CN112322541B - 一株小菜蛾桂林不动杆菌PxCG3菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株及其应用，所述菌株于2020年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61134。本发明研究表明Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株具有提高Bt毒素杀虫活性、增效Cry1Ac原毒素快速致死小菜蛾的作用，Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株可以作为新型生物防治的细菌，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。

Description

一株小菜蛾桂林不动杆菌PxCG3菌株及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，更具体地，涉及一株小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株及其应用。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella(L)是危害十字花科作物最为严重的虫害之一，通常造成甘蓝、西兰花和花菜等多种重要蔬菜严重的经济损失(Talekar and Shelton,1993)。小菜蛾对防治鳞翅目害虫的所有杀虫剂及苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis(Bt)均产生了严重的抗药性，其防治越来越困难(Talekar and Shelton，1993；Baxter et al.,2005)。因此，需要寻找一种可以解决或缓解小菜蛾对Bt的抗性，从而提高Bt蛋白杀虫活性的方法。

在昆虫各个组织及器官均有不同种类及数量的昆虫共生菌分布，这些共生菌与其在长久的进化过程中，相互依存，有许许多多的研究表明，昆虫体内的共生菌对宿主昆虫的生长发育、繁衍起着特殊的作用。如今科学家已经探索了许多昆虫的共生菌，揭示了共生菌对宿主昆虫的重要意义。而昆虫的肠道参与昆虫的取食、消化、排泄等过程，具有极为丰富的营养物质和独特的生理生化环境，也是众多微生物赖以生存的部位；肠道主要分为前肠、中肠和后肠。其中，中肠是食物消化和营养吸收的最主要场所。昆虫肠道微生物种类极多，数量庞大，肠道细菌占整个肠道微生物的90％以上(杨云秋等，2018)。许多科学研究表明，昆虫的肠道微生物与宿主昆虫共同生活进化，参与调节众多生理功能，也对宿主昆虫生长发育起着重要作用，有些科学家甚至将肠道微生物喻为昆虫消化系统的一个器官，可见肠道微生物对宿主的重要意义，而中肠作为肠道的最主要部位，里面的共生菌微生物种群的结构和功能渐渐成为近年来的研究热点。例如专利CN109402008A公开了一株具有吲哚降解能力的不动杆菌TAT1-6A及其应用，所述菌株其吲哚降解能力测定结果表明吲哚的去除效果良好，能有效的降解粪便中的吲哚，降解率最高可达到84.45％，表现出了较高的应用潜力；CN109161511A公开了一种诱导番茄抗南方根结线虫的不动杆菌，所述不动杆菌的菌剂具有诱导番茄抗南方根结线虫的用途,可诱导番茄在种子萌发和生长期间产生对南方根结线虫的抗性；上述专利均涉及对不动杆菌的相关功能研究，但关于不动杆菌对于鳞翅目害虫的防治以及对Bt毒素杀虫活性的影响，目前还鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株。

本发明的第二个目的在于提供所述小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacterguillouiae PxCG3菌株的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株，所述菌株于2020年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61134。

具体地，所述菌株的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明通过将所述小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株进行小菜蛾饲喂试验，结果发现，与对照相比，在环丙沙星，左氧氟沙星及甲硝唑抗生素添食并清除小菜蛾肠道菌群后，添食Cry1Ac原毒素及本发明的PxCG3菌液，小菜蛾死亡率显著上升。添食后60小时，小菜蛾死亡率为81.67％，72h死亡率为96.67％；小菜蛾无菌种群在单独添食Cry1Ac原毒素处理下，死亡率比同时添食Cry1Ac原毒素加PxCG3显著降低，单独添食Cry1Ac原毒素60小时，小菜蛾死亡率为58.33％，72h死亡率为71.67％；结果表明本发明分离鉴定的Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株具有增效Cry1Ac等Bt蛋白原毒素快速致死小菜蛾的作用。

因此，本发明提供所述小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株在提高Bt蛋白杀虫活性中的应用。

小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株在防治十字花科蔬菜害虫中的应用。

本发明还提供一种用于防治十字花科蔬菜害虫的方法，是将小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株与Bt蛋白共同饲喂害虫。

本发明还提供所述的小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株在制备防治十字花科蔬菜害虫的药剂中的应用。

本发明还提供一种用于防治十字花科蔬菜害虫的药剂，所述药剂包含小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株，可利用PxCG3菌株对Bt蛋白原毒素的增效作用提高对害虫的致死率。

优选地，所述Bt蛋白为Cry1Ac原毒素。

优选地，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株小菜蛾桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株及其应用，所述菌株于2020年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61134。本发明研究表明，Acinetobacter guillouiae PxCG3菌株具有提高Bt毒素杀虫活性、增效Cry1Ac原毒素快速致死小菜蛾的作用，Acinetobacterguillouiae PxCG3菌株可以作为新型生物防治的细菌，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。

附图说明

图1为PxCG3分离菌平板照片。

图2为小菜蛾肠道分离菌PxCG3 16S rRNA系统发育分析。注：每一分支上标示为：GenBank序列号+菌株名称。

图3为不同处理小菜蛾幼虫存活率情况分析。注：Axenic-Cry1Ac表示为无菌种群且没有添食Cry1Ac原毒素；Axenic+Cry1Ac表示为无菌种群添食Cry1Ac原毒素处理；Axenic+Cry1Ac+PxCG3表示为无菌种群同时添食Cry1Ac原毒素以及PxCG3菌液处理。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1菌株PxCG3的分离培养

(1)选择性分离培养基的配制：

LB培养基(10g蛋白胨，5g酵母抽提物，10g NaCl，15g琼脂，溶于1L无菌ddH2O水中，调pH至7.0)；

营养琼脂培养基NA(3g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，15g琼脂，溶于1L无菌ddH2O中，调pH至7.0)。

(2)解剖并涂板：无菌条件下于超净台内解剖小菜蛾3龄幼虫并取中肠内含物，离心分取上清及沉淀，稀释5个浓度梯度，按稀释10^-4～10^-5倍后分别涂布NA平板，置于30℃恒温培养箱培养，每隔24h观察一次；

(3)连续纯化培养并拍照：选择性培养基中有单菌落长出后，首先根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落，每个单菌落至少在LB平板上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照(图1)并转接至LB液体培养基中，摇菌至指数生长期时保存于15％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。

实施例2菌株PxCG3鉴定及系统发育分析

1、传统的生物学鉴定

(1)菌落形态特征

从形态学来看PxCG3菌在LB平板上形成圆形、边缘整齐的灰白色菌落，革兰染色有时不易脱色，多为球杆状、常呈双排列,可单个存在，有时形成丝状和链状。本细菌专性需氧，最适生长温度为35℃；营养要求不高，在普通培养基上生长良好；

(2)桂林不动杆菌的生理生化特征测定

细菌生理生化测定参考《常见细菌系统鉴定手册》的方法进行，采用细菌微量生化反应管。对可利用的碳源测试结果如表1，对半乳糖、乳糖、山梨醇、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、淀粉、蜜二糖、D-核糖、蔗糖、黄色素都能利用，只有菊糖、棉子糖、松三糖不能利用。

表1 PxG3的生化特征

2、分子生物学鉴定

(1)使用天根生物公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNAKit)抽提保存的单克隆菌株基因组DNA，并以提取的DNA为模板，16S rDNA通用引物27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为上下游引物扩增细菌的16S rDNA，PCR反应体系如表2。轻轻混匀后，短暂离心，置于PCR仪上按照：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃，5min；4℃，end的程序反应，PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后送擎科生物技术有限公司(广州)测序。

表2细菌16S rDNA PCR扩增体系(50μL)

(2)菌株PxCG3系统发育分析

根据测序引物27F及1492R的结果。分析测序质量，并用SeqMan(DNAStar)拼接序列，然后将该序列与NCBI中rRNA/ITS数据库进行blast比对，并上传到GenBank数据库。选取下载整理PxCG3菌株的近缘序列后用ClustalW软件进行多序列比对分析，之后用Mega7.0软件采取邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树，调整bootstrap值并检验进化树的可靠性。结果如图2，由图2可知，PxCG3与Acinetobacter guillouiae strain ATCC 11171相似性最高。将其命名为小菜蛾桂林不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)PxCG3菌株，分类地位为细菌界(Bacteria)，变形菌门(Proteobacteria)，Gamma-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，假单胞菌目(Pseudomonadales)，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)，不动杆菌属(Acinetobacter)，桂林不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)。所述菌株已于2020年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61134，分类命名为Acinetobacter guillouiae PxCG3，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

实施例3 PxCG3菌株对Bt的增效作用

1、小菜蛾肠道细菌的清除

配制抗生素溶液：1mg/mL环丙沙星；1mg/mL左氧氟沙星；2mg/mL甲硝唑；

小菜蛾肠道细菌的清除方法，及添食抗生素。具体的方法：收集小菜蛾卵卡并消毒：收集小菜蛾产卵盛期产好的卵卡，首先置于5‰次氯酸钠消毒液中消毒10分钟，然后置于清水中浸泡两次，每次5分钟，最后用吸水纸吸干后置于养虫盒内，24h后添加饲料喂养；

抗生素饲喂处理：称取4g小菜蛾人工饲料于无菌培养皿中，然后分别加入333μL以上配制好的环丙沙星，左氧氟沙星及甲硝唑抗生素溶液，拌匀后置于养虫盒内，之后每天更换一次饲料，从初孵幼虫开始一直持续到三龄幼虫，对照组饲喂正常饲料；

肠道菌清除效果的检测：处理组与对照组分别随机取5头虫，解剖取中肠内容物，灭菌ddH₂O梯度稀释10³～10⁴倍，取100μL涂板LB固体培养基(无抗性)，48h后检测有无细菌生长；另取约20头虫中肠，研磨抽提DNA，16S通用扩增引物PCR检测，检测有无扩增条带。

2、试验组处理

选取健康发育历期一致的三龄小菜蛾。不同处理对Cry1Ac原毒素(20ug/mL)的敏感性测定均使用亚致死剂量(LC₂₅)Cry1Ac前毒素。将Cry1Ac原毒素储存液用ddH₂O稀释至20ug/mL，然后每4g饲料混合1mL毒素稀释液。小菜蛾3龄幼虫饲喂前，饥饿处理小菜蛾4h，饲喂后从24h开始每隔12h统计活虫数量，一直持续到132h。存活率统计分析情况见图3，数据处理及图表制作使用Graphpad 7.0软件，并用Student’s-T test进行差异显著性分析。可见，当用环丙沙星，左氧氟沙星及甲硝唑抗生素添食并清除小菜蛾肠道菌群后，添食Cry1Ac原毒素及PxCG3菌液，小菜蛾死亡率显著上升。添食后60小时，小菜蛾死亡率为81.67％，72h死亡率为96.67％；小菜蛾无菌种群在单独添食Cry1Ac原毒素处理下，死亡率比同时添食Cry1Ac原毒素加,PxCG3显著降低，单独添食Cry1Ac原毒素60小时，小菜蛾死亡率为58.33％，72h死亡率为71.67％；表明本发明分离鉴定到了PxCG3菌株具有增效Cry1Ac原毒素快速致死小菜蛾的作用，本发明分离得到的小菜蛾桂林不动杆菌(Acinetobacterguillouiae)PxCG3菌株可以作为新型生物防治的细菌，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株小菜蛾桂林不动杆菌PxCG3菌株及其应用

<141> 2020-11-16

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> 小菜蛾桂林不动杆菌(Acinetobacter guillouiae PxCG3)

<400> 1

ggtcgtagtc gtagagttcg atcctggctc agtgagacgt tgcttcggaa actgtaccta 60

tttggcggac gggtgagtaa tacttaggaa tctgcctatt aatgggggac aacatctcga 120

aagggatgct aataccgcat acgccctacg ggggaaagca ggggatcact tgtgaccttg 180

cgttaataga tgagcctaag tcggattagc tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg 240

acgatctgta gcgggtctga gaggatgatc cgccacactg ggactgagac acggcccaga 300

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg gggaaccctg atccagccat 360

gccgcgtgtg tgaagaaggc cttatggttg taaagcactt taagcgagga ggaggctctt 420

ctagttaata cctaggatga gtggacgtta ctcgcagaat aagcaccggc taactctgtg 480

ccagcagccg cggtaataca gagggtgcga gcgttaatcg gatttactgg gcgtaaagcg 540

tgcgtaggcg gctttttaag tcggatgtga aatccccgag cttaacttgg gaattgcatt 600

cgatactggg aagctagagt atgggagagg atggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat 660

gcgtagagat ctggaggaat accgatggcg aaggcagcca tctggcctaa tactgacgct 720

gaggtacgaa agcatgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac 780

gatgtctact agccgttggg gcctttgagg ctttagtggc gcagctaacg cgataagtag 840

accgcctggg gagtacggtc gcaagactaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca 900

agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg gtcttgacat 960

agtaagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac ttacatacag gtgctgcatg 1020

gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttt 1080

tccttatttg ccagcacttc gggtgggaac tttaaggata ctgccagtga caaactggag 1140

gaaggcgggg acgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgac cagggctaca cacgtgctac 1200

aatggtcggt acaaagggtt gctacctagc gataggatgc taatctcaaa aagccgatcg 1260

tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga 1320

tcagaatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acgccataca 1380

agctagcgct acagaatttc cagtctcact aagtcgtaac aaggtagccg cagagtttcg 1440

tt 1442

Claims (7)

1.一株小菜蛾桂林不动杆菌（Acinetobacter guillouiae）PxCG3菌株，其特征在于，所述菌株于2020年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCCNo：61134。

2.权利要求1所述的小菜蛾桂林不动杆菌PxCG3菌株在防治小菜蛾中的应用。

3.一种用于防治小菜蛾的方法，其特征在于，将权利要求1所述的小菜蛾桂林不动杆菌PxCG3菌株与Bt蛋白共同饲喂小菜蛾。

4.权利要求1所述的小菜蛾桂林不动杆菌PxCG3菌株在制备防治小菜蛾的药剂中的应用。

5.一种用于防治小菜蛾的药剂，其特征在于，包含权利要求1所述的小菜蛾桂林不动杆菌PxCG3菌株。

6.根据权利要求5所述的药剂，其特征在于，还包含Bt蛋白。

7.根据权利要求3所述的方法或权利要求6所述的药剂，其特征在于，所述Bt蛋白为Cry1Ac原毒素。

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