KR20180066770A - 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 db8균주, 이를 포함하는 바이오플락 수산물 양식용 조성물, 이를 이용한 수산물 양식 방법 및 바이오플락 수산물 양식용 조성물의 제조방법 - Google Patents

암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 db8균주, 이를 포함하는 바이오플락 수산물 양식용 조성물, 이를 이용한 수산물 양식 방법 및 바이오플락 수산물 양식용 조성물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP, 이를 포함하는 바이오플락 수산물 양식용 조성물, 이를 이용한 수산물 양식 방법 및 바이오플락 수산물 양식용 조성물의 제조방법을 제공한다.

Description

암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주, 이를 포함하는 바이오플락 수산물 양식용 조성물, 이를 이용한 수산물 양식 방법 및 바이오플락 수산물 양식용 조성물의 제조방법{Novel micoroorganism panibacillus sp. DB8 having degradation activity of ammonia and nitrous acid and composition comprising the same for biofloc for aquaculture of fishery product, aquaculture of fishery product using the same and manufacturing method for the composition for biofloc for aquaculture of fishery product}
본 발명은 암모니아 및 아질산 농도 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP, 이를 포함하는 바이오플락 수산물 양식용 조성물, 이를 이용한 수산물 양식 방법 및 바이오플락 수산물 양식용 조성물의 제조방법을 제공한다.
흰다리새우 (Litpenaeusvannamei)는 우리나라 서해안의 중요한 양식어종 중 하나이다. 새우생산량은 2005년 1,614ton 에서 2012년 2,860ton으로 약 2배 가까이 증가하였다.그 중 대중에 많이 알려진 대하는 0.6%에 불과하며 국내양식 환경에 적합한 흰다리 새우가 99.4%로 거의 대부분이다. 흰다리 새우는 성장이 비교적 빠르고 환경적응력이 높아 전세계적으로 가장 많이 양식되고 있는 종이다. 그 동안의 양식 산업의 발달로 생산성은 2005년 0.7ton/ha에서 2012년 2,8ton/ha로 약 4배 증식하였다. 국내 새우양식장은 총 1,010ha로 전남이 400ha로 가장 많고, 충남이 그 다음으로 270ha이다. 양식의 거의 대부분은 축제식 양식장에서 반 집약식으로 생산된다. 국내 새우류 수입량은 연간 약 6.6만톤이나 국내소비자는 활새우를 선호하여 양식의 중요성은 더욱 높다고 할수 있다.
새우의 소비가 증가됨에도 불구하고 새우양식이 크게 성장하지 못하는 이유는 다음과 같다. 첫째로, 바이러스성 및 세균성 질병에 의한 대량폐사가 빈번하여 해마다 약 30 ~50% 폐사하기 때문인데, 흰반점 바이러스(White Spot Disease virus), 간췌장바이러스(hepatopancreatic parvo like virus)와 Vibrio 세균에 의한 피해도 증가하고 있다. 또한 근래에는 조기치사증후군(Early Mortality syndrome, EMS), 급성간췌장괴사증후군 (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome, AHPNS)이라 불리는 신종 질병이 태국, 중국, 말레이시아 등 아시아에서 발생하여 대량폐사의 원인이 되고 있다. 이러한 질병에 의한 대량폐사를 막기 위해 항생제나 포르말린 같은 무분별한 화학약품을 사용하는 문제점이 발생한다. 둘째로, 축제식이나 가두리에서는 사료량 등 생산비는 높으나, 질병과 자연환경에 따라 생산성기복이 커서(1 ~ 4ton/ha), 예측 불가능한 양식환경과 낮은 생산량으로 적극적으로 새우양식에 투자하려는 양식업자는 점점 감소되고 있기 때문이다. 또한 축제식이나 가두리 양식장 자가오염 및 양식장 배출수에 의한 연안오염으로 양식장 환경문제는 더욱 악화되고 있는 실정이다. 3,000ton 생산기준으로, 약 30만톤의 오염된 배출수가 연안으로 방류되어 양식장의 위험요소가 가중되고 있는 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 근래에는 내륙에서 미생물을 이용한 하우스양식에 대한 관심이 높아지고 있는데, 실내 하우스 양식, 일명 바이오플락(Biofloc) 양식이 그 해결책으로 대두 되고 있다. 바이오플락 양식이란, 종속 영양세균 (heterotrophic bacteria, 타급영양세균, 타가영양균)과 수산물을 함께 양식하여 종속 영양세균이 수조 물속의 유기부산물(질소를 포함한)을 조류(algae, 물에 사는 하등식물)보다 10~100배 빨리 분해하여 물을 정화시킴으로서 종속 영양세균에 분해된 유기부산물은 다시 단백질 먹이가 되어 물 교환 및 수처리 등의 여과 과정이 필요 없는 양식방법을 말한다. 이러한 바이오플락 양식 기술은 바닷물을 교환하지 않으므로 바닷물을 통하여 유입되는 질병원의 전염을 차단 가능하고, 양식밀도를 높임으로써 양식 생산성을 높일 수 있고, 새우의 플락 재섭취를 통하여 사료효율을 높일 수 있으며, 독립된 공간에서 양식함으로 사료의 손실이 적어 경제적이다. 또한, 미생물을 이용한 양식기술이므로 항생제등 다른 화학제품의 사용이 필요 없어 식품 안전성이 담보된 친환경기술이다.
이와 같은 바이오플락 양식은 양식수 교환 없이 독립된 공간에서 사육하므로 수질오염에 따른 수산물의 폐사가 우려된다는 문제점이 있다. 따라서 바이오플락 양식에 있어서는 자체적인 정화능력을 갖는 환경을 만들어 주는 것이 핵심이다. 바이오플락 양식의 장점에도 불구하고 민간양식에 많이 공급되지 않는 원인은 아직 자체적으로 수질을 개선하는 미생물과 그 이용방법이 확립되지 못하기 때문이다.
종래 미생물을 이용한 바이오플락 양식 기술은 1990년대 이스라엘에서 틸라피아 양식에 처음 시도되었으며 새우양식기술에는 1990년대 미국에서 처음 적용되었다.
2000년대 중반 이후 동남아에서도 개발되기 시작하였으며, 국내에서는 2003년 수산과학원에서 기술개발에 착수하였으며 2011년 이후 민간양식에 기술이전이 시작되었다.
그러나 바이오플락을 이용한 민간양식에서는 미생물 종류와 증식상태 등이 부적절하여 효과적으로 암모니아와 아질산염을 제거하지 못하거나 사료첨가량과 투여시기, 탄소와 질소 비율 조절 등 관리 부족으로 인하여 양식에 실패하는 경우도 많아 정착되지 못하고 있는 실정이다. 바이오플락 양식기술은 독립되고 밀폐된 공간에서 수산물을 양식하므로 첨가된 사료의 부패, 수산물의 배설물에서 생성되는 암모니아와 아질산염이 많이 생성되는데 이런 물질은 수산물에 독소로 작용하여 폐사의 원인이 된다.
따라서 바이오플락 양식이 성공하기 위해서는 유용 미생물이 양식장에서 증식하면서 첨가된 사료의 부패, 새우의 배설물에서 생성되는 암모니아와 아질산염을 효과적으로 제거하고 이들 미생물을 수산물이 섭취하여 영양분으로 사용함으로써 수산물의 증체량과 면역력을 향상시켜 생산성을 높이는 것이 바이오플락 양식기술의 핵심이다.
종래 수산양식에서 미생물의 이용은 식물먹이생물 (Fukami et al., 1997; Rico et al., 1998), Rotifer (Gatesoupe, 1991; Douillet, 2000), Artemia (Verschuere et al., 1999), 어류 (Beveridge et al., 1989; Skjermo and Vadstein, 1999), 패류 (Riquelme et al., 1997; Gibson et al., 1998) 및 새우류 (Rengpipat et al., 1998; Rengpipat et al., 2000; Shariff et al., 2001) 등 수산양식 의 거 의 모든 분야에 걸쳐 사용 효과가 보고되어 있다.
그러나 국내 양식 현장에서는 다양한 종류의 미생물이 혼합되어있는 미생물제를 사용하고 있어 미생물의 관리가 어렵고 문제 발생시 원인 파악이 되지 않는다. 이러한 과학적 근거가 부족하고, 체계적인 관리가 되지 않아 재현성있게 양식이 되지 않고, 실패하는 경우가 빈번하여 정착되지 못하고 있는 실정이다.
Gatesoupe, 1991 Beveridge et al., 1989 Skjermo and Vadstein, 1999
본 발명의 목적은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP 를 유효성분으로 포함한 것을 특징으로 하는, 바이오플락 수산물 양식용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP를 배양액에 접종하여 30~37℃에서 24~48 시간 배양하여 포자상태의 액상 바이오 플락 양식용 조성물을 수득 하는 단계를 포함하는 바이오 플락 양식용 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이오 플락 양식장 내의 양식 수 내에 제2항의 바이오 플락 수산물 양식용 조성물을 도입하는 단계; 및 상기 양식수 내의 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP의 수를 30 ~ 100 x 103 CFU/ml로 유지시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 플락 수산물 양식 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP를 제공한다.
본 발명은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP 를 유효성분으로 포함한 것을 특징으로 하는, 바이오플락 수산물 양식용 조성물을 제공한다.
본 발명은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP를 배양액에 접종하여 30~37℃에서 24~48 시간 배양하여 포자상태의 액상 바이오 플락 양식용 조성물을 수득 하는 단계를 포함하는 바이오 플락 양식용 조성물 제조방법을 제공한다.
본 발명은 바이오 플락 양식장 내의 양식 수 내에 제2항의 바이오 플락 수산물 양식용 조성물을 도입하는 단계; 및 상기 양식수 내의 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP의 수를 30 ~ 100 x 103 CFU/ml로 유지시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 플락 수산물 양식 방법을 제공한다.
본 발명에 의해, 사용이 간편하고 관리하기 쉬운 단일 미생물인 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP를 사용하여 효과적으로 양식수의 수질을 개선함으로써 수산물의 생산성을 증가시킬 수 있다.
또한, 소화효소 생성능, 면역력 증강 기능이 우수한 균주인 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP를 이용하여, 항생제등 다른 화학제품의 사용을 최소화 하여 우수한 식품안정성을 달성 할 수 있다.
본 발명에 의해 개발된 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP을 사용하여, 독성의 암모니아성 질소와 아질산성 질소를 효과적으로 제거하고 양식수 수질을 개선 시킴으로 인해서 질병발생 억제를 통해 생산량 향상을 달성 할 수 있다.
도 1은 암모니아와 아질산 농도에 따른 색상변화를 나타내는 도이다.
도 2는 새우 양식 수조에서 투여 미생물에 의한 암모니아와 아질산 농도변화를 나타내는 도이다.
도 3은 DB 8 균주의 16s rRNA 염기서열을 나타내는 도이다.
도 4는 DB8의 분류학적 위치(Neighbor phylogenic tree)를 나타내는 도이다.
도 5는 주사현미경을 통한 외부형태에 관련한 도이다.
도 6은 DB8 균주를 사용한 새우 양식수의 용존산소농도 변화를 나타내는 도이다.
도 7은 DB8 균주를 사용한 새우 양식수의 pH농도 변화를 나타내는 도이다.
도 8은 DB8 균주를 사용한 새우 양식수의 아질산농도 변화를 나타내는 도이다.
도 9는 DB8 균주를 사용한 새우 양식수의 암모니아농도 변화를 나타내는 도이다.
도 10은 DB8 균주를 사용한 새우 양식수의 알카리도 변화를 나타내는 도이다.
도 11은 DB8 균주를 이용하여 양식한 새우의 크기 (90일 양식)를 나타내는 도이다.
본 발명은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP을 제공한다.
본 발명은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP 를 유효성분으로 포함 할 수 있으며, 필요에 의해 추가적인 첨가물을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 바이오플락이란, 세균성 미생물, 식물플랑크톤, 사육생물 배설물, 유기물 등이 결 합된 미세집합체(floc)를 의미하는 것이다. 즉, 바이오플락 양식 기술이란, 종속 영양세균 (heterotrophic bacteria, 타급영양세균, 타가영양균)과 수산물을 함께 양식하여 종속 영양세균이 수조 물속의 유기부산물(질소를 포함한)을 조류(algae, 물에 사는 하등식물)보다 10~100배 빨리 분해하여 물을 정화시킴으로서 종속 영양세균에 분해된 유기부산물은 다시 단백질 먹이가 되어 물 교환 및 수처리 등의 여과 과정이 필요 없는 양식방법을 말한다. 수산물을 양식함에 있어, 양식 생물에 악영향을 주는 대표적 물질로 암모니아와 아질산염이 있으며, 이를 제거하는 미생물적인 방법에는 자가영양세균에 의한 방법 및 타기영양세균에 의한 방법 두 가지가 있다. 사료와 배설물로 생성된 암모니아와 아질산염은 주로 자가영양세균에 의해 질산화된다. Nitromonas에 의해 암모니아는 아질산염으로, 아질산염은 nitrobacter에 의해 약독화된 질산염으로 전환된다. 반면에 타가영양세균인 probiotics는 암모니아나 아질산염을 질소원으로 이용하여 세균단백질로 동화시킨다. 새우는 이것을 섭취하여 영양분으로 사용하고 일부는 다시 배출하여 선순환과정을 거쳐 양식장내 농도를 일정하게 유지시킨다. 본 발명은 타가영양세균 방식에 의한 것으로, 타가영양세균에 해당하는 신규한 미생물을 통하여, 암모니아와 아질산염 농도를 감소 시킬 뿐 아니라, 본발명에 사용되는 미생물인 panibacillus sp . DB8자체를 유효한 먹이로 사용하여, 수산물 생산성 향상에도 도움을 준다.
본 발명에 있어, 수산물이란 어류, 갑각류 및 패류로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 의미하며, 바람직하게는 새우, 흰다리새우, 대하, 민물새우, 뱀장어,미꾸라지, 황복, 넙치, 도미, 송어, 참게, 전복 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이며, 더욱 바람직하게는 흰다리 새우인 것을 특징으로 하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상술한 바이오플락 수산물 양식용 조성물은 비타민 C, 규산염, 실리카겔, 트레할로스, 글리세롤, 프락토올리고당, 베타인, 프롤린, 덱스트란, 말토스, 수크로스 및 만니톨 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 안정제를 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP을 포함하는 바이오 플락 수산물 양식 조성물은 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP의 포자상태로 사용 될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. .
본 발명의 포자상태는 포자 형성율이 85% 내지 95%일 수 있으며, 이에 제한 되지 않는다.
본 발명은 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP를 배양액에 접종하여 30~37℃에서 24~48 시간 배양하여 포자상태의 액상 바이오 플락 양식용 조성물을 수득 하는 단계를 포함하는 바이오 플락 양식용 조성물 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상술한 제조방법에 사용되는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP을 포함하는 바이오 플락 양식용 조성물 제조방법에 있어서, 포자상태는 포자 형성율이 85% 내지 95%일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 바이오 플락 양식장 내의 양식 수 내에 상술한 바이오플락 수산물 양식용 조성물을 도입하는 단계; 및 상기 양식수 내의 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP의 수를 30 ~ 100 x 103 CFU/ml로 유지시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 플락 수산물 양식 방법을 제공한다.
본 발명은 양식수내 미생물 수를 30 ~ 100 x 103 CFU/ml로 유지시킬 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
이하 본발명의 내용을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다.
실시예 1 미생물 균주선별
1-1. 미생물 분리
본 발명자들은 양식수에서 암모니아와 아질산 이용율이 우수한 미생물을 분리하기 위해 충남 태안군 해변에서 채수한 해수와 충남 예산군 소재 새우양식장(예진수산)에서 채수한 양식수를 생리식염수에 현탁하고 희석하여 시료를 준비하였다. 각각의 희석액을 분석배지(marine agar BD) 에 도말하여 28℃에서 40시간 배양한 후 단일 콜로니 다수를 1차 선별하여 Tryptic soy agar(TSA, BD)에 계대하여 균주를 확보하였다.
1-2. 암모니아 이용성이 우수한 미생물 분리
1차 선별균주 중 암모니아 이용율이 우수한 균주를 분리하기 위하여 암모니아 이용배지(Glucose 0.5%, Ammonium sulfate 5ppm)에 분리균주를 접종하고 28℃, 50rpm에서 16시간 배양하였다. 배양액 내의 암모니아 농도를 측정하기 API ammonia Kit(API)를 사용하였다. 배지 5ml를 시험관에 넣고, 용액A와 용액B를 각각 1ml씩 넣고 5분간 방치한 후 630nm에서 흡광도를 측정하고 암모니아 표준품 정량곡선과 비교하여 농도를 측정하였다.
1-3. 아질산 이용성이 우수한 미생물 분리
1차 선별균주 중 아질산 이용율이 우수한 균주를 분리하기 위하여 아질산 이용배지(Glucose 0.5%, Sodium nitrate 5ppm)에 분리균주를 접종하고 28℃, 50rpm에서 16시간 배양하였다. 배양액 내의 아질산 농도를 측정하기 API nitrate Kit(API)를 사용하였다. 배지 5ml를 시험관에 넣고, 용액A를 각 1ml씩 넣고 5분간 방치한 후 490nm에서 흡광도를 측정하고 아질산 표준품 정량곡선과 비교하여 농도를 측정하였다.
약 30개의 균주를 1차 선별하여 암모니아와 아질산 농도 측정을 한 결과 하기 표1에서 알수 있듯이, DB 2, 4, 8 균주에서 감소효과가 가장 우수하였다. DB2는 암모니아 보다 아질산 이용율이 높았고 DB4와 DB8은 암모니아와 아질산 이용율 모두 양호하였다 (도 1참조). 이런 과정을 통해 암모니아 및 아질산 이용율(=암모니아 및 아질산 분해능)이 가장 우수한 3균주를 2차 선별하였다.
[표 1]
Figure pat00001
실시예 2 소규모 새우 양식시험
시험관 시험에서 암모니아와 아질산 이용율(=암모니아 및 아질산 분해능)이 가장 우수하였던 2차 선별 균주인 DB2(시험군1), DB4(시험군2), DB8(시험군3), 그리고 새우양식용 수질개선제로 상용화된 Nature Farm(시험군4)제품으로 벤치 수조에서 수질개선 및 새우양식을 비교하였다.
40L 수조에 해수 20L를 넣고 air stone을 부착한 호스를 통해 공기를 계속 주입시키고 온도는 전기히터봉을 이용하여 26 ~28℃를 유지시켰다.
각각의 수조에 각 미생물을 104 CFU/ml 되게끔 접종하고 pellet 사료 1g, 당밀 2g을 첨가하고 공기와 온도를 일정하게 유지시키면서 암모니아 농도, 아질산 농도, DO (Lutron DO 5510), pH를 매일 측정하였다. 미생물을 투입하지 않은 것을 대조군(시험군5)으로 하였다.
사료에 의해 증가된 암모니아와 아질산이 미생물에 감소되고 유지되는 것을 확인하고 각 수조에 중간 육성 새우를 입식하였다(50 미/20L). 실험에 사용된 흰다리새우는 충남 예산군에 소재한 예진수산에서 30일 양식된 약 1g 중량의 새우를 제공받았다. 입식 후 펠렛 사료1호를 1회 1g씩 매일 2회 공급하였고 당밀은 주기적으로 7일 간격으로 1g씩 공급하였다.새우 입식 후 암모니아, 아질산, DO(Lutron DO 5510), pH를 매일 측정하여 변화를 관찰하고 매주 양식수의 총 미생물수를 TSA 배지로 분석하여 측정하였다.
DB2는 암모니아 농도가 초기 5일간 1ppm이상이었으나 5일 이후는 1ppm 이하로 안정화되었으나 기준 농도 0.2ppm을 상회하는 불안정한 상태를 보였다. 아질산농도는 1 ~ 4ppm으로 매우 불안정하여 새우 양식에 적합하지 않았다.
DB4는 암모니아 농도가 0.2에서 2ppm까지 불안정하였으며 아질산 농도도 1 ~ 4ppm으로 매우 불안정하여 새우 양식에 적합하지 않았다.
DB8은 30일간 0.2ppm으로 안정화되어 가장 양호한 결과를 보였고 아질산 농도는 최대 1ppm까지 상승하였으나 시험군 중에서도 가장 양호하였다.
수질개선제로 상용화된 NF제품(Nature farm(제조원: 한민수산질병관리원, 호기성 및 혐기성균 5가지가 농축된 박테리아제))은 암모니아 농도는 0.2ppm으로 양호하였으나 아질산 농도는 최대 2ppm까지 상승하였다. 그러나 이 제품은 nitromonas등 여러 균주가 혼합된 제품으로 단일 균주로 사용한 DB8 보다 효과적이지 않다.
한편 미생물을 첨가하지 않은 대조군은 암모니아 농도가 10일 이후에 5ppm 이상이었고, 아질산 농도도 2ppm을 상회하여 유효한 미생물이 없을 때 수질이 악화되는 것을 확인 할 수 있었다(도 2참조).
또한 각 시험군 수조에서 총 미생물균수를 측정하였다. DB 2 투여군 수조에서는 총 균수가 초기 7일간은 41× 103 CFU/ml로 투여균보다 4배 높은 수준에서 유지되었으나 28일 경과 후에는 4× 103 CFU/ml로 투여 균보다 적은 상태로 유지되었다.
DB 4 투여군은 초기 7일간은 55× 103 CFU/ml로 투여균보다 5배 높은 수준에서 유지 되었고 28일 경과 후에는 20× 103 CFU/ml로 총균수 감소가 있었으나 초기 투여 균보다는 높은 상태를 유지하였다.
DB 8 투여군은 초기 7일간은 62× 103 CFU/ml로 시험군 중에서 가장 높은 균수를 보였고 28일 경과 후에도 35× 103 CFU/ml로 감소는 있었으나 시험군중에서 가장 높은 균수를 유지하였다.
상용화균주인 NF 투여군은 초기 7일간은 47× 103 CFU/ml로 비교적 높은 균수를 보였으나 이후 계속 감소되어 28일 경과 후에는 10× 103 CFU/ml를 보였다. 하기 표 2는 양식기간 내 양식수의 총 미생물 수 변화를 나타낸다.
[표 2]
Figure pat00002
미생물을 투여하지 않은 대조군은 초기 7일간은 10× 103 CFU/ml를 보였고 시험기간 동안 내 내 균수변화가 적었다. 대조군의 결과를 보면 해수와 사료, 당밀 등에서 자연적으로 발생하는 미생물수는 기본적으로 10× 103 CFU/ml은 유지된다고 볼 수 있다. 여기에 인위적으로 투여한 미생물에 의해서 균수가 증가하나 해수의 염도, 온도, 영양분이 적합하지 못하여 계속적으로 증식은 되지 못하고 점차 감소하는 경향을 보인다.
예비시험에서 새우양식수조에 포도당 등 영양분을 충분이 공급하면 미생물 수가 500× 103 CFU/ml 까지 증식되고 암모니아 농도와 아질산 농도는 0.2ppm 이하로 감소하였으나 용존산소(DO)가 5ppm 이하로 감소하여 새우가 폐사되는 결과를 보였다.
따라서 새우 양식수에서의 적절한 미생물 수는 30 ~100 x 103 CFU/ml 가 적절하다.
소규모 새우양식시험을 통해 암모니아와 아질산 농도를 현저히 감소시키면서 양식수내 미생물수를 30 ~ 60 x 103 CFU/ml 로 유지시키는 DB8균주를 새우양식장 수질개선용 미생물로 최종선정하였다
실시예 3 DB8균주의 동정 및 특성
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 암모니아 및 아질산 이용율 및 새우양식에 효과적인 균주로 최종 선별된 DB8에 대한 생리 생화학적 특징을 조사하였다. DB8은 유포자성 간균의 모양을 가지며, 그램 양성, 카탈라제 양성인 균주로 바실루스 속에 속한다. API 킷트(API biomerieux, France)을 이용한 당이용성 특성은 하기 표 3과 같으며, Biolog 분석을 통한 생화학적 특성은 하기 표 4와 같다.
[표 3]
Figure pat00003
+: 양성반응, -: 음성반응, w(weak): 약한 양성반응
[표 4]
Figure pat00004
+: 양성반응, -: 음성반응, w(weak): 약한 양성반응
또한 16S rRNA 유전자 염기서열에 의한 유전자간의 상동성비교를 위해 염기서열을 분석하였고, 동정하는 분자생물학적 분석을 통해 동정하였다(도 3참조). 계통수 상에서 DB8 16S rRNA 유전자는 페니바실러스(Panibacillus) 속에 가장 가까운 위치에 배치되었다(도 4 참조). 또한 16S rRNA 유전자 서열에 대한 Blast 2 상동성 검색 결과 모두 99% 이상의 높은 동일성을 나타내었다. 상기와 같이 DB8을 분자생물학적으로 동정한 결과 Panibacillus sp . 속으로 동정되었다. 본 발명의 균주를 Panibacillus sp . DB로 명명하고 2016년 10월 18일자로 생물자원센터에 기탁하였다.
[수탁번호]
기탁기관명: 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)
수탁번호: KCTC 13134BP
실시예 4 DB8균주를 이용한 대규모 새우양식시험
DB8균주에 의한 하우스 새우양식장의 수질개선과 생산성 증가효과를 확인 하기 위해 충남 예산군 소재의 예진수산에서 대규모(100평) 양식 시험을 진행하였다. 시험기간은 2016년 7월 27일 부터 10월 26일 까지 약 90일간 진행하였다.
신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) 배양액(1.0 x108 CFU/ml) 5L를 해수 50ton이 들어있는 치하 양식장에 살포하여 2.0 x104 CFU/ml 되게끔 하였다. pellet 사료 1kg, 당밀 20kg을 첨가하고 공기를 브로와를 통해 공급해주고 온도는 27 ~29℃로 유지시켰다.
사료에 의해 증가된 암모니아와 아질산 농도가 1ppm 이하로 감소된 것을 확인하고 치하 15만미를 입식하였다.
치하 입식 후 30일간은 치하용 크럼블사료(CJ Co.)를 1회 400g씩 매일 4회 공급하였다. 30일이후 치하가 약 1g 무게로 성장했을 때 12만미를 100평 규모의 본 양식장으로 이송하였다. 본 양식장은 치하 이송 10일전 DB8 배양액(1.0 x108 CFU/ml) 20L를 본 양식장 해수 200ton에 살포하여 2.0 x104 CFU/ml 되게끔 하여 암모니아, 아질산, 용존산소, pH등 수질을 안정화 시켰다.
양식 30일부터 60일까지는 펠렛 사료1호를 1회 1kg씩 매일 4회, 60일부터 90일까지는 펠렛 사료 2호를 1회 1kg씩 매일 4회 공급하였다. 당밀은 주기적으로 7일 간격으로 10kg씩 공급하였다.
치하 입식 후 암모니아, 아질산, DO(Lutron DO 5510), pH를 매일 측정하여 변화를 관찰하였다.
비교예
충남 예산군 소재 하우스 새우양식장인 예진수산에서 4월부터 9월까지 예진수산 종균(바실러스 서브틸리스가 함유된 쌀뜨물 발효액)을 이용하여 새우를 양식한 수질분석과 새우생산성을 비교하였다, 상이한 균주를 사용한 것을 제외하고는 새우 양식 방법, 관리 등은 실시예 4와 동일하게 하였다.
실시예 5 용존산소변화
양식기간 동안 용존산소농도 (DO)는 5.5 ~ 8.5 mg/L였고 평균 8mg/L를 보여 양식장내 공기주입량과 공기 순환에는 문제가 없는 것으로 보인다. 30 ~37일 기간은 본 양식장에 중간새우를 입식하고 공기 주입량을 조절하는 기간이어서 일시적으로 DO가 급속히 감소하였다 (도 6참조). 반면 비교예에서는 용존산소 농도가 6 ~7 mg/L를 보였다. 공기주입량과 수류등이 실시예에서 사용한 양식장과 동일한 조건이 아니어서 단순비교하기는 어렵다. 그러나 양식장에서는 공기 주입량이 풍부하여 DO 부족으로 인해 새우가 수면위로 상승하는 현상은 발견되지 않았다.
실시예 6 pH 변화
양식기간 동안 pH는 7.2~8.0의 범위를 보여주었으며, 전 양식기간동안 7.0 이하로 떨어진 시기는 없이 새우양식에 적합한 pH 범위를 나타내었다. 반면 비교예 에서는 양식 초기에는 pH 7 내외로 불안정하였고 60일 이후에 pH7.0 ~ 7.5 사이를 유지하였다(도 7참조). 양식기간 동안 양식수의 pH가 7이하로 떨어지면 중조를 첨가하여 인위적으로 pH 7 이상을 유지시겼다.
아질산염 농도는 양식 전 기간동안 0.2mg/L 농도를 보여 새우배설물과 섭취되지 않은 사료에서 발생하는 아질산염을 DB 8균주가 효과적으로 감소시켰다. 반면 비교예 에서는 60일 이전에는 0.2ppm에서 0.8ppm까지 변동폭이 심하였고 60일 이후에 0.2ppm으로 안정화되었다(도 8 참조).
실시예 7 암모니아 농도 변화
암모니아 농도는 양식 전 기간동안 0.2mg/L 이하 농도를 보여 새우배설물과 섭취되지 않은 사료에서 발생하는 암모니아를 DB 8균주가 효과적으로 감소시켰다. 반면 비교예 에서는 60일 이전에는 0.2ppm에서 5ppm까지 변동이 심하였고 60일 이후에 0.2ppm으로 안정화되었다(도 9참조).
실시예 9 알카리도변화
기존 양식방법은 60일 이전 까지는 알카리도가 400 ~ 250으로 변동폭이 심하였고, 60일 이후로는 250으로 안정화되었다. DB8을 사용한 양식(실시예 4)에서는 전 기간동안 알카리도가 일정하게 유지되어 수질 변화 없이 안정적으로 새우를 양식할 수 있는 수질이 조성되었다(도 10 참조).
실시예 10 새우의 생산성
90일간 양식 종료 후 새우 크기와 중량을 측정하였다. 체장은 140 mm ~ 120mm였고, 체중은 22 ~ 26g을 보여 높은 성장율을 보였다(도 11 참조). 이는 새우 25g까지 양식하는데 기존 양식방법(비교예)으로는 약 120일이 소요되는데 비해 30일 이상 양식기간을 단축시켰으며 생존율도 기존 63%에 비해 83%로 증가하여 생산성이 월등히 증가하였다(표 5참조). 또한 기존 새우양식기간이 120일이면 최대 연 3회 양식이 가능하나 본 발명에 의하면 연 4회 양식도 가능하여 생산성을 획기적으로 증가 시킬 수 있다.
[표 5]
Figure pat00005
본 발명에 의해 개발된 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP 를 사용하였을 때 독성의 암모니아성 질소와 아질산성 질소를 제거하여 양식수 수질을 개선 시킴으로 인해서 질병발생을 억제시키고 획기적으로 생산성을 향상시키는 것으로 확인되었다.
실시예 11 바이오플락용 미생물 제조
본 발명의 페니바실러스 속 DB8 균주 생산을 위해서 DB8균을 전배양액 Tryptic soy broth(Neogen, USA)에 접종하고 37에서 24시간 배양하였다. 전배양액을 생산배지 (카제인 펩톤 15g/L,소이펩톤 5g/L, 효모추출물 5g/L, 포도당 5g/L, 염화칼륨 0.2g/L, 마그네슘 설페이트 0.012g/L)에 접종하고 37℃에서 48 ~72시간 배양하였다. 배양초기에 pH는 완만히 감소하다 24시간 이후 다시 pH가 증가하는데 이시기는 포자를 형성하는 시기이다. 현미경으로 다이렉트 카운트를 하여 포자 형성율이 90% 이상 진행되었을 때 배양을 멈추었다. 액상제조물의 경우 저장성 개선을 위해 액상안정제로 규산염이나 비타민C등을 첨가하였다.
생산액의 미생물 수는 2 x 108 CFU/ml 였으며, 30일간 8 ~ 10℃ 에 보관시에도 균수변화는 없었다.
생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC) KCTC13134BP 20161018
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Claims (10)

  1. 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP.
  2. 제 1항의 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP 를 유효성분으로 포함한 것을 특징으로 하는, 바이오플락 수산물 양식용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 수산물은 어류, 갑각류 및 패류로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 바이오 플락 수산물 양식용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 수산물은 새우, 흰다리새우, 대하, 민물새우, 뱀장어,미꾸라지, 황복, 넙치, 도미, 송어, 참게 및 전복으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 바이오 플락 수산물 양식용 조성물.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 바이오플락 수산물 양식용 조성물은 비타민 C, 규산염, 실리카겔, 트레할로스, 글리세롤, 프락토올리고당, 베타인, 프롤린, 덱스트란, 말토스, 수크로스 및 만니톨으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 안정제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 플락 수산물 양식용 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP 는 포자상태인 것을 특징으로 하는, 바이오 플락 수산물 양식용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 포자상태는 포자 형성율이 85% 내지 95%인 것을 특징으로 하는 바이오 플락 양식용 조성물.
  8. 제1항의 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP를 배양액에 접종하여 30~37℃에서 24~48 시간 배양하여 포자상태의 액상 바이오 플락 양식용 조성물을 수득 하는 단계를 포함하는 바이오 플락 양식용 조성물 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 포자상태는 포자 형성율이 85% 내지 95%인 것을 특징으로 하는 바이오 플락 양식용 조성물 제조 방법.
  10. 바이오 플락 양식장 내의 양식 수 내에 제2항의 바이오 플락 수산물 양식용 조성물을 도입하는 단계; 및
    상기 양식수 내의 암모니아 및 아질산 분해능을 갖는 신규미생물 페니바실러스 속 DB8균주(panibacillus sp . DB8) KCTC 13134BP의 수를 30 ~ 100 x 103 CFU/ml로 유지시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 플락 수산물 양식 방법.

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