KR20190024612A - 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 및 이를 이용한 대두 발효물의 제조 방법 - Google Patents

신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 및 이를 이용한 대두 발효물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주 (KCCM12038P)를 대두박 또는 대두 단백 농축물에 접종하는 단계 및 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주를 배양하여 발효시킨 대두박 또는 발효 대두 단백 농축물을 수득하는 단계를 포함하는, 대두 발효물을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 대두 발효물 그리고 상기 발효물을 포함하는 동물 사료 조성물에 관한 것으로, 상기 방법으로 제조된 대두 발효물은 점액질을 포함하지 않으며, 항균성이 우수하고, 저분자 펩타이드의 함량이 높다.

Description

신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 및 이를 이용한 대두 발효물의 제조 방법 {A Novel Bacillus amyloliquefaciens Bacterium strain and Method for Producing Fermented Soy Products using the Same}
본 출원은 신규한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34(KCCM12038P) 균주 및 이를 이용한 대두 발효물 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 동물 사료에는 단백질 원으로 어분이 포함되지만, 최근 어분 생산국 내의 어분 생산이 감소하거나 어분 수급이 불안정해짐에 따라 전 세계적으로 어분의 가격은 상승하고 있다. 이에 따라 동물성 단백질인 어분을 대체하는 식물성 소재의 단백질의 필요성이 증가하여 이를 개발하고자 하는 노력이 계속되어 왔다. 대표적인 식물성 소재의 단백질은 견과류, 콩, 곡물에 포함되는 단백질이 있으나, 콩 단백질 중 대두는 다른 콩과 비교하여 단백질과 지방산, 다당류가 더욱 풍부한 것으로 알려져 있다.
탈지 대두박(이하 '대두박'이라 한다)은 단백질과 지방의 함량이 높은 대두로부터 유지를 추출한 후 남은 부산물이다. 그러나, 대두박은 다양한 항영양인자 (anti-nutritional factor, ANF)가 함유되어 사료로 이용되는 경우 소화율이 저해된다는 문제점이 있다 (Li et al., J. Anim Sci., 68:1790, 1990). 특히, 트립신 저해인자 (trypsin inhibitor, TI)는 생체 내에서 효소활성을 저해하여 단백질의 이용성을 저하시키는 대표적인 항영양인자로 알려져 있고 특히 어린 가축용 사료에 항영양인자가 첨가되는 경우 그 사용량을 제한하고 있다. 또, 대두박으로부터 물 또는 식염을 이용하여 대두 단백이 추출된다. 이러한 대두 단백은 탈지 대두박으로부터 수용성 및 비수용성 탄수화물과 같은 비단백 성분을 제거하는 정도에 따라, 탈지 대두 가루 (defatted soy flour), 대두 단백 농축물 (soy protein concentrate), 조직 대두 단백 (structured soy protein), 가수분해 대두 단백질 (hydrolyzed soy protein) 또는 대두 단백 분리물 (soy protein isolate)의 대두 단백질 가공품으로 구분될 수 있다. 또한, 대두 단백은 단백질 함량이 높기 때문에, 육가공 식품, 우유 가공 식품, 빵이나 스낵류 식품 외에도, 가축 사료에도 활용될 수 있다.
하지만, 대두박으로부터 추출된 대두 단백은 단백질의 서브유닛들로 이루어진 고분자의 단백질과 소화를 저해하는 항영양인자 등을 다수 포함하고 있다. 특히 항영양인자는 주로 식물성 단백질 내에 존재하며, 동물의 소화 능력을 저해시키는 요인으로 알려져 있다. 따라서, 대두 단백을 사료에 사용하기 위해서는 동물의 사료 소화율을 높일 수 있도록 항영양인자를 감소시키고, 고분자량의 단백질을 저분자량의 펩타이드로 전환시키는 연구가 필요하다.
한편, 현재 생산되고 있는 대두 단백 농축물 (soy protein concentrates), 대두 단백 분리물 (soy protein isolate) 또는 가수분해 대두 단백질 (hydrolized soy protein) 등과 같은 대두 단백질 가공품은 화학적 처리 또는 효소적 처리에 의하여 생산되고 있다. 그러나 화학적 가공방법은 생산 단가가 높고 제조 과정 중 열처리, 화학적 처리, 열건조 등으로 인하여 단백질 변성 및 수용성 아미노산의 소실 등이 일어나 실제 단백질의 용해도가 낮아지는 문제점을 갖는다. 이로 인해 화학적 가공방법은 단백질의 극심한 변성이 일어나지 않을 정도에서 열처리를 하기 때문에 항영양인자인 트립신 억제인자가 결과물인 대두 단백질 가공품 내에 상당량 존재하게 된다.
이와 같은 대두 단백질 가공품의 화학적 가공방법의 문제점을 해결하는 수단으로 바실러스균 또는 곰팡이를 이용하여 발효시키는 생물학적 가공방법의 발효 대두박 제품이 개발되었다(대한민국 등록특허 제10-0645284호, 제10-0459240호, 제10-0925173호 및 제10-1139027호). 그러나 상기 생물학적 가공방법으로 제조된 발효 대두박 또는 발효 대두 단백 농축물이라 하더라도 소화율 향상과 관련되는 가공품 내의 저분자 펩타이드 함량 및 항영양인자 함량은 상기 사용하는 바실러스, 유산균 및 효모와 같은 미생물의 종과 균주에 따라 달라지며, 특히 동일한 미생물 종이라도 각 균주별 효소 생산능력과 생장속도 등에 따라서도 함량은 변화할 수 있다 (대한민국 등록특허 제10-1517326호). 즉, 생물학적 가공방법에 있어서 사용되는 균주는 최종 대두 단백질 가공품의 특징과 소화율에 차이를 나타내는 결정적 요소가 된다.
본 출원 관련 선행기술로서 한국 등록특허 제10-0645284호, 제10-0459240호, 제10-0925173호, 및 제10-1139027호가 공지되어 있다. 상기 문헌에 개시된 기술에 따르면, 바실러스 서브틸리스, 아스퍼질러스 오리재, 락토바실러스 루테리, 사카로마이세스 세레비지에의 미생물 군의 종균을 이용하여 발효 처리과정에서 다수의 항영양인자를 제거하고, 나아가 단백질이나 탄수화물을 소화가 쉬운 저분자 형태로 분해할 수 있어 소화 흡수율이 높은 고품질의 사료용 단백 소재를 제공할 수 있는 것이 사실이다. 그러나, 대두박 또는 대두 단백 농축물의 발효에 이용되는 상기 미생물군, 특히 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스는 항균력이 낮아 외부 오염 균주에 대한 저항력이 약하고, 단백 분해 효소 생산능이 낮다는 단점이 있다. 이밖에도, 일부 미생물 균주들은 발효과정 중 점액질을 생성하는데, 이러한 점액질로 인하여 발효물의 통기성이 악화되어 호기적 발효의 효율성을 저하시킨다는 단점이 있다.
한편, 본 출원 관련 선행기술로서 대한민국 등록 특허 제10-1517326호에 출원인이 공개한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K2G 균주는 트립신 저해인자를 포함한 항영양인자를 제거하고 단백질 분해능이 크고 항균력이 있으며 저분자화된 펩티드를 함유하는 동물사료를 제공하는 데에 유용하다. 하지만, 상기 선행 문헌들에는, 살모넬라, 비브리오, 포토박테리움과 같은 균을 포함하는 다양한 병원성 미생물에 대한 항균력이 우수하고 대두 발효물 내 저분자 펩타이드 함량을 높이며, 점액질의 생성을 저해할 수 있는 신규 균주 및 이를 이용한 대두 발효물 제조방법에 대하여는 아무런 개시나 교시된 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 (KCCM12038P) 균주를 대두박 또는 대두 단백 농축물에 접종하여 저분자 펩타이드의 대두 발효물을 제조하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 저분자 펩타이드 함량을 높인 항균력이 우수하고 점액질 생성이 없는 대두 발효물을 개발함으로써 본 출원을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-0645284호 (2006.11.06. 등록) 대한민국 등록특허 제10-0459240호 (2004.11.19. 등록) 대한민국 등록특허 제10-0925173호 (2009.10.29. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1517326호 (2015.04.27. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1139027호(2012.04.16. 등록)
Li et al., J. Anim Sci., 68:1790, 1990
본 출원의 목적은 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 (KCCM12038P) 균주를 대두박 또는 대두 단백 농축물에 접종하여 저분자 펩타이드의 대두 발효물을 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 출원의 다른 목적은 저분자 펩타이드 함량을 높인 항균력이 우수하고 점액질 생성이 없는 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 (KCCM12038P) 균주를 제공하는 데에 있다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 항균력이 우수하고 점액질 생성이 없는 대두 발효물을 제공하는 데에 있다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 대두 발효물이 포함된 동물 사료 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 출원은, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 (KCCM12038P) 균주를 대두박 또는 대두 단백 농축물에 접종하는 단계 및 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주를 배양하여 발효시킨 대두박 또는 발효 대두 단백 농축물을 수득하는 단계를 포함하는, 대두 발효물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 출원에 따른 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주는 단백 분해 효소 활성이 우수하고, 병원균에 대한 항균력이 우수하며, 발효시 점액질 생성능이 저감되어 있는 바, 고품질의 대두 발효물을 제조할 수 있다.
본 출원에서 용어 “대두 발효물”은 상기 대두 단백 농축물 또는 대두박에 본 출원 균주 또는 대조군의 균주를 접종 발효하여 수득한 산물, 발효 대두 단백 농축물 또는 발효 대두박을 의미한다.
본 출원에서 용어 “대두 단백 농축물”이란 두과 작물인 대두에서 추출한 단백질의 농축물을 지칭한다. 대두에서 추출한 단백질은 콩에서 Haxane 등 유기용매를 사용하여 콩기름을 추출한 후 남은 건더기인 탈지 대두에서 수용성 및 비수용성 탄수화물과 같은 비단백질을 제거한 것이다.
본 출원에서 용어 “대두박”이란 두과작물인 대두로부터 착유 후 생기는 산물로 가장 많이 사용되는 식물성 단백질 사료이다. 대두박은 동물에게 급여하는 가장 경제적이고 고품질의 식물성 단백질 사료로서 콩으로부터 기름을 추출시 생기는 부산물이다.
본 출원에서 용어 “바실러스 아밀로리퀴페시언스”는 바실러스 속의 미생물로 그램 양성 토양 세균이다. 바실러스 서브틸리스와 근연관계가 있는 것으로 알려져 있고 BamH1 효소 및 ribonuclease의 일종인 barnase(바나아제)라는 항생제를 생성한다. 상기 토양 세균은 농업에서 특히 식물의 뿌리 감염원에 대응하는 항균 활성기능균으로 알려져 있다.
최근 동물 사료에는 항생제 사용이 제한되고 있으며, 단백질 소스로는 식물성 단백질인 대두 발효물이 사용되고 있는 추세이다. 따라서, 병원성 미생물로 인한 질병 피해를 줄이고자 하는 측면에서, 사료 조성물의 천연 항균성, 특히, 대두 발효물의 항균력이 중요해지고 있다. 이에, 본 발명자들은 활성이 뛰어난 단백 분해 효소를 제조하면서도 발효시 점액질 생성능이 저감되어 있는 동시에 다양한 병원균에 대한 항균력을 갖는 균주를 개발하고자 노력하였다. 구체적으로, 종래에 대두 발효물을 제조하기 위해 사용되는 것으로 알려진 바실러스 아밀로리퀴페시언스를 준비한 후, 이에 균주 개량을 위하여 UV를 조사하여 균주를 선별, 분리하였으며, 이들 중 다양한 병원성 미생물에 대한 항균력이 우수한 본 출원의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34를 선별할 수 있었다. 본 출원에서 용어 “개량”은 균주의 결점이나 생산성을 보완하기 위하여 돌연변이(mutation), 유전자 재조합(genetic recombination), 유전자 조작(gene cloning)의 방법이 사용될 수 있으며 돌연변이는 유전자, 염색체 혹은 유전체 돌연변이를 포함한다. 상기 돌연변이를 유도하기 위하여 UV를 이용한 물리적 돌연변이, 화학적 돌연변이, 생물학적 돌연변이가 사용될 수 있으며 UV는 UV 램프를 이용하여 200 내지 300nm의 파장이 95 내지 100%의 치사율에 이르는 시간 동안 조사될 수 있다. 본 출원에서는 A254nm의 UV 파장이 야생형 균주의 치사율이 99.99%에 이르는 시간 동안 조사되어 콜로니를 형성한 변이 균주들만을 분리하여 수득한다.
일 실시예에 따르면, 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 는, 병원균에 대한 항균력이 우수하다. 예를 들면, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34는 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhymurium), 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 포토박테리움 담셀 (Photobacterium damsel), 리스토넬라 안귈라럼 (Listonella anguillarum) 및 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 병원균에 대하여 항균력을 갖는다. 상기 항균력은 희석법(dilution method), 생육저해환 크기 측정법(disk diffusion test), E-TEST 등을 사용하여 측정할 수 있다.
구체적으로, 살모넬라 균은 가축에 식중독을 일으킬 수 있으며, 비브리오 종을 비롯한 다른 균들은 패혈증, 비브리오 콜레라, 새우 비브리오증, 방어류 결정증 및 넙치에드워드병을 포함하는 양어에 질병을 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 이러한 병원성 균에 대하여, 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스는 병원성 균의 생육을 효과적으로 억제하는 바, 이를 이용하여 제조된 대두 발효물 또는 이를 포함하는 대두 발효물은 상기 병원균들에 대한 항균성을 가질 수 있다.
종래의 대두 발효물은, 발효 과정 중에 생산되는 효소에 의하여 원료 대두의 당질, 단백질에서 유래된 레반형의 프락탄 (levan form fructan)과 폴리글루탐이트 (polyglutamate)의 중합으로 인하여 끈적끈적한 점액질이 생성된다는 문제점이 있었다. 이러한 점액질의 생성은 대두 발효물을 덩어리로 뭉치게 하여, 교반을 어렵게 하고 발효물 내의 용존 산소, 온도의 제어와 이송을 어렵게 하여 대량 생산 공정 상에서 많은 문제점을 야기하였다. 상기 점액질의 생성 여부는 콜로니의 표현형 관찰로 그 점성이나 광택을 측정하거나 폴리-γ-글루탐산과 같은 고분자 물질의 함량을 측정하여 판단할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34는, 점액질 생성능이 낮을 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스로 제조된 대두 발효물은 끈적끈적한 점액질의 함유량이 낮고, 덩어리로 뭉치는 현상이 거의 없는 바, 이를 이용하여 고품질의 대두 발효물을 제조할 수 있다 (실시예 4 참조).
일 실시예에 의하면 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 는 활성이 뛰어난 단백 분해 효소를 생산하여 고분자로 구성되어 있는 대두 단백질을 대부분 가수분해함으로써 저분자 펩타이드로 분해하여 대두 발효물의 소화 흡수율을 크게 증가시킬 수 있다. 본 출원의 펩타이드는 다양한 조합의 아미노산이 펩타이드 결합에 의한 중합물을 형성하고 있는 것으로 일반적으로는 2 내지 50개의 아미노산이 결합되어 있는 형태를 지칭하며 저분자 펩타이드는 분자량(Molecular Weight)이 작은 펩타이드로 소화시 흡수를 용이하게 하여 동물 사료로 적용시 소화율을 증가시키는 장점이 있다. 최종 제조하고자 하는 목적의 가수분해물이 포함하는 저분자 펩타이드 종류와 구성비에 따라 상기 원료인 대두 단백 농축물의 수분 함량, 단백질 함량 조건 등을 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스로 제조된 대두 발효물은 분자량 30KDa 이하의 저분자 펩타이드를 40 중량% 이상 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 대두 발효물은, 분자량 30KDa 이하의 펩타이드를 40 내지 100 중량%, 50 내지 95 중량%, 60 내지 90 중량%, 70 내지 90 중량%, 75 내지 90 중량%, 75 내지 85 중량%, 또는 80 내지 85 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 대두 발효물은 10KDa 이하의 펩타이드를 15 중량% 이상 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 대두 발효물은 10KDa 이하의 펩타이드를 15 내지 80 중량%, 20 내지 70 중량%, 30 내지 65 중량%, 40 내지 65 중량%, 또는 50 내지 60 중량% 포함할 수 있다. 일실시예에 따르면, 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스로 제조된 대두 발효물은 발효 전과 비교하여 단백질의 함량이 증가된 것일 수 있다. 이는 종래에 알려진 균주로 발효된 대두 발효물과 비교하더라도 더 빠른 시간 내에 단백질 함량을 높여 발효시간을 단축시킬 수 있음을 나타낸다. 즉, 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스는 대두 발효물 내 저분자 펩타이드 함량을 크게 증가시켜 사료의 품질을 높이며, 더 빠르게 단백질 함량을 증가시켜 발효시간을 단축시킬 수 있다.
본 출원의 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주의 16S RNA를 분석한 결과, 표준 균주인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 아종. 플란타룸(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum) FZB42T(CP000560)과 가장 가까운 근연 관계를 나타내었고, 16S rRNA 유전자 서열 상동성은 99.93%(1507 bp / 1508 bp)로 확인되었다. 이에, 본 출원에 따른 상기 변이 균주 CJ24-34는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 아종 플란타룸 CJ24-34로 명명되었고, 부다페스트 조약에 따라 2017년 6월 15일자 한국미생물보존센터(Korean Culture of Microorganisms, KCCM)에 기탁번호 KCCM12038P를 부여받았다.
일 실시예에 따르면, 상기 대두 발효물의 제조방법은, 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 (KCCM12038P) 균주를 대두박 또는 대두 단백 농축물에 접종하는 단계 이전에, 대두박 또는 대두 단백 농축물의 수분 함량을 조절하고, 열처리한 후, 냉각하여 준비하는 단계를 더 포함할 수 있다. 원료인 대두박 또는 대두 단백 농축물은 고체 발효 하기 전에 적당량의 물을 직접 분무하거나 혼합하여 수분 함량을 조절한 다음 일정 시간 동안 열처리 하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 상기 수분 함량은 목적하는 대두 발효물의 단백질 또는 저분자 펩타이드 함량, 또는 발효 시간을 설정하기 위한 목적에서 조절될 수 있다. 또한, 열처리의 목적은 원료 내 잡균을 사멸시키고, 원료가 갖고 있는 세포벽을 파괴하여 단백질을 변성시켜, 목적하는 미생물이 활발하게 생육할 수 있는 환경을 제공하기 위한 것이다. 열처리 방법은 해당 기술 분야에 널리 알려진 다양한 방법을 제한 없이 이용할 수 있다. 구체적으로는 스팀 또는 과열 수증기 (superheated steam)를 이용하여 수행될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 출원 대두박 또는 대두 단백 농축물의 수분함량은 30 내지 80%(v/w)로 조절하고, 열처리를 10 내지 30분 동안, 열처리 온도를 70 내지 130℃로 조절한 후, 30 내지 50℃에서 냉각하여 준비할 수 있으며, 본 출원 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 배양액을 각 대두박 및 대두 단백 농축물의 중량 대비 10 중량 % 접종하여 20 내지 50℃에서 8 내지 72시간 동안 발효시킬 수 있다.
보다 구체적으로 상기 대두 대두박 또는 대두 단백 농축물의 조절 수분함량(v/w)은 30 내지 80%, 30 내지 70%, 30 내지 60%, 30 내지 50%, 30 내지 40%, 40 내지 80%, 40 내지 70%, 40 내지 60%, 40 내지 50%일 수 있다. 대두박의 수분 함량은 목적하는 발효 대두박의 단백질 또는 저분자 펩타이드 함량, 또는 발효 시간을 설정하기 위한 목적에서 저수분이나 고수분 조건으로 적절하게 조절할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 열처리 온도가 낮거나 처리 시간이 짧은 경우에는, 잡균의 살균 효과가 저하되고 이후의 발효 공정이 원활하게 진행되지 않는 문제점이 있으며, 열처리 온도가 높거나 처리 시간이 길어지는 경우에는 대두박 내 단백질의 변성으로 인하여 소화율이 감소되어 최종 제품의 품질이 저하되는 문제점이 발생한다. 따라서, 이러한 문제점이 발생하지 않도록 열처리 온도 또는 처리 시간을 상기 범위 내에서 채택하는 것이 바람직하다. 이러한 열처리 과정을 통하여 대두박 또는 대두 단백 농축물에 존재하는 오염균이 거의 사멸되고 이후 공정인 고체 발효가 원활하게 진행되는 화학적 환경이 조성되는 효과가 있을 뿐만 아니라 소화율을 저해하는 트립신 저해인자(TI)와 같은 항영양인자가 약간 감소하는 효과도 기대할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 열처리 온도는 70 내지 120℃, 70 내지 110℃, 70 내지 100℃, 80 내지 130℃, 80 내지 120℃, 80 내지 110℃, 80 내지 100℃, 90 내지 130℃, 90 내지 120℃, 90 내지 110℃, 90 내지 100℃일 수 있다. 또한 상기 열처리 시간은 보다 구체적으로 10 내지 30분, 20 내지 30분일 수 있다.
상기와 같이 열처리된 대두박 또는 대두 단백 농축물은, 고체 발효가 가능한 온도로 냉각될 수 있다. 상기 냉각 공정은, 컨베이어(conveyor)식 방냉기를 이용한 이송 과정을 통하여 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 대두박 또는 대두 단백 농축물의 온도가 30 내지 50℃로, 35 내지 45℃, 또는 35 내지 40℃가 될 때까지 수행될 수 있다.
상기 발효를 위한 배양 온도는 20 내지 50℃ 일 수 있고, 보다 구체적으로 30 내지 50℃, 40 내지 50℃, 30 내지 40℃, 20 내지 40℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 목적하는 대두 발효물의 품질에 따라 변동될 수 있다. 또한, 상기 발효를 위한 배양 시간은 8 내지 72시간일 수 있고, 보다 구체적으로 10 내지 70 시간, 10 내지 60 시간, 10 내지 50 시간, 10 내지 40 시간, 10 내지 30 시간, 10 내지 20 시간, 8 내지 18 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 목적하는 대두 발효물의 품질에 따라 변동될 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 대두박 또는 대두 단백 농축물에 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주를 105 내지 109 CFU/g, 105 내지 108 CFU/g, 106 내지 109 CFU/g 또는 106 내지 108 CFU/g 접종할 수 있다. 상기 접종되는 균주의 양은 대두박 또는 대두 단백 농축물의 고체 발효를 좌우하는 중요한 요인이 될 수 있다. 접종되는 균주의 양이 적은 경우에는 발효물을 제조하는데에 많은 시간이 소요되어, 발효시간이 길어지고 다른 미생물에 오염될 가능성이 높다. 반면, 접종되는 균주의 양이 과도한 경우에는 발효시간이 단축될 수는 있으나, 발효 환경을 적절하게 유지하는 것이 어려울 수 있다. 특히 발효 균주의 생육 특성과 발효 장치 종류에 따라 발효 성적이 크게 좌우되므로 생산 단계에서의 균주 특성을 고려하여 접종량을 적절히 선정하는 것이 바람직하다.
일실시예에 따르면, 상기 대두박 또는 대두 단백 농축물에 본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주를 접종시킨 후 고체 발효시켜, 대두 발효물을 수득할 수 있다. 예를 들면, 상기 발효 공정에는, 충진층 발효기(packed-bed fermentor)가 사용될 수 있다. 충진층 발효기에는 회분식 통기배양장치, 밀폐식 배양장치, 연속식 통기배양장치 등 여러 가지 형식이 있으며, 대두 발효물 제조에 이용될 수 있는 것이라면 그 형식에 제한 없이 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 생산 규모에 따라 적절한 장치를 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 충진층 발효기에 균주가 접종된 대두박 또는 대두 단백 농축물을 5 내지 50 ㎝ 두께로 올려놓고, 20 내지 50℃에서 8 내지 72시간 동안 발효시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 발효 단계 이후에 수득된 대두 발효물을 저온 저습에서 건조하는 단계 및 분쇄하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 발효 종료 직후의 대두 발효물 내 잔존 수분 함량은 20 내지 50% (v/w) 일 수 있다. 수분 함량이 10 내지 12%(v/w)인 대두 발효물 최종 제품을 제조하기 위하여 건조 공정이 추가될 수 있다. 발효가 종료된 이후, 대두 발효물 내 덩어리가 형성될 수 있으므로, 건조 공정 이후에는 대두 발효물의 입자 크기를 균일하게 만들기 위하여 분쇄 공정이 추가될 수 있다. 상기 건조 공정 및 분쇄 공정은 해당 기술분야에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으나, 과도하게 고온에서 건조할 경우에는 대두 발효물 내 생균이 사멸될 수 있으므로, 저온에서 건조 공정이 수행되는 것이 바람직하다. 또한 상기 분쇄 공정은 대두 발효물을 이용하고자 하는 목적에 따라 다양한 크기로 분쇄할 수 있으며, 예를 들면, 햄머 밀(hammer mill)을 이용할 수 있다.
본 출원에 따른 아밀로리퀴페시언스 균주를 이용하여 제조된 대두 발효물은 저분자 펩타이드 함량이 높아 동물의 소화 흡수율을 향상시킬 수 있으며, 단백 함량이 높으므로, 동물성 단백질을 대체할 수 있는 고품질 단백질 사료 재료로서 이용 가치가 매우 높다.
일실시예에 따르면, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주(KCCM12038P), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 또는 상기 배양물의 건조물을 제공한다. 상기 균주는 전술한 바와 같이, 신규한 균주이며, 이를 이용하여 제조된 대두 발효물은 점액질을 적게 포함하는 반면, 저분자 펩타이드의 함량이 높으며, 항균성을 갖는다.
일실시예에 따르면, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주(KCCM12038P), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 또는 상기 배양물의 건조물을 포함하고, 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhymurium), 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 포토박테리움 담셀 (Photobacterium damsel), 리스토넬라 안귈라럼 (Listonella anguillarum) 및 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 병원균에 대하여 항균력을 갖는, 항균성 조성물을 제공한다. 이에 관한 보다 상세한 사항은 전술된 내용 및 실시예를 참고할 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 방법에 의해 제조된 대두 발효물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다. 본 출원에 따른 사료 조성물 내 대두 발효물의 함량은 적용 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 1 내지 99 중량%, 보다 구체적으로는 10 내지 90 중량%, 20 내지 80 중량%로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 사료 조성물은 투여를 위해서 대두 발효물 이외에 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물,키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
또한, 본 출원의 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.
본 출원의 사료 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체형 담체의 경우에는 정제, 산제, 토로키제 등의 투여 형태일 수 있으며 액체형 담체의 경우에는 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀젼제, 용액제 등의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유할 수도 있다.
본 출원의 사료 조성물은 포유류, 가금류, 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 상업용으로 중요한 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다. 상업적으로 중요한 가금류에는 닭, 오리, 거위 등이 포함되며, 송어와 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류를 포함 할 수 있다.
본 출원에 따른 사료 조성물은 가축사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏ 당 약 10 내지 500g, 바람직하기로는 10 내지 100g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다.
본 출원에 따른 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주는 항균력과 단백질 분해능력이 뛰어나며, 점액질 생성능이 낮으므로, 대두박이나 대두 단백 농축물에 접종하여 저분자 펩타이드 함량이 높고 항균력이 우수한 고품질의 대두 발효물을 제조할 수 있다. 특히, 본 출원의 대두 발효물이 다양한 병원성균에 노출될 수 있는 동물에 제공된다면, 이의 항균력으로 인하여 병원성균으로부터의 감염률을 낮추고 생존률을 증가시킬 수 있을 뿐 아니라, 고함량의 저분자 펩타이드로 인하여 소화 흡수율을 향상시킬 수 있다.
도 1은 발효 대두 단백 농축물의 형태를 나타낸 사진도이다.
도 2는 발효 대두 단백 농축물의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진도이다.
도 3은 발효 대두박의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진도이다.
도 4는 저수분에서의 발효 대두박의 SDS-PAGE 결과는 나타낸 사진도이다.
도 5는 본 출원의 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주의 계통분류학적 유연관계를 나타내는 계통수(phylogenic tree)이다.
본 출원은 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ24-23 균주 및 이를 이용한 대두 발효물의 제조방법과 그 발효 산물에 관한 것으로 이하 본 출원을 실시예와 실험예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 것에 불과하며, 본 출원의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
이하, 본 출원을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
[실시예 1] 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주의 분리
종래에 대두박 또는 대두 단백 농축물 발효에 이용되는 것으로 알려진, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(이하, “CJ823 균주”로 지칭, 대한민국 등록특허 제10-1517326호 참조)를 준비한 후, 하기와 같은 방법으로 해당 균주의 개량을 실시하였다.
우선 상기 CJ823 균주를 TSB 평판배지(배지 조성: 효소분해된 카제인(enzymatic digest of casein) 17.0 g, 효소분해된 대두박(enzymatic digest of soybean meal) 3.0 g, 염화나트륨 (NaCl) 5.0 g, 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 2.5 g, 덱스트로스(dextrose) 2.5 g, 아가(agar) 15.0 g, 25℃, 최종 pH: 7.3±0.2)에서 37℃ 조건으로 12시간 동안 배양하여 활성화하였다. 상기 활성화된 균주를 0.8% NaCl 살균용액 9 mL에 약 2 백금(A660nm에서 0.2 정도로 희석함)을 현탁하여 종균으로 사용하였다. 미리 준비한 TSB 50 mL에 상기 종균 현탁액을 1% 접종한 후, A660nm에서 4.0 내지 5.0 정도에 이르도록 37℃에서 180 rpm으로 배양하였다. 상기 종균을 배양 후, 배양액을 원심분리(8000 rpm, 4℃, 10분)하여 균체와 상등액을 분리하였다. 분리된 균체는 배양액과 동일한 양의 0.8% NaCl 살균 용액으로 2회 세척되었다. 상기 균체의 농도가 약 A660nm = 0.8 이 되도록 0.8% NaCl 살균용액 20 mL를 균체와 혼합하고, 15 mL의 혼합물을 멸균된 페트리 디쉬(petri dish)에 도포하였다. 다음에는 UV 램프(VIBER LOURMAT, 115V, 60Hz)를 이용하여 A254nm의 파장으로 약 50 cm의 높이에서 균체에 UV 를 조사하였다. 상기 UV 조사는, UV 조사 시간에 따른 상기 야생형 균주의 치사율이 99.99%에 이르는 시간까지 수행되었다. 이어서 상기 UV 조사된 혼합물 0.1 mL을 TSA 평판배지(배지 조성: tryptic soy agar, 효소분해된 카제인 15 g, 효소분해된 대두박 5 g, NaCl 5 g, 아가 15 g, 25℃에서의 최종 pH 7.3±0.2)에서 37℃ 조건으로 12시간 동안 배양하고, 콜로니를 형성한 변이 균주들만을 분리하여 수득하였다.
[실시예 2] 바실러스 아밀로리퀴페시언스의 단백질 분해능력 및 항균력 측정
상기 실시예 1에 따라 분리하여 수득한 각 변이 균주들의 단백질 분해능력 및 항균력을 하기와 같은 방법으로 확인하였다. 대조군으로는, 공지된 바실러스 서브틸리스(기탁번호 KCCM11438P) 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스(CJ823 균주)가 사용되었다 (이하, 각 대조군 1 및 대조군 2로 지칭된다).
1) 단백질 분해능력
상기 실시예 1로부터 수득한 변이 균주들의 단백질 분해능력을 측정하기 위하여, 2%(w/v) 탈지유(Difco, USA)가 함유된 YM 한천배지(yeast extract 3.0g, malt extract 3.0g, peptone 10.0g, agar 20.0g)에 균주를 접종배양하여, 형성되는 콜로니의 지름(growth, G)을 측정하는 동시에 기질이 분해되어 생성되는 투명환(clear zone, C)의 크기를 측정하였다.
보다 구체적으로, 상기 각 변이 균주는 TSB 배지(배지 조성: enzymatic digest of casein 17.0g, enzymatic digest of soybean meal 3.0g, NaCl 5.0g, dipotassium phosphate 2.5g, dextrose 2.5g, final pH 7.3±0.2 at 25℃)에서 37℃의 조건에서 200rpm의 교반속도로 12시간 동안 배양되었다. 이후 각 변이 균주의 배양액 탈지유 함유 YM 한천배지에 1.0ul씩 점적되고, 37°C에서 16시간 동안 배양되었다. 배양이 완료된 후, 배지 위에 형성된 콜로니의 지름(G)과 투명환의 크기(C)을 측정하였다.
2) 살모넬라 티피뮤리움에 대한 항균력
상기 실시예 1로부터 수득한 변이 균주들의 항균력을 측정하기 위하여 가축에 질병을 일으킬 수 있는 대표적인 병원균인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium, ATCC14028)을 이용하였다. 보다 구체적으로, 상기 변이 균주들을 각각 GYP 배지(배지 조성: glucose 10g, yeast extract 8g, polypeptone 2g, pH 7.0)에서 37℃의 조건에서 180rpm 의 교반 속도로 12시간 동안 배양하였다. 각 변이 균주 배양액은 살모넬라 티피뮤리움이 1x105 CFU/ml로 첨가된 GYP 한천배지(배지 조성: glucose 10g, yeast extract 8g, polypeptone 2g, agar 15g, pH7.0)에 1.5μL씩 점적되고, 37℃ 에서 15시간 동안 배양되었다. 배양이 완료된 후, 변이 균주들의 콜로니 주위에 형성되는 생육 저해환의 크기를 측정하여, 항균력의 활성 역가를 측정하였다.
균주 명칭 C G C/G C-G 항균력
대조군 1 6.6 6.6 1.00 0.00 ++
대조군 2 12.46 8.31 1.50 4.15 ++++
CJ24-1 13.02 7.05 1.85 5.97 +++++
CJ24-3 13.91 6.78 2.05 7.13 +++++
CJ24-4 14 6.76 2.07 7.24 +++++
CJ24-5 14.06 7.02 2.00 7.04 +++++
CJ24-6 13.79 6.78 2.03 7.01 +++++
CJ24-7 13.56 6.57 2.06 6.99 +++++
CJ24-9 13.45 6.34 2.12 7.11 +++++
CJ24-10 13.15 6.46 2.04 6.69 +++++
CJ24-11 13.5 6.82 1.98 6.68 +++++
CJ24-12 13.31 6.68 1.99 6.63 +++++
CJ24-13 13.76 6.62 2.08 7.14 +++++
CJ24-14 13.6 7.23 1.88 6.37 -
CJ24-15 14.15 6.94 2.04 7.21 +++++
CJ24-16 13.26 5.92 2.24 7.34 +++++
CJ24-17 13.27 6.07 2.19 7.20 +++++
CJ24-18 13.37 5.95 2.25 7.42 +++++
CJ24-19 13.7 6.94 1.97 6.76 +++++
CJ24-20 13.94 7.38 1.89 6.56 +++++
CJ24-21 13.18 6.86 1.92 6.32 +++++
CJ24-22 13.26 6.35 2.09 6.91 ++++
CJ24-23 13.73 6.69 2.05 7.04 +++++
CJ24-24 13.79 7.5 1.84 6.29 +++++
CJ24-25 13.4 6.45 2.08 6.95 +++++
CJ24-26 14.08 7.23 1.95 6.85 +++++
CJ24-27 13.9 7.93 1.75 5.97 ++
CJ24-28 13.82 5.92 2.33 7.90 +++++
CJ24-29 13.93 5.87 2.37 8.06 +++++
CJ24-30 13.55 5.99 2.26 7.56 +++++
CJ24-31 13.22 5.91 2.24 7.31 ++++
CJ24-32 13.64 5.81 2.35 7.83 +++
CJ24-33 13.91 6.11 2.28 7.80 ++++
CJ24-34 14.13 6.21 2.28 7.92 +++++
CJ24-35 15.11 7.13 2.12 7.98 +
CJ24-36 12.91 5.11 2.53 7.80 +++
상기 표 1은, 균주들의 배양이 완료된 후 측정된 투명환의 크기 (C), 콜로니의 지름 (G), 이들의 비율 (C/G), 이들의 크기 차이 (C-G), 및 생육 저해환의 크기를 측정을 통한 항균력을 나타낸 표이다.
상기 표 1에 따르면, 변이 균주들 중에서 CJ24-28, CJ24-29, CJ24-32, CJ24-33, CJ24-34 및 CJ24-36가 형성된 콜로니의 크기 대비 투명환의 크기의 비율(C/G)이 높은 편(2.28-2.53)에 속하였고, 그 중에서도 CJ24-28, CJ24-29, 및 CJ24-34의 항균력(모두 +++++)이 가장 높았다. 반면에 대조군 1 의 C/G값이 가장 낮았으며 대조군 2 의 C/G값은 그 다음으로 낮았고(각 1.00, 1.50), 항균력은 각 ++, ++++에 불과하였다. 즉, 상기 변이 균주들은 종래 알려진 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 아밀로리퀴페시언스보다 단백질 분해능력과 항균력이 모두 현저히 향상된 균주들임을 확인하여 상기 균주들을 대두 단백 농축물이나 대두박에 적용하여 대두 발효물을 제조할 경우 해당 발효물은 항균력을 가질 것을 기대할 수 있었다.
[실시예 3] CJ24-34 균주의 항균력 측정
상기 실시예 2에서 항균력이 우수한 것으로 선별된 균주들(CJ24-28, CJ24-29, 및 CJ24-34) 중에서, 투명환의 크기(C)와 콜로니의 지름(G)이 가장 커 단백질 분해 능력이 뛰어난 CJ24-34 균주의 살모넬라 외 병원성 미생물에 대한 항균력을 추가적으로 확인하고자 하였다. 향균력의 확인을 위하여 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 포토박테리움 담셀 (Photobacterium damsel), 리스토넬라 안귈라럼 (Listonella anguillarum), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garviaeae) 및 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)의 병원생 미생물이 사용되었고, 이들은 패혈증, 비브리오 콜레라, 새우 비브리오증, 방어류결정증, 넙치 연쇄상구균증 및 넙치에드워드병을 포함하는 양어에 대하여 질병을 발생시킬 우려가 있는 것으로 알려져 있다. 상기 병원성 미생물 중 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 포토박테리움 담셀 (Photobacterium damsel) 및 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garviaeae) 는 경상대학교 병원체자원은행으로부터 분양받은 균주이며, 리스토넬라 안귈라럼 (Listonella anguillarum) 및 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda) 는 KCTC로부터 분양 받은 균주이다. 각 병원성 미생물들을 아래 표 2에 따라 해당 배지와 온도에서 배양한 후, 단일 콜로니를 선별하였으며, 이를 test tube에 옮겨 해당 액상배지에서 overnight하여 전배양하였다. 전배양액은 다시 각 병원성균의 해당 액상배지 100mL에 0.1% 접종하여 약 12시간 본배양하였다. 본 배양액은 항균력 테스트를 하기 위한 각 병원성균별 한천배지를 준비할 때 이용하였다.
병원성균 유발 질병 분양처 기탁번호 배양 조건
한천배지 액상배지 온도(℃)
Vibrio vulnificus 새우비브리오증 P4710 Marine agar (BD Difco) Marine broth (BD Difco) 30
Vibrio parahaemolyticus 새우비브리오증 P4712 Marine agar (BD Difco) Marine broth (BD Difco) 30
Photobacterium damsela 방어류결정증 P4482 Marine agar (BD Difco) Marine broth (BD Difco) 30
Listonella anguillarum 방어비브리오증 KCTC 2711 MRS agar (BD Difco) MRS broth(BD Difco) 30
Lactococcus garviaeae 넙치연쇄상구균증 P4737 Marine agar (BD Difco) Marine broth (BD Difco) 30
Edwardsiella tarda 넙치에드워드병 KCTC 12267 Nutrient broth(BD Difco) + 0.2% agar Nutrient broth(BD Difco) 37
본 출원의 CJ24-34를 GYP 한천배지(glucose 1%, yeast extract 0.8%, peptone 0.2%, agar 0.2%)에 배양하여 얻은 단일 콜로니를 GYP 배지(glucose 1%, yeast extract 0.8%, peptone 0.2%) 3mL가 담긴 test tube에 접종하여 overnight 으로 37℃, 180rpm 조건에서 전배양하였다. 전배양액을 다시 GYP 배지 100mL에 0.1% 접종하여 37℃, 180rpm에서 본배양하였다. 다음, 본배양 16시간, 20시간 후의 배양액을 확보하여 각각의 배양액 10mL을 8000rpm, 10분, 4℃에서 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상등액은 다시 0.2μm syringe filter로 여과하여 여과액을 준비하였다.
한천 배지에서 CJ24-34 균주에서 분비하는 항균물질의 항균력을 테스트하기 위해 각 병원성균별 한천 배지를 준비하기 위하여 각 병원성 균 배양조건에 해당하는 한천배지를 준비하여 121℃, 15분에서 멸균하였다. 이를 방냉하여 한천배지가 굳기 전 미리 준비해 놓은 각 병원성균 배양액을 한천배지에 1% 첨가하여 혼합한 후, 사각 플레이트에 옮겨 각각의 병원성균이 접종된 한천배지를 굳혔다. 완전히 굳힌 한천배지 플레이트에 peni cylinder cup을 위치시켜 각 컵에 미리 준비해 놓은 CJ24-34 여과액 (각 16시간, 20시간)을 300μL씩 loading 하고 각 병원성 균들의 배양조건에 따라 해당 균을 배양하였다. 배양이 완료된 후 각 병원성 균별 배양된 한천배지에서 나타난 투명환의 크기를 측정하였다. 이 때 peni cylinder cup 크기는 7mm이며, 추가적으로 항균물질에 의해 발생한 투명환까지 포함한 spot의 지름을 측정함으로써 투명환의 크기를 비교하였다. 투명환의 크기가 클수록 CJ24-34가 분비한 항균물질에 의해 병원성균이 생육하지 못한 것을 의미한다. 또한 본 실험에서는 peni cylinder cup 내부에 발생한 투명환도 항균력의 지표로 해석하였으나, peni cylinder cup 크기 외부로 발생한 투명환과 동일하게 크기를 측정하지는 못하였다.
병원성균 유발 질병 분양처 기탁번호 배양시간별 투명환 크기(mm) * peni cylinder cup 크기 7mm
16시간 20시간
Vibrio vulnificus 새우비브리오증 P4710 9 10
Vibrio parahaemolyticus 새우비브리오증 P4712 7 (내부 투명환 발생) 7 (내부 투명환 발생)
Photobacterium damsela 방어류결정증 P4482 15 15
Listonella anguillarum 방어비브리오증 KCTC 2711 14 14
Lactococcus garviaeae 넙치연쇄상구균증 P4737 Not clear zone Not clear zone
Edwardsiella tarda 넙치에드워드병 KCTC 12267 25 25
표 3에 기재된 투명환의 크기를 참고하면, 본 출원 CJ24-34는 특정 병원성균에 대한 항균력을 갖는 항균물질을 분비하는 것을 확인할 수 있었다. Peni cylinder cup 크기는 7mm이며, 이를 기준으로 해석할 때 CJ24-34의 항균물질은 Vibrio vulnificus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum, Edwardsiella tarda 의 생육을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 한편 Vibrio parahaemolyticus 의 투명환 크기는 peni cylinder cup의 크기와 동일한 7mm로 외부 투명환 크기 측정시 항균력이 없는 것처럼 평가할 수 있으나, 실질적으로 plate상에서 볼 때 peni cylinder cup 내부에 투명환이 일부 존재하는 것을 확인할 수 있었기 때문에, 이 병원균에 대한 항균력이 일부 존재한다고 볼 수 있다. 즉, 본 실험에서 테스트한 총 6종의 병원성균 중 5종의 병원성균(Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Photobacterium damsel, Listonella anguillarum, Edwardsiella tarda) 에 대해 항균력을 나타냈으며, 본 출원 CJ24-34 균주를 대두 단백 농축물이나 대두박에 적용할 경우 병원성균 증식이 방지된 대두 발효물 및 이를 포함하는 동물사료 조성물을 제조할 수 있을 것으로 기대된다.
[실시예 4] 바실러스 아밀로리퀴페시언스의 점액질 생성능 측정
상기 실시예 2에서 우수한 단백질 분해능력과 항균력이 확인되어 선별된 변이 균주 CJ24-28, CJ24-29 및 CJ24-34의 점액질 생성능을 확인하기 위하여 상기 균주들을 GYP 한천배지에서 다시 배양하여, 각 콜로니의 표현형을 상세히 관찰하였다. 대조군으로는 실시예 2에 기재된 대조군 2 (바실러스 아밀로리퀴페시언스, CJ823 균주)가 사용되었다.
실험 결과, 상기 대조군 2의 균주 콜로니는 광택과 함께 점성이 관찰되어 점액질 생성이 확인된 반면, 상기 실시예 2에서 선별된 변이 균주 CJ24-28, CJ24-29 및 CJ24-34의 콜로니에서는 모두 광택 또는 점성이 관찰되지 않아 점액질 생성이 억제되었음을 확인하였다.
[실시예 5] CJ24-34 균주의 대두 단백 농축물에서의 점액질 생성능 및 발효능
상기 실시예 2와 실시예 3에서 선별된 변이 균주들 중 단백질 분해 능력과 항균력이 우수한 것으로 확인된 CJ24-34 균주를 대두 단백 농축물에 접종하여 발효시킨 경우, 균주의 점액질 생성 여부와 발효능력을 확인하고자 하였다. 이의 대조군으로, 실시예 2에서 언급한 대조군 1 (바실러스 서브틸리스: 기탁번호 KCCM11438P) 및 대조군 2 (바실러스 아밀로리퀴페시언스: CJ823)가 모두 사용되었다.
상기 CJ24-34 균주는 GYP 배지(배지 조성: glucose 10g/L, yeast extract 8g/L, soy pepton 2g/L)에서 전배양되었으며, 전배양을 통해 얻은 본배양액은 다시 GYP 배지에 1% 가 되도록 접종한 후, 균체농도가 A660nm = 6 이상이 될 때까지 배양되었다.
상기 대두 단백 농축물은 수분 함량을 약 43%(v/w)로 조절하고, 100 ℃에서 30분 동안 열처리한 후 30 내지 50°C로 냉각하여 준비하였다. 상기 대두 단백 농축물 중량을 기준으로, 10 중량%의 상기 CJ24-34 균주의 배양액을 상기 전처리된 대두 단백 농축물에 접종하고, 접종된 배양액의 수분 함량을 약 46%로 조절하였다. 상기 대두 단백 농축물은 37 ℃와 습도 95%가 유지되는 항온항습기에서 16시간 동안 발효시켰다. 발효 전, 상기 대두 단백 농축물의 pH는 약 6.8 이었으며, 각 균주들은 약 107 CFU/g 접종되었다. 발효가 종료된 후, 발효물의 점액질 생성 여부가 체크되었으며, 발효물의 수분, 생균수 및 pH가 다시 측정되었다. 발효물의 단백질 함량과 단백질 증가량은, 발효물을 건조시킨 후에 건조 중량을 기준으로 측정되었다.
도 1은, CJ24-34 및 두 대조군 균주를 적용하여 발효시킨 발효 대두 단백 농축물의 형태를 나타낸 사진도이다. 도 1의 A 및 C는, 각각 대조군 1 (바실러스 서브틸리스) 및 본 출원에 따른 CJ24-34로 발효된 발효 대두 단백 농축물의 사진이며, 이들 발효물은 모두 끈적이거나 뭉쳐있지 않아 점액질 생성이 억제된 것이 확인되었다. 반면, 도 1의 B는 대조군 2 (바실러스 아밀로리퀴페시언스)로 발효된 발효 대두 단백 농축물의 사진이며, 이 발효물은 끈적임이 강하여 덩어리가 형성되어 있었다. 즉, 종래의 바실러스 아밀로리퀴페시언스는 발효 과정 중에 상당한 양의 점액질을 형성시키는 반면, 본 출원에 따른 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34는 점액질을 거의 생성하지 않아 발효물의 대량생산에 유용할 수 있음을 확인하였다.
균주 명칭 시간
(hr)		 수분
(%)		 생균수
(CFU/g)		 pH 단백질 함량
(%, 건조중량)		 단백질 증가량
(%,건조중량)
대조군1
(바실러스 서브틸리스)		 0 45.49 1.1. x 108 6.84 63.3 　
16 38.94 7.8 x 109 8.45 68.0 4.0
대조군2
(CJ823)		 0 45.94 1.6 x 108 6.76 63.9 　
16 39.19 4.6 x 109 8.23 68.0 4.1
본 출원
CJ24-34		 0 45.86 6.1 x 107 6.83 64.2 　
16 37.73 1.8 x 109 8.28 68.3 4.0
본 출원의 CJ24-34를 이용한 발효물의 특징을 알아보기 위해 대조군을 포함한 각 균주를 적용한 발효 대두 단백 농축물의 시간별 (0, 16시간) 수분, 생균수, pH, 단백질 함량 및 단백질의 증가량을 확인하였다(표 4). 실험결과, 본 출원에 따른 CJ24-34로 발효된 발효 대두 단백 농축물은, 약 37% 내지 39%의 수분 함량을 포함하고 있었으며, pH는 8 이상이었고, 생균수 약 109 CFU/g 이상을 포함하고 있었다. 또한 단백질 함량은 원료의 단백 함량 대비 약 4% 상승되어 발효능력이 확인되었다.
[실시예 6] 발효 대두 단백 농축물의 단백질 분해도 및 분자량 분포도
본 실시예에서는 발효물에 포함된 펩티드의 크기 및 분포를 확인하기 위하여 상기 실시예 5의 발효 대두 단백 농축물의 단백질 분해도 및 분자량 분포도를 분석하였다. 이는 각각 SDS-PAGE와 GPC 방법으로 측정되었다.
1) SDS-PAGE (폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법)
원료(대두 단백 농축물) 및 실시예 5에 따라 준비된 발효 대두 단백 농축물 (CJ24-34의 발효 대두 단백 농축물 및 대조군 1의 발효 대두 단백 농축물)의 100mg을 각각, 8M의 우레아 용매 5mL 에서 현탁(suspension)시키고, 초음파 처리(sonication)한 후, 원심분리(8000rpm, 10분)하여 상등액을 분리하였다. 상기 상등액을 bicinchoninic acid로 정량하여 SDS-PAGE의 젤에 로딩하였다.
도 2는, 발효 대두 단백 농축물의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진도이다. 도 2의 왼쪽부터, M은 바이오마커, 1번은 원료 (대두 단백 농축물), 2번 및 3번은 본 출원에 따른 CJ24-34의 발효 대두 단백 농축물, 4번 및 5번은 대조군 1의 발효 대두 단백 농축물 각각의 단백질 분포를 나타낸다. 도 2에 나타난 단백질 분포에 따르면, 본 출원에 따른 CJ24-34의 발효 대두 단백 농축물은 고분자 단백질을 거의 포함하지 않고, 대부분 저분자 펩타이드로 구성되어 있는 것으로 확인할 수 있어 해당 균주를 사료에 적용시 소화 흡수율의 향상을 기대할 수 있었다. 반면, 대조군 1의 발효 대두 단백 농축물은 고분자 단백질을 여전히 포함하고 있었는 바, 고분자 단백질이 제대로 분해되어 있지 않다는 점을 확인할 수 있었다.
2) GPC (Gel Permeation Chromatography)
GPC는 분자량이 서로 다른 표준 단백질을 분석하여 각각의 용출지연 시간(retention time)을 확인한 후, 분자량과 용출지연 시간 관계의 표준 곡선을 산출하고, 이에 따라 측정하고자 하는 시료 내의 단백질 분자량 분포도를 도출할 수 있는 방법이다. 보다 구체적으로는 특정 분자량을 갖는 단백질의 용출지연 시간을 계산한 후, 그 시간에 따라 크로마토그램의 부분을 나누고, 전체 크로마토그램 면적 중 각 분자량 범위별 부분면적 비율을 계산하는 것이다.
원료 (대두 단백 농축물) 및 실시예 5에 따라 준비된 발효 대두 단백 농축물 (CJ24-34의 발효 대두 단백 농축물 및 대조군 1의 발효 대두 단백 농축물)의 100mg을 각각, 8M의 우레아 용매 5ml 에 현탁(suspension)시키고 초음파 처리(sonication)한 후, 원심분리(8000rpm, 10분)하여 상등액을 분리하였다. 상기 상등액을 0.45μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과한 후, 여과액을 GPC 방법으로 분석하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.
MW(KDa) 원료 (대두 단백 농축물) CJ24-34의 발효 대두 단백 농축물 (1) CJ24-34의 발효 대두 단백 농축물 (2) 대조군 1의 발효 대두 단백 농축물 (1) 대조군 1의 발효 대두 단백 농축물 (2)
>75 22.40 5.59 6.05 17.22 18.28
30~75 46.99 14.07 13.57 36.30 38.08
10~30 15.92 24.57 24.27 21.99 20.71
5~10 4.70 22.04 21.86 8.94 8.17
<5 9.98 33.73 34.26 15.54 14.76
Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
표 5는, 원료 및 발효 대두 단백 농축물의 GPC 결과를 나타낸 것이다. 표 5를 참고하면, 본 출원에 따른 CJ24-34의 발효 대두 단백 농축물(1) 및 (2)에는 30KDa 이하의 펩타이드가 약 80%, 10KDa 이하의 펩타이드가 약 55% 포함되어 있어 저분자 펩티드를 위주로 구성되어 있음을 확인하였다. 반면, 대조군 1의 발효 대두 단백 농축물은, 원료에 비하여 저분자량 펩타이드를 더 많이 포함하고 있기는 하나, 10KDa 이하의 펩타이드 함량은 약 23 내지 24% 수준에 불과하여 대부분 고분자 펩티드를 위주로 구성되어 있음을 확인하였다.
[실시예 7] CJ24-34 균주의 대두박 발효능, 단백질 분해도 및 분자량 분포도
본 출원에 따른 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주가 대두박에 적용된 경우에도 발효능이 우수한지 확인하기 위하여, 종래 발효 대두박의 생산 균주로 활용되었던 바실러스 아밀로리퀴페시언스 2종(KCCM11471P, KCCM11906P)을 대조군으로 하여 발효능을 확인하였다. 상기 KCCM11471P는 대조군 3, KCCM11906P는 대조군 4로 표기하였다.
상기 바실러스 균주들은 각각 GYP 배지(배지조성: glucose 10g/, yeast extract 8g/L, soy pepton 2g/L)에서 전배양하고, 이를 통해 수득한 배양액을 다시 GYP 배지에 그 1%를 접종하여 A660nm = 6 이상이 될 때까지 배양하였다.
대두박은 수분 함량을 약 43%(v/w)로 조절하고, 100°C에서 30분 동안 열처리한 후 30 내지 50°C로 냉각하여 준비하였다. 상기 대두박 중량을 기준으로, 10 중량%의 바실러스 배양액을 각각 상기 전처리된 대두박에 접종하고 수분함량을 약 46%로 조절하였다. 발효 전, 상기 대두박의 pH는 약 6.8 이었으며, 각 균주들은 약 107 CFU/g 접종되었다. 배양액이 접종된 대두박은 37°C, 습도 95%가 유지되는 항온항습기에서 18시간 발효되었다. 발효 시작 후 각 14, 16, 18시간 후의 발효 대두박을 샘플링하여 단백질 함량의 경시적 변화를 측정하여 표 6에 나타내었다.
항목 발효시간(hr) 대조군 3의 발효 대두박 대조군 4의 발효 대두박 CJ24-34의 발효 대두박
1 1 2 1 2 3
단백질 함량(%, 건조중량) 0 54.1 54.2 54.1 54.2 54.1 54.1
14 58.9 59.5 59.6 59.9 59.9 60.0
16 59.4 59.7 59.5 60.2 60.0 60.0
18 59.4 59.6 59.8 60.8 60.5 60.1
단백질 증가량(%, 건조중량) 14 4.7 5.3 5.5 5.7 5.8 5.9
16 5.3 5.5 5.4 6 5.9 5.9
18 5.2 5.4 5.6 6.6 6.3 5.9
표 6은, 발효 대두박의 단백질 함량 및 단백질 증가량을 나타낸 표이다. 표 6을 참고하면, CJ24-34의 발효 대두박의 단백질 함량과 단백질 증가량은 대조군 3 또는 대조군 4에 비하여 높았다. 보다 구체적으로, 발효시간이 동일한 경우, CJ24-34 발효 대두박의 단백질 함량은 평균적으로 대조군 3에 비하여 약 1% 더 높았으며, 대조군 4에 비하여 약 0.5% 더 높았다. 발효 대두박을 제조하는 기술에 있어서, 보다 빠르게 단백질의 함량을 높여 발효시간을 단축시키는 것은 매우 중요하므로, 본 출원의 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34는 대두 발효물의 생산성을 향상시키고 제조원가를 감소시킬 수 있는 장점이 있다.
한편, 발효 대두박을 구성하는 펩티드의 크기를 확인하기 위하여 상기 CJ24-34로 발효시킨 발효 대두박과 원료(대두박)의 단백질 분해도 및 분자량 분포도를 분석하였다. 이를 위하여, 실시예 6에 기재된 방법과 동일한 GPC 방법이 사용되었다.
도 3은, 원료(대두박) 및 CJ24-34로 발효시킨 발효 대두박의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진도이다. 도 3의 왼쪽부터, M은 바이오마커, 1번은 원료(대두박), 2번은 본 출원에 따른 CJ24-34로 발효시킨 발효 대두박의 단백질 분포를 나타낸다. 도 3을 참고하면, 본 출원에 따른 CJ24-34의 발효 대두박은 고분자 단백질을 거의 포함하지 않고, 대부분 저분자 펩타이드를 위주로 포함하고 있는 것으로 확인하여 해당 균주를 사료에 적용시 소화 흡수율의 향상을 기대할 수 있었다.
MW(KDa) 원료(대두박) CJ24-34의 발효 대두박
> 75 44.9% 8.1%
30 ~ 75 36.9% 10.0%
10 ~ 30 9.1% 23.5%
5~10 2.4% 22.5%
<5 6.7% 35.9%
Total 100.0% 100.0%
표 7은, 원료(대두박) 및 발효 대두박의 펩티드 구성을 알아보기 위한 GPC 결과를 나타낸 것이다. 표 7을 참고하면, 원료(대두박)은 30KDa 이상의 펩티드가 약 82%로 대부분 고분자 펩타이드로 구성된 반면, 본 출원에 따른 CJ24-34로 발효시킨 발효 대두박은 30KDa 이하의 펩타이드가 약 82%, 10KDa 이하의 펩타이드가 약 58% 포함되어 있어 대부분 저분자 펩타이드로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 원료에 포함되어 있던 고분자 단백질의 대부분이 저분자 펩타이드로 분해되어 해당 균주를 사료에 이용시 소화율의 증대를 기대할 수 있을 것으로 예상된다.
[실시예 8] CJ24-34의 저수분 조건에서의 대두박 발효능
본 출원에 따른 CJ24-34 균주를 GYP 배지(배지조성: glucose 10g/, yeast extract 8g/L, soy pepton 2g/L)에서 전배양하고, 이를 통해 수득한 배양액을 다시 GYP 배지에 그 1%를 접종하여 A660nm = 6 이상이 될 때까지 배양하였다.
대두박은 수분 함량을 저수분 조건의 약 31%(v/w)로 조절하고, 100°C에서 30분 동안 열처리한 후 30 내지 50°C로 냉각하여 준비하였다. 대두박 중량을 기준으로, 10 중량%의 바실러스 배양액을 상기 전처리된 대두박에 접종하고 수분 함량을 약 저수분 조건의 36%로 조절하였다. 배양액이 접종된 대두박은 37°C, 습도 95%가 유지되는 항온항습기에서 12시간 동안 발효되었다. 발효 시작 후, 8 시간, 10 시간, 12시간 되는 시점에 발효물을 샘플링하여, 수분, 생균수, 단백질 함량 및 단백질 증가량을 측정하였다.
시간(hr) 수분(%) 생균수(CFU/g) 단백질 함량
(%, 건조중량)		 단백질 증가량
(%, 건조중량)
0hr 37.1 4.4 x 108 52.34 　
8hr 35.15 8.2 x 109 54.6 2.26
10hr 33.25 7.6 x 109 55.93 3.59
12hr 31.55 7.0 x 109 56.1 3.76
표 8을 참조하면, 발효시간이 지남에 따라 수분은 점차 감소하였으며, 생균수는 7.0 x 109CFU/g 수준까지 생장하였다. 또한 바실러스의 생장 과정에서 대두박의 당성분이 이용됨에 따라 발효물 내에 12시간 후 약 4%의 단백질 함량이 증가하는 결과를 확인할 수 있었다. 즉, 본 출원에 따른 균주는 저수분의 대두박에서도 발효능이 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 저수분의 발효 대두박 내의 펩티드 크기의 구성을 확인하기 위하여 단백 분해도 및 분자량 분포도를 확인하기 위해 실시예 6에서 설명한 동일한 방법으로 SDS-PAGE와 GPC를 분석하였다.
도 4는 저수분에서의 발효 대두박의 SDS-PAGE 결과는 나타낸 사진도이다. 도 4의 왼편부터 M은 바이오마커, 1번은 원료(대두박), 2번은 8시간 발효시킨 발효 대두박, 3번은 10시간 발효시킨 발효 대두박, 4번은 12시간 발효시킨 발효 대두박의 각 단백질 분포를 나타낸다. 도 4에 따르면, 대두박 원료의 고분자 단백질이 발효 중 분해됨에 따라 저분자 펩타이드가 증가함으로 사료에 적용시 소화율의 증대 효과를 가져올 것을 확인할 수 있었다.
분자량(KDa) 원료 (대두박) 발효 대두박
8hr		 발효 대두박 10hr 발효 대두박 12hr
> 75 54.9 27.5 21.6 20.9
30 ~ 75 28.8 30.2 27.1 27.1
10 ~ 30 8.0 22.9 26.7 27.2
5~10 2.2 9.1 12.2 12.4
<5 6.1 10.3 12.5 12.4
Total 100.0 100.0 100.0 100.0
표 9는, 원료 및 발효시간(8, 10, 12hr)에 따른 저수분 조건의 발효 대두박의 GPC 결과를 나타낸 것이다. 표 9를 참고하면, 본 출원에 따른 CJ24-34 균주로 12시간 발효시킨 대두박 발효물에는 30KDa 이하의 펩타이드가 약 52%, 10KDa 이하의 펩타이드가 약 24.8% 포함되어 있었다. 반면, 원료(대두박)는 30KDa 이하의 펩타이드가 약 16.3%로 대부분 고분자 펩티드로 구성되어 있었다. 즉, 원료에 포함되어 있던 고분자 단백질의 상당량이 저분자 펩타이드로 분해된 것을 확인할 수 있어 저수분 조건에서도 본 출원 균주 CJ24-34로 발효시킨 대두박은 저분자 펩티드 함량이 높아 사료에의 활용시 증진된 소화 효과를 가질 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
[실시예 9] 본 출원 변이 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ24-34 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 및 계통수 분석
본 출원 CJ24-34 변이 균주의 동정을 위하여 하기 표 10의 염기서열을 이용하여 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석하였다.
16S rRNA 유전자의 염기서열에 의한 균주 동정을 위해 범용 프라이머(universal primer)로서 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3', 서열번호 1)와 1492R (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3', 서열번호 2)을 이용하여 PCR로 증폭한 후 정제하였다. 염기서열 결정을 위해서는 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'), 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3', 서열번호 3), 805R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3', 서열번호 4) 및 1492R (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 이용하여 1,508 bp의 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 BigDye®　Terminator　v3.1　Cycle　Sequencing　Kits(Applied Biosystems Inc., USA)를 이용하여 시퀀싱을 하였고, ABI　3730XL　DNA　Analyzer　(Applied　Biosystems, 3.850　Lincoln　Centre　Drive　Foster　City,　CA　94404　USA)로 분석하였다.
서열번호 1 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'
서열번호 2 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'
서열번호 3 5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3'
서열번호 4 5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3'
서열번호 5 16S rRNA sequence of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CJ24-34
16S rRNA 염기 서열 분석 결과,　본 출원 CJ24-34 변이 균주는 서열번호 5의 16S rRNA 염기 서열을 포함하고 있음이 확인되었다. 서열 목록은 도면 후면에 첨부하였다. 유전자 염기 서열과의 유사성 판단은 EzTaxon server (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)와 GenBank/EMBL/DDBJ로부터 등록된 염기서열과 비교하여 얻었다. 염기서열을 이용하여 다중 서열 정렬을 진행한 후 MEGA 6 program을 이용하여 계통수(phylogenic tree)를 작성하고 분류학적 위치를 분석하였다(도 5).
상기 계통수 분석 결과, 본 출원 CJ24-34 변이 균주는 표준 균주인 바실러스 아밀로리퀴페시언스 아종. 플란타룸(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum) FZB42T(CP000560)과 가장 가까운 근연 관계를 나타내었고, 16S rRNA 유전자 서열 상동성은 99.93%(1507 bp / 1508 bp)로 확인되었다.
본 출원에 따른 상기 변이 균주 CJ24-34는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 subsp. Plantarum CJ24-34로 명명되었고, 부다페스트 조약에 따라 2017년 6월 15일자 한국미생물보존센터(Korean Culture of Microorganisms, KCCM)에 기탁번호 KCCM12038P로 수탁되었다.
본 출원은 항균력과 단백질 분해능력이 뛰어나고 점액질 생성능이 낮은 신규 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 및 이를 이용한 동물의 사료 소화율이 제고된 저분자 펩타이드의 발효 대두박 또는 발효 대두 단백 농축물 및 그 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 동물사료, 식품 및 제약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12038P
수탁일자 : 20170615
<110> CJ CHEILJEDANG CORP. <120> A Novel Bacillus amyloliquefaciens Bacterium strain and Preparation method for producing Fermented Soy Protein Products using the Same <130> P6026 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer for 16S rRNA for identification-27F <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer for 16S rRNA for identification-1492R <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer for 16S rRNA for identification-518R <400> 3 ccagcagccg cggtaatacg 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer for 16S rRNA for identification-805R <400> 4 taccagggta tctaatcc 18 <210> 5 <211> 1508 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA sequence ofBacillus amyloliquefacienssubsp. plantarumCJ24-34 <400> 5 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtctga 180 accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480 gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720 agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840 tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900 aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020 gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140 tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260 aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320 tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440 gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500 acaaggta 1508

Claims (12)

  1. 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 (KCCM12038P) 균주를 대두박 또는 대두 단백 농축물에 접종하는 단계; 및
    상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주를 배양하여 발효시킨 발효 대두박 또는 발효 대두 단백 농축물을 수득하는 단계를 포함하는, 대두 발효물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 대두 발효물은, 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhymurium), 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 포토박테리움 담셀 (Photobacterium damsel), 리스토넬라 안귈라럼 (Listonella anguillarum) 및 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 병원균에 대하여 항균력을 갖는 것인 대두 발효물을 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 대두 발효물은, 분자량 30KDa 이하의 저분자 펩타이드를 40 중량% 이상 포함하는 것인 대두 발효물을 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    균주를 대두박 또는 대두 단백 농축물에 접종하는 단계 이전에,
    대두박 또는 대두 단백 농축물의 수분 함량을 조절하고, 열처리하는 단계를 더 포함하는 것인 대두 발효물을 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 대두박 또는 발효 대두 단백 농축물의 수분 함량은 30 내지 80%(v/w)로 조절되고, 상기 열처리는 70 내지 130℃에서 10 내지 30분간 수행되는 것인 대두 발효물을 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 CJ24-34(KCCM12038P)는 105 내지 109 CFU/g의 균수로 접종되는 것인 대두 발효물을 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양은, 20 내지 50℃에서 8 내지 72시간 동안 수행되는, 대두 발효물을 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 수득된 발효 대두박 또는 발효 대두 단백 농축물을 건조 및 분쇄하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인 대두 발효물을 제조하는 방법.
  9. 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주(KCCM12038P).
  10. 바실러스 아밀로리퀴페시언스 CJ24-34 균주(KCCM12038P), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 또는 상기 배양물의 건조물을 포함하고,
    살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhymurium), 비브리오 불니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 포토박테리움 담셀 (Photobacterium damsel), 리스토넬라 안귈라럼 (Listonella anguillarum) 및 에드워드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 병원균에 대하여 항균력을 갖는, 항균성 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 대두 발효물.
  12. 제11항의 대두 발효물이 포함된 동물 사료 조성물.
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