CN114990008B - 一种用于防治美人鱼发光杆菌的解淀粉芽孢杆菌 - Google Patents

一种用于防治美人鱼发光杆菌的解淀粉芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物筛选技术领域,具体涉及一种用于防治美人鱼发光杆菌的解淀粉芽孢杆菌;于2021年11月12日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),编号CGMCC NO:23793;地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌是从银鲳肠道中筛选获得的,其具有预防治疗美人鱼发光杆菌的功效,可以在水体或饲料中高浓度使用,而不会对银鲳产生明显的应激反应。

Description

一种用于防治美人鱼发光杆菌的解淀粉芽孢杆菌
技术领域
本发明属于微生物筛选技术领域,具体涉及一种用于防治美人鱼发光杆菌的解淀粉芽孢杆菌。
背景技术
银鲳(Pampus argenteus)是亚洲地区的一种经济价值极高的海洋经济鱼类,目前银鲳的市场供应主要还是依靠捕捞,经过近十年的技术攻关,银鲳的人工养殖及繁育技术在浙江省宁波市取得初步成功:人工繁殖出银鲳鱼受精卵并育出仔鱼,并在东海地区多个渔场已开展小规模的银鲳养殖。由于人工养殖环境与其自然生长环境存在差异、驯化时间不长等原因导致养殖银鲳疾病频发,严重阻碍银鲳养殖产业的发展。
美人鱼发光杆菌是一种嗜盐的海水养殖动物致病菌,也是一种人鱼共患菌,病死鱼以出血性败血症为典型特征。目前对于养殖银鲳爆发的美人鱼发光杆菌等细菌性疾病的治疗主要依赖于抗生素,虽然有一定效果,但是并不能从根本上控制该病,而且鱼体极易产生耐药性,造成环境中的药物残留,破坏生态平衡,威胁人体的健康和安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于防治美人鱼发光杆菌的解淀粉芽孢杆菌,即一种银鲳肠道中筛选获得的,具有防治美人鱼发光杆菌效果的解淀粉芽孢杆菌。
本发明所提供的具有防治美人鱼发光杆菌效果的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Bac2021株,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,其保藏编号为CGMCC NO:23793;地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期2021年11月12日。
所述的解淀粉芽孢杆菌Bac2021株,其16S rRNA的序列为SEQ ID NO:1。
本发明还提供所述的解淀粉芽孢杆菌Bac2021株在制备用于预防和治疗美人鱼发光杆菌的制品中的应用;
本发明再一个方面还提供解淀粉芽孢杆菌Bac2021株的一种用途,是在制备银鲳饲料中的应用。
本发明再一个方面提供一种银鲳饲料,其中添加有上述的解淀粉芽孢杆菌。
本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌具有预防治疗美人鱼发光杆菌的功效。而且,因本发明的解淀粉芽孢杆菌是从银鲳肠道中筛选获得的,因此可以在水体或饲料中高浓度使用,而不会对银鲳产生明显的应激反应。
附图说明
图1:Bac2021株的生长曲线图;
图2:注射感染实验的三组银鲳体内皮质醇的含量图;
图3:菌株对美人鱼发光杆菌的抑菌图,其中a为Bac2021株的菌液,c为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZM506株的发酵菌液,b和d分别为空白培养基对照。
具体实施方式
本发明实施例中所用的培养基为LB培养基,其组成如下:胰蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g,NaCl 10.0g,充分溶解于1000mL双蒸水中,121℃高压灭菌15分钟,将pH值调至调7.0,加15.0g琼脂,在4℃条件下备用。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1:筛选对美人鱼发光杆菌具有抑制效果的菌株
2020年在宁波养殖厂的养殖银鲳出现细菌感染的迹象,患病银鲳出现明显的皮肤溃疡,在银鲳的胸鳍、臀鳍、尾鳍均具有严重的出血症状,背鳍和臀鳍鳍条基部出现了程度严重的烂鳍现象;对致病菌进行分离,分子标记确定致病菌为美人鱼发光杆菌。
而在同一养殖环境中的银鲳并没有表现出发病的症状,从这些健康银鲳的肠道样品中筛选获得具有拮抗美人鱼发光杆菌效果的菌株。
1、筛选单菌落
用麻醉剂对银鲳进行麻醉后迅速解剖,分离出肠道,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)对肠道外壁进行冲洗后,用镊子挤出肠道内容物,放入含有PBS缓冲液的离心管中,随后用灭菌眼科剪将胃肠道纵向剪开,用PBS缓冲液清洗几次,去掉残留肠道内含物,用橡胶刮刀将肠道内壁粘膜慢慢刮下来,将分离的内含物和粘膜混合在一起,混合均匀。
将肠道内容物在80℃水浴加热30分钟,取100μL涂布于LB固体培养基上,电热恒温培养箱中30℃培养24h;筛选单菌落。
将纯化的单菌落分别在LB液体培养基中进行培养,30℃、180rpm/min培养24h后,在4℃、8000rpm条件下离心10min,获得的上清培养液用于牛津杯抑菌圈实验。
2、牛津杯抑菌圈实验
将100μL经过扩大培养的美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)ZM504株(保藏编号为CGMCC NO.16907)的菌液涂布到TSA-1固体培养基上,取100μL筛选的每个单菌落的上清培养液加入到牛津杯中,在30℃培养24h后,测量抑菌圈直径,筛选抑菌圈直径最大的单菌落进行进一步研究。
5个单菌落(分别命名为pa-1、pa-2、pa-3、pa-4、pa-5)进行抑菌实验,结果表明pa-2的抑菌圈最大(表1),从而将其用于进一步的分析。
表1:筛选菌株的抑菌圈直径表
菌种名称 抑菌圈直径(cm)
pa-1 3.52
pa-2 4.03
pa-3 2.74
pa-4 2.95
pa-5 1.86
3、pa-2的分类学鉴定
pa-2株在普通琼脂平板上形成圆形、扁平、湿润有粘性的小菌落。经革兰染色确定为革兰阳性杆菌,显微镜下可见两端钝圆、长短不一、有大于菌体的末端芽胞存在。
通过16S rRNA方法确定pa-2株的分类学信息,具体步骤如下:
1)基因组DNA提取
使用细菌DNA试剂盒提取菌液的总DNA。用溶菌酶消化细菌细胞壁,接着用蛋白酶K裂解细胞,裂解后过DNA吸附柱,用试剂盒中配置的洗涤液快速洗涤DNA,最后用低离子强度洗涤液洗脱DNA。使用NanoDrop 1000测定DNA浓度,A260/A280的比值在1.7-1.8之间。提取的DNA产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。用无菌水将DNA稀释至1ng/L。所得的DNA在-20℃保存,用于细菌16S rRNA基因的PCR扩增。
2)PCR扩增
利用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)对16S rRNA的V3区进行PCR扩增。将切胶回收纯化的PCR产物进行测序。测序结果通过NCBI的BLAST进行同源序列比对,确定pa-2株与NCBI数据库中已有的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的16SrDNA序列同源性相似性最高(SEQID NO:1)。
因此将pa-2株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bac2021株,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,其保藏编号为CGMCC NO:23793;地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2:Bac2021株的生长曲线测定
将Bac2021株接种到LB液体培养基中,在30℃、180rpm/min培养24h获得种子液。再取1mL培养的种子液接种于LB液体培养基中,在0℃、180rpm/min条件下进行培养。每2h用分光光度计在600nm处测定发酵液的D600nm值至其趋于稳定。对照组为未接菌的LB培养基。
如图1所示,本发明筛选的Bac2021株在经过3h的生长迟缓期后,其生长量开始逐渐上升进入对数期。在15~28h时生长速度较快且稳定,进入稳定生长期。28h后生长量开始下降。
因此,本发明所筛选的Bac2021株在培养28h后就能获得理论上的最高菌含量。
实施例3:Bac2021株对银鲳的安全性检测
1)溶血性实验
将Bac2021株接种至LB液体培养基,在30℃、180rpm/min培养24h,培养液中菌浓度约为108CFU/mL;然后取10μL菌液点种到血平板上,在30℃恒温培养箱中培养24h,观察是否有溶血现象产生。而以美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)ZM504株作为阳性对照。
结果显示美人鱼发光杆菌ZM504株的血平板上的滤纸片周围有草绿色圆环,显示为α溶血;而Bac2021株平板上的滤纸片周围没有圆环。结果表明本发明的Bac2021株不产生溶血素,没有溶血性能。
2)注射感染实验
将Bac2021株活化后接种至LB液体培养基,在30℃、180rpm/min中培养24h(菌液浓度约为108CFU/mL);然后将发酵培养液在8000r/min条件下离心5min来收集菌体,用无菌生理盐水冲洗三次,将菌体密度调整为1.50×107CFU/mL。
在宁波象山银鲳养殖场挑取日龄60-80d的健康银鲳进行腹腔注射感染实验,实验分为3组,每组设10个平行,其中分别注射50μL生理盐水(生理盐水组,作为阴性对照组)、50μL(107CFU/mL)的Bac2021菌液(Bac2021组)、50μL(107CFU/mL)解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.857株菌液(CGMCC 1.857组)。
注射后的银鲳按照常规的方法进行养殖,结果发现注射了生理盐水和Bac2021菌液的银鲳,在注射后的第2-3天就可以恢复正常的摄食;而注射CGMCC 1.857株菌液组的银鲳在5天后才能恢复正常的进食,且10条注射银鲳中出现了一条死亡的现象。
上述结果表明本发明从银鲳肠道中筛选的解淀粉芽孢杆菌Bac2021株不会使银鲳产生明显的应激反应,而不同来源的解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.857株,会使银鲳产生明显的应激反应。
考虑到鱼类遭受应激源刺激时,皮质醇含量会显著升高,进而促进血糖含量增加,血糖的增加为肌肉和神经提供更多能量,通过抑制生长来使得鱼类适应应激环境。因此血清中皮质醇是评价鱼类抗应激能力的重要指标;当鱼体产生明显的应激反应时,体内的皮质醇含量会明显提升。
选用放射免疫法对上述三组的银鲳血清中的皮质醇的含量进行检测,结果如图2所示,结果表明解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.857株实验组的银鲳体内的皮质醇含量明显高于本发明的Bac2021株实验组的含量。
实施例4:Bac2021株对美人鱼发光杆菌的拮抗效果
将保藏编号为CGMCC NO.16907的美人鱼发光杆菌ZM504株接种到LB液体培养基中进行培养至OD600为0.8;之后将制备的菌液分别与含1%琼脂的对应培养基混合,使OD600至0.2,用以制作半固体培养基。
纸片法来检测抑菌性,在纸片上中分别加200μl本发明筛选获得的Bac2021株的发酵菌体的发酵液和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZM506株的发酵液体,恒温孵育24h后,观察并测定结果。
从图3结果可以看出,本发明Bac2021株的抑菌圈明显大于ZM506株的抑菌圈,表明本发明的Bac2021株具有更好的抑制美人鱼发光杆菌的效果。
本发明所筛选的菌株可用于制备用于预防、治疗美人鱼发光杆菌的制品,例如活菌剂。还可以用作饲料添加剂来制备银鲳饲料。
序列表
<110> 宁波市海洋与渔业研究院
<120> 一种用于防治美人鱼发光杆菌的解淀粉芽孢杆菌
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc 60
tgtaagactg ggataactca gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ctgaaccgca 120
tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttactg atggacccgc ggcgcattag 180
ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat 240
cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 300
tccgcaatgg acgaaagtct gacggaccaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc 360
gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt 420
acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtattac gtaggtggca 480
agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg 540
aaagcccccg gctcaaccgg ggagggacat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag 600
gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc 660
gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgggggg agcgaacagg 720
attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg 780
ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gagagtacgg tcgcaagact 840
gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 900
gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc 960
cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcat cagctcgtgt cgtgagatgt 1020
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca 1080
ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1140
ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatgcacag aacaaagggc agcgaaaccg 1200
cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caaatcgact 1260
gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1320
gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga aagtttgtaa cacccgatgt cggtgagg 1378

Claims (5)

1.一种解淀粉芽孢杆菌,其特征在于,所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的保藏编号为CGMCC NO:23793。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备用于预防和治疗美人鱼发光杆菌的制品中的应用。
3.一种用于预防和治疗美人鱼发光杆菌的制品,其特征在于,所述的制品中包含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的活菌或其发酵液。
4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备银鲳饲料中的应用。
5.一种银鲳饲料,其特征在于,所述的银鲳饲料中添加有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。
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