KR20160045278A

KR20160045278A - 미생물 균주를 이용한 발효 사료 첨가제 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20160045278A
Application number: KR1020140140553A
Authority: KR
Inventors: 김수기; 우개민; 조상범; 장인환; 송인근; 장효군
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2016-04-27

Abstract

본 발명은 미생물 균주를 이용한 발효 사료 첨가제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Saccharomyces cerevisiae 균주를 이용하여 사료원료의 조성을 변화시켜 제조된 발효사료 첨가제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

미생물 균주를 이용한 발효 사료 첨가제 조성물 및 그 제조방법{A FERMENTED FEED ADDITIVE COMPOSITION USING MICROORGANISM AND A PREPRATION METHOD THEREOF}

돼지 뿐만 아니라 닭, 가금 및 새우와 같은 동물의 위 및 장 내에서의 병원성 세균 감염은 농부들 뿐만 아니라 소비자에게도 커다란 문제거리이다. 농부가 사육지에서 매우 엄격한 위생 기준을 지킨다 하더라도, 이러한 감염을 방지하는 것이 가능할지라도, 매우 어렵고, 젖을 뗀 새끼 돼지의 심한 설사증 발병은 장 내 천연 대장균과 락트산의 관계에 있어서의 면역학적 인자에 따라 좌우된다. 감염에 대항하기 위해 항생물질을 자주 사용하는 것은 살모넬라와 같은 내성 균주가 발생하기 때문에 큰 문제가 된다. 이러한 몇몇의 세균이 다수의 항생물질에 대해 내성을 갖게 되어, 그 결과 항생물질로 처치할지라도 동물이 죽게된다. 일단 병원성 세균으로 인해 불균형이 야기되면, 음식물의 소화능이 감소하므로 정상적인 방식으로는 동물의 체중을 늘일 수가 없다. 명백한 사육자의 경제적인 손실 외에도, 고기의 질이 저하되는 경우가 허다하고, 이 고기의 소비자가 감염될 수 있다는 명백한 위험도 존재한다.

세균 감염에 매우 민감한 일군의 동물들은 새끼 돼지로, 암퇘지로부터 빈번하게 감염되게 된다. 새끼 돼지들을, 젖 뗄 무렵 암퇘지로부터 격리하여 고형 사료를 먹이기 시작하면, 이들은 장에서 심각한 문제를 보이게 된다. 이 문제는 새끼 돼지들이 죽을 정도로 심한 경우가 흔하다. 또한, 이러한 감염은, 몇몇 새끼 돼지들이 죽는 것 뿐만 아니라 감염된 동물들의 사육 기간이 과도하게 길어지므로, 농부들에게 커다란 경제적인 문제를 야기하게 된다. 병든 새끼 돼지 문제의 심각도는 나라마다 다르다. 유럽에서는 15 내지 30 %의 동물들이 감염되나, 열대 지방의 나라에서는 그 수치가, 예를 들어 40 %에 이를 정도로 상당히 높다.

브로일러 (broiler)의 사육은 많은 문제가 있는 또 다른 군이다. 조류에 있어서 살모넬라 및 캄필로박터 감염은 매우 흔하며, 농부들에게 지대한 경제적인 손실을 야기하고 닭의 소비자 내에서 중증 감염 내지 치명적인 감염을 야기한다. 브로일러 및 씨암탉에 있어서 살모넬라 감염은 살모넬라 세균이 모든 종류의 항생물질에 대해 고도의 내성을 나타내게 됨에 따라, 전세계에 걸쳐 구제불능의 상태로 진전하고 있다.

일단 동물이 병원성 세균에 감염되면 현재 시판되는 항생물질 및 공생물질로 동물을 처치하는 것은 어렵거나, 거의 불가능하다.

새우 양식에도 또한, 세균으로 감염된 물, 먹지 않은 사료로 인해 악화된 연못의 바닥층, 배설물 및 화학물질에 따른 많은 문제가 있다. 이러한 모든 환경상의 오염 요인들은 새우의 병원균 감염의 위험을 증가시켜 농부들에게 커다란 경제적인 불이익을 야기한다. 치사율 100 %에 이르는 가장 흔한 병원성 세균 중의 하나는 각종 비브리오 균류이다.

환경 오염의 관점에서 보면, 닭, 씨암탉 및 돼지의 사육에는 문제점이 많으므로 암모니아 방출량을 줄이는 것이 시급하다. 바닥의 배설물로부터의 암모니아 방출은 동물들에게 독성이 강하고 감염의 위험을 증가시켜, 치사율을 증가시키며, 성장능을 저하시킨다.

이론적으로, 감염, 항생물질을 사용하지 않은 성장 촉진, 및 향상된 생태학에 관한 상기 언급된 문제들을 해결하는 가장 좋은 방법은 아마도, 병원성 세균이 점액질 막 표면으로 부착되는 것을 막는 방법을 찾거나, 또는 세균총의 불균형으로 이미 고통을 받고 있는 동물들에 대해서는, 정상 세균총을 회복시키는 방법을 찾아, 다수의 공생 효과를 나타내고 생미생물, 그의 고유 소화 효소, 고유 유기산 및 고유 박테리오신으로 구성된, 신속하게 개시되고 따라서 면역 방어계를 강화시키는 천연 '칵테일'의 조성물을 사용하므로써 동물의 치사율을 감소시키고 성장 속도를 증대하는 것일 것이다. 또한, 상기 생성물은 효소, 유기산 및 박테리오신으로 구성되고 발효가 진행되는 동안 생미생물에 의해 생산되어야 한다. 생미생물로부

터의 대사물질인 효소, 유기산 및 박테리오신의 다수의 공생 작용의 신속한 개시는 공생물질의 유효성 판단에 필수적이다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제1020120003954호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 수분함량이 적은 발효 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 균체 활성이 우수한 발효 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전분 분해 활성이 우수한 발효 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항균 활성이 우수한 발효 사료첨가제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 서브틸리스를 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 수분함량이 낮은 발효 사료 첨가제 제조방법을 제공한다.

또 본 발명은 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 서브틸리스를 접종하여 발효하여 제조된 수분함량이 낮은 발효 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)의 조성비는 대두박 4%, 소맥피 20% 및 옥태말분 76%(w/w)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스를 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 개선된 전분분해 효소 활성을 가지는 발효 사료 첨가제 제조방법을 제공한다.

또 본 발명은 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스를 접종하여 발효하여 제조된 우수한 전분분해 효소 활성을 가지는 발효 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)의 조성비는 각각 동량인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 또는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 균체 성장용 발효 사료 첨가제 제조방법을 제공한다.

또 본 발명은 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 또는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 접종하여 발효하여 제조된 개선된 균체 성장용 발효 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 소맥피 및 옥태말분(corn bran)의 조성비는 98:2(w/w)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 락토바실러스 브레비스 또는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 항균 활성을 가지는 발효 사료 첨가제 제조방법을 제공한다.

또 본 발명은 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 락토바실러스 브레비스 또는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 접종하여 발효하여 제조된 항균 활성을 가지는 발효 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Bacillus aminoliquefaciens, Saccharomyces cerevisiae 균주를 이용하여 사료원료의 조성을 변화시켜 발효사료 첨가제를 제조하고자 수행하였다. 발효사료첨가제 원료로는 대두박, 소맥피, 옥태말분을 검토하였다.

각 원료들이 선발된 균주들의 배양성적(균체활성 및 수분함량)에 미치는 영향을 조사하였고, 그 결과를 바탕으로 최적 혼합 조건을 탐색하였다. 최적 혼합조건은 부분요인분석법의 하나인 혼합물 설계법을 활용하였으며, 분산분석을 통하여 효과를 검정하고, 최적화도구를 이용하여 반응값들을 모형화하였고, 최종적으로 서로 다른 특성의 최적 배지조성을 조사하였다.

본 최적화 과정에서는 총 4가지의 특성을 배양 효율 평가 기준으로 활용하였다.

첫 번째로는 최종 배양물의 수분함량이다. 수분함량은 발효과정 중, 발효열 혹은 기타 다른 생물학적 현상과 공극형성을 통한 통기성에 의하여 조절된다. 그리고 최종 제품의 수분함량은 후공정인 건조 공정의 부하를 줄여줄 수 있다. 따라서 배양 후, 최종 배양물의 수분함량이 낮을수록 후공정 부하가 적고, 생산비 절감의 요인으로 활용될 수 있다.

두 번째는 효소활성이다. 효소활성으로는 전분분해활성을 조사하였다. 전분 분해활성은 가축의 장내 전분 이용성을 향상시킬 수 있다. 가축의 장내에서 전분이 원활하게 분해 및 이용되지 못하게 되면, 소화물의 이송속도가 느려지고, 영양소의 흡수 효율이 떨어져 가축의 생산성 저하 원인이 될 수 있다.

세 번째는 균체활성이다. 균체활성은 생균을 활용하는 생균제에 있어서는 매우 중요한 품질관리 대상이 된다.

마지막은 항균활성이다. 항균활성은 항생제 대체 물질 개발에 있어 매우 중요한 기준이다. 항균활성의 증가는 발효사료첨가제의 기능성 확보와 항생제 대체효과 확보에 있어 매우 중요한 품질 향상 요인으로 판단된다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

다양한 고체 배지용 원료들이 배양 후 수분함량에 미치는 영향

총 3가지 배지용 원료들이 다양한 종균들의 발효 후 수분함량에 미치는 영향은 도 1에서 보는 것과 같다. 균주 B. subtilis SK877의 경우 옥태말분을 사용하는 것이 최종 발효물의 수분함량을 낮출 수 있을 것으로 판단되었다. 균주 B. amyloliquefaciens SK3487의 경우 대두박을 사용한 배양물에서 가장 낮은 수분함량을 나타내었다. 균주 S. cerevisiae SK3587의 경우, 소맥피에서 가장 낮게 나타났으며, 균주 L. plantarum SK3121에서는 옥태말분이 가장 낮게 나타났다.

이상의 결과를 통하여 본 발명에서 사용된 각 배지 원료들이 사용된 균주들에 대하여 서로 다른 효과를 나타내는 것으로 나타났다.

다양한 고체 배지용 원료들이 균체 성장에 미치는 영향

종균들의 균체 성장 효율에 대한 각 배지 원료들의 효과는 도 2에서 보는 것과 같다. 수분함량에서와 같이 균주에 따라서 각 원료들의 효과는 매우 다양하게 나타났다. 균주 B. subtilis SK877에서는 대두박이 가장 높은 균체 성장 효율을 나타내었다. 균주 B. amyloliquefaciens SK3487은 소맥피에서 가장 우수한 활성을 나타내었다. 그리고 S. cerevisiae SK3587 균주와 L. plantarum SK3121균주들은 대두박에서 가장 잘 자라는 것으로 나타났다.

이상의 결과를 통하여 4가지 균주 모두가 잘 자랄 수 있고, 혼합하여 배양할 수 있는 범용 배지는 본 실험에서 사용된 3가지 원료들을 모두 함께 사용해야 하는 것으로 판단되었다.

이에 이후 실험은 위 3가지 배지 원료들을 혼합할 수 있는 조건을 알아보기 위하여 수행되었다.

고체배지 원료들을 이용한 각 균주별 배양에 있어 배양액의 항균활성

배지원료들이 유산균 배양액의 항균활성에 미치는 영향을 조사한 결과는 표 1에서 보는 것과 같다. 균주 L. brevis SK1304의 경우 소맥피에서 가장 우수한 항균활성을 나타냈으며, 균주 L. plantarum SK3121의 경우 3가지 원료 모두 서로 유사한 항균활성을 나타내었다.

Strain¹	Medium ingredient	Pathogens³
Strain¹	Medium ingredient	SK870	SK890	SK891	SK1450	SK3360
SK1304	Soybean meal	-	-	-	-	-
	Wheat bran	++	++	++	++	+
	Corn bran²	-	-	-	-	-
SK3121	Soybean meal	-	+	+	-	-
	Wheat bran	-	+	+	-	+
	Corn bran	-	+	+	-	-

표 1은 배지 원료들이 유산균 배양액의 항균활성에 미치는 영향

¹Strain: SK1304-Lactobacillus brevis; SK3121-Lactobacillus plantarum.

²Corn byproduct: 옥태말분

³Pathogen: SK870-Clostridium perfingens Type E; SK890-Haemopillus parasuis;

SK891-Haemopillus somnus; SK1450-Burkholderia sp. ;

SK3360-Salmonella pullorum.

생산기술의 독창성 확보를 위한 PBD(Plackett-Burman design)분석으로 배양법 확립

실험설계

혼합물 설계란 3가지 변수들의 합이 모두 동일한 조건에서 각 변수들의 비율을 달리하는 실험 설계에 사용되는 방법이다.

본 연구에서는 대두박, 소맥피 그리고 옥태말분을 혼합하는 최적 조건을 도출하기 위하여 혼합물 설계법을 적용하였고, 그 결과는 표 2에서 보는 것과 같다.

총 10개의 서로 다른 배합비율을 갖고 있는 실험(run)들이 도출되었고, 설계표에 따라서 제작된 배지에 각 균주들을 접종하고 배양 효율을 평가하였다.

Run	Variables (%)
Run	Soybean meal (A)	Wheat bran (B)	Corn bran (C)
1	100.0	0.0	0.0
2	0.0	100.0	0.0
3	0.0	0.0	100.0
4	50.0	50.0	0.0
5	50.0	0.0	50.0
6	0.0	50.0	50.0
7	33.3	33.3	33.3
8	66.7	16.7	16.7
9	16.7	66.7	16.7
10	16.7	16.7	66.7

표 2는 배지원료들의 최적 혼합 비율 도출을 위한 혼합물 설계 구성표

최종 배양물의 수분함량

총 10개의 실험(run)들에서 얻어진 각 균주별 발효물의 수분함량은 표 3에서 보는 것과 같다. 균주 L. plantarum SK3121의 경우 다른 균주들에 비하여 다소 낮은 수분함량을 나타내었다. 반면에 균주 S. cerevisiae SK3487의 경우 비교적 높은 수분을 나타내었다.

Run	Strains¹
Run	SK3121	SK3587	SK3487	SK877
1	48.24±0.54	49.16±0.22	45.80±0.51	52.98±1.82
2	50.59±1.32	50.01±0.35	57.96±0.60	56.02±0.86
3	45.66±1.36	50.74±0.65	51.25±0.17	51.48±0.45
4	48.49±0.15	50.74±0.18	53.01±0.19	53.99±0.52
5	47.44±1.14	48.78±0.41	58.55±0.25	55.34±0.24
6	50.08±0.46	50.62±0.12	57.79±0.40	54.77±0.42
7	48.38±1.12	50.18±0.35	60.04±0.23	55.70±0.62
8	48.74±0.23	51.25±0.52	54.64±0.36	54.24±0.48
9	49.74±0.04	51.48±2.06	58.21±0.19	54.28±0.28
10	47.60±1.03	49.38±0.61	58.02±0.76	52.26±0.96

표 3은 배지원료들의 다양한 혼합비율이 균주 배양 후 배양물의 수분함량 (%)에 미치는 영향 결과

¹Strains: SK877-Bacillus subtilis, SK3487-Bacillus amyloliquefaciens ,

SK3587-Sacchromyces cerevisiae, SK3121-Lactobacillus plantarum.

전분분해 활성

각 실험들(run)에서 얻어진 반응값으로 전분분해활성은 표 4에서 보는 것과 같다. 전분분해활성은 배지원료들의 배합비율에 큰 영향을 받고 있는 것을 알 수 있었다. 즉 배합비율에 따라서 효소활성이 나타날 수도 아니면 그렇지 않을 수도 있다는 것을 알 수 있었다.

Run	Strain¹
Run	SK877	SK3487
1	0.98±0.27	0.54±0.16
2	0.17±0.02	0.14±0.01
3	0.16±0.00	0.18±0.01
4	ND	0.29±0.12
5	ND	ND
6	0.17±0.01	0.15±0.01
7	ND	ND
8	ND	ND
9	ND	0.22±0.03
10	0.03±0.03	0.28±0.03

표 4는 배지원료들의 다양한 혼합비율이 균주 배양 후 배양물의 전분분해활성(Unit)에 미치는 영향 결과

¹Strains: SK877Bacillus subtilis, SK3487-Bacillus amyloliquefaciens.

균체성장효율

각 실험(run)들에서 얻어진 균체성장효율은 표 5에서 보는 것과 같다. 비교적 모든 균주들이 우수한 성장을 나타내었으며, L. plantarum SK3121 균주의 경우 배지원료들의 배합비율에 가장 민감하게 반응하는 것을 알 수 있었다.

Run	Strains¹
	SK877	SK3487	SK3121	SK3587
1	9.31±0.03	8.56±0.06	10.03±0.05	8.96±0.32
2	9.27±0.05	9.19±0.08	9.73±0.18	9.09±0.16
3	8.49±0.16	5.82±0.09	6.98±0.04	7.57±0.06
4	9.13±0.03	9.33±0.04	9.60±0.04	8.95±0.49
5	9.25±0.04	9.32±0.07	8.49±0.16	8.96±0.26
6	9.22±0.01	9.28±0.05	9.02±0.40	8.81±0.01
7	9.09±0.14	9.81±0.04	9.33±0.04	8.65±0.07
8	8.62±0.12	9.28±0.14	9.95±0.05	8.59±0.11
9	9.30±0.05	9.69±0.07	9.84±0.05	8.48±0.16
10	9.25±0.14	8.89±0.09	8.62±0.09	8.22±0.44

표 5는 배지원료들의 다양한 혼합비율이 균주 균체성장효율(log₁₀(CFU/g))에 미치는 영향 결과

¹Strains: SK877Bacillus subtilis, SK3487-Bacillus amyloliquefaciens,

SK3587-Sacchromyces cerevisiae, SK3121-Lactobacillus plantarum.

항균활성

다양한 병원균들에 대한 각 실험(run)들의 항균활성은 표 6에서 보는 것과 같다. 병원균별로 항균활성이 최소 6 mm에서 최대 20 mm로 매우 큰 변화를 나타내었다.

Runs	Pathogens¹
Runs	SK872	SK891	SK3359
1	6.0	8.5	6.0
2	8.0	16.3	10.8
3	12.0	20.3	14.5
4	10.5	18.8	11.0
5	12.3	21.0	12.0
6	14.5	21.8	12.8
7	10.0	19.3	10.0
8	9.0	20.3	9.0
9	9.5	20.0	14.0
10	12.5	20.3	14.0

표 6은 배지원료들의 다양한 혼합비율이 L. plantarum SK3121 균주 발효물의 항균활성(clear zone, mm)에 미치는 영향 결과

¹Pathogen: SK872-Enterotoxigenic coli;

SK891-Haemophilus somnus;

SK3359-Salmonella gallinarum.

수분활성에 대한 분산분석

각 실험들에서 달리한 배지 원료들의 혼합비율이 최종 배양물의 수분함량에 미치는 효과에 대한 분산분석은 표 7에서 보는 것과 같다. 균주 S. cerevisiae SK3587을 제외하고는 모든 균주에서 유의적인 효과가 나타났다(P<0.05). 즉 배지 원료들의 혼합비율이 배양물의 수분함량을 변화시킬 수 있다는 가설이 증명되었다. 배지원료들 간의 상호작용에 있어서는 옥태말분을 중심으로 한 상관관계에서 유의적인 효과가 많이 관찰되었다.

Item¹	Strains²
Item¹	SK3121	SK3587	SK3487	SK877
Regression	<0.001	0.081	<0.001	<0.001
linear	<0.001	0.506	<0.001	<0.001
quadratic	0.040	0.073	<0.001	0.005
Lack-of-fit	0.871	0.052	0.001	0.024
Interaction
A*B	0.147	0.027	0.001	0.408
A*C	0.533	0.165	<0.001	0.001
B*C	0.014	0.593	<0.001	0.388

표 7은 배지원료들의 배양 후 최종 배양물의 수분에 미치는 영향에 대한 분산분석 결과

¹A, soybean meal; B, wheat bran; C, corn bran

²Strains: SK877Bacillus subtilis, SK3487-Bacillus amyloliquefaciens,

SK3587-Sacchromyces cerevisiae, SK3121-Lactobacillus plantarum.

전분분해효소활성에 대한 분산분석

각 실험들에서 달리한 배지 원료들의 혼합비율이 최종 배양물의 전분분해효소활성에 미치는 효과에 대한 분산분석은 표 8에서 보는 것과 같다. 두 균주 모두에서 유의적인 효과가 관찰되었다(P<0.05). 항균활성에 대한 배지원료들 간의 상호관계는 대두박을 중심으로 한 상관관계에서 모두 유의성이 관찰되었다(P<0.05). 이상의 결과를 통하여 전분분해효소활성에 대두박이 매우 중요한 역할을 하고 있는 것을 알 수 있었다.

Item¹	Strain²
Item¹	SK877	SK3487
Regression	<0.001	0.002
linear	<0.001	0.010
quadratic	<0.001	0.001
Lack-of-fit	0.051	<0.001
Interaction
A*B	<0.001	0.278
A*C	<0.001	<0.001
B*C	0.745	0.927

표 8은 배지원료들의 배양 후 최종 배양물의 항균활성에 미치는 영향에 대한 분산분석 결과

¹A, soybean meal; B, wheat bran; C, corn bran

²Strains: SK877Bacillus subtilis, SK3487-Bacillus amyloliquefaciens.

균체성장에 대한 분산분석

각 실험들에서 달리한 배지 원료들의 혼합비율이 최종 배양물의 균체성장에 미치는 효과에 대한 분산분석은 표 9에서 보는 것과 같다. 모든 균주들에 대하여 각 배지 원료들이 균체성장에 유의적인 효과를 미치고 있는 것으로 나타났다(P<0.05).

Item¹	Strains²
Item¹	SK3121	SK3587	SK3487	SK877
Regression	<0.001	<0.001	<0.001	0.010
linear	<0.001	<0.001	<0.001	0.002
quadratic	<0.001	0.093	<0.001	0.037
Lack-of-fit	0.002	0.056	<0.001	<0.001
Interaction	SK3121	SK3587	SK3487	SK877
A*B	0.641	0.143	<0.001	0.076
A*C	0.232	0.061	<0.001	0.152
B*C	<0.001	0.328	<0.001	0.049

표 9는 배지원료들의 배양 후 최종 배양물의 균체성장에 미치는 영향에 대한 분산분석 결과

¹A, soybean meal; B, wheat bran; C, corn bran

²Strains: SK877Bacillus subtilis, SK3487-Bacillus amyloliquefaciens,

SK3587-Sacchromyces cerevisiae, SK3121-Lactobacillus plantarum.

시작품 제작 및 평가

일련의 실험결과를 통하여 총 4가지 서로 다른 최적 배지조성을 도출하였다. 각 최적배지들은 수분함량 최소화(배지번호 1), 효소활성 최대화(배지번호 2), 세포성장효율 최대화(배지번호 3) 그리고 항균활성 최대화(배지번호 4) 등을 목표로 설계되었으며, 각 배지성분들은 표 10에서 보는 것과 같다.

Ingredient	Optimized medium No.
Ingredient	No 1 (Moisture content)	No 2 (Amylase)	No 3 (Cell yield)	No 4 (Antibacterial activity)
Soybean meal	3.96	33	0	96
Wheat bran	19.76	33	98	4
Corn bran	76.28	34	2	0
Sum	100	100	100	100

표 10은 제품의 특징 및 목표에 따른 배지 원료들의 최적 배합비율(%)

얻어진 총 4가지 서로 다른 최적배지들을 기존의 실험방법과 동일한 방법으로 배양하여 배양 효율을 분석하였다.

상기의 분석 결과를 종합하면,

배지 내 수분함량을 조사한 결과 수분함량을 기준으로 최적화된 배지번호 1번(대두박 3.96%, 소맥피 19.76%, 옥태말분 76.28%)에서 가장 낮은 수분 함량을 나타내었다(표 11).

¹Strains	Optimized medium No.
¹Strains	No1	No2	No3	No4
SK877	42.94	50.58	53.23	51.81
SK3487	50.25	54.62	52.82	51.64
SK3587	49.09	51.24	51.98	50.66
SK3121	46.70	47.68	48.19	48.00

표 11은 최종 배양물의 수분함량 결과

¹Strains: SK877Bacillus subtilis, SK3487-Bacillus amyloliquefaciens,

SK3587-Sacchromyces cerevisiae, SK3121-Lactobacillus plantarum.

최적 배지들에서 배양된 균주들의 전분분해효소 활성은 표 12에서 보는 것과 같다. 배지번호 2번(대두박 33%, 소맥피 33%, 옥태말분 34%)의 경우 효소활성 최대화로 설계된 것이며, 효소활성 또한 가장 높게 나타났다.

¹Strain	Optimized medium No.
¹Strain	No 1	No 2	No 3	No 4
SK877	0.41	0.54	0.41	0.44
SK3487	0.35	0.55	0.41	0.48

표 12는 최종 배양물의 전분분해효소 활성

¹Strains: SK877Bacillus subtilis, SK3487-Bacillus amyloliquefaciens.

각 최적배지들의 균체 성장 효율은 표 13에서 보는 것과 같다. 균체성장을 목적으로 최적화된 배지는 배지번호 3번(소맥피 98%, 옥태말분 2%)이었다. 본 배지는 균주번호 SK3487과 SK3121에 대하여 가장 적합한 것을 알 수 있었다.

¹Strain	Optimized medium No.
¹Strain	No 1	No 2	No 3	No 4
SK877	9.00	8.59	7.67	7.96
SK3487	8.87	9.28	9.42	8.22
SK3587	8.67	8.89	8.63	8.43
SK3121	6.70	8.20	9.36	9.56

표 13은 최종 배양물의 세포성장 효율

¹Strains: SK877Bacillus subtilis,

SK3487-Bacillus amyloliquefaciens,

SK3587-Sacchromyces cerevisiae,

SK3121-Lactobacillus plantarum

최종배양 물의 항균활성 결과는 표 14에서 보는 것과 같다. 비록 항균활성 극대화를 위한 최적배지는 배지번호 4번(대두박 96%, 소맥피 4%)이었으나, 배지번호 1번(대두박 3.96%, 소맥피 19.76%, 옥태말분 76.28%)에서 가장 우수하게 나타났다.

¹Pathogen	Optimized medium No.
¹Pathogen	No 1	No 2	No 3	No 4
SK872	15	12	-	8
SK891	21	18	13	8
SK3359	14	10	1	9

표 14는 최종 배양물의 항균활성 결과

¹Pathogen: SK872-Enterotoxigenic coli;

SK891-Haemophilus somnus;

SK3359-Salmonella gallinarum.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 배지의 수분함량, 생균수의 성장 효율, amlyase 활성, 항균 활성을 평가 기준으로 Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Bacillus aminoliquefaciens, Saccharomyces cerevisiae 균주를 이용하여 효능 있는 발효사료첨가제 제조시 최적 배지조성물을 제조할 수 있었다.

도 1은 총 3가지 배지용 원료들이 다양한 종균들의 발효 후 수분함량에 미치는 영향을 보여주는 그림,
도 2는 종균들의 균체 성장 효율에 대한 각 배지 원료들의 효과를 보여주는 그림

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에 사용된 원료는 대두박과 소맥피, 옥태말분을 이용하여 일정한 비율로 골고루 혼합하여 실험하였다.

본 발명의 발효 조건은 각 비율에 따라 만들어진 발효배지 6 g을 50 mL conical tube에 넣은 후 4 mL 멸균증류수를 첨가하여 골고루 혼합하였다. 살균을 위하여 dry oven에 80℃, 2시간 동안 열처리하였다.

본 발명에서 사용된 균주는 사일리지에서 분리한 Bacillus subtilis (SK877), 김치에서 분리한 Lactobacillus plantarum (SK3121)와 Bigbiogen 회사로부터 분양 받은 Bacillus aminoliquefaciens (SK3487), Saccharomyces cerevisiae (SK3587)로 고체사료 발효에 사용하였다.

실시예1: 고체사료 발효

고체사료 발효의 제조는 열처리 한 배합사료에 미리 활성화 시킨 4종의 발효 균주를 각각 0.5 mL씩 접종하였다(106~107CFU/g). B. subtilis (SK877), B. aminoliquefaciens (SK3487)와 L. plantarum (SK3121)을 접종한 고체사료는 37℃, S. cerevisiae (SK3587)는 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.

실시예 2: 생균수 측정

생균수 측정은 lawn-spotting 방법으로 실행하였다. 각 고체발효 사료의 1g과 9ml의 멸균증류수 용액에서 순차적으로 희석한 후에 각 단계의 희석액 10㎕을 agar 배지에 spotting하였다. Bacillus로 발효한 배양액은 Luria Bertani(LB) agar 배지에서 37℃, Lactobacillus로 발효한 배양액은 Lactobacilli MRS agar 배지에서 37℃, Sacchromyces로 발효한 배양액은 Yeast molds(YM) agar에서 30℃, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양 한 후에 형성된 집락의 수를 측정하였다.

실시예 3:항균 활성 측정

상기 4가지 균주를 이용한 고체발효사료의 항균활성 선행연구 결과, L. plantarum (SK3121)을 제외한 3개 균주의 고체발효사료는 항균활성이 나타나지 않았다. 선행연구결과 바탕으로 L. plantarum (SK3121)으로 발효한 고체사료로만 병원성 세균에 대한 항균활성을 평가하였다. 항균활성 평가에 사용된 병원성 균주는 Enterotoxigenic coli SK872, Haemophilus somnus SK891와 Salmonella gallinarum SK3359를 사용하였다. 각각의 병원균들은 LB에서 20시간 동안 배양한 후에 사용하였다. 항균 활성의 평가는 agar well diffusion assay 방법을 사용하였다. 병원성 미생물 배양액을 면봉으로 묻혀 LB 평판배지에 swabing 하였다. 멸균된 Pasteur tube의 뒷부분을 이용하여 지름 6 mm의 구멍을 만들었다. 항균활성 평가를 위한 고체발효사료 배양액은 7 g의 고체발효사료를 21 ml 멸균증류수에 넣은 후, 6000 rpm, 10 min, 4 ℃에서 원심 분리하였다. 상등액을 멸균거지로 여과한 다음 vacuum evaporator (Rotavapor re 111, switzland)로 농축시켰다. 농축시킨 3 ml을 0.2㎛ microfilter (Pall Corporation, USA)로 다시 여과하여 항균활성 실험에 사용하였다. 항균활성 평가용 평판배지는 뒤집지 않은 상태에서 37℃에서 overnight 동안 배양한 후에 형성된 6 mm 샘플 구멍을 포함한 직경을 mm로 생육저지환의 크기를 평가하였다.

실시예 4: Amylase 활성 측정

Bacillus SK877와 SK3487로 이용한 고체발효사료의 amylase 활성을 평가하였다. amylase 활성 측정을 위한 샘플은 2 g 고체발효사료와 0.1 M phosphate buffer(pH 7.0) 6ml에 골고루 혼합하여 rotary incubator에 180 rpm 30분 동안 shaking을 하였다. Shaking을 종료한 후 6000 rpm, 10 min, 4℃에서 원심 분리하였다. 상등액을 0.2㎛ microfilter (Pall Corporation, USA)로 여과하였다.

Amylase 활성 측정 방법은 Zhizhuang xiao et al (2004)에 따라 실험하였다. 효소 반응은 40㎕ soluble starch와 여과하여 준비한 40㎕ 샘플을 잘 혼합하여 50℃, 30분 동안 반응시켰다. 100 ㎕ iodine reagent를 넣은 다음, 150 ㎕를 취하여 96 well plate에 떨어 뜨렸다. OD 값을 microplate reader (Biotek Instruments, synergy 2)로 이용하여 580nm 파장에서 측정한다.

U (단위): 1 분 동안에 1 mg 전분이 iodine 용액과 반응하여 효소 활성에 의하여 색깔의 감소로 나타나는 값

U/ml= (A580control - A580sample) ÷A580/mg starch ÷30 min ÷0.04 ml

A580 control: 효소가 없는 전분 용액의 흡광도

A580 sample: 전분이 효소와 반응한 흡광도

A580/mg starch: 표준 곡선에 얻은 1 mg 전분의 흡광도

30 min: 반응시간

0.04 ml: 효소반응에 효소의 사용량

Claims

대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 수분함량이 낮은 발효 사료 첨가제 제조방법.
대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 접종하여 발효하여 제조된 수분함량이 낮은 발효 사료 첨가제 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)의 조성비는 대두박 4%, 소맥피 20% 및 옥태말분 76%(w/w)인 것을 특징으로 하는 조성물.
대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 개선된 전분분해 효소 활성을 가지는 발효 사료 첨가제 제조방법.
대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 접종하여 발효하여 제조된 우수한 전분분해 효소 활성을 가지는 발효 사료 첨가제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)의 조성비는 각각 동량인 것을 특징으로 하는 조성물.
소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 균체 성장용 발효 사료 첨가제 제조방법.
소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 접종하여 발효하여 제조된 개선된 균체 성장용 발효 사료 첨가제 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 소맥피 및 옥태말분(corn bran)의 조성비는 98:2(w/w)인 것을 특징으로 하는 조성물.
대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 또는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 항균 활성을 가지는 발효 사료 첨가제 제조방법.
대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 또는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 접종하여 발효하여 제조된 항균 활성을 가지는 발효 사료 첨가제 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 대두박, 소맥피 및 옥태말분(corn bran)의 조성비는 대두박 4%, 소맥피 20% 및 옥태말분 76%(w/w)인 것을 특징으로 하는 조성물.