CN101869118A - 短小芽孢杆菌h2在预防和/或杀灭养殖水体弧菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌H2和/或其菌剂在预防和/或杀灭养殖水体弧菌中的应用。还公开了一种预防和/或杀灭养殖水体中弧菌的方法，是将短小芽孢杆菌H2(Bacillus pumilus H2)菌剂接入养殖水体，所述短小芽孢杆菌H2菌剂是将短小芽孢杆菌H2菌株接入LB培养基制成。该菌剂可以在通常的育苗和养殖温度下产生拮抗弧菌的细菌素，抑制弧菌的生长和繁殖，起到有效地控制由致病性弧菌引起的水产动物传染性疾病的发生和蔓延的作用，降低水产动物死亡率。与相应的养殖池适配，适用于育苗和养殖水体中致病性弧菌的预防和防治。

Description

短小芽孢杆菌H2在预防和/或杀灭养殖水体弧菌中的应用

技术领域

本发明涉及一种短小芽孢杆菌H2和/或其菌剂的新用途，特别是涉及短小芽孢杆菌H2菌株和/或菌剂在预防和/或杀灭养殖水体弧菌中的应用。

背景技术

近十年来，大规模养殖在我国得到了迅猛的发展，养殖的品种已由一般品种向名特优品种过渡，养殖方式也由粗放向半精养、精养发展，但养殖生产模式基本上仍沿袭以往的静水、不排污的池塘养殖为主，养殖水体污染日益严重；同时工业废水、生活污水的排放也使养殖水域环境质量日益下降。这不仅直接危害养殖对象，而且也是疾病频繁发生的主要诱因。随着我国水产养殖规模的日益扩大，水产动物的病害成为了水产养殖业发展的瓶颈问题，水产动物传染性疾病蔓延越来越快，发病率越来越高，危害越来越严重。而致病性弧菌是水产动物传染性疾病中最主要的病原菌。目前在水产动物疾病防治中主要使用广谱抗生素，虽然使用抗生素能够有效地控制疾病的发生和蔓延，但是它干扰养殖环境中和水产动物肠道中有益微生物菌群的正常生长和繁殖，导致水产动物对病原微生物的易感性，更严重的是病原菌的耐药性增强。另外抗生素的使用还会导致其在水生动物体内的残留、富集，最终将危害人类的健康，因此使得水产品质量降低，成为了水产品销售量和出口贸易量的限制因素。为此人们提出了许多替代抗生素使用的方法，目前应用在水产养殖业生产上的主要有实用疫苗、免疫刺激剂和非特异性免疫增强因子、益生菌制剂等。益生菌通常是指在饲料中添加活的微生物，以改善宿主的肠道平衡。作为益生菌，其具有许多优点，如提高养殖动物的免疫力和产生抗菌的化合物抑制病原微生物生长等。目前的益生菌产品主要使用的是芽孢杆菌属。由于益生菌制剂无毒、无残留、不产生抗药性，并且作为病原生物的抑制剂能够有效地改善养殖生态环境，维持生态平衡，增强水产养殖动物的免疫力，近年来，人们开始尝试在养殖水体中施用益生菌(Probiotics)来改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫力，抑制病原微生物，从而减少疾病的发生。在欧美、日本以及印度尼西亚、泰国等国家的水产养殖业中.益生菌制剂得到日益广泛的应用，并已创造了巨大的经济效益，有望成为未来水产养殖动物病害防治的一个新方向。益生菌菌剂也可以说是在微生态理论的指导下，改善和调理微生态，保持微生态平衡，调试水产养殖生物环境，提高其健康水平或增进健康状态的益生菌(微生物)及其代谢产物和生长促进物质的制品。养殖生产上实际应用的微生态制剂应包括活菌体、死菌体、菌体成份、代谢产物及具有活性的生长促进物质等部分。

目前国内也发明了一些应用在水产养殖业生产上的芽孢杆菌菌剂，并申请了多个专利，如“百花山”净水宝，天辰渔肥等，但这些产品主要应用为养殖水体的水质调节，通过保持水体的微生态平衡，加强水体的循环、自净作用。但到目前为止，还没有专门针对用于控制由致病性弧菌引起的水产动物传染性疾病的微生物菌剂。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)H2于2003年9月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.1004，其菌种特征为：

1、菌落特征：

在LB平板上培养2天的菌落大小为直径3-4mm，菌落呈圆形，表面湿润，边缘整齐，凸出，白色。

2、细胞形态特征：

适宜于pH5-9范围内常温培养，其细胞为短杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢。细胞大小为0.5×2μm。

3、生理生化特征：

菌株H2为好氧菌，菌株H2能利用甘油，L-阿拉伯糖，D-核糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，D-甘露糖，甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷，甲基-α-D-甘露糖苷，N-乙酰氨基葡萄糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，七叶灵，柳醇，纤维二糖，麦芽糖，D蔗糖，D-海藻糖，菊糖，D-棉子糖，淀粉，肝糖，木糖醇，龙胆二糖，D-乳糖，D-松二糖，D-塔格糖，L-岩藻糖，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，产酸。不从其它碳源产酸。

API ZYM结果显示，菌株H2具有碱性磷酸盐酶、酯酶(C4)、类脂酯酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、β-葡萄糖甘酶等酶的活性，不具有类脂酶、α-半乳糖甘酶、β-半乳糖甘酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甘酶、β-岩藻糖甘酶等酶的活性

短小芽孢杆菌H2的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。

发明内容

本发明提供了一种短小芽孢杆菌H2(Bacillus pumilus H2)菌株和/或菌剂在预防和/或杀灭养殖水体弧菌中的应用。

本发明还提供了一种预防和/或杀灭养殖水体中弧菌的方法，是将短小芽孢杆菌H2菌剂接入养殖水体。

如上所述的方法，其中，所述短小芽孢杆菌H2菌剂是将短小芽孢杆菌H2菌株接入LB培养基中培养后获得的培养物。

所述LB培养基由下述物质组成：蛋白胨8-12质量份，酵母提取物和/或酵母浸膏4-6质量份，氯化钠8-12质量份，蒸馏水970-980质量份，NaOH调pH 7-7.5；优选的配方是：蛋白胨10质量份，酵母提取物和/或酵母浸膏5质量份，氯化钠10质量份，蒸馏水975质量份，用NaOH调pH 7.2。

短小芽孢杆菌H2的培养条件为温度28-32℃，振荡速度180-210rpm，培养时间1-3天；优选为30℃，振荡速度200rpm，培养时间2天。

短小芽孢杆菌H2的接种浓度为10⁴-10⁷CFU/mL，优选为10⁵CFU/mL。

短小芽孢杆菌H2菌剂在养殖水体中的接入浓度为10³-10⁴CFU/mL。

将上述短小芽孢杆菌H2菌株的培养物取出即为制成的菌剂。本发明提供的短小芽孢杆菌H2菌株和/或菌剂在养殖水体通常的育苗和养殖温度下即可产生拮抗弧菌的细菌素，抑制弧菌的生长和繁殖，能够起到有效地控制由致病性弧菌引起的水产动物传染性疾病的发生和蔓延的作用，降低了水产动物的死亡率。适用于育苗和养殖水体中致病性弧菌的预防和防治。

附图说明

图1短小芽孢杆菌H2菌剂上清液对需钠弧菌(V.natriegens)生长的抑制

图2接种短小芽孢杆菌H2菌剂后对凡纳滨对虾虾苗存活率的影响

具体实施方式

菌种扩大培养：现场实验视情况而定是否需要进行扩大培养，若需要扩大培养则使用如下培养基：葡萄糖0.5％，氯化铵0.5％，蛋白胨0.05％，磷酸盐0.03％，硫酸镁0.01％，海水配制(或以蒸馏水配制，按海水素的使用说明加入海水素)。按10％接种量接种，曝气培养，夏天室温、冬天控制扩大培养温度为20℃，1周为一个培养周期。

在扩大培养后，可通过直接向养殖池喷洒或与饲料混合后喷洒等方式对菌剂进行投喂，取一定体积的培养物接入养殖水体，使菌剂终浓度为10³-10⁴CFU/mL为宜。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、短小芽孢杆菌H2菌剂上清液对需钠弧菌FS-1(Vibrio natriegensFS-1，购自中国普通微生物菌种保藏中心)生长的抑制

一、短小芽孢杆菌H2菌剂上清液的制备：

将短小芽孢杆菌H2菌株接种到100mL的LB培养基中，28℃培养24h得到菌剂，将菌剂4000r/min离心10分钟，得到菌剂上清液，将该上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤。

二、菌剂上清液对需钠弧菌(Vibrio natriegens)FS-1生长的抑制作用：

一组试验是将需钠弧菌在28℃ LB培养基中培养48h，然后在1mL新鲜的LB培养基中加入菌剂过滤上清液1mL，再接种50μL的需钠弧菌FS-1；另一组接种需钠弧菌FS-1(50μL)至2mL LB液体培养基中作为对照，放入摇床28℃培养，每组试验三个平行。使用600nm处的吸光度OD₆₀₀来表示需钠弧菌的生长量，分别在24h，48h，72h和96h对需钠弧菌FS-1的OD₆₀₀值进行测定，结果如图1。

结果表明，加入短小芽孢杆菌H2菌剂过滤上清液的实验组对需钠弧菌FS-1的生长具有一定抑制作用，需钠弧菌FS-1的生长量小于对照实验组。

实施例2接种菌剂后对凡纳滨对虾虾苗存活率的影响

取240支大试管，分成4个试验组，每组60支，再将每个试验组分为三个平行组，每个平行组20支。所有试管全部加入5ml无菌生理盐水，试验组1为空白对照组，只有无菌生理盐水；试验组2加入了1mL短小芽孢杆菌H2菌剂，终浓度为6×10⁷CFU/mL；试验组3加入了1mL需钠弧菌FS-1菌株，终浓度为5.83×10⁷CFU/mL；试验组4加入了0.5mL短小芽孢杆菌H2菌剂和0.5mL需钠弧菌FS-1菌株。取240尾对虾虾苗(体长约1cm)随机分别放入上述试管中，每试管一只。28℃下避光孵育72h，每隔8h统计各组虾苗的存活率。

如图2所示：试验组3所有虾苗全部死亡需要16h，时间明显短于试验组1，即空白对照组的32h；试验组4所有虾苗全部死亡需要48h；试验组2所有虾苗全部亡则需要72h。表明：短小芽孢杆菌H2菌剂维持了虾苗在不增加食物和氧气的条件下生存了72h，有利于虾苗的存活，对虾苗存在有一定的保护作用。

实施例3、短小芽孢杆菌H2菌剂的制备及其对南美凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)死亡率的影响

一、短小芽孢杆菌H2菌剂的制备

短小芽孢杆菌H2(CGMCC 1004)菌株采用LB培养基培养，培养基配方如下：

蛋白胨10g，酵母提取物(或酵母浸膏)5g，NaCl 10g，蒸馏水975ml，用NaOH调pH 7.2。

将上述菌种接种在LB培养基中，接种浓度为10⁵CFU/mL，培养温度为30℃，摇床振荡速度为200rpm，好气培养2天。

二、需钠弧菌FS-1(Vibrio natriegens FS-1，购自中国普通微生物菌种保藏中心)的培养

将需钠弧菌FS-1在LB培养基中28℃培养24h，接种浓度为10⁵CFU/mL。

三、南美凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖：

南美凡纳滨对虾取自江苏赣榆育苗场，体长1-2cm，取自育苗场的虾苗，先暂养7天，然后移至实验虾池中，虾池的长×宽×高＝49×49×48cm，有效水体为96L，每个实验缸的放养量为100尾，约1000尾/m³水体。对照组和实验组饲喂相同颗粒饲料(“统一牌”凡纳滨对虾配合饲料2号)，每天2次，每次0.34g/池(分别在8:00和20:00)。主要营养成分为：水分12％、粗蛋白42％、粗脂肪4％、粗灰分16％、粗纤维5％、钙3.5％、总磷1％、赖氨酸2％等。

四、虾池实验：

随机选定16个虾池，分为4组，每组4个虾池：

每组的1号虾池既不接种菌剂，也不接种需钠弧菌，为空白对照；

每组的2号虾池接种短小芽孢杆菌H2菌剂，终浓度为10³CFU/mL，在不换水的情况下，维持2周，每隔7天接种一次菌剂，在2周后，接种需钠弧菌FS-1，终浓度为10⁴CFU/mL；

每组的3号虾池接种短小芽孢杆菌H2菌剂，终浓度为10⁴CFU/mL，在不换水的情况下，维持2周，每隔7天接种一次菌剂，在2周后，接种需钠弧菌FS-1，终浓度为10⁴CFU/mL；

每组的4号虾池只接种需钠弧菌FS-1，终浓度为10⁴CFU/mL。

分别考察以上16个虾池中对虾的抗病效果，统计结果如下表1。

表1 加入两种浓度的短小芽孢杆菌H2对凡纳滨对虾生长的影响

序列表

<160>1

<210>1

<211>1484

<212>DNA

<213>短小芽孢杆菌H2(Bacillus pumilus H2)

<400>1

gacgggtgcg tgcgtctata ctgcgagtcg agcggacaga agggagcttg ctcccggatg     60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg    120

ggaaaccgga gctaataccg gatagttcct tgaaccgcat ggttcaagga tgaaagacgg    180

tttcggcgtg tcacttagca gagtcaagga ccagcgttcg gtcagtacat tacggccata    240

gttgtgtggg gtaatggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg    300

gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc    360

cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt    420

aaagctctgt tgwtagggaa gaacaagtgc gagagtaact gctcgcacct tgacggtacc    480

taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc    540

gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa    600

gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggag    660

agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa    720

ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt    780

agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc    840

cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa    900

actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca    960

acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggctttccc   1020

ttcggggaca gagtgacagg tggtgcatgc ttgtcgtcag cccgtggtcg tgagatgtag   1080

ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttggttg ccagcattta gttggtcact   1140

ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc   1200

ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggctg cgagaccgca   1260

aggtttagcc aatcccataa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc   1320

gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc    1380

cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgcaaca cccgaagtcg gtgaggtaac    1440

ctttatggag ccagccgctg aatatgtaca gagggattat attg                     1484

Claims (10)

1.短小芽孢杆菌H2(CGMCC No.1004)和/或其菌剂在预防和/或杀灭养殖水体弧菌中的应用。

2.一种预防和/或杀灭养殖水体中弧菌的方法，是将短小芽孢杆菌H2和/或其菌剂接入养殖水体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌H2菌剂是将短小芽孢杆菌H2接入LB培养基培养后获得的培养物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB培养基由下述物质组成：蛋白胨8-12质量份，酵母提取物和/或酵母浸膏4-6质量份，氯化钠8-12质量份，蒸馏水970-980质量份，用NaOH调pH 7-7.5。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述LB培养基由下述物质组成：蛋白胨10质量份，酵母提取物和/或酵母浸膏5质量份，氯化钠10质量份，蒸馏水975质量份，用NaOH调pH 7.2。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌H2的培养条件为温度28-32℃，振荡速度180-210rpm，培养时间1-3天。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌H2菌剂的培养条件为温度30℃，振荡速度200rpm，培养时间2天。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌H2在LB培养基中的接种浓度为10⁴-10⁷CFU/mL。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌H2在LB培养基中的接种浓度为10⁵CFU/mL。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌H2菌剂在养殖水体中的接入浓度为每mL养殖水体10³-10⁴CFU。

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