CN115353210A - 短小芽孢杆菌lzp02在处理养猪废水中的应用 - Google Patents

短小芽孢杆菌lzp02在处理养猪废水中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了短小芽孢杆菌LZP02在处理养猪废水中的应用。所述的短小芽孢杆菌LZP02保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2018598。本发明将不同种类的有益微生物接种于养猪废水用以筛选得到在养猪废水中生长且繁殖速度较快的菌种短小芽孢杆菌LZP02，并检测其对养猪废水中营养成分的利用情况，以及对养猪废水中污染物的降解情况，结果发现LZP02能在原始养猪废水培养基中进行生长且生物量较高，使用优化碳氮比的养猪废水培养基接种LZP02后生物量提升显著。LZP02菌株在优化碳氮比的养猪废水培养基中进行发酵对COD、氨态氮具有较好的去除率，本发明的提出一方面降低了养猪废水对环境污染的可能性，另一方面也更有利于养猪废水的资源化利用。

Description

短小芽孢杆菌LZP02在处理养猪废水中的应用
技术领域
本发明涉及一种可用于处理养猪废水的微生物菌株，特别涉及短小芽孢杆菌LZP02在处理养猪废水中的应用，还涉及一种处理养猪废水的方法。本发明属于农业生产技术领域。
背景技术
中国是世界上最为庞大的生猪规模化养殖与消费产业国家之一。随着经济不断发展，生猪养殖产业链规模不断扩大，根据2016年中国统计年鉴，在2015年我国猪肉年产量5486.5万吨，生猪养殖规模十分巨大(国家统计局，2016)，，而产生的禽畜粪便也已经成为一大主要污染源，随之带来的环境污染问题也越来越凸显。我国禽畜粪便总体产生量现已达到2.43x108吨，尿液为1.63x108吨，总氮为1.02x106吨，总磷为1.60x105吨(潘庆，2002)，COD排放量已经达到7118万吨，远远超过工业废水以及生活废水COD的排放量之和，由于大部分生猪养殖场都采用冲水进行猪舍清洁，因此猪场废水猪尿与粪便等相互混杂，废水中氨态氮含量、磷含量、悬浮物以及有机物浓度高且碳氮比严重失衡，如果不经过处理的大量排放对湖泊、河流、农田等环境当中对导致水体富养化、土壤性质改变等一些列污染问题。
现如今国内外的养猪废水处理技术主要集中于三大类方式分别为物化处理技术、自然处理技术以及生物处理技术。其中物化处理法使用较多的方法是介质吸附法、絮凝沉淀法等，如钱峰等利用沸石-稻草组合进行猪尿废水过滤，COD、氨态氮以及磷的去除率分别能达到47.9％、72.9％以及50.1％(钱锋，2008)，像崔丽娜等人通过磁絮凝法能够对COD浓度为3232mg/L的养猪废水去除61.02％ (崔丽娜，2010)。尽管物化法对猪尿废水有较好的污染物去除率，但其对猪尿废液污染去除广谱性较低、去除污染物成本较高、处理设备投入较大、工程应用较少等弱势。而自然处理法一般是利用天然的土壤、水体以及生物进行综合作用来进行污染物的去除，像是朱夕珍等通过高炉渣和石英砂等基质进行人工湿地构建对COD、BOD、磷的去除率分别达到71％-88％、80％-89％、70％-85％(朱夕珍， 2003)，以及鲁秀国等利用氧化塘处理养猪废水COD≤400mg/L、氨态氮≤70mg/L (鲁秀国，2009)。自然处理法对污染废水的去污能力也较为不错，但稳定性不足，并且净化时间较长。生物处理技术则是一种运用微生物的催化作用来处理高浓度有机废水的新型方法，像是梁美东等使用SRB反应器进行曝气处理养猪废水能够将COD的去除率增加至90％以上(梁美东，2009)，李锋民等采用好氧-厌氧联合处理法能够使氨态氮和总氮的去除率达到99.7％与50.7％(李锋民，2011)。但是通过生物处理法对废水进行处理的过程中会产生大量的活性污泥无法进行处理对环境造成二次污染。
但尽管养猪废水对环境会造成一系列的污染，但不可否认其本身含有大量有机质，氮、磷、钾等营养元素，而这些元素也同样是微生物的生长所必须的，对提升微生物的数量和质量都具有积极意义。如果以养猪废水作为基础培养基进行有益微生物发酵生产即可大大降低微生物菌肥的生产成本又可通过生物降解减轻污染问题，这样就能使废水变废为宝，实现其剩余价值，并且还可节约大量用于治理环境污染的资源，对环境污染物的无害化资源利用的推进具有十分重要意义。
因此，本发明将不同种类的有益微生物接种于养猪废水用以筛选得到在养猪废水中生长且繁殖速度较快的菌种，并检测其对养猪废水中营养成分的利用情况，以及对养猪废水中污染物的降解情况，并对养猪废水的发酵体系与流程进行探索，为养猪废水无害化资源利用提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种可用于处理养猪废水的微生物菌株；
本发明的目的之二在于提供一种处理养猪废水的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明将不同种类的有益微生物接种于养猪废水用以筛选得到在养猪废水中生长且繁殖速度较快的菌种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LZP02(CCTCC NO：M2018598)，并检测其对养猪废水中营养成分的利用情况，以及对养猪废水中污染物的降解情况，结果发现LZP02能在原始养猪废水培养基中进行生长且生物量较高，使用优化碳氮比的养猪废水培养基接种LZP02后生物量提升显著，最高活菌数为4.07×1010cfu/mL。LZP02菌株在优化碳氮比的养猪废水培养基中进行发酵对COD、氨态氮具有较好的去除率，COD去除率为92.25％、氨态氮去除率为91.11％，对养猪废水磷含量的去除较小，去除率为25.63％，且能够有效调节原始养猪废水的pH值，一方面降低了发酵废液对环境污染的可能性，另一方面也更好的提升了养猪废水的资源化利用。
在上述研究的基础上，本发明首先提出了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LZP02在处理养猪废水中的应用，所述的短小芽孢杆菌LZP02命名为Bacillus pumilusLZP02，分类命名分别为Bacillus pumilus LZP02，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国.武汉.武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2018598，保藏时间为2018年9月6日。
其中，优选的，将短小芽孢杆菌LZP02的种子液接种于已灭菌的待处理养猪废水中，经过发酵即可获得处理后养猪废水，经处理后的养猪废水相较于处理前污染物含量有所下降。
其中，优选的，还包括向已灭菌的待处理养猪废水中加入红糖的步骤，使得养猪废水的碳氮比为16-20：1。。
其中，优选的，所述的发酵是指于30℃，120r/min下发酵培养24-96h。
其中，优选的，经处理后的养猪废水相较于处理前总氮、总碳、总有机碳、 COD、氨态氮、磷的含量均有所下降。
进一步的，本发明还提出了一种处理养猪废水的方法，包括以下步骤：
(1)将短小芽孢杆菌LZP02接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行活化，将活化后菌株复接于牛肉膏蛋白胨培养基中然后使用无菌水将菌株浓度调节为 OD600＝1.0作为种子液；所述的短小芽孢杆菌LZP02保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCCNO.M 2018598；
(2)将种子液接种于已灭菌的待处理养猪废水中，经过发酵即可获得处理后养猪废水，经处理后的养猪废水相较于处理前污染物含量有所下降。
其中，优选的，步骤(2)中还包括向已灭菌的待处理养猪废水中加入红糖的步骤，使得养猪废水的碳氮比为16-20：1。
其中，优选的，步骤(2)中是将种子液按1-2vol％的接种量接种于已灭菌的待处理养猪废水中。
其中，优选的，步骤(2)中所述的发酵是指于30℃，120r/min下发酵培养24-96h。
其中，优选的，经处理后的养猪废水相较于处理前总氮、总碳、总有机碳、 COD、氨态氮、磷的含量均有所下降。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明虽然以生物处理法作为基础，但在养猪废水处理的同时利用养猪废水中的丰富营养实现了有益微生物的大量繁殖，借以获取有益微生物菌体进行微生物菌剂的制作，在去除污染物保护环境的同时创造经济价值。本发明筛选得到活菌数较高的有益微生物LZP02，在作物促生方面均效果优异，活菌数最高能达到 4.07×1010cfu/mL，在污染物的去除上效果良好有机质去除率89.86％，COD去除率92.25％，氨态氮去除率91.11％。由此证明本发明的方法对养猪废水的去污能力不弱于国内外主流的物化处理技术、自然处理技术以及传统生物处理技术达到的效果甚至更好，并且对养猪废水中的污染物去除的种类更全面，具有较高的广谱性；通过微生物发酵来进行养猪废水处理在去污成本上更为低廉，设备投入资金少，无需大量场地，去污周期短，能靠近源头快速搭建小型发酵设备进行养猪废水处理，小型企业也同样可以负担体系构建成本。总之，本发明建立了一种生态保护-农业发展的良性循环体系，符合我国可持续发展战略大方向。
附图说明
图1为LZP02菌株在原始与优化碳氮比后的养猪废水中生物量随时间的变化；
图2为经LZP02处理后原始(B)与优化后养猪废水(C)总氮含量变化及下降率(A)比较；
图3为经LZP02处理后原始(B)与优化后养猪废水(C)总碳含量变化及下降率(A)比较；
图4为经LZP02处理后原始(B)与优化后养猪废水(C)总有机碳含量变化及下降率(A)比较；
图5为LZP02发酵液上清液中总氮、总碳、总有机碳的下降率比较；
图6为LZP02在优化培养基中随发酵时间的pH(A)与COD(B)的变化；
图7为LZP02对氨态氮与磷含量的去除率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1菌株的筛选及其在养猪废水处理中的应用
1材料与方法
1.1原始养猪废水理化特性及试验菌株来源
试验所用养猪废水取自齐齐哈尔市富拉尔基区某养猪场，采集后的养猪废水存放于4℃条件下进行保存以待后续实验，养猪废水基本特性为总氮403.2mg/L、总碳981.6mg/L、总有机碳361.9mg/L、磷含量48.66mg/L、氨态氮315.98mg/L、 pH 8.85。本试验所用菌株均为课题组分离筛选得到的不同种类的纯培养高效农业微生物，经研究发现各菌种均为在植物促生、生物防治、污染物防治等方面具有较好工业化应用潜力高效菌种，于-80℃冰箱中保存待用，所有菌株均经过菌株形态与16SrDNA分类鉴定，鉴定列表如表1所示。
表1供试菌株
Figure BDA0003494233980000051
1.2培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10.00g，牛肉膏3.00g，NaCl 5.00g，琼脂 20.00g，蒸馏水定容至1000.00mL，液体培养基不加琼脂。
原始养猪废水培养基：猪场的运输来的养猪废水。
优化碳氮比的养猪废水培养基：红糖10g，养猪废水定容至1000.00ml，使得养猪废水的碳氮比为16-20：1。
1.3养猪废水高效降解菌株初筛
将表1的供试菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行活化。将活化后菌株复接于牛肉膏蛋白胨培养基中然后使用无菌水将各菌株浓度调节为OD600＝1.0作为种子液用于养猪废水的处理试验。
为了筛选能够在养猪废水中大量生长的菌株，将不同菌株的种子液按1vol％接种量分别接种于装有100mL已灭菌养猪废水的三角瓶中，于30℃，120r/min摇瓶培养，每24h对发酵液进行取样，检测各个时间段的活菌数确定菌株最大活菌量。活菌数通过稀释涂布法进行确定，设三组平行。而后挑选发酵生物量较高的菌种进行后续实验。
1.4筛选菌种对养猪废水资源化利用效果探究
1.4.1各筛选菌种在原废水与碳氮比优化废水中的随时间生长情况及处理效果的变化
由于原始养猪废液的碳氮比有可能会抑制菌体生长繁殖降低养猪废水的处理效果，因此对养猪废水培养基进行适当的碳氮比优化用以提高生物量。将筛选菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基制作种子液，按2vol％的接种量分别接种于300mL的原始养猪废水培养基以及添加1wt％红糖的优化培养基中，在30℃， 120r/min摇瓶培养，每24h对样品进行取样测定各项指标。
1.4.2经筛选菌株处理的优化碳氮比养猪废水离心后的处理效果
为模拟工业化生产过程中在获取菌体之后经菌种处理的养猪废水是否能够进一步的降低环境威胁潜力，本实验通过对不同发酵时间的样液离心后进行指标检测。将筛选菌种的种子液接种于优化培养基中，在于30℃，120r/min摇瓶培养，每24h对样品进行取样，并在12000rpm的条件下离心5min，而后进行指标测定。
1.5试验测定指标
1.5.1水质指标
对样品进行COD、pH、总氮、总碳、总有机碳、氨态氮、磷含量的测定。
1.5.2微生物指标
将10mL的发酵液放入到90mL无菌水于200r/min的摇床中震荡30min，而后进行梯度稀释，得到10-7、10-8、10-9浓度的稀释液，而后取0.1mL稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，30℃培养24h，计算活菌数(cfu/mL)，设三组平行。
2.结果与讨论
2.1养猪废水处理菌株筛选
通过检测养猪废水中各菌种活菌数最大含量以达到对不同菌株进行筛选的目的，通过使用养猪废水对各有益菌株进行培养发现LZP02能够在养猪废水中进行生长且具有较高的生物量，最大活菌数为2.08×1010cfu/mL。
2.2 LZP02在原始与优化后的养猪废水培养基中随时间菌体生长情况比较
为确定LZP02在不同培养基中生物量随时间的变化情况，分别接种于原始以及优化后的养猪废水培养基中每24h进行活菌数测定。由图1可知LZP02在原始培养基中培养48h达到最大活菌数2.08×1010cfu/mL，在优化后的养猪废水培养基中活菌数为4.07×1010cfu/mL，生物量提升了48.89％。
2.3 LZP02在原始与优化后的养猪废水培养基中总氮、总碳和总有机碳的变化情况
2.3.1 LZP02在原始与优化后的养猪废水培养基中总氮的改变
将LZP02分别接种于原始养猪废水培养基与优化后的养猪废水培养基，每 24h对发酵液进行总氮测定。由图2可知，在原始养猪废水接种LZP02菌株后发酵液总氮的含量随着菌株发酵时间的增加普遍呈现不断下降趋势，在培养96h时 LZP02发酵液的总氮含量均下降到最低值为154.9mg/L，相较于对照组而言总氮含量下降了61.58％。当对养猪废水进行碳氮比调节优化后LZP02发酵液同样随着发酵时间的延长总氮含量呈现总体下降的趋势，并且在0-24h的发酵区间内总氮含量快速下降，而后趋于平缓，LZP02培养72h后总氮含量达到最小值128.7 mg/L，相较于对照组LZP02总氮下降了61.47％。通过比较可以发现LZP02在原始与优化后的养猪废水培养基中其发酵液总氮的下降率无显著性差异。
2.3.2 LZP02在原始与优化后的养猪废水培养基中总碳处理情况比较
将LZP02分别接种于原始以及优化后的养猪废水培养基，每24h对发酵液进行总碳测定。如图3所示，LZP02菌株接种于原始养猪废水培养基后，发酵液中总碳的含量随着培养时间的增加呈现缓慢下降而后趋于稳定的趋势，LZP02发酵液总碳含量下降到的最低值为760.8mg/L，相较于对照组而言，筛选菌株LZP02 发酵液的总碳下降率为22.49％。将筛选菌株接种于优化后的养猪废水培养基后，其发酵液中总碳的含量随着培养时间的提升不断下降且速度较快最终趋于缓慢下降，培养96h后各菌株发酵液总碳含量达到最小值1680mg/L，总碳下降率相较于对照组而言降低了67.38％。LZP02在优化后的养猪废水培养基中培养，其发酵液中总碳含量下降率相较于在原始养猪废水中的总碳下降率显著提高。
2.3.3 LZP02在原始与优化后的养猪废水培养基中总有机碳处理情况比较
由图4可知，接种LZP02菌株后，原始养猪废水发酵液中的总有机碳含量随着菌体培养时间的增加呈现先增加后减少的趋势，相较于对照组而言LZP02发酵后的总有机碳最低值含量为309.3mg/L，总有机碳下降率为14.53％，而将LZP02 接种于优化碳氮比后的培养基中，发酵液总有机碳含量随培养时间延长不断下降在96h时达到最小值，相较于对照组LZP02下降率达到81.29％，相比于原始养猪废水培养基而言优化后的养猪废水培养基对总有机碳的消耗量以及消耗速度更为迅速。
2.4经LZP02处理的养猪废水去除菌体后发酵废液各指标的变化
通过比较发现对LZP02菌株在优化碳氮比后的养猪废水培养基中能够更好的生长繁殖，因此选择优化碳氮比后的养猪废水作为有益微生物工业化发酵的基础培养基，同时为了模拟在工业生产过程中LZP02在养猪废水中发酵并收获菌体后能否更好的降低其滤出的发酵废液对环境的潜在威胁，因此本试验通过高速离心法对菌株发酵液中的菌体进行去除并测定上清液中总氮、总碳、总有机碳、COD、氨态氮、磷的变化情况。
2.4.1 LZP02在优化后的养猪废水培养基中总氮、总碳以及总有机碳含量的变化
将LZP02接种于优化后的养猪废水培养基中每24h对离心后的上清液进行总氮、总碳和总有机碳测定。由图5可知，相较于对照组而言离心后的LZP02发酵液上清液中总氮含量下降了93.40％，总碳含量降低了84.72％，而总有机碳的含量降低了89.86％，这表明LZP02菌株能较好的利用养猪废水中的营养成分进行自身的生长繁殖与代谢活动，防止滤出的发酵废液富营养造成环境污染。
2.4.2 LZP02在优化后的养猪废水培养基中pH以及COD变化
对LZP02发酵液每24h进行pH测定，由图6可知养猪废水经过LZP02菌株发酵96h后其pH由原始pH＝8.85的碱性溶液降低为pH＝7.37的中性发酵液，这可能是由于在发酵过程中菌株在碱性的养猪废水中通过利用养猪废水的营养物质进行自身生长时会分泌一定量的有机酸从而将高碱性的养猪废水的pH值降低。
为确定筛选菌株对养猪废水COD去除效果，对LZP02发酵液上清液进行 COD检测，由图6可知随着菌株发酵时间的不断增加，其COD含量不断快速下降，最大COD去除率达到92.25％，说明LZP02对COD具有较好的去除率。
2.4.3 LZP02在优化后的养猪废水培养基中对氨态氮以及磷的去除率
对LZP02不同发酵时间的发酵液上清液进行氨态氮含量测定，由图7可知 LZP02菌株能大幅度的降低发酵废液中氨态氮的含量，对氨态氮的去除率达到 91.11％，对氨态氮去除效果比较好。同样对发酵液上清液进行磷含量测定发现相较于对照组LZP02对磷的去除率可达到25.63％，去磷效果一般。
3结论
(1)LZP02能在原始养猪废水中进行生长且生物量较高，使用优化培养基接种LZP02后生物量提升显著，最高活菌数为4.07×1010cfu/mL。
(2)LZP02菌株在优化碳氮比的养猪废水培养基中进行发酵对COD、氨态氮具有较好的去除率，COD去除率为92.25％、氨态氮去除率为91.11％，对养猪废水磷含量的去除较小，去除率为25.63％，且能够有效调节原始养猪废水的pH 值，降低了发酵废液对环境污染的可能性，更好的提升养猪废水的资源化利用。

Claims (10)

1.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LZP02在处理养猪废水中的应用，所述的短小芽孢杆菌LZP02保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2018598。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将短小芽孢杆菌LZP02的种子液接种于已灭菌的待处理养猪废水中，经过发酵即可获得处理后养猪废水，经处理后的养猪废水相较于处理前污染物含量有所下降。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括向已灭菌的待处理养猪废水中加入红糖的步骤，使得养猪废水的碳氮比为16-20：1。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵是指于30℃，120r/min下发酵培养24-96h。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，经处理后的养猪废水相较于处理前总氮、总碳、总有机碳、COD、氨态氮、磷的含量均有所下降。
6.一种处理养猪废水的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将短小芽孢杆菌LZP02接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行活化，将活化后菌株复接于牛肉膏蛋白胨培养基中然后使用无菌水将菌株浓度调节为OD600＝1.0作为种子液；所述的短小芽孢杆菌LZP02保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M2018598；
(2)将种子液接种于已灭菌的待处理养猪废水中，经过发酵即可获得处理后养猪废水，经处理后的养猪废水相较于处理前污染物含量有所下降。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中还包括向已灭菌的待处理养猪废水中加入红糖的步骤，使得养猪废水的碳氮比为16-20：1。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中是将种子液按1-2vol％的接种量接种于已灭菌的待处理养猪废水中。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的发酵是指于30℃，120r/min下发酵培养24-96h。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，经处理后的养猪废水相较于处理前总氮、总碳、总有机碳、COD、氨态氮、磷的含量均有所下降。
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