低温嗜盐α‑淀粉酶的基因克隆、表达及应用 |
| CN106566819B (zh) * | 2016-06-03 | 2020-04-14 | 哈尔滨工业大学（威海） | 一种低温嗜盐α—淀粉酶的基因克隆、表达及分离纯化方法 |
| CN106755040A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 南京晓庄学院 | 产适冷α‑淀粉酶菌株、构建方法和生产α‑淀粉酶的方法 |
| CN108588056A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-09-28 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种低温α-淀粉酶Tcamy及其基因和应用 |
| CN108588056B (zh) * | 2018-03-12 | 2020-03-27 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种低温α-淀粉酶Tcamy及其基因和应用 |
| CN108410764A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-08-17 | 中国海洋大学 | 一种用于帝王蟹暂养的冷水菌 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Benjamin et al. | Coconut cake–a potent substrate for the production of lipase by Candida rugosa in solid‐state fermentation | |
| US4284722A (en) | Heat and acid-stable alpha-amylase enzymes and processes for producing the same | |
| FI79345C (fi) | Enzymprodukt innehaollande en -1,6-glukosidas och foerfarande foer framstaellning av denna. | |
| Javed et al. | An innovative approach for hyperproduction of cellulolytic and hemicellulolytic enzymes by consortium of Aspergillus niger MSK-7 and Trichoderma viride MSK-10 | |
| CN102120971B (zh) | 一种普鲁兰酶产生菌及其所产生的耐热普鲁兰酶及编码基因 | |
| Joseph et al. | Studies on the enhanced production of extracellular lipase by Staphylococcus epidermidis | |
| CN102286441B (zh) | 一种低温酯酶及其编码基因与应用 | |
| WO1986001831A1 (en) | Thermostable starch converting enzymes | |
| CN101691579A (zh) | 海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用 | |
| Lo et al. | Characterization and high-level production of xylanase from an indigenous cellulolytic bacterium Acinetobacter junii F6-02 from southern Taiwan soil | |
| CN103849636B (zh) | 编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因、由该基因转化的黑曲霉菌株及其用途 | |
| CN106755015A (zh) | 一种新型普鲁兰酶基因和高产菌株的获得方法及产酶工艺 | |
| Mohan Reddy et al. | Production of thermostable pullulanase by Clostridium thermosulfurogenes SV2 in solid-state fermentation: optimization of enzyme leaching conditions using response surface methodology | |
| CN104630084A (zh) | 一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌 | |
| Finore et al. | Use of agro waste biomass for α-amylase production by Anoxybacillus amylolyticus: purification and properties | |
| Li et al. | Genome shuffling of Aspergillus niger for improving transglycosylation activity | |
| Roble et al. | Simultaneous amylase production, raw cassava starch hydrolysis and ethanol production by immobilized Aspergillus awamori and Saccharomyces cerevisiae in a novel alternating liquid phase–air phase system | |
| CN102409006A (zh) | 一种生产酸性高温淀粉酶的菌株及其工艺方法 | |
| CN100347290C (zh) | 一种转糖基β－半乳糖苷酶产生菌 | |
| CN108018274A (zh) | 一种极端耐热木聚糖酶1vbr的突变体xynh及其用途 | |
| CN101691576A (zh) | 热稳定的高温酸性α-淀粉酶基因、工程菌、重组酶及应用 | |
| Klingeberg et al. | Immobilization of anaerobic thermophilic bacteria for the production of cell-free thermostable α-amylases and pullulanases | |
| Kalyani et al. | Production and purification of amylase from Bacillus subtilis isolated from soil | |
| CN101531987A (zh) | 一种中温α-淀粉酶高产菌株及其构建方法 | |
| Elmarzugi et al. | Production of α-amylase using new strain of Bacillus polymyxa isolated from sweet potato |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20100407 |