CN114317337B - 一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌PxG15及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌PxG15菌株，该菌株于2021年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61609。该菌株能够在体外发酵培养，把PxG15菌株和Cry1Ac原毒素混合添食可快速致死十字花科蔬菜类害虫小菜蛾，具有增效Cry1Ac原毒素的作用；能显著抑制小菜蛾的羽化率，显著提高小菜蛾死亡率，对小菜蛾的致死率能达91.5％。本发明提供的盐生谷胱甘杆菌PxG15菌株能提高Bt在十字花科蔬菜害虫的杀虫效率，可作为新型微生物防治菌用于十字花科蔬菜害虫的防控。

Description

一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌PxG15及其 应用

技术领域

本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌PxG15及其应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性细菌，因其对人畜无害并对特定昆虫具有较高的杀虫活性，故在多个国家推广使用。目前Bt制剂被认为是使用最广泛的高效、环保的微生物杀虫剂。Bt在芽孢形成初期会分泌杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Protein，ICP)又称内毒素，晶体蛋白分为Cry和Cyt两大类，目前研究主要集中在Cry晶体。值得注意的是Bt制剂的杀虫毒力存在特异性，这是因为苏云金芽孢杆菌经害虫食入后，需在昆虫中肠碱性的环境中溶解，释放出原毒素(Protoxin)，而后被蛋白酶水解激活，形成具有杀虫活性的毒素蛋白(activated toxin)。水解后的毒素蛋白作用于虫体的中肠上皮细胞，引起肠道麻痹、穿孔、虫体瘫痪、停止进食。随后苏云金杆菌进入血腔繁殖，引起败血症，导致虫体死亡。

小菜蛾(Plutella xylostella)是危害十字花科蔬菜作物最严重的虫害之一，主要危害花菜、甘蓝和西兰花等十字花科蔬菜，因小菜蛾而造成的经济损失每年高达50亿美元。目前小菜蛾对所有杀虫剂包括苏Bt均产生了严重的抗药性，其防治越来越困难(Talekar and Shelton,1993；Baxter et al.,2005)。我国每年投入7.7亿美元用于小菜蛾的研究和防控(Furlong et al.,2013；Li et al.,2016)。

肠道是昆虫一个重要的器官，在防御经病原物侵染过程中的重要作用。肠道主要分为前肠、中肠和后肠。其中，中肠是食物消化和营养吸收的最主要场所。同时由于中肠的特殊生态环境，其中栖息着大量的肠道共生菌。这些共生菌对昆虫的生长发育、繁殖、营养吸收、免疫、抵御病原以及抗药性等具有重要的影响(Sharon et al.,2010；Dillon etal.,2005；Broderick et al.,2006)。昆虫中肠的共生菌与宿主昆虫间存在非常密切的关系，包括相互影响互相制约。一方面，昆虫中肠的微环境影响甚至决定着其肠道内细菌的群落结构及其代谢活动，另一方面，中肠细菌的群落组成及其代谢活动也反过来作用于宿主昆虫，影响宿主的生理代谢生长发育。同时昆虫的肠道共生菌存在定殖抗力，即优势菌群有抵御外来微生物及病原菌侵染的能力。昆虫肠道微生物的结构与功能主要受宿主生活环境及食物的影响，此外伴随着昆虫的不同发育阶段其肠道微生物也会发生相应的变化(Dillon et al.,2010；Yun et al.,2014)。一般情况下，昆虫与肠道微生物之间是互惠互利的关系，但在某些特殊情况下，一些肠道共生菌会变成条件致病菌进而对昆虫造成不利的影响。

昆虫肠道微生物种类繁多，大多数不可体外培养，但也有少数可以在体外培养的被纯化鉴定出来，相关功能也得以研究。目前也有针对昆虫的肠道菌群研究，一株蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)分离株具有抗菌活性，可以在Bt侵染过程中保护赤拟谷盗(Tribolium castaneum)降低死亡率(Grau et al.,2017)；现有技术也公开了具有昆虫肠道感染作用的球孢白僵菌菌株，通过肠道感染和肠道体壁双重感染起到防治害虫的协同增效作用；如中国专利CN112175861A公开了一株小菜蛾蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)PxG1菌株，可用于提高Bt毒素杀虫活性和增效Cry1Ac原毒素快速致死小菜蛾的作用，但是目前关于小菜蛾肠道菌的作用，也仅有麦芽芳香卡诺杆菌(Carnobacteriummaltaromaticum)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)和桂林不动杆菌(Acinetobacterguillouiae)是已鉴定的小菜蛾肠道菌，可用于以Bt的杀虫活性或抗性研究，目前仍然缺乏更多具有抗性或具有更多更好作用的菌株作为微生物杀虫剂或增效剂用来加强对害虫的防控。

发明内容

本发明提供了一株新的具有增效Cry1Ac杀虫活力的优良菌株，可以提高Cry1Ac对十字花科蔬菜害虫的毒力，作为微生物杀虫剂或增效剂用于加强对害虫的防控。

本发明的目的是提供一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌PxG15菌株。

本发明的第二个目的是提供所述菌株PxG15的应用。

本发明的第三个目的是提供一种Bt蛋白增效杀虫剂。

本发明的第四个目的是提供一种防治十字花科蔬菜害虫的药剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌(Glutamicibacterhalophytocola)PxG15菌株，该菌株于2021年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61609。该菌株分离自小菜蛾中肠中，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，经形态学特征和16S rRNA系统发育分析鉴定为盐生谷胱甘杆菌(Glutamicibacter halophytocola)同源性达到99.08％。菌株PxG15在LB固体平板上培养后，呈球状，圆形，凸起，光滑，不透明，黄色，外周无淡色黄晕，属于革兰氏阴性菌G^-。

本发明研究的PxG15菌株能够在体外发酵培养，PxG15菌株具有增效Cry1Ac原毒素作用，把PxG15菌株和Cry1Ac原毒素混合添食可快速致死小菜蛾，显著抑制小菜蛾的羽化率，平均羽化率下降到56.48％；将菌株PxG15发酵后的菌体、超声破碎上清和沉淀分别添食小菜蛾，均可显著提高小菜蛾死亡率，其中超声破碎沉淀与Cry1Ac原毒素对小菜蛾的死亡率能达到91.5％；本发明将小菜蛾肠道菌群清除后，肠道菌PxG15的回补可显著提高小菜蛾幼虫对Cry1Ac原毒素的敏感性(P<0.0001)，而且PxG15细菌的回补均降低了半数生存期(Median Survival Time)，使小菜蛾半数生存期由2.5天降低至1.5天。

特别地，苏云金杆菌可做微生物源低毒杀虫剂，以胃毒作用为主，主要对部分鳞翅目害虫有较好的防治效果，其杀虫原理是：在苏云金杆菌经害虫食入后，寄生于寄主的中肠内，在肠内合适的碱性环境中生长繁殖，晶体毒素经过虫体肠道内蛋白酶水解，形成有毒效的较小亚单位，它们作用于虫体的中肠上皮细胞，引起肠道麻痹、穿孔、虫体瘫痪、停止进食，随后苏云金杆菌进入血腔繁殖，引起败血症，导致虫体死亡；所以采用苏云金杆菌对防治十字花科蔬菜害虫具有很好地防治效果，而本发明的PxG15菌株具有增效Cry1Ac原毒素作用，可以进一步增强苏云金杆菌的杀虫活性，所以，本发明的PxG15菌株对采用苏云金杆菌防治的十字花科蔬菜害虫也具有一定的防治效果。

因此，菌株PxG15在制备Bt蛋白增效杀虫剂中的应用，在制备防治十字花科蔬菜害虫的药剂中的应用，以及在防治十字花科蔬菜害虫中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

本发明提供一种Bt蛋白增效杀虫剂，由所述菌株PxG15和/或其发酵液与Bt蛋白制备得到。

优选地，其发酵液的浓度为1.0×10⁵～1.0×10¹⁰CFU/mL。

优选地，所述Bt蛋白为Cry1Ac原毒素。

本发明提供一种防治十字花科蔬菜害虫的药剂，含有所述菌株PxG15和/或其发酵液。

优选地，其发酵液的浓度为1.0×10⁵～1.0×10¹⁰CFU/mL。

优选地，所述十字花科蔬菜害虫包括小菜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、菜青虫、黄曲条跳甲、小地老虎中的一种或几种。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌(Glutamicibacter halophytocola)PxG15菌株，该菌株能够在体外发酵培养，PxG15菌株具有增效Cry1Ac原毒素作用，把PxG15菌株和Cry1Ac原毒素混合添食可快速致死小菜蛾，显著抑制小菜蛾的羽化率，平均羽化率下降到56.48％；将菌株PxG15发酵后的菌体、超声破碎上清和沉淀分别添食小菜蛾，均可显著提高小菜蛾死亡率，其中超声破碎沉淀与Cry1Ac原毒素对小菜蛾的死亡率能达到91.5％；本发明将小菜蛾肠道菌群清除后，肠道菌PxG15的回补可显著提高小菜蛾幼虫对Cry1Ac原毒素的敏感性(P<0.0001)，而且PxG15细菌的回补均降低了半数生存期(Median Survival Time)，使小菜蛾半数生存期由2.5天降低至1.5天。

PxG15菌株具有增效Cry1Ac杀虫活力的作用，即能提高Bt在十字花科蔬菜害虫小菜蛾的杀虫效率，PxG15菌株可以作为新型生物防治的细菌，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景；可作为微生物杀虫剂或增效剂来加强对害虫的防控，为十字花科蔬菜害虫的防治提供新的微生物菌株和防治方法策略。

附图说明

图1为小菜蛾肠道微生物LB培养结果图(注：10^-1、10^-2、10^-3和10^-4为肠道菌不同稀释浓度梯度，对照组为肠道菌群加抗生素进行培养)；

图2为菌株PxG15的平板照片；

图3为小菜蛾肠道菌株PxG15系统发育分析图(注：每一分支上标示为：GenBank序列号+菌株名称)；

图4为菌株PxG15增效Cry1Ac原毒素对小菜蛾幼虫的存活率(注：Cry1Ac+ddH₂O表示为同时添食Cry1Ac原毒素以及ddH₂O；Cry1Ac+PxG15表示为同时添食Cry1Ac原毒素以及PxG15分离菌；PxG15+ddH₂O表示为同时添食PxG15分离菌以及ddH₂O；ddH₂O表示为单独添食ddH₂O)；

图5为菌株PxG15对小菜蛾羽化率的影响；

图6为菌株PxG15发酵产物增效Cry1Ac原毒素对小菜蛾的存活率；

图7为菌株PxG15回补对Cry1Ac原毒素毒力的影响(注：无菌小菜蛾幼虫(n＝60)经Cry1Ac原毒素处理的存活率分析；实验进行三次生物学重复，误差棒表示标准差；采用log-rank(Mantel-Cox)检验，P<0.01视为具有显著性差异)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1菌株的分离培养

(1)选择性分离培养基的配制：

LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母抽提物，10g NaCl，15g琼脂，溶于1L无菌ddH₂O中，调pH至7.0；

营养琼脂培养基NA：3g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，15g琼脂，溶于1L无菌ddH₂O中，调pH至7.0。

(2)解剖并涂板：

在无菌条件下于超净台内解剖小菜蛾3龄幼虫并取出中肠内含物，离心后分取上清液及沉淀，稀释4个浓度×10^-1、×10^-2、×10^-3和×10^-4梯度，按稀释10^-4倍后分别涂布LB平板，置于30℃恒温培养箱培养，并观察拍照，结果如图1所示，由图1可知4中不同稀释浓度的小菜蛾肠道菌群在添加抗生素培养后均不能生长。

(3)连续纯化培养并拍照：

选择性培养基中有单菌落长出后，根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落，每个单菌落至少在LB平板上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照，并转接至LB液体培养基中，摇菌至指数生长期时保存于15％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。

实施例2菌株的鉴定

(1)菌株的形态鉴定：

在LB固体培养基上，菌株呈球状，圆形，凸起，光滑，不透明，黄色，外周无淡色黄晕，属于革兰氏阴性菌G^-，命名为PxG15菌株，菌株PxG15的平板照片如图2所示，由图2可知菌株PxG15在平板上划线后菌株呈圆形，不透明的黄色，外周无淡色黄晕。

(2)16S rDNA鉴定：

利用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物公司)抽提保存的单克隆菌株基因组DNA，以提取的DNA为模板，16S rDNA通用引物27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTG TTACGACTT-3’，为上下游引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系如表1所示，配制好反应体系后轻轻混匀后，短暂离心，置于PCR仪上；

表1细菌16S rDNA PCR扩增体系

PCR扩增的程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃，5min；4℃保存。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后送广州擎科生物技术有限公司测序。

(3)菌株的系统发育分析：

根据测序结果进行分析，用Chromas软件拼接序列，然后将该序列与NCBI中rRNA/ITS数据库进行blast比对。GenBank序列号以及与数据库中已知细菌比对信息见下表2所示，序列信息如SEQ ID NO.1所示；选取PxG15菌株的近缘序列后用ClustalW软件进行多序列比对分析，采用MEGA 4.0软件的最大简约法(MP)对测定的小菜蛾幼虫肠道共生菌16SrDNA序列与部分GenBank数据库中相似性最高的序列进行系统发育分析，结果如图3所示，由图3可知菌株PxG15与盐生谷胱甘杆菌Glutamicibacter halophytocola聚为一支，同源性较高，推测可能为同一菌种，菌株PxG15分类单元属于细菌界，土杆菌门，放线菌纲，微球菌目，微球菌科，谷氨酸杆菌属，盐生谷胱甘杆菌。因此本发明筛选获得的降解菌鉴定为盐生谷胱甘杆菌Glutamicibacter halophytocola，并于2021年4月16日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61609，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

表2小菜蛾肠道分离菌PxG15 16S rDNA序列比对

(4)菌株PxG15的生理生化特征测定：

细菌生理生化测定参考《常见细菌系统鉴定手册》的方法进行，采用细菌微量生化反应管。对可利用的碳源测试结果如表3所示，测定结果表明PxG15对甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、果糖、鼠李糖、蔗糖、菊糖、松叁糖、棉子糖、淀粉和肝糖均能利用，对赤癣糖、D-阿拉伯糖、L-木糖、D-松二糖、阿东醇、山梨醇、乳糖、密二糖、海藻糖和木糖醇均不能利用。

表3 PxG15生理生化鉴定

注：“+”为阳性反应，“﹣”为阴性反应。

实施例3菌株PxG15和Cry1Ac原毒素对小菜蛾的生物测定

(1)菌株PxG15的活化：

在超净台将6mL LB液体培养基中，加入6μL PxG15甘油菌，30℃，200g摇床振荡培养12h。将摇好的菌液以1:100转接新鲜LB培养基，30℃，200g放入摇床摇6h。将活化后的肠道菌PxG15，10000g离心2min收集菌体，用相同的体积无菌ddH₂O清洗3次，收集清洗好的菌体，加入相同体积的ddH₂O制备菌悬液，取200μL菌悬液使用酶标仪检测OD₆₀₀，调节菌悬液OD₆₀₀＝1.0。

(2)小菜蛾的饲养：

在温度为25±1℃，光周期为16h:8h(光:暗)，相对湿度为75％的条件下饲养小菜蛾。小菜蛾幼虫使用人工饲料饲养，人工饲料的配方为：含有酵母粉40克，麦胚粉75克，复合维生素2克，山梨酸2克，尼泊金2克，抗坏血酸2克，蔗糖20克，萝卜籽6克，琼脂12克，菜籽油2毫升，亚油酸3到4滴，水500毫升；成虫饲喂10％蜂蜜水补充营养，卵用浸过萝卜菜汁的卵卡收集。

(3)Cry1Ac原毒素提取方法：

S1.活化Bt HD73甘油菌得到种子液，用种子液划线平板(LB固体培养基)，待长出单菌落后，挑取单菌落至LB液体培养基中，220rpm，30℃培养12h，之后1：100(菌液：培养基)比例转接菌液至1/2LB培养基，220rpm，30℃培养28.5h；

S2.4℃，8000g离心10分钟，收集沉淀；

S3.1M NaCl(预冷)清洗1次，ddH₂O(灭菌预冷)清洗1次；

S4.用Buffer A(50mM Na₂CO₃，50mM EDTA-Na₂，3％β-ME，pH 10.0)重悬，调节pH至9.6～10，100g，冰上孵育1h；

S5.4℃，13000g离心20min，收集上清；

S6.将收集到的上清用4M的NaAc-HAc调节pH到4.5，4℃过夜孵育；

S7.4℃，13000g离心15min，ddH₂O清洗2次，用50mM Na₂CO₃(PH 9.6)溶解；

S8.将Cry1Ac原毒素储存液用ddH₂O稀释至20mol/L；

S9.然后每1g饲料混合250μL样液，在饲喂小菜蛾3龄幼虫前，饥饿处理4h，饲喂后从24h开始每隔12h统计活虫数量，一直持续到84h。

(4)Cry1Ac原毒素对小菜蛾的毒力测定：

将上述步骤提取得到的Cry1Ac原毒素用无菌ddH₂O稀释成7个不同浓度，同时设置一组只含有无菌ddH₂O的作为空白对照，每个处理4个重复，每个重复10头虫。每个重复在无菌培养皿(直径9cm)中加入1克人工饲料，每皿在饲料上滴加250μL毒素稀释液，另外加入无菌ddH₂O的一组作为空白对照。搅拌均匀后，分别挑入10头饥饿处理约4h的三龄小菜蛾幼虫，挑虫完毕后转移至人工气候箱内饲养，气候箱温湿等条件与正常饲养一致。36h后统计每个皿内活虫数量，并计算对应每个处理的死亡率，参考对照组的死亡率情况，利用Abbott公式得到每个处理的校正死亡率(Abbott,1987)，然后使用SPSS 22进行Probit分析并计算毒力回归方程的斜率，亚致死剂量(LC₂₅)及其95％置信区间(Finney,1971)。

表4小菜蛾3龄幼虫对Cry1Ac原毒素的敏感性测定

(5)Cry1Ac原毒素对小菜蛾的处理：

随机选取160头生长健康且龄期一致的小菜蛾3龄幼虫，饥饿处理3h。将处理好的幼虫分成4组，每一组中再分出4个小组作为重复组，每一个重复组中有10头小菜蛾3龄幼虫；4组处理的配制如下所示：

组1：用125μL肠道菌PxG15和125μL ddH₂O与1g饲料添食3龄幼虫；

组2：用125μL肠道菌PxG15加125μL 20mol/L Cry1Ac原毒素与1g饲料添食3龄幼虫；

组3：用125μL 20mol/L Cry1Ac原毒素加125μL ddH₂O与1g饲料添食3龄幼虫；

组4：用250μL ddH₂O与1g饲料添食3龄幼虫。

每隔12h记录一次小菜蛾的存活虫数，直至所有小菜蛾死亡为止。数据处理及图表制作使用Graphpad 7.0软件，并用Student’s-T test进行差异显著性分析。结果如图4所示，由图4可知PxG15菌株和Cry1Ac原毒素混合添食3d后，小菜蛾存活率为58.23％，4d存活率为53.71％；单独添食Cry1Ac原毒素3d小菜蛾存活率为37.1％，4d存活率为14.8％，单独PxG15菌株对小菜蛾没有造成死亡，说明PxG15分离菌对Cry1Ac原毒素具有显著增效作用。

实施例4菌株PxG15对小菜蛾的羽化率影响

取甘油菌PxG15，按照1：1000比例转接于LB液体培养基中过夜活化培养得到种子菌，种子菌按照1：100的比例转接至新鲜培养基中培养约6h。培养后菌液离心富集菌体，ddH₂O重复洗涤3次以去除残留培养基，用ddH₂O稀释到OD₆₀₀＝1.0保存备用。

选取健康发育历期一致的3龄小菜蛾，称取4g小菜蛾人工饲料于无菌培养皿中，然后加1ml上述菌液，拌匀后置于养虫盒内，之后每天更换一次饲料，直至羽化观察，对照组饲喂正常饲料。数据处理及图表制作使用Graphpad 7.0软件，并用Student’s-T test进行差异显著性分析。结果如图5所示，由图5可知饲喂PxG15菌的小菜蛾，小菜蛾羽化率显著降低，平均羽化率为56.48％，说明分离菌PxG15可以显著降低羽化率。

实施例5菌株PxG15的发酵实验

(1)菌株PxG15的活化：

在超净台内6mL LB液体培养基中，加入6μL PxG15甘油菌，30℃，200g摇床振荡培养12h。将摇好的菌液以1:100转接新鲜LB培养基，30℃，200g放入摇床摇6h。将活化后的肠道菌PxG15，10000g离心2min收集菌体，用同样的体积无菌ddH₂O清洗3次。收集清洗好的菌体，加入同样体积的ddH₂O制备菌悬液。

(2)菌株PxG15的超声破碎：

利用超声(功率：1000w，超声5s；间隙5s，循环60次)破碎肠道菌PxG15，再10000rpm离心2min，分别收集上清和沉淀，上清用0.22μm的滤膜过滤，获得无菌上清。

(3)菌株PxG15发酵产物增效Cry1Ac原毒素对小菜蛾的死亡率的影响：

随机选取100头生长健康且龄期一致的小菜蛾3龄幼虫，饥饿处理3h。将处理好的幼虫分成3大组，每一大组中再分出3小组作为重复组，每一个重复组中有10头小菜蛾3龄幼虫，3大组处理的配制如下所示：

第一大组：用125μL肠道菌PxG15发酵产物和125μL 20mol/L Cry1Ac原毒素与1g饲料添食3龄幼虫；

第二大组：用125μL肠道菌PxG15超声破碎上清和125μL 20mol/L Cry1Ac原毒素与1g饲料添食3龄幼虫；

第三大组：用125μL肠道菌PxG15超声沉淀和125μL 20mol/L Cry1Ac原毒素与1g饲料添食3龄幼虫。

每隔12h记录一次小菜蛾的存活虫数，直至所有小菜蛾死亡为止。数据处理及图表制作使用Graphpad 7.0软件，并用Student’s-T test进行差异显著性分析。结果如图6所示，由图6可知PxG15的发酵产物，超声破碎上清，超声破碎沉淀分别与Cry1Ac原毒素混合添食小菜蛾后，都可以显著提高Cry1Ac原毒素对小菜蛾的死亡率。在第5天时，超声破碎沉淀与Cry1Ac原毒素对小菜蛾的死亡率为91.5％，超声破碎上清与Cry1Ac原毒素对小菜蛾的死亡率为75％，PxG15发酵产物与Cry1Ac原毒素对小菜蛾的死亡率为71％。

实施例6菌株PxG15对小菜蛾Cry1Ac原毒素的杀虫活性影响

(1)配制抗生素溶液：

采用1mg/ml环丙沙星；1mg/ml左氧氟沙星；2mg/ml甲硝唑。

(2)收集卵卡并消毒：

收集小菜蛾产卵盛期产好的卵卡，首先置于5‰次氯酸钠消毒液中消毒10分钟，然后置于清水中浸泡两次，每次5分钟，最后用吸水纸吸干后置于养虫盒内，1-2天待虫孵化后添加饲料喂养；

(3)抗生素饲喂处理：

称取4克小菜蛾人工饲料于无菌塑料杯中，然后分别加入333μL以上配制好的环丙沙星、左氧氟沙星以及甲硝唑抗生素溶液为处理组，搅拌均匀后取适量置于养虫盒内，之后每天更换一次新鲜饲料，从初孵幼虫开始一直持续到3龄初幼虫，处理前24h改为饲喂正常饲料；对照组从孵化开始一直饲喂正常饲料。

(4)肠道菌清除效果的检测：

处理组与对照组分别随机取10头虫，解剖取中肠内容物，无菌ddH₂O梯度稀释10³～10⁴倍，取100μl涂板LB固体培养基(无抗性)，置于30℃培养箱内培养，48h后检测有无细菌生长。

(5)回补肠道分离菌：

取出已经做好菌种鉴定的的肠道分离菌甘油菌，剔除重复菌种后，分别按照1：1000比例转接于LB液体培养基中过夜活化培养得到种子菌，种子菌按照1：100的比例转接至新鲜LB培养基中培养约6h。培养后将菌液离心富集菌体，无菌ddH₂O重复洗涤3次以去除残留培养基，菌体用ddH₂O重悬后稀释到OD₆₀₀＝1.0，然后称取1克小菜蛾人工饲料置于90mm无菌培养皿中，滴加250μL上述稀释后的菌液，搅拌均匀后每皿挑入10头三龄小菜蛾无肠道菌幼虫。

将分离出的小菜蛾肠道菌PxG15对无肠道菌种群进行回补，并分别测定了其对Cry1Ac原毒素的敏感性，结果如图7所示。由图7可知回补实验结果显示PxG15的回补可显著提高小菜蛾幼虫对Cry1Ac原毒素的敏感性(P<0.0001，log-rank(Mantel-Cox)检验)，而且PxG15细菌的回补均降低了半数生存期(Median Survival Time)，使小菜蛾半数生存期由2.5天降低至1.5天。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌PxG15及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1424

<212> DNA

<213> 盐生谷胱甘杆菌（Glutamicibacter halophytocola）PxG15菌株(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 1

gggactggcg ctgcttacca tgcagtcgaa cgatgaagcc ctgcttgcag ggtggattag 60

tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgagtaac ctgcccccga ctctgggata agcccgggaa 120

actgggtcta ataccggata tgacttccta ctgcatggtg ggttgttgaa agatttatcg 180

gtgggggatg gactcgcggc ctatcagctt gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac 240

gacgggtagc cggcctgaga gggtgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300

cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc 360

cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttc agtagggaag aagcgaaagt 420

gacggtmcct gcagaagaag cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480

ggcgcaagcg ttatccggat ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtt tgtcgcgtct 540

gccgtgaaag tccgaggctc aacctcggat ctgcggtggg tacgggcaga ctagagtgat 600

gtaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc 660

gatggcgaag gcaggtctct gggcatttac tgacgctgag gagcgaaagc atggggagcg 720

aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgtt gggcactagg tgtgggggac 780

attccacgtt ttccgcgccg tagctaacgc attaagtgcc ccgcctgggg agtacggccg 840

caaggctaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta 900

attcgatgca acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacatg tgccagaccg ctccagagat 960

ggggtttccc ttcggggctg gttcacaggt ggkgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgtt ccatgttgcc agcacgtagt 1080

ggtggggact catgggagac tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1140

tcatcatgcc ccttatgtct tgggcttcac gcatgctaca atggccggta caatgggttg 1200

cgatactgtg aggtggagct aatccctaaa agccggtctc agttcggatt ggggtctgca 1260

actcgacccc atgaagtcgg agtcgctagt aatcgcagat cagcaacgct gcggtgaata 1320

cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc aagtcacgaa agttggtaac acccgaagcc 1380

gatggcctaa ccaccttgtg tggggggagt cgtcgaaggc agta 1424

Claims (8)

1.一种具有增效Cry1Ac杀虫活力的盐生谷胱甘杆菌(Glutamicibacterhalophytocola)PxG15菌株，其特征在于，该菌株于2021年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61609。

2.权利要求1所述菌株PxG15在制备Bt蛋白增效杀虫剂中的应用，其特征在于，所述Bt蛋白为Cry1Ac原毒素。

3.一种Bt蛋白增效杀虫剂，其特征在于，由权利要求1所述菌株PxG15和/或其发酵液与Bt蛋白制备得到，所述Bt蛋白为Cry1Ac原毒素。

4.根据权利要求3所述Bt蛋白增效杀虫剂，其特征在于，所述发酵液的浓度为1.0×10⁵～1.0×10¹⁰cfu/mL。

5.权利要求1所述菌株PxG15在制备防治十字花科蔬菜害虫的药剂中的应用，其特征在于，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。

6.一种防治十字花科蔬菜害虫的药剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株PxG15和/或其发酵液，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。

7.根据权利要求6所述的药剂，其特征在于，发酵液的浓度为1.0×10⁵～1.0×10¹⁰cfu/mL。

8.权利要求1所述菌株PxG15在防治十字花科蔬菜害虫中的应用，其特征在于，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。

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