CN103045498B

CN103045498B - 解淀粉芽孢杆菌及其用途

Info

Publication number: CN103045498B
Application number: CN201210382963.3A
Authority: CN
Inventors: 李卫芬; 邓斌; 张小平; 黄琴; 姚江涛; 余东游
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2032-10-10
Also published as: CN103045498A

Abstract

本发明涉及一种有抑菌效果和提高动物免疫能力的解淀粉芽孢杆菌的筛选及应用。本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏名称：解淀粉芽孢杆菌 SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年7月11日，保藏号：CCTCC No: M2012280。解淀粉芽孢杆菌 SC06接种于LB液体培养基中培养后，离心取菌泥，干燥至恒重，与玉米淀粉等混合后制成干菌粉；在动物的常规饲料中添加上述干菌粉，喂食动物；从而实现用于抑菌或者用于提高动物的免疫能力，动物是指水生动物或畜禽。

Description

解淀粉芽孢杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及一种有抑菌效果和提高动物免疫能力的解淀粉芽孢杆菌的筛选及应用。

背景技术

我国作为世界水产大国，也是世界上唯一水产养殖产量高于捕捞产量的国家，2002年水产养殖产量高达2770万吨，约占世界水产养殖总产量的70％，这主要得益于我国水产养殖集约化程度的不断提高。水产养殖已成为我国渔业发展的重点，是我国大农业中发展较快、活力较强、经济效益较高的产业之一。伴随着我国水产养殖业的迅猛发展，各类水产病害亦迅猛增长，据不完全统计，目前水产养殖病害在300种以上，每年约有1/10 的养殖面积发生病害，年损失产量占养殖总产量的15 %～30 % ，经济损失高达数百亿元，水产动物病害已成为影响我国水产养殖业发展的主要制约因素（黄艳平等，2004）。

针对水产养殖业病害爆发频率的加剧，抗生素作为重要的抗细菌性疾病的药物，在水产养殖上得到广泛应用。如用青霉素和硫酸链霉素治疗亲鱼产后受伤引起感染及罗非鱼的溃烂病、赤皮病、打印病；用庆大霉素治疗草鱼“三病”（肠炎病、烂鳃病、赤皮病）；用红霉素治疗球菌引起的感染和虹鳟鱼的细菌性肾脏疾病等都收到良好的效果；加氯霉素可以抑制淡水养殖中的致病性气单胞菌，氟喹诺酮类抗菌素可以抑制海水养殖中致病性弧菌。这在一定程度上极大地促进了水产养殖业的发展。但同时，养殖水体中长期使用抗生素已引发一系列环境和社会问题，尤其是过量的使用抗生素使水体微生物选择压力增大，一方面导致抗药微生物滋生，可改变水体微生物群落结构，恶化水体的适养性，另一方面引起水产动物体内菌群失调，易引发内源性、外源性和二重感染(胡彩红, 2005)。因此，限制和减少抗生素类药物在水产养殖水体中的使用，寻找抗生素的替代品已经成为水产养殖业发展的必然趋势。

益生菌不仅可避免抗生素的副作用、达到防治疾病的效果，而且能促进动物生长。近年来，益生菌作用抗生素类药物的替代物，在养殖业得到广泛的关注。现代微生态学研究表明，微生物在水产养殖中占有重要的地位，直接影响产量、物质循环、动物营养、水质、疾病控制及养殖水环境(Moriarty, 1998)。随着微生物学和微生态学的深入研究，利用益生菌来调节动物体内生态环境、改善养殖生态环境、增强机体免疫功能、抑制病原微生物、减少疾病发生，正逐渐成为各国研究热点。由于益生菌制品没有残留，也不会产生抗药性，在中国、印度等水产养殖大国得到广泛的应用，并主张用其替代抗生素。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌有抑菌效果和提高动物免疫能力。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，保藏名称：解淀粉芽孢杆菌 SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年7月11日，保藏号：CCTCC No: M2012280。

本发明还同时提供了上述解淀粉芽孢杆菌的用途，用于抑菌或者用于提高动物的免疫能力。

作为本发明的解淀粉芽孢杆菌的用途的改进：动物为水生动物或畜禽。

本发明以SC06菌株总DNA为模板，使用通用引物：

上游引物（P1）：5’－AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT －3’

下游引物（P6）：5’－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC －3’；

进行 PCR扩增获得的16s rDNA部分序列；通过Blast与GenBank收录的细菌16s rDNA基因序列比对，发现SC06菌株与解淀粉芽孢杆菌的同源性为99%。

本发明的解淀粉芽孢杆菌可作为益生菌用于提高水生动物、畜禽生长，并提高其抗氧化和免疫功能。

本发明的解淀粉芽孢杆菌实际使用时，可采取向水中投放解淀粉芽孢杆菌 SC06的方法，一般控制解淀粉芽孢杆菌 SC06在水体中的浓度为0.5~5×10⁷CFU/mL；也可在每克常规水生动物/畜禽基础日粮中添加解淀粉芽孢杆菌 SC06 0.5~5×10⁵CFU。本发明的解淀粉芽孢杆菌也可先制成干菌粉，再进行如上操作。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是SC06的扫描电镜图片；

图2是SC06对甲鱼生长的影响对比图。

具体实施方式

实施例1、解淀粉芽孢杆菌SC06的获得

1）、制备稀释液：

称取土壤（采自杭州郊区蔬菜地）2g，放入l00ml无菌水中，用高速组织捣碎机捣碎。无菌操作吸取捣碎液1.0ml加入9.0ml无菌水中，再用无菌水稀释为10^-1、10^-2，10^-3、10^-4、10^-5、10 ^-6、10^-7共七个浓度梯度。

2）、培养：

取各浓度的稀释液100ul 分别涂布于LB培养基平板（蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，琼脂16g/L，其余为水；用10mol/L NaOH调节pH7.0，121℃灭菌20分钟），晾干后倒置恒温箱内30℃培养。

3）、菌株的分离、纯化：

在LB培养基上于30℃培养 48 h，即有菌落出现。用接种针挑取单个菌落，在LB培养基平板表面连续划线培养，选择那些形态不一样的菌落，重复几次后便可形成单独孤立的菌落，因而获得纯培养菌株。

4）、不同时间抑菌效果测定：

将每个单菌落活化后分别置于50ml胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptone soya Broth，TSB，购自杭州微生物试剂厂公司)中培养，初始接种浓度为1.0×10⁶ CFU/mL，24h后调整各菌液至1.0×10⁹CFU/mL备用。LB培养基平板高温灭菌（121℃灭菌20分钟）后，冷却至50-60℃后，按照1％（体积比）的接种量加入一种病原性细菌菌液（培养16h的嗜水气单胞菌（Aeromonas HydroPhila ATCC 14715）、副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus ATCC 27519）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens ATCC 13525）），倒平板，放置无菌室约1h，倒置放于4℃冰箱中1h，用直径0.25cm打孔器在平板表面均匀的打孔，然后按照每孔10μl的加样量加入被筛选菌株菌液，在30℃培养，每隔3h取样，测定24h内的抑菌圈直径变化，每个平皿设3个重复。挑选出对所试3株病原性细菌的总抑制效果最佳的菌落，命名为SC06。SC06对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌抑制效果最为明显，12h抑菌环平均直径分别为16.2和13.1mm，对荧光假单胞菌12h抑菌环平均直径为9.4mm。

5）、SC06拮抗性测定：

将菌株SC06在LB液体培养基(蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，其余为水；用10mol/L NaOH调节pH7.0，121℃灭菌20分钟)30℃进行培养，每隔3h取样，测定其OD600。结果显示，SC06生长较快，18h的OD₆₀₀为1.72±0.16。

6）、共凝集试验

参照Chabrillon M., et al 2005方法并稍作修改进行。于LB液体培养基中接种病原性细菌和被筛选细菌，30℃过夜培养，测定其OD600，并将其OD稀释至0.5，然后取菌株SC06和病原性细菌各1.5ml于无菌具塞试管中，涡旋振荡混匀，30℃静置培养4h后测定OD₆₀₀。3.0ml的病原性细菌或被筛选细菌30℃静置培养4h作为对照管。其共凝集率表示：共凝集率＝[(SC+LC)/2-(S+L)/( SC+LC)/2]×100（SC和LC：对照管病原细菌和益生菌的终OD600；L+S：试验管终OD600）。结果发现，SC06对3株病原性细菌均具有较好共凝集效果，对A. hydroPhila、P. flurorescens、V. Parahaemolyticus的共凝集率分别为30.42％、41.20％、39.20％。

备注说明：病原性细菌是指嗜水气单胞菌（Aeromonas HydroPhilaATCC 14715）、副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus ATCC 27519）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens ATCC 13525）。

7）、菌种鉴定：

（1）形态特征

在液体培养基中呈均匀混浊并伴有微量沉淀，轻轻摇动沉淀即散开。在营养琼脂平板上菌落SC06直径为2.0～3.0mm，平台状，边缘整齐，不透明，有光泽，无色素，质地较软。SC06在扫描电镜的形态如图1。SC06首尾相连，形成链状。

（2）16S rRNA序列分析

对分离筛选到的菌株SC06进行进一步的16S rRNA序列分析与比对。根据细菌16S rDNA的保守序列设计一对引物，

上游引物（P1）：5’－AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT －3’

下游引物（P6）：5’－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC －3’

由上海生工合成。PCR扩增分别以筛选得到的菌株为模板。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性50s，52℃退火1min，72℃延伸1min 30s，反应30个循环。

目的片断按照常规方法（Sambrook, et al., 2001）进行克隆和序列测定，测定结果与GenBank中所登录的16S rRNA序列（登录号：NC_017912.1、NC_017061.1 和 NC_016784.1等）进行比对分析，基因同源性达到99%以上。根据《Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology》（Holt, J.G., Gibbons, N.E., 1994）和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英等，2001），通过性态特征和16S rRNA序列分析，确定菌株SC06为解淀粉芽孢杆菌。

将该菌株进行保藏，保藏名称为：解淀粉芽孢杆菌 SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年7月11日，保藏号：CCTCC No: M 2012280。

实施例2、解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法：

解淀粉芽孢杆菌 SC06接种于LB液体培养基中，30℃培养20小时后，离心取菌泥，60度恒温干燥至恒重、与玉米淀粉按4:1的重量比（即，玉米淀粉：恒温干燥后的菌泥=4:1的重量比）混合而制成干菌粉，每克干菌粉中SC06活菌数为10⁸cfu。

实施例3、SC06可提高罗非鱼的抗氧化能力

尼罗罗非鱼(吉福品系)由浙江跃腾水产食品有限公司提供，用2.5％（质量浓度）的食盐水进行浸泡消毒，在浙江大学饲料科学研究所水产动物营养实验室暂养14d后，选取体重约2.50g的健康的尼罗罗非鱼，采取单因子设计方案：对照组和SC06组。每组3个平行重复，每个重复30尾鱼。实验鱼在密闭式过滤循环系统的水族箱(100cm×50cm×50cm)中饲养，实际水体积为200L，饲养水温25-28℃，ACO-318型空气压缩机24h增氧。每天9：00和19：00两次投饵（对照组为常规的尼罗罗非鱼饲料；SC06组为在常规的尼罗罗非鱼饲料的基础上每4天向水体中添加一次干菌粉，直至SC06在水体中的浓度为10⁷CFU/mL），日投饵率为体重的3.5％。每两周称重一次，调节投饵量。每天观察鱼的健康状况，记录投饵量、死亡数量。本实验期间不换水，水源为充分曝气除氯的自来水。试验21d后进行相应的检测，具体如表1所述。结果表明，与对照组相比，SC06组（即SC06菌株添加组）的血清中CAT（过氧化氢酶）活性、T-AOC（总抗氧化能力）和MDA（脂质过氧化物）含量分别降低81.64％(P<0.05)、61.99％(P<0.05)和82.14％(P<0.05)，超氧根阴离子自由基（O2^－）活力升高31.58％(P<0.05)，GSH-Px（谷胱甘肽过氧化物酶）基本不变。因此，SC06可有效提高罗非鱼机体中CAT和GSH-Px活性，对降低血清中脂质过氧化对机体造成的危害有重要的作用。

表1、 SC06对罗非鱼血清抗氧化指标的影响

	对照组	实验组
			CAT(U/ mgprot)	4.43±0.50a	0.814±0.40b
GSH-Px(U/mgprot)	529.60±39.92	529.60±37.63
			T-AOC(U/mgprot)	8,31±0.44a	3.16±0.21b
MDA(nmol/ml)	5.67±0.56a	1.01±0.18b
			O2^－(U/gprot)	112.38±13.93b	147.86±5.71a

备注：同行肩注不同字母者表示差异显著（P<0.05）（n=3），反之，差异不显著（P>0.05）

实施例4、SC06对草鱼生长和免疫功能的影响

草鱼先用0.1%（质量浓度）KMnO₄溶液浸泡消毒1h后，暂养5d。后选取体重46g左右的健康无病草鱼300尾，随机分成两组：对照组和实验组，每组三个重复，每个重复50尾鱼。预试期为7d，正试期为45d，对照组饲喂基础日粮，实验组在基础日粮添加0.1% 重量比的SC06干菌粉（即实施例2所得的干菌粉）。试验鱼在室内过滤式循环水系统的圆形水族箱（体积为2.75m³）中饲养，实际水体积为1.33m³，试验水温18-25℃，ACO-318型空气压缩机24h增氧。每天08:00、12:00和9:00三次投饵，按草鱼体重2%的日投饵量饲喂，投喂时缓慢且尽量让鱼吃完。每两周称重一次，调整投饵量。每天观察鱼的健康状况并记录水温、投饵量和鱼死亡情况。每周取水样用于测定养殖水体水质指标，每次取完水样后换1/3体积的水，水源为充分曝气的水库水，试验期间不清除残饵和粪便。45d后测定对照组和实验组的生长性能（表2）和免疫指标（表3）。结果表明：与对照组相比，饲料中添加SC06的实验组显著提高了草鱼的平均日增重和特定生长率，显著降低草鱼的死亡率（P<0.05）。血清免疫指标测定结果表明，与对照组相比，饵料中添加SC06的实验组对草鱼血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、A/G比和溶菌酶活性无显著影响，但显著提高了草鱼血清中 IgM、C3和AKP含量（P<0.01），也显著降低了髓过氧化物酶的含量。

表2 SC06对草鱼生长性能的影响

项目	对照组	实验组
			初始重（g）	46.85±0.5	46.54±0.41
终末重（g）	54.99±0.65b	56.39±0.32a
			日增重（g）	0.181±0.013b	0.219±0.016a
特定生长率（％）	0.358±0.029b	0.427±0.028a
			死亡率（％）	13.06±3.44a	6.97±1.96b

同行肩注不同字母者表示差异显著（P<0.05）（n=3），反之，差异不显著（P>0.05）

表3 SC06对草鱼血清免疫蛋白和非特异性免疫功能的影响

项目	对照组	实验组
			总蛋白(g/L)	34.27±2.86	35.75±1.08
白蛋白(g/L)	16.87±1.42	17.12±0.97
			球蛋白(g/L)	20.43±1.51	21.33±2.16
IgM(g/L)	0.14±0.012B	0.29±0.011A
			溶菌酶含量(μg/ml)	1.07±0.15	1.11±0.19
AKP(金氏单位/100ml)	5.08±0.097B	10.62±0.26A
			髓过氧化物酶(μ/L)	93.38±4.50A	43.26±1.87B
C3(g/L)	0.57±0.056B	1.27±0.12A

实施例5、SC06对甲鱼生长和免疫的影响

在中得甲鱼试验基地-温室养殖池（池面积52m²，共16个池)，每个池放甲鱼1700只（甲鱼5克左右），水温控制在26-28℃，每5天换水一次，换水量为20%，实验组每吨饲料添加SC06干菌粉（即实施例2所得的干菌粉） 1000克，一天投喂二次（投喂量为常规重量），每15天用氯制剂或碘制剂消毒1次。4个月后对甲鱼的体重和免疫指标进行测定。由图2可知，在饲料中添加SC06的实验组可以明显促进甲鱼生长，且甲鱼发病率也明显降低，特别是烂皮病；甲鱼外观也明显改善。表4表明，饲料中添加SC06可降低甲鱼肠粘膜炎症因子(IL-12和TNF-α)和抗炎因子（IL-10），降低分泌型SIG-A和热应激蛋白HSP70。说明添加SC06使甲鱼肠道更健康、病原菌明显降低，从而减少了炎症反应。而对照组因炎症反应强而使抗炎因子相对提高，且刺激肠道更多的免疫球蛋白以清除病原菌。同时使甲鱼处于应激状态，使热应激蛋白HSP70显著升高。

表4 SC06对甲鱼免疫的影响

	对照	实验组
			BD（ng/ml）	8.25±0.048	8.248±0.014
IFN-a（ng/L)	1164.65±155.51	874.692±163.692
			IFN-r（ng/L）	954.36±78.79	756.89±113.60
TNF-α（ng/L）	688.24±34.01A	431.13±29.40B
			SIG-A（ug/ml）	48.23±7.71a	28.41±5.60b
HSP70（ng/ml）	11.24±0.47A	5.57±0.74B
			TFG-B（pg/ml）	1058.41±330.34	1223.00±116.00
IL-10（ng/ml）	18.53±0.46a	11.86±3.70b
			IL-12（pg/ml）	737.51±2.83A	722.85±4.51B

实施例6、SC06对鸡生长和免疫能力的影响

选用1日龄健康且体重无显著差异的罗斯308肉鸡216羽，随机分为两组，每组设3个重复，每个重复 36羽（公母各半）。对照组饲喂基础日粮，处理组在每克基础日粮中添加解淀粉芽孢杆菌SC06 10⁵CFU（即，在每克基础日粮中添加0.001g的实施例2所得的SC06干菌粉）。试验期间自由采食和饮水，按常规免疫程序进行免疫接种，记录每个处理的采食量，并分别在21日龄和42日龄称重（表5）。每天观察鸡只的精神状态、饮水、食欲和粪便情况，对死亡鸡作病理解剖，判明死因，记录各组死亡鸡数。进鸡前一周，依照常规程序对鸡舍进行消毒。采用地面垫料平养的方式育雏，鸡舍暖气供热，育雏室第一周温度为32～33℃，第二周温度为 29～30℃，以后每周降低2℃，相对湿度保持在60%～65%。采用 24 小时光照，自然光照辅以人工光照。6周后测定血清免疫指标，结果表明，日粮中添加SC06的处理组可提高血清中总蛋白、球蛋白和溶菌酶，而对血清中白介素6(IL-6)、白介素10（IL-10）和肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量无显著变化。

表5 、初始重、21日龄和42日龄体重

表6 、SC06对鸡血清免疫指标的影响

项目	对照组	实验组
			总蛋白（g/L）	49.57±1.32b	59.73±1.89a
白蛋白（g/L）	10.34±0.48	13.03±0.89
			球蛋白（g/L）	39.48±0.58b	46.69±1.20a
溶菌酶	0.72±0.070b	1.13±0.30a
			白介素10（IL-10）	96.16±12.91	121.66±14.17
白介素6 (IL-6)	134.09±8.35	151.77±4.24
			肿瘤坏死因子（TNF-α）	34.98±2.31	31.70±2.53

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.解淀粉芽孢杆菌，其特征是：

保藏名称：解淀粉芽孢杆菌SC06(Bacillus amyloliquefaciens SC06)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年7月11日，保藏号：CCTCC No:M 2012280。

2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的用途，其特征是：用于制备抑菌或者提高动物的免疫能力的药物。

3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌的用途，其特征是：所述动物为水生动物或畜禽。