CN108410764A - 一种用于帝王蟹暂养的冷水菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于帝王蟹暂养的冷水菌，为北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)PDN201601于2017年12月27日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15132。本发明的冷水菌用于处理帝王蟹暂养用的水体。本发明所提供的冷水菌能有效的处理帝王蟹的暂养水体，利用工厂化暂养设施和精细化管理完成对帝王蟹的长时间暂养，暂养过程中出现的水体氨氮积累的问题，采取利用冷水菌培养形成的生物膜构建而成的生物滤池的方法解决。

Description

一种用于帝王蟹暂养的冷水菌
技术领域
本发明属于有益菌筛选技术领域，具体涉及一种用于帝王蟹暂养的冷水菌。
背景技术
帝王蟹是一类大型甲壳类动物，成体体重1-15kg，栖息于深海低温的水域环境中。帝王蟹富含蛋白质、脂类等营养物质，以其外型美观、肉质鲜美，成为国内市场需求逐年增长的海捕水产品。
目前，我国市场上的帝王蟹全部来自于国外进口。国外捕捞帝王蟹为季度性捕捞，并有严格的配额限制。由于帝王蟹对水质有较高要求，使其难于长时间暂养，因此无法形成稳定的供应货源，实现全年在中国市场内的供给。
而且，帝王蟹所生活的水体为低温水体，低温环境下氨氮的降解对帝王蟹养殖来说十分重要。对于氨氮降解菌而言：目前市场上所使用的氨氮降解菌对于帝王蟹养殖水体的处理效果不佳，其能够发挥作用的温度一般在15℃以上，4℃低温下基本无法存活；而对耐低温氨氮降解菌的使用尚处在筛选研究阶段，未在养殖系统中应用。因此，没有合适的氨氮降解菌可用的现状导致目前室内帝王蟹养殖水体不能有效的进行循环使用，而频繁的换水即增加成本，又会导致帝王蟹出现应激反应，导致死亡率升高。所以，能够筛选出可用且高效的氨氮降解菌将对于帝王蟹养殖产业而言至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于帝王蟹暂养的冷水菌，能够有效的对帝王蟹的养殖水体进行净化处理，从而有效提高帝王蟹暂养的存活率。
本发明所提供的冷水菌，为北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)PDN201601于2017年12月27日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15132。
本发明的冷水菌用于处理帝王蟹暂养用的水体；
本发明所提供的冷水菌用于制备生物膜，所制备的生物膜用于帝王蟹暂养用的水体的净化处理。
本发明所提供的冷水菌能有效的处理帝王蟹的暂养水体，利用工厂化暂养设施和精细化管理完成对帝王蟹的长时间暂养，暂养过程中出现的水体氨氮积累的问题，采取利用冷水菌培养形成的生物膜构建而成的生物滤池的方法解决。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：冷水菌的筛选与鉴定
1、样品采集
用无菌枪头在帝王蟹暂养池水处理系统中的珊瑚石中刮取少量菌膜，涂布于LB固体培养基上，准备进行进一步筛选。
2、细菌富集
用接种环在带回的LB固体培养基上挑取形态大小不同的单菌落置于10mL的LB液体培养基(纯水1000mL、蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 30g、pH 7.4～7.6)中，放在摇床(4℃，180r/min)上进行好氧培养，培养72h后，获得纯菌株。最终从固体培养基上挑取并能成功富集的细菌有21株，分别编号为：A11、A31、A32、A41、A42、B11、B21、B22、B31、B32、B33、B41、B42、B51、B52、C11、C12、C21、C22、C31、C32。
3、初筛
配置C/N为15:1的海水氨氮培养基，配方为：海水1000mL、葡萄糖375.00mg、氯化铵38.21mg，使培养基中C、N的浓度分别为150mg/L、10mg/L。
取培养好的菌液1mL于离心管中，置于离心机4000r/min离心10min，将上清液去掉，用灭过菌的海水冲洗菌体，再用同样的条件离心，去上清液。将菌体接入灭菌后的海水氨氮培养基中，置于摇床(4℃，180r/min)培养40h后，用靛青蓝分光光度法测量氨氮，以筛选出具有氨氮降解功能的菌株。
经过初筛，筛选出10株具有氨氮降解功能的菌株，其中B11、B31、B32、B41、B42对氨氮的降解效果最好；8株细菌的海水氨氮培养基中的氨氮浓度高于空白组；3株细菌(B51、B52、B22)由于在海水氨氮培养基中无法生长，因此弃掉。
4.复筛
配置LB液体培养基、海水氨氮培养基、海水亚硝氮培养基，LB液体培养基及海水氨氮培养基的成分同上，海水亚硝氮培养基的配方为：海水1000mL、葡萄糖375.00mg、亚硝酸钠49.28mg，使培养基中C、N的浓度分别为150mg/L、10mg/L。
选取筛选得到的5株氨氮降解效果好的细菌(B11、B31、B32、B41、B42)作为潜在功能菌株，进行复筛。将细菌接种至LB液体培养基中培养72h，然后按照与初筛相同的方法将细菌离心后分别接至海水氨氮培养基和海水亚硝氮培养基中，置于摇床(4℃，180r/min)培养40h，用靛青蓝分光光度法测定氨氮浓度，用盐酸萘乙二胺分光光度法测定亚硝氮浓度。
实验结果表明：5株细菌(B11、B31、B32、B41、B42)都能够不同程度上降解水体中的氨氮，其中B41的效果最好，在40h时降解率可达72.31％，其次为B11，降解率为57.20％，各菌株对氨氮的降解关系为B41>B11>B42>B32>B31；有2株细菌(B41、B42)对亚硝氮具有较明显的降解效果，降解率分别为39.19％、42.55％，其余3株细菌(B11、B31、B32)对亚硝氮的降解效果不明显或无降解效果。
5.细菌鉴定
菌株B41细胞革兰氏染色为阴性，且为杆状。在LB固体培养基上形成为圆形菌落，表面干燥，白色，不透明。
对降解氨氮和亚硝氮效果最好的菌株B41进行鉴定。测定B41的16S rRNA的基因序列，并在NCBI中用BLAST进行同源序列比对，然后用MEGA 5.0构建系统发育树，确定菌株种类。
经鉴定，菌株B41与北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)具有最高的相似性，命名为北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonas arctica)PDN201601株，于2017年12月27日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15132。
实施例2：冷水菌用于制备生物膜
1)菌株培养：将PDN201601的冷水菌在LB培养液中低温4℃培养72h后获得菌体。LB培养液成分如下：1L蒸馏水中加入30克氯化钠，10蛋白胨，5克酵母粉，pH 7.4-7.8。高温灭菌后接种上述冷水菌在上述条件下培养。
2)前期挂膜：将整袋的多孔珊瑚石消毒清洗后装入泡沫箱中，每个泡沫箱作为一个处理单元，珊瑚石体积约占处理单元的30％-40％，加入高氨氮海水，持续充分曝气。将PDN201601菌液均匀泼洒于多孔珊瑚石上，按1g/L浓度添加蔗糖调节碳氮比促进微生物生长。根据需要每次可同时挂生物膜若干组，经4-5天生物膜即培养成熟，成熟后的珊瑚石网袋上有粘液富集，附着菌可达1010cfu/g左右，能快速降解氨氮。
3)菌株的效果检测：
将成熟的生物膜放入暂养帝王蟹的循环水处理系统内，处理单元内的海水转移入发酵池。同比例添加蔗糖(1g/L)，充分持续曝气，经过3-5天左右发酵池成熟。在处理初始氨氮浓度为12.94mg/L池水时，72h后氨氮浓度降到1.97mg/L，去除率高达85％，上述结果表明本发明筛选的菌株能有效的降低帝王蟹养殖水体中的氨氮浓度。
实施例3：
将筛选的菌株制备的生物膜放入暂养池内进行水体处理，然后放入帝王蟹进行暂养，暂养的日常管理操作包括水质监测、人工投饵、日常捞池、杀菌消毒等步骤。
水质监测包括每日对暂养池水温度、盐度、pH、溶解氧、水位、氨氮、亚硝氮指标的测定，使暂养池中各项指标维持在正常范围内，即温度1-4℃、盐度35-37、pH 7.5-8.5、溶解氧>5mg/L、水位40cm-50cm、氨氮<0.5mg/L和亚硝氮<0.5mg/L。间隔三天投喂一次牡蛎或者贻贝肉，维持帝王蟹暂养期间的重量。每天进行捞池操作，将活力较差的帝王蟹挑出，并用水泵吸除池底的排泄物。用做转移帝王蟹的筐子单次使用后要用高锰酸钾消毒，晾干后再次使用。每日工作结束后用淡水将地面彻底清洗干净。
暂养过程：
从进货后开始，工人每日早上8点进行捞池工作，将死蟹和半死蟹分类捞出进行不同处理。间隔3天投喂一次饵料，并在投喂前进行底质清洁工作。每日进行水质指标的常规检测，包括水温、盐度、溶解氧、pH的检测和对氨氮、亚硝氮指标的跟踪监测。7月16日向1#-6#暂养池投放B41菌，后调大蛋白质分解器，增加池体充氧。8月10日所有螃蟹出货结束。
对暂养结果分析如下：
1、改善帝王蟹体重下降问题：从进货后监测取样帝王蟹的体重，结果表明帝王蟹体重基本没有变化，且投喂并没有造成水体氨氮的较大波动，螃蟹进食后生长状况良好。
2、降解水体氨氮问题：向1#-6#暂养池水处理系统中投放B41菌进行挂膜后，经过5天左右，各池氨氮成功从约20mg/L降至2mg/L以下，水体亚硝氮水平没有较大变化。
3、延长帝王蟹暂养时间问题：刚进货的前几天，螃蟹对新环境不适应，使得这段时间成为帝王蟹死亡的高峰期，死亡数大约在每个池子每天5只。后随着暂养的进行，死亡数有相应的下降，维持在每池每天2只左右。经过统计，本次帝王蟹暂养期间共死亡蟹约1.2吨，成活率约为92％，相比于之前的暂养方法显著提高了成活率。

Claims (6)

1.一种冷水菌，其特征在于，所述的冷水菌为北极假交替单胞菌(Pseudoalteromonasarctica)PDN201601株，其保藏编号为CGMCC NO.15132。
2.如权利要求1所述的冷水菌，其特征在于，所述的冷水菌是从帝王蟹暂养池水处理系统中的珊瑚石的菌膜中筛选获得的。
3.权利要求1所述的冷水菌在处理帝王蟹暂养用的水体中的应用。
4.权利要求1所述的冷水菌在制备生物膜中的应用。
5.一种生物膜，其特征在于，所述的生物膜是使用权利要求1所述的冷水菌培育的。
6.权利要求5所述的生物膜在在处理帝王蟹暂养用的水体的净化处理中的应用。
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