KR20150117184A - 신규한 유산균, 진균 및 세균을 포함하는 사료첨가용 조성물 - Google Patents

신규한 유산균, 진균 및 세균을 포함하는 사료첨가용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자연계에서 새로이 분리동정된 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135), 진균인 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 세균인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는 사료첨가용 조성물, 상기 조성물에 포함될 수 있는 신규한 미생물, 상기 조성물을 포함하는 발효사료, 상기 발효사료를 이용한 가축의 사육방법 및 상기 발효사료의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 이용하면 가축사료에 대한 유해균의 오염을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 발효사료의 부패를 방지하여 저장성을 향상시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 가축사육에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 유산균, 진균 및 세균을 포함하는 사료첨가용 조성물{Composition of formulated diets comprising novel lactic acid bacteria, fungus and bacterium}
본 발명은 신규한 유산균, 진균 및 세균 및 이를 포함하는 사료첨가용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 자연계에서 새로이 분리동정된 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135), 진균인 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 세균인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는 사료첨가용 조성물, 상기 조성물에 포함될 수 있는 신규한 미생물, 상기 조성물을 포함하는 발효사료, 상기 발효사료를 이용한 가축의 사육방법 및 상기 발효사료의 제조방법에 관한 것이다.
가축 및 이들의 산물은 인류가 생존하기 위해 필요한 단백질의 중요한 공급원이기 때문에, 가축의 사육효율을 향상시키기 위한 노력이 지속적으로 수행되어 왔다. 이같은 가축의 사육효율을 향상시키기 위하여 가장 많은 연구가 진행된 부분은 사료이다. 전통적인 가축의 사육방법인 방목시에는 주로 초지에서 생산되는 풀을 사료로서 사용하였다. 그러나, 농업의 생산성이 증가함에 따라, 농가에서 생산되는 농작물 또는 그의 부산물을 사료로서 사용하게 되었는데, 주로 대두박, 참깨, 맥류, 볏짚, 옥수수, 땅콩, 완두콩, 사탕무, 펄프 등을 사용하였다. 또한, 농작물로부터 공급이 어려운 단백질 및 지방성분을 보충하기 위하여, 동물 내장 가루, 어분 가루 등의 동물유래 성분을 추가로 공급하고 있다. 최근에는, 종래의 사료성분에 아미노산, 무기염료, 비타민, 항생물질, 효소 등을 부가적으로 포함하는 배합사료가 일반적으로 사용되고 있다.
한편, 최근에는 청정하고 위생적인 축산물에 대한 소비자의 인식이 높아지고, 가축의 사육과정에서 사용되고 있는 항생제에 대한 부정적인 시각이 대두되면서, 항생제 사용의 대안으로 유용 미생물(생균제)을 이용한 발효사료 제조기술이 주목받고 있다. 그러나, 이같은 발효사료의 경우, 가축에 유익한 미생물 뿐만 아니라 해로운 미생물도 활발히 증식할 수 있어, 부패 및 변질이 쉬운 약점이 있다. 예를 들어, 곰팡이독소 중에서 발효사료에 영향을 크게 미치는 것에는 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol), 제랄레논(Zearalenon), 아플라톡신　B1(Aflatoxin B1)이 있다. 데옥시니발레놀은 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) 균주가 생성하는 곰팡이 독소로 작물의 양적, 질적 저하와 가축의 생육저하 또는 개체수의 감소뿐만 아니라 급/만성 질병유발을 일으키지만 국제암연구소에서 발암가능성은 없는 물질로 분류했다. 푸사리움 그래미니아룸 균주는 곡물사료 제조시 생육하여 데옥시니발레놀을 생성하며, 데옥시니발레놀을 섭취하면 사료효율 감소와 발굽 이상, 유방염 등에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다(Smith, T. K. et. al., Journal of animal science (1997) 75(8), 2184-2191, Keese, C. et. al., Molecular nutrition & food research (2008) 52(12), 1514-1529). 푸사리움 그래미니아룸이 생성하는 다른 독소인 제랄레논(Zearalenon)은 난소낭종, 태아 사산, 비규칙적 고열, 낮은 임신율에 영향을 준다고 보고되었다. 이런 제랄레논은 5~20℃의 저온, 저산소 환경인 온대 및 한 대지역에서 생산된 농산물에서 흔히 발생하므로 온대지역에 포함되는 우리나라는 아플라톡신보다는 푸사리움(Fusarium) 독소에 오염될 가능성이 높다. 그리고 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus)가 생성하는 아플라톡신 B1은 인간 및 동물에서 노출될 경우 면역기능이 억제됨으로써 감염에 대한 저항성이 낮아지는 것으로 나타났고, 성장장해와 폐사, 사료 효율 감소, 질병별 감염율 증가를 야기하는 것으로 알려져 있다(Nam, K, H., Korean Journal of Poultry Science (1994) 21(2), 113-117 ). 동물은 종에 따라 독성에 대한 감수성이 달라지며, 같은 종 안에서도 연령, 성별, 몸무게, 식이, 감염 물질에의 노출, 기타 곰팡이독소 또는 약물 등의 존재에 따라 상당한 차이가 있다(식품의약품안전청 유해물질총서). 특히, 곰팡이독소는 가축을 키우는 농가에 심각한 피해를 주는 요인이 되고 있다.
한편, 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주는 인체와 가축질병의 주된 원인체로 약 2,000여 종이 밝혀져 있고, 인간에게는 세균성 식중독, 가축에게는 주요 질병을 발병시키는 것으로 알려져 있다. 살모넬라 균주는 어린 가축에게 설사증상을 동반하여 높은 폐사율과 성장저해를 일으키고 다른 질병의 혼합감염에 의한 심한 병증을 유발한다. 살모넬라 균주에 대한 감염을 치료하기위해 항생제를 사용하는데, 이런 항생제는 투입된 후로 2∼3달이 지나야 소화 배출된다. 이러한 항생제를 지속적으로 투입하거나 휴약기간 전에 식용될 경우는 잔류 항생제로 인하여 면역력 저하와 항생제내성균주의 등장 위험성을 갖고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 곰팡이 오염 및 잡균의 증식을 억제하여 보존성 및 안정성이 높은 발효사료를 제조하고자 예의 연구노력한 결과, 내산성 및 내담즙성을 지니며, 잡균의 생육 억제와 살모넬라 균에 대한 사멸능을 가지고 올 수 있는, 신규한 젖산균 락토바실러스 플란타룸 균주; 내산성 및 내담즙성을 지니고 장 내에서 증체량과 사료 섭취량을 증가시킬 수 있는, 신규한 효모균 및 곰팡이 생육 억제 효과 및 효소 활성을 나타내는 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주를 분리 동정하였고, 상기 3종의 균주를 생균제로 사용하여 발효 사료를 제조한 결과, 제조된 발효 사료의 보존성 및 안정성이 우수하여 상기 3종의 균주를 생균제 및 사료 첨가제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135), 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물에 포함될 수 있는 신규한 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 3종의 균주를 포함하는 발효사료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발효사료를 급이시키는 단계를 포함하는, 가축의 사육방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 원료사료에 상기 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 발효사료의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 유해균의 오염으로 인한 폐해를 방지할 수 있는 미생물 제제의 조건으로서, 유해균을 사멸시키거나 또는 유해균의 증식을 억제하는 기본적인 효과 외에도 가축의 체내에 섭식된 경우에도 미생물이 생존하여 본래의 기능을 발휘할 수 있어야 할 것으로 가정하였다. 또한, 이러한 조건을 모두 갖춘 단일 미생물을 사용하기 보다는, 각각의 효과를 부분적으로 나타낼 수 있는 미생물의 복합제제를 사용하는 것이 새로운 유해균에 대한 우수한 방어효과를 나타낼 수 있을 것으로 가정하였다.
이에, 유해균을 사멸시키거나 또는 유해균의 증식을 억제하는 능력이 우수한 균주와 가축의 체내에 섭식된 경우에도 미생물이 생존하여 본래의 기능을 발휘할 수 있는 균주를 규명하고자 예의 노력한 결과, 내산성과 내담즙성이 우수하고, 살모넬라 균에 대하여 사멸능을 지니는 신규한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)(KCTC 12508BP), 내산성 및 내담즙성을 지니며 장내에서 증체량과 사료섭취량 증가를 가져올 수 있는 신규한 효모균인 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)(KCTC 12510BP) 및 곰팡이 생육 억제 효과가 우수한 신규한 세균인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)(KCTC 12509BP)를 각각 발굴하고, 이들의 혼합제제가 사료에 미치는 효과를 규명하였다. 그 결과, 상기 혼합제제를 배합사료에 첨가하고 이를 발효시켜서 수득한 발효사료는 종래의 미생물 제제에 의해 제조된 발효사료와는 달리, 발효시간이 경과하여도 사료내 미생물 균체수의 비율이 일정하게 유지되고, pH가 감소하며, 발효후에도 부패되지 않음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 미생물을 포함하는 혼합제제는 사료첨가용 조성물 또는 생균제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)(KCTC 12508BP), 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)(KCTC 12510BP) 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)(KCTC 12509BP)를 포함하는 사료첨가용 조성물, 생균제 및 상기 사료첨가용 조성물에 포함될 수 있는 신규한 미생물을 제공한다.
본 발명의 용어 "락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)"란, 16s rRNA를 코딩하는 유전자의 염기서열이 표준균주인 락토바실러스 플랜타럼의 것과 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주로서, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12508BP를 부여받은 균주를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주는 우수한 내산성과 내담즙성을 나타내며, 살모넬라 속 균주에 대하여 사멸능을 나타내어, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)"란, 16s rRNA를 코딩하는 유전자의 염기서열이 표준균주인 사카로마이세스 세레비지애의 것과 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주로서, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12510BP를 부여받은 균주를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주는 우수한 내산성과 내담즙성을 나타내어, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)"란, 16s rRNA를 코딩하는 유전자의 염기서열이 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴페시언스의 것과 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주로서, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12509BP를 부여받은 균주를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주는 푸사리움 솔라니, 푸사리움 sp., 아스퍼질러스 플라부스 및 페니실리움 sp. 균주에 대하여 우수한 항균활성을 나타내며, 프로테아제, 셀룰라아제, α-아밀라제, 피타아제(phytase) 및 자일라나제와 같은 효소활성을 나타낸다. 따라서, 상기 균주는 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "유해균"이란, 가축 또는 가축의 부산물에 오염되어, 상기 가축에게 부정적인 효과를 유발시키거나, 상기 가축의 품질을 저해시키거나, 또는 가축의 부산물을 섭식한 사람에게 부정적인 효과를 유발시킬 수 있는 미생물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 유해균은 가축에게 부정적인 효과를 유발시키거나, 또는 상기 가축의 품질을 저해시킬 수 있으면서도, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제에 의하여 사멸하거나 또는 증식이 억제될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 가축용 배합사료에 오염되어 상기 배합사료를 변질시킬 수 있는 진균류 및 인간 및 가축에게 질병을 유발할 수 있는 살모넬라 속 미생물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 푸사리움 속(Fusarium sp.) 균주, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주, 페니실리움 속(Penicillium sp.) 균주, 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 균주, 푸사리움 속 균주, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주, 페니실리움 속 균주, 살모넬라 엔테리카 서브스페시스 엔테리카 균주(Salmonella enterica subsp . enterica), 살모넬라 티피무리엄 균주(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 균주(Salmonella enteritidis) 등의 단독 균주 또는 이들이 조합된 복합균주가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "사료첨가용 조성물"이란, 가축의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위해서 사료에 첨가되는 물질을 의미한다.
본 발명의 용어 "생균제"란, 프로바이오틱스(probiotics)라고도 하고, 숙주동물의 장내 미생물 균총의 개선으로 숙주동물에 유익한 작용을 하는 살아있는 미생물을 포함하는 제제를 의미한다. 대체로, 상기 생균제는 그 자체로 비병원성일 뿐만 아니라 병원성 물질을 생산하지도 않으며, in vitro 증식이 용이하고, 생체 내에서 빠른 성장율을 나타내며, 내산성 및 내담즙성을 가지고, 실온에서도 그의 효과를 유지하는 등의 다양한 특징을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 생균제는 본 발명에서 최초로 규명한 상기 3종의 균주를 포함하는 생균제로 해석될 수 있는데, 상기 생균제는 동물용 사료첨가제, 사일리지용 생균제, 발효사료용 생균제를 포함하는 다양한 제품의 첨가물로서 사용될 수 있고, 상기 제품에 첨가되기 위하여, 액상 생균제, 생균분말 등의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 젖산균 락토바실러스 플라타넘 J-135, 효모 사카로마이세스 세레비제 DAE-4, 세균 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Pbs-17의 혼합균주를 포함하는 생균제 및 생균분말은 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 젖산균 락토바실러스 플라타넘 J-135, 효모 사카로마이세스 세레비제 DAE-4, 세균 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Pbs-17 균주는 단독으로 또는 다른 추출물, 부산물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 젖산균 락토바실러스 플라타넘 J-135, 효모 사카로마이세스 세레비제 DAE-4, 세균 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주는, 각각 통상의 방법에 따라 배양액, 분말의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 젖산균 락토바실러스 플라타넘 J-135, 효모 사카로마이세스 세레비제 DAE-4, 세균 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 스테비아 추출물 및 천연소재 추출물을 들 수 있다.
아울러, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제는 발효사료, 발효조사료, 사일리지 등의 가축용, 가금용, 어류양식용 발효사료의 제조에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 곡물발효시에도 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 사료첨가용 조성물 또는 생균제는 상기 유해균이 사료에 오염되는 것을 방지하기 위한 목적으로 사용될 수 있는데, 상술한 3종의 신규 미생물을 포함하는 상기 조성물 또는 생균제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 3종의 균주를 1:1:1(w/w/w)로 포함하는 조성물 또는 생균제가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 x 109CFU/㎖로 배양된 3종의 각 균주를 1:1:1(w/w/w)로 포함하는 조성물 또는 생균제가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 x 109CFU/㎖로 배양된 3종의 각 균주를 1:1:1(w/w/w)로 혼합한 혼합균주를 액상중량 기준으로 1%(w/w)가 되도록 포함하는 조성물 또는 생균제가 될 수 있다.
아울러, 본 발명의 사료첨가용 조성물 또는 상기 생균제는 상술한 3종의 신규 미생물 뿐만 아니라, 가축의 생산성 또는 건강 증진에 필요한 필수 영양소를 완전공급하는 데 필요한 뉴클레오티드류, 효소류, 미량성분 뿐만 아니라 가축의 생육을 보조하는 다른 미생물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드류로는 5'-아데닐산, 크산틴산, 리보핵산, 디옥시리보핵산 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 효소류로는 상기 3종의 미생물로부터 제공되지 않는 아라비나제(arabinase), 아라비노퓨라노시타제(arabinofuranosidase), 갈락타나제(galactanase), 펙티나제(pectinase), 말타제(maltase), 인버타제(invertase), 리파제(lipase) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 미량성분으로는 아미노산, 칼슘, 인산, 유기산 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 미생물로는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균주, 웨이셀라 속(Weisella sp.) 균주, 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.) 균주, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주, 노카르디아 속(Nocardia sp.) 균주 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 가축용 발효사료에 적합한 미생물 제제를 개발하기 위하여, 자연계에서 채취된 시료로부터 유산균, 진균 및 세균을 분리하고, 이 중에서 내산성, 내담즙성, 항균활성, 효소활성 등의 특징이 우수한 각 1종의 유산균, 효모균 및 세균을 선발하였다. 상기 선발된 균주의 16S rRNA를 코딩하는 유전자의 서열을 결정하고, 이를 종래의 균주의 것과 비교하여 동정한 결과, 상기 선발된 각 균주는 종래의 균주와 구별되는 새로운 균주임을 확인하였다. 이에, 상기 유산균은 "락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12508BP를 부여받았으며; 상기 효모균은 "사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12510BP를 부여받았으며; 상기 세균은 "바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12509BP를 부여받았다.
또한, 상기 동정된 각 균주의 내산성, 내담즙성, 효소활성 및 항균활성을 평가한 결과, 상기 유산균은 내산성(표 1)과 내담즙성(표 2)을 나타내고, 살모넬라 속 세균에 대한 항균활성을 나타내고(도 1 및 표 4), 상기 효모균은 내산성(표 1)과 내담즙성(표 2)을 나타내며, 상기 세균은 피타제, 프로테아제, 자일라나제, α-아밀라제 및 셀룰라제의 활성(표 3)을 나타낼 뿐만 아니라, 진균류에 대한 항균활성(도 2 및 표 4)을 나타냄을 확인하였다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 원료사료에 가하고, 이를 발효시켜서 제조된 발효사료를 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제는 사료에 오염될 수 있는 유해균의 증식을 억제할 수 있으므로, 이를 원료사료에 가하여 발효사료를 제조할 경우, 안전성 및 보존성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "원료사료"란, 상기 사료첨가용 조성물 또는 생균제가 첨가되는, 사료를 의미한다. 이러한 원료사료로는 단일사료, 배합사료 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "배합사료"란, 가축의 사육목적에 맞는 영양소를 고르게 공급할 수 있도록 배합하여 만든 사료를 의미하며, 상기 배합사료는 가축이 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등 영양소를 포함한다. 배합사료를 만들 때는, 영양적인 면에서 볼 때, 가축의 식욕을 증진시키고 소화기관의 정상적인 작용을 촉진시키기 위하여 적정량의 고형물(固型物)이 반드시 필요하며, 가축의 생산활동을 충분히 발휘시키기 위해 적당한 양의 단백질을 넣어 주어야 하며, 가축의 체온유지와 생산활동을 정상적으로 유지하기 위한 열량이 들어가야 하며, 기타 칼슘 또는 인과 같은 무기물과 비타민도 충분히 함유되어야 한다.
본 발명의 용어 "발효사료"란, 상기 원료 사료에 본 발명에서 제공하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 가하여 발효시켜서 제조된 발효사료를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 발효사료는 가축의 사료에 대한 상기 유해균의 오염을 방지하는 효과를 나타낼 수 있는데, 당업계에 공지되거나 시판되는 임의의 가축용 배합사료에 상기 사료첨가용 조성물을 추가함으로써 구성될 수 있으며, 상기 사료첨가용 조성물이 추가되기만 한다면 배합사료의 조성은 당업자에 의해 적절하게 조절될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 유해균 오염 방지용 발효사료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 가축용 배합사료에 통상적으로 사용되는 쌀, 발효대두분, 대두, 이탈리안그라스, 수단그라스, 호밀, 볏짚, 옥수수, 소맥피, 쌀겨, 당맥피 등을 단독으로 또는 조합하여 주성분으로 포함할 수 있고, 이들 주성분은 가축용 배합사료에 일반적으로 사용되는 적절한 범위로 포함될 수 있다.
한편, 상기 발효사료에 포함되는 유해균 오염 방지용 조성물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 발효사료의 최종 중량을 기준으로 0.01 내지 10%(w/w)가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5%(w/w)가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1%(w/w)가 될 수 있다.
또한, 상기 발효사료는 상술한 주성분 이외에 통상적인 가축용 배합사료에 포함될 수 있는 혈장 단백질, 어분, 유장, 복합유제품, 대두유, 아미노산 프리믹스, 산미제 프리믹스, 홍삼박, 소금, 비타민-미네랄 혼합물 등을 단독으로 또는 혼합하여 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 3종의 신규한 균주를 배합사료에 가하고 발효시켜서 발효사료를 제조한 다음, 상기 발효사료의 특성을 종래의 미생물 제제를 사용하여 제조된 발효사료와 비교한 결과, 본 발명의 발효사료는 유산균이 상대적으로 다량으로 증식하는 경향을 나타내었으나, 종래의 발효사료에 비하여는 과도하게 증식하지 않았고(도 3), pH는 발효시간의 경과에 따라 감소하였으며(도 4), 발효 후에도 부패하지 않음을 확인하였다(도 5).
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발효사료를 가축에 급이시키는 단계를 포함하는, 가축의 사육방법을 제공한다.
본 발명의 발효사료를 급이시킬 수 있는 가축은 특별히 이에 제한되지 않으나, 한우, 육우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 개, 고양이, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위 등이 될 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 원료사료에 본 발명의 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 발효사료의 제조방법을 제공한다.
상기 발효사료의 제조시 사용되는 원료사료는 본 발명에서 제공하는 발효사료의 제조에 사용될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 통상적으로 사용되는 쌀, 발효대두분, 대두, 이탈리안그라스, 수단그라스, 호밀, 볏짚, 옥수수, 소맥피, 쌀겨, 당맥피 등을 단독으로 또는 조합하여 주성분으로 포함하는 배합사료를 사용할 수 있고, 이들 주성분은 가축용 원료사료에 일반적으로 사용되는 적절한 범위로 포함될 수 있다.
또한, 상기 원료사료에 첨가되는 사료첨가용 조성물 또는 생균제는 본 발명에서 제공하는 락토바실러스 플라타넘J-135 균주, 사카로마이세스 세레비제 DAE-4 균주 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Pbs-17 균주를 각각 개별적으로 포함할 수도 있고, 이들의 혼합균주를 포함할 수 있는데, 이들 개별균주 또는 혼합균주를 포함하는 사료첨가용 조성물 또는 생균제의 원료사료에 대한 첨가량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 발효사료의 재료 및 무게, 곰팡이와 부패세균의 생육정도에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는데, 바람직하게는 락토바실러스 플라타넘 J-135, 사카로마이세스 세레비제 DAE-4 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Pbs-17의 액상 혼합균주를 1회 사용시 10 내지 100 mg/kg으로, 분말 혼합균주는 1 내지 10 mg/kg으로 첨가할 수 있다.
이때, 원료사료에 대한 상기 사료첨가용 조성물 또는 생균제의 첨가방법은 다양한 경로를 통하여 수행될 수 있다.
본 발명의 사료첨가용 조성물 또는 생균제를 이용하면 가축사료에 대한 유해균의 오염을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 발효사료의 부패를 방지하여 저장성을 향상시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 가축사육에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 3종의 살모넬라 속 세균(살모넬라 sp.1(Salmonella enterica subsp . enterica), 살모넬라 sp.2(Salmonella typhimurium) 및 살모넬라 sp.3(Salmonella enteritidis))에 대한 본 발명에서 제공하는 유산균의 항균활성을 나타내는 사진으로서, A는 살모넬라 sp.1에 대한 항균활성을 나타내고, B는 살모넬라 sp.2에 대한 항균활성을 나타내며, C는 살모넬라 sp.3(Salmonella enteritidis)에 대한 항균활성을 나타낸다.
도 2는 4종의 진균류(푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 페니실리움 sp.(Penicillium sp.) 및 푸사리움 sp.(Fusarium sp.))에 대한 본 발명에서 제공하는 세균의 항균활성을 나타내는 사진으로서, A는 푸사리움 솔라니에 대한 항균활성을 나타내고, B는 아스퍼질러스 플라부스에 대한 항균활성을 나타내며, C는 페니실리움 sp.에 대한 항균활성을 나타내고, D는 푸사리움 sp.에 대한 항균활성을 나타낸다.
도 3은 발효시간의 경과에 따라 발효사료에 포함된 유산균, 진균 및 세균의 균체수의 변화를 나타내는 그래프로서, A는 대조군 1의 발효사료(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, B는 대조군 2의 발효사료(타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, C는 실험군 1의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 0.5%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, D는 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, (●)는 유산균을 나타내고, (×)는 진균을 나타내며, (▲)는 세균을 나타낸다.
도 4는 발효시간의 경과에 따라 발효사료의 pH 변화를 나타내는 그래프로서, (●)는 대조군 1의 발효사료(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, (▲)는 대조군 2의 발효사료(타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, (■)는 실험군 1의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 0.5%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, (×)는 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타낸다.
도 5는 대조군 1(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)과 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)의 부패여부를 나타내는 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유산균, 효모균 및 세균의 선발
가축용 발효사료에 적합한 미생물 제제를 개발하기 위하여, 내산성, 내담즙성, 항균활성 및 효소활성이 우수한 유산균, 효모균 및 세균을 자연계로부터 분리동정하고자 하였다.
먼저, 자연계로부터 내산성, 내담즙성, 항균활성 및 효소활성이 우수한 균주를 분리하기 위해 항생제를 먹이지 않은 닭 내장과, 대전 근교에서 채취한 포도, 정읍시 내장산 토양 등의 시료를 채취하였다.
다음으로, 채취된 시료에 멸균수를 가하고, 30 ℃에서 30분간 진탕시킨 다음, 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액을 10,000배 부피로 희석하여 희석액을 수득하고, 상기 희석액 0.1㎖를 유산균을 선별하기 위한 MRS-Agar 배지(10.0g/ℓ Proteose Peptone, 10.0g/ℓ Beef Extract, 5.0g/ℓ 효모추출물, 20.0g/ℓ Glucose, 1.0g/ℓ Polysorbate 80, 2.0g/ℓ Ammonium Citrate, 5.0g/ℓ Sodium Acetate, 0.1g/ℓ Magnesium Sulfate, 0.05g/ℓ Manganese Sulfate, 2.0g/ℓ Dipotassium Phosphate 및 15.0g/ℓ 한천), 효모균을 선별하기 위한 YM-Agar 배지(3.0g/ℓ 효모추출물, 3.0g/ℓ Malt Extract, 5.0g/ℓ Peptone, 10.0g/ℓ Dextrose 및 15.0g/ℓ 한천) 또는 세균을 선별하기 위한 LB-Agar 배지(5.0g/ℓ 효모추출물, 10.0g/ℓ Tryptone, 10.0g/ℓ NaCl 및 15.0g/ℓ 한천)에 각각 접종하고, 30 ℃ 항온기에서 1 내지 3일동안 배양한 후, 상기 각 배지에서 생성된 단일 콜로니(single colony)를 형태학적으로 분석하여, 유산균, 효모균 및 세균을 각각 1차 선발하였다.
상기 1차 선발된 균주 중에서, 유산균, 효모균 및 세균을 각각 최종 선발하였다. 구체적으로, 유산균은 살모넬라 sp. 균주에 대한 항균활성, 0.1N-HCl로 pH를 조절한 조건에서의 내산성 및 인공 담즙에 대한 내담즙성을 나타내는 균주를 최종 선발하였고; 효모균은 0.1N-HCl로 pH를 조절한 조건에서의 내산성 및 인공 담즙에 대한 내담즙성을 나타내는 균주를 최종 선발하였으며; 세균은 각종 효소(protease, cellulase, α-amylase, xylanase 및 phytase)의 활성을 나타내고, 다양한 균주(푸사리움 sp., 아스퍼질러스 플라부스, 페니실리움 sp., 곰팡이)에 대한 항균활성을 나타내는 균주를 최종 선발하였다.
실시예 2: 선발된 유산균, 효모균 및 세균의 동정
상기 실시예 1에서 최종 선발된 유산균, 효모균 및 세균의 계통분류학적으로 동정하기 위하여, 상기 각 균주로부터 16S ribosomal RNA(rRNA)의 유전자인 16S rDNA를 증폭시킨 후, 증폭된 산물을 정제하여 자동염기서열 분석 장치(Applied Biosystems model 373A automatic sequencer)와 염기서열 분석키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems)에 적용하여, 상기 16S rDNA의 염기서열을 결정하였다.
상기 결정된 16S rDNA의 염기서열을 유전자은행의 블라스트 프로그램에 적용하여, 상기 16S rDNA에 포함된 internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene 그리고 internal transcribed spacer 2를 포함하는 571bp의 염기서열을 분석하였고, 그 결과는 다음과 같았다:
먼저, 유산균은 표준균주인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)과 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주임을 확인하여, 상기 유산균을 "락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에서 수탁번호 KCTC 12508BP를 부여받았다.
다음으로, 효모균은 표준균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주임을 확인하여, 상기 효모균을 "사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 수탁번호 KCTC 12510BP를 부여받았다.
끝으로, 세균은 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)와 높은 상동성을 나타내지만 동일하지는 않은 균주임을 확인하여, 상기 세균을 "바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)"라 명명하고, 2013년 10월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고 수탁번호 KCTC 12509BP를 부여받았다.
실시예 3: 동정된 유산균, 효모균 및 세균의 활성평가
상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균, 효모균 및 세균의 내산성, 내담즙성, 효소활성 및 항균활성을 평가하였다.
실시예 3-1: 내산성 평가
상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균 및 효모균의 내산성을 평가하였다(표 1).
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 9,000 rpm으로 25분동안 원심분리 하여 균주를 수득하였다. 또한, 상기 MRS 액체배지에 HCl을 첨가하여 pH 2.0 내지 5.0으로 조정된 각 배지를 수득하고, 상기 수득한 각 배지에 상기 수득한 균주를 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 접종하였으며, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 종료된 후, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 배양희석액을 수득하고, 상기 배양희석액을 MRS-Agar 배지에 접종한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 배양이 종료된 후, 생성된 집락의 수를 측정하고, pH 변화에 따른 집락수의 변화를 분석함으로서, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주의 내산성을 평가하였다. 이때, 대조군으로는 pH를 조정하지 않은 MRS 액체배지에서 배양된 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 사용하였다.
한편, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주와 YM 배지를 사용하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주의 내산성을 평가하였다.
내산성 평가
균주 pH
2.0 3.0 4.0 5.0 대조군
유산균 - 2.5 × 107 2.0 × 109 8.9 × 109 8.7 × 109
효모균 1.8 × 108 1.3 × 109 8.9 × 109 8.4 × 109 6.7 × 109
상기 표 1에서 보듯이, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(유산균) 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(효모균)는 pH 5.0 이하의 조건에서도 생육할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 상기 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주는 내산성을 나타내어 소장 및 대장에서 생육하면서 활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 내담즙성 평가
담즙산에 대한 내성(내담즙성)은 위에서의 산성조건에 대한 저항성과 더블어 프로바이오틱스 미생물이 갖추어야 할 기본적인 특성 중 하나이다. 담즙은 소장의 상부에서 분비되어 섭취된 지질식품의 소화, 흡수를 촉진하고, 미생물에 대해 세제와 유사한 작용을 함으로써 지방과 지방산으로 구성되어있는 미생물의 세포막에 영향을 주어 미생물 살균작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이에, 상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균 및 효모균의 내담즙성을 평가하였다(표 2).
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 9,000 rpm으로 25분동안 원심분리 하여 균주를 수득하였다. 또한, 0.5 내지 2%(v/v)의 인공담즙(돼지담즙, Sigma)을 포함하는 각각의 MRS 액체배지를 제작하고, 상기 제작된 인공담즙을 포함하는 각각의 MRS 액체배지에 상기 수득한 균주를 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 접종하였으며, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 종료된 후, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 배양희석액을 수득하고, 상기 배양희석액을 MRS-Agar 배지에 접종한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 생성된 집락의 수를 측정하고, 인공담즙의 농도 변화에 따른 집락수의 변화를 분석함으로서, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주의 내담즙성을 평가하였다. 이때, 대조군으로는 인공담즙을 포함하지 않은 MRS 액체배지에서 배양된 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 사용하였다.
한편, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주와 YM 배지를 사용하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주의 내담즙성을 평가하였다.
내담즙성 평가
균주 담즙(bile, %)
0.5 1.0 2.0 대조군
유산균 5.0 × 107 4.0 × 107 1.2 × 106 8.7 × 109
효모균 7.4 × 108 1.9 × 108 1.6 × 108 6.7 × 109
상기 표 2에서 보듯이, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(유산균) 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(효모균)는 인공담즙의 농도가 증가할 수록 균주의 생존율이 감소되었으나, 최대함량의 인공담즙을 포함하는 배지에서도 일정 수준의 균주가 유지됨을 확인하였다.
따라서, 상기 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주는 내담즙성을 나타내어 소장 및 대장에서 생육하면서 활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-3: 효소활성 평가
상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균, 효모균 및 세균에서 생산되는 다양한 효소(lipase, phytase, protease, Xylanase, α-amylase 및 cellulase)의 활성을 평가하였다(표 3).
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 희석된 배양희석액을 수득하고, 상기 배양희석액을 효소활성 평가용 기질이 포함된 MRS-Agar 배지에 접종한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 배양된 배지에서 형성되는 투명환 또는 노란색환의 크기를 측정함으로써, 다양한 효소의 활성을 평가하였다. 이때, 리파제(lipase) 활성은 1%(w/v) 트리카프릴린(tricaprylin)이 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양후 형성되는 투명환의 크기를 측정하여 평가하고; 피타제(phytase) 활성은 0.1%(w/v) 소듐피테이트(sodium phytate)가 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양후 형성되는 투명환의 크기를 측정하여 평가하였으며; 프로테아제(protease) 활성은 1%(w/v) 탈지분유(skim milk)가 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양후 형성되는 투명환의 크기를 측정하여 평가하고; 자일라나제(xylanase) 활성은 0.5%(w/v) 바이르키우드 자일란(birchwood xylan)이 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양한 다음, 콜로니 주변에 0.5% Congo-red로 15분간 염색하여 생성되는 투명환의 크기를 측정하여 평가하였으며; α-아밀라제(α-amylase) 활성은 1%(w/v) 가용성 전분이 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양한 다음, 콜로니 주변에 Rugol's 용액을 적가하여 생성되는 노란색 환의 크기를 측정하여 평가하고; 셀룰라제(cellulase) 활성은 0.5%(w/v) CMC(carboxymethyl cellulose)가 첨가된 MRS-Agar 배지를 사용하여 배양한 다음, 0.2% Congo-red로 15분간 염색하고, 1M NaCl로 탈염시킨 후에 잔류하는 노란색 환의 크기를 측정하여 평가하였다.
다음으로, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주와 YM 배지를 사용하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주의 효소활성을 평가하였다.
끝으로, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주와 LB 배지를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주의 효소활성을 평가하였다.
효소활성 평가
균주 효소활성(mm)
리파제 피타제 프로테아제 자일라나제 α-아밀라제 셀룰라제
유산균
효모균
세균		 -
-
-		 -
-
10		 -
-
22		 -
-
18		 -
-
13		 -
-
18
상기 표 3에서 보듯이, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(유산균) 및 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(효모균)는 효소활성을 전혀 나타내지 않았으나, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주(세균)는 리파제를 제외한 피타제, 프로테아제, 자일라나제, α-아밀라제 및 셀룰라제의 활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주는 다양한 효소활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-4: 항균활성 평가
상기 실시예 2에서 동정된 각 유산균, 효모균 및 세균의 항균활성은 3종의 살모넬라 속 세균(살모넬라 sp.1(Salmonella enterica subsp . enterica), 살모넬라 sp.2(Salmonella typhimurium) 및 살모넬라 sp.3(Salmonella enteritidis))과 4종의 진균류(푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 페니실리움 sp.(Penicillium sp .) 및 푸사리움 sp.(Fusarium sp .))를 대상으로 측정하였다(도 1, 2 및 표 4).
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여, 배양물을 수득하였다. 상기 배양물 100㎖를 여과지에 흡수시킨 디스크를 수득하고, 이를 3종의 살모넬라 속 세균이 배양된 각 NB 배지의 상단에 위치시킨 후, 37℃에서 24시간 배양하였으며, 배양후 NB 배지에서 생성되는 투명환의 크기를 측정하였다(도 1). 또한, 상기 4종의 진균류가 배양된 PDA 배지의 가장자리에 상기 수득한 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주의 배양물을 접종하고, 25℃에서 배양하여 곰팡이의 생육을 저해하는 환의 크기를 측정함으로써, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주의 항균활성을 평가하였다.
다음으로, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주와 YM 액체배지를 사용하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주의 항균활성을 평가하였다.
끝으로, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주와 LB 배지를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주의 항균활성을 평가하였다.
도 1은 3종의 살모넬라 속 세균(살모넬라 sp.1(Salmonella enterica subsp . enterica), 살모넬라 sp.2(Salmonella typhimurium) 및 살모넬라 sp.3(Salmonella enteritidis))에 대한 본 발명에서 제공하는 유산균의 항균활성을 나타내는 사진으로서, A는 살모넬라 sp.1에 대한 항균활성을 나타내고, B는 살모넬라 sp.2에 대한 항균활성을 나타내며, C는 살모넬라 sp.3에 대한 항균활성을 나타낸다. 또한, 상기 A 내지 C에 표시된 Lp는 본 발명에서 제공하는 유산균을 처리한 실험군을 나타내고, C는 공지된 항생제(tetracycline)를 처리한 대조군을 나타낸다.
도 2는 4종의 진균류(푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 페니실리움 sp.(Penicillium sp .) 및 푸사리움 sp.(Fusarium sp .))에 대한 본 발명에서 제공하는 세균의 항균활성을 나타내는 사진으로서, A는 푸사리움 솔라니에 대한 항균활성을 나타내고, B는 아스퍼질러스 플라부스에 대한 항균활성을 나타내며, C는 페니실리움 sp.에 대한 항균활성을 나타내고, D는 푸사리움 sp.에 대한 항균활성을 나타낸다.
아울러, 상기 도 1 및 2에서 측정된 생육을 저해하는 환의 직경을 하기 표 4에 나타내었다.
항균활성 평가
균주 항균활성(mm)
살모넬라
sp. 1		 살모넬라
sp. 2		 살모넬라
sp. 3		 푸사리움
솔라니		 푸사리움
sp.		 아스퍼질러스 플라부스 페니실리움 sp.
유산균
효모균
세균		 12
-
-		 14
-
-		 10
-
-		 -
-
10		 -
-
15		 -
-
9		 -
-
12
도 1, 2 및 표 4에서 보듯이, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(유산균)는 살모넬라 속 세균에 대하여는 항균활성을 나타내었으나, 진균에 대하여는 항균활성을 나타내지 않고, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(효모균)는 세균 및 진균에 대하여 항균활성을 전혀 나타내지 않았으며, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주(세균)는 세균에 대하여는 항균활성을 나타내지 않았으나, 진균에 대하여는 항균활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주와 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주의 혼합제제는 세균과 진균에 대한 항균활성을 동시에 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4: 발효사료의 제조 및 특성분석
실시예 4-1: 발효사료의 제조
먼저, 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주를 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 희석된 배양희석액을 수득하였다.
다음으로, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주를 YM 액체배지에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 희석된 배양희석액을 수득하였다.
그 다음으로, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주를 LB 액체배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물에 멸균된 생리식염수를 가하여 1.9 x 109 CFU/㎖의 농도가 되도록 희석된 배양희석액을 수득하였다.
끝으로, 상기 수득한 3종의 배양희석액을 동일부피로 혼합하여 혼합균주 배양액을 수득하였다.
상기 수득한 혼합균주 배양액을 배합사료(178kg/t 이탈리안그라스 사일리지, 178kg/t 수단그라스 사일리지, 133kg/t 호밀 사일리지, 222kg/t 볏짚 사일리지, 111kg/t 옥수수 사일리지, 33kg/t 소맥피, 45kg/t 쌀겨, 33kg/t 당맥피, 62kg/t 홍삼박, 3kg/t 소금 및 2kg/t 비타민-미네랄 혼합물)에 각각 0.5(실험군 1) 또는 1%(w/w)(실험군 2)로 첨가하고, 상기 배양액이 첨가된 배합사료를 대형자루에 500kg씩 담은 후 밀봉하고 3주 동안 발효시켜서, 각각의 발효사료를 제조하였다.
한편, 대조군의 발효사료로는 타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료(대조군 1)와, 타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료(대조군 2)를 사용하였다.
실시예 4-2: 발효시간의 경과에 따른 균체수의 변화
상기 실시예 4-1에서 제조된 대조군과 실험군의 각 발효사료에 포함된 유산균, 진균 및 세균의 균체수의 변화를 발효시간의 변화에 따라 측정하였다. 대략적으로, 발효후 1, 3, 5, 7, 14 및 21일이 경과된 시점에서 시료를 채취하고, 채취된 각 시료 1g에 멸균된 생리식염수를 가하여 107 배 희석된 희석액을 수득한 다음, 상기 희석액 100㎕를 LB-Agar 배지, MRS-Agar배지 또는 PDA 배지에 접종하였으며, 25℃(PDA 배지) 또는 37℃(LB 고체배지, MRS 고체배지)에서 배양하여, 각각 세균, 유산균 및 진균을 선별배양하고, 배양이 종료된 후 생성된 집락을 계수하였으며, 이를 비교하였다(도 3).
도 3은 발효시간의 경과에 따라 발효사료에 포함된 유산균, 진균 및 세균의 균체수의 변화를 나타내는 그래프로서, A는 대조군 1의 발효사료(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, B는 대조군 2의 발효사료(타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, C는 실험군 1의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 0.5%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, D는 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, (●)는 유산균을 나타내고, (×)는 진균을 나타내며, (▲)는 세균을 나타낸다.
도 3에서 보듯이, 대조군의 경우에는 발효시간이 경과함에 따라, 특정 미생물이 과도하게 증식되었으나, 본 발명의 혼합균주 배양액이 첨가된 발효사료는 유산균이 상대적으로 다량으로 증식하는 경향을 나타내었으나, 대조군에 비하여 과도하게 증식하지는 않음을 확인하였다.
상기 증식된 유산균은 기타 부패균 및 곰팡이의 생육을 억제할 수 있으므로, 발효사료의 부패 및 병원성 곰팡이로 인한 위험성을 방지하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4-3: 발효시간의 경과에 따른 pH 의 변화
상기 실시예 4-1에서 제조된 대조군과 실험군의 각 발효사료의 pH 변화를 발효시간의 변화에 따라 측정하고, 비교하였다. 대략적으로, 발효후 1, 3, 5, 7, 14 및 21일이 경과된 시점에서 시료를 채취하고, 채취된 각 시료 1g에 멸균된 증류수 9㎖을 가하여 30분 동안 교반하였으며, 상기 교반액의 pH를 측정하고, 이를 비교하였다(도 4).
도 4는 발효시간의 경과에 따라 발효사료의 pH 변화를 나타내는 그래프로서, (●)는 대조군 1의 발효사료(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, (▲)는 대조군 2의 발효사료(타사의 혼합생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내며, (■)는 실험군 1의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 0.5%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타내고, (×)는 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)를 나타낸다.
도 4에서 보듯이, 대조군 1의 발효사료는 발효시간이 경과하여도 중성 pH를 유지하는 반면, 대조군 2, 실험군 1 및 실험군 2의 발효사료는 발효시간이 경과함에 따라, pH가 저하됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 발효사료는 낮은 수준의 pH를 유지하여 잡균과 부패균주의 생육을 억제할 수 있으므로, 저장성이 향상됨을 다시 한번 확인할 수 있었다.
실시예 4-4: 발효시간의 경과에 따른 부패여부
상기 대조군 1의 발효사료와 실험군 2의 발효사료를 21일 동안 발효시킨 후에 부패여부를 확인하였다(도 5). 도 5는 대조군 1(타사의 유산균 생균제를 1%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)과 실험군 2의 발효사료(본 발명의 혼합균주 배양액이 1.0%(w/w) 첨가하여 발효시킨 발효사료)의 부패여부를 나타내는 사진이다.
도 5에서 보듯이, 유산균 생균제를 첨가하여 발효시킨 발효사료(대조군 1)는 발효후에 부패된 반면, 본 발명의 혼합균주 배양액을 첨가하여 발효시킨 발효사료(실험군 2)는 발효후에도 부패하지 않음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 발효사료는 우수한 보존성을 나타냄을 알 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC12508BP 20131025 한국생명공학연구원 KCTC12509BP 20131025 한국생명공학연구원 KCTC12510BP 20131025

Claims (11)

  1. 수탁번호 KCTC 12508BP의 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(Lactobacillus plantarum J-135), 수탁번호 KCTC 12510BP의 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 수탁번호 KCTC 12509BP의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는, 사료첨가용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물에 포함된 상기 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주, 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주의 함량비는 1:1:1(w/w/w)인 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 사료첨가용 조성물은 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주, 푸사리움 속(Fusarium sp.) 균주, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주, 페니실리움 속(penicillium sp.) 균주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 균주에 대하여 항균활성을 나타내는 것인 조성물.
  4. 수탁번호 KCTC 12508BP의 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(Lactobacillus plantarum J-135), 수탁번호 KCTC 12510BP의 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 수탁번호 KCTC 12509BP의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는, 생균제.
  5. 수탁번호 KCTC 12508BP의 락토바실러스 플랜타럼 J-135 균주(Lactobacillus plantarum J-135), 수탁번호 KCTC 12510BP의 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4 균주(Saccharomyces cerevisiae DAE-4) 및 수탁번호 KCTC 12509BP의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17 균주(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17)를 포함하는, 발효사료.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 발효사료는 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주, 푸사리움 속(Fusarium sp.) 균주, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주, 페니실리움 속(penicillium sp.) 균주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 균주에 대하여 항균활성을 나타내는 것인 발효사료.
  7. 제5항의 발효사료를 가축에 급이시키는 단계를 포함하는, 가축의 사육방법.
  8. 원료사료에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 사료첨가용 조성물 또는 제4항의 생균제를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 발효사료의 제조방법.
  9. 수탁번호 KCTC 12508BP의 락토바실러스 플랜타럼 J-135(Lactobacillus plantarum J-135).
  10. 수탁번호 KCTC 12510BP의 사카로마이세스 세레비지애 DAE-4(Saccharomyces cerevisiae DAE-4).
  11. 수탁번호 KCTC 12509BP의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 PBS-17(Bacillus amyloliquefaciens PBS-17).
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