CN112175861B - 一株小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株及其应用，所述菌株于2020年06月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61067。本发明研究表明，饲喂Enterococcus mundtii PxG1菌株的小菜蛾，羽化率显著降低；同时表明Enterococcus mundtii PxG1菌株具有提高Bt毒素杀虫活性、增效Cry1Ac原毒素快速致死小菜蛾的作用，Enterococcus mundtii PxG1菌株可以作为新型生物防治的细菌，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。

Description

一株小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，更具体地，涉及一株小菜蛾肠球菌Enterococcus PxG1菌株及其应用。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella(L)是危害十字花科作物最为严重的虫害之一，通常造成甘蓝、西兰花和花菜等多种重要蔬菜严重的经济损失(Talekar and Shelton,1993)。小菜蛾对防治鳞翅目害虫的所有杀虫剂及苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis(Bt)均产生了严重的抗药性，其防治越来越困难(Talekar and Shelton，1993；Baxter et al.,2005)。因此，需要寻找一种可以解决或缓解小菜蛾对Bt的抗性，从而提高Bt蛋白杀虫活性的方法。

在昆虫各个组织及器官均有不同种类及数量的昆虫共生菌分布，这些共生菌与其在长久的进化过程中，相互依存，有许许多多的研究表明，昆虫体内的共生菌对宿主昆虫的生长发育、繁衍起着特殊的作用。如今科学家已经探索了许多昆虫的共生菌，揭示了共生菌对宿主昆虫的重要意义。而昆虫的肠道参与昆虫的取食、消化、排泄等过程，具有极为丰富的营养物质和独特的生理生化环境，也是众多微生物赖以生存的部位；肠道主要分为前肠、中肠和后肠。其中，中肠是食物消化和营养吸收的最主要场所。昆虫肠道微生物种类极多，数量庞大，肠道细菌占整个肠道微生物的90％以上(杨云秋等，2018)。许多科学研究表明，昆虫的肠道微生物与宿主昆虫共同生活进化，参与调节众多生理功能，也对宿主昆虫生长发育起着重要作用，有些科学家甚至将肠道微生物喻为昆虫消化系统的一个器官，可见肠道微生物对宿主的重要意义，而中肠作为肠道的最主要部位，里面的共生菌微生物种群的结构和功能渐渐成为近年来的研究热点。例如专利CN104911131A公开了一株蒙氏肠球菌及其在低温青贮中的应用，所述菌株具有耐低温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并在低温青贮过程中迅速繁殖并产酸降pH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维等营养成分有效保留，非营养物质如粗灰分成分降低，达到长期保存青贮饲料的效果；CN109456911A公开了一株蒙氏肠球菌HcM7及其应用，所述HcM7对HcNPV活性有显著的抑制作用，在保护美国白蛾中将具有广泛的应用。上述专利均涉及肠道共生菌蒙氏肠球菌的相关功能研究，但关于其对于蒙氏肠球菌对Bt蛋白等杀虫剂活性的影响，目前还鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株。

本发明的第二个目的在于提供所述小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtiiPxG1菌株的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株，所述菌株于2020年06月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61067。

具体地，所述菌株的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明从小菜蛾免疫Cry1Ac的中肠中分离培养一株PxG1菌株，本发明通过将所述小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株进行小菜蛾饲喂试验，结果发现，与对照相比，饲喂蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株的小菜蛾羽化率显著降低，表明可通过饲喂害虫以本发明的Enterococcus mundtii PxG1菌株从而降低害虫羽化率，控制害虫数量。另外，当用环丙沙星，左氧氟沙星及甲硝唑抗生素添食并清除小菜蛾肠道菌群后，添食Cry1Ac原毒素及本发明的PxG1菌液，小菜蛾存活率急剧下降，添食48小时，小菜蛾存活率仅为25％，在84小时小菜蛾存活率为1.7％，120小时存活率为0％；而清除肠道菌群的小菜蛾，添食Cry1Ac原毒素48小时小菜蛾存活率为60％，84小时小菜蛾存活率为16.7％，120小时小菜蛾存活率为1.7％，132小时存活率为0％；结果表明本发明分离鉴定的Enterococcus mundtii PxG1菌株具有增效Cry1Ac等Bt蛋白原毒素快速致死小菜蛾的作用。

因此，本发明提供所述小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株在提高Bt蛋白杀虫活性中的应用。

本发明还提供所述的小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株在降低十字花科蔬菜害虫羽化率中的应用。

小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株在防治十字花科蔬菜害虫中的应用。

本发明还提供一种用于防治十字花科蔬菜害虫的方法，是将小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株饲喂害虫，或将小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcusmundtii PxG1菌株与Bt蛋白共同饲喂害虫。

本发明还提供所述的小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株在制备防治十字花科蔬菜害虫的药剂中的应用。

本发明还提供一种用于防治十字花科蔬菜害虫的药剂，所述药剂包含小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株，可利用PxG1菌株对害虫羽化率的影响控制其数量。

优选地，还包含Bt蛋白，还可利用PxG1菌株对Bt蛋白原毒素的增效作用提高对害虫的致死率。

进一步优选地，所述Bt蛋白为Cry1Ac原毒素。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株小菜蛾蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii PxG1菌株及其应用，所述菌株于2020年06月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61067。本发明研究表明，饲喂Enterococcus mundtii PxG1菌株的小菜蛾，羽化率显著降低；同时表明Enterococcus mundtii PxG1菌株具有提高Bt毒素杀虫活性、增效Cry1Ac原毒素快速致死小菜蛾的作用，Enterococcus mundtii PxG1菌株可以作为新型生物防治的细菌，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。

附图说明

图1为PxG1分离菌平板照片。

图2为小菜蛾肠道分离菌PxG1 16S rRNA系统发育分析。注：每一分支上标示为：GenBank序列号+菌株名称。

图3为PxG1菌株对小菜蛾的羽化率情况分析。

图4为不同处理小菜蛾幼虫存活率情况分析。注：Axenic-Cry1Ac表示为无菌种群且没有添食Cry1Ac原毒素；Axenic+Cry1Ac表示为无菌种群添食Cry1Ac原毒素处理；Axenic+Cry1Ac+PxG1表示为无菌种群同时添食Cry1Ac原毒素以及PxG1菌液处理。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1菌株PxG1的分离培养

(1)选择性分离培养基的配制：

LB培养基(10g蛋白胨，5g酵母抽提物，10g NaCl，15g琼脂，溶于1L无菌ddH₂O水中，调pH至7.0)；

肠球菌分离培养基EC(3g牛肉浸粉，17g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g牛胆粉，5g氯化钠，1g七叶苷，0.5g柠檬酸铁铵，0.25g叠氮化钠，1g柠檬酸钠，13.5g琼脂，溶于1L无菌ddH₂O中，调pH至7.0)。

(2)解剖并涂板：无菌条件下于超净台内解剖小菜蛾3龄幼虫并取中肠内含物，离心分取上清及沉淀，稀释5个浓度梯度，按稀释10^-4～10^-5倍后分别涂布选择性平板EC，置于30℃恒温培养箱培养，每隔24h观察一次；

(3)连续纯化培养并拍照：选择性培养基中有单菌落长出后，首先根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落，每个单菌落至少在LB平板上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照(图1)并转接至LB液体培养基中，摇菌至指数生长期时保存于15％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。

实施例2菌株PxG1鉴定及系统发育分析

1、传统的生物学鉴定

(1)菌落形态特征

从形态学来看PxG1菌为圆形或椭圆形黄色菌落，表面光滑有光泽、呈链状排列的革兰氏阳性球菌。一般在液体培养基中链长，固体培养基中链则短，无鞭毛、无芽孢，为需氧或兼性厌氧菌。本菌同链球菌一样，对营养要求也较高，在含有血清的培养基上生长良好。

(2)肠球菌的生理生化特征测定

细菌生理生化测定参考《常见细菌系统鉴定手册》的方法进行，采用细菌微量生化反应管。对可利用的碳源测试结果如表1，对半乳糖、山梨醇、甘露醇、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、棉子糖、淀粉、蜜二糖、D-核糖、乳糖、菊糖、蔗糖、黄色素和松三糖都能利用，只有乳糖、菊糖、棉子糖、松三糖、淀粉不能利用。

表1 PxG1的生化特征

2、分子生物学鉴定

(1)使用天根生物公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNAKit)抽提保存的单克隆菌株基因组DNA，并以提取的DNA为模板，16S rDNA通用引物27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为上下游引物扩增细菌的16S rDNA，PCR反应体系如表1。轻轻混匀后，短暂离心，置于PCR仪上按照：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃，5min；4℃，end的程序反应，PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后送擎科生物技术有限公司(广州)测序。

表2细菌16S rDNA PCR扩增体系(50μL)

(2)菌株PxG1系统发育分析

根据测序引物27F及1492R的结果。分析测序质量，并用SeqMan(DNAStar)拼接序列，然后将该序列与NCBI中rRNA/ITS数据库进行blast比对，并上传到GenBank数据库。选取下载整理PxG1菌株的近缘序列后用ClustalW软件进行多序列比对分析，之后用Mega7.0软件采取邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树，调整bootstrap值并检验进化树的可靠性。结果如图2，由图2可知，PxG1与Enterococcus mundtii strain NBRC 100490和Enterococcus mundtii strain ATCC 43186相似性最高。将其命名为小菜蛾蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)PxG1菌株，所述菌株已于2020年06月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61067，分类命名为Enterococcus mundtiiPxG1，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

实施例3 PxG1菌株对小菜蛾的羽化率

取出保藏的甘油菌PxG1，按照1：1000比例转接于LB液体培养基中过夜活化培养得到种子菌，种子菌按照1：100的比例转接至新鲜培养基中培养约6h。培养后菌液离心富集菌体，ddH₂O重复洗涤3次以去除残留培养基，用ddH₂O稀释到OD600＝1.0保存备用。

选取健康发育历期一致的三龄小菜蛾。称取4g小菜蛾人工饲料于无菌培养皿中，然后加1mL上述菌液，拌匀后置于养虫盒内，之后每天更换一次饲料，直至羽化观察，对照组饲喂正常饲料。结果如图3，由图3可知，饲喂PxG1的小菜蛾，羽化率显著降低。数据处理及图表制作使用Graphpad 7.0软件，并用Student’s-T test进行差异显著性分析，表明喂食PxG1菌株会显著降低小菜蛾的羽化率，从而达到防治小菜蛾的目的。

实施例4 PxG1菌株对Bt的增效作用

1、小菜蛾肠道细菌的清除

配制抗生素溶液：1mg/mL环丙沙星；1mg/mL左氧氟沙星；2mg/mL甲硝唑；

小菜蛾肠道细菌的清除方法，及添食抗生素。具体的方法：收集小菜蛾卵卡并消毒：收集小菜蛾产卵盛期产好的卵卡，首先置于5‰次氯酸钠消毒液中消毒10分钟，然后置于清水中浸泡两次，每次5分钟，最后用吸水纸吸干后置于养虫盒内，24h后添加饲料喂养；

抗生素饲喂处理：称取4g小菜蛾人工饲料于无菌培养皿中，然后分别加入333μL以上配制好的环丙沙星，左氧氟沙星及甲硝唑抗生素溶液，拌匀后置于养虫盒内，之后每天更换一次饲料，从初孵幼虫开始一直持续到三龄幼虫，对照组饲喂正常饲料；

肠道菌清除效果的检测：处理组与对照组分别随机取5头虫，解剖取中肠内容物，灭菌ddH₂O梯度稀释10³～10⁴倍，取100μL涂板LB固体培养基(无抗性)，48h后检测有无细菌生长；另取约20头虫中肠，研磨抽提DNA，16S通用扩增引物PCR检测，检测有无扩增条带。

2、试验组处理

选取健康发育历期一致的三龄小菜蛾。不同处理对Cry1Ac原毒素(20ug/mL)的敏感性测定均使用亚致死剂量(LC₂₅)Cry1Ac前毒素。将Cry1Ac原毒素储存液用ddH₂O稀释至20ug/mL，然后每4g饲料混合1mL毒素稀释液。小菜蛾3龄幼虫饲喂前，饥饿处理小菜蛾4h，饲喂后从24h开始每隔12h统计活虫数量，一直持续到132h。存活率统计分析情况见图4。数据处理及图表制作使用Graphpad 7.0软件，并用Student’s-T test进行差异显著性分析。可见，当用环丙沙星，左氧氟沙星及甲硝唑抗生素添食并清除小菜蛾肠道菌群后，添食Cry1Ac原毒素及PxG1菌液，小菜蛾存活率急剧下降，添食48小时，小菜蛾存活率仅为25％，在84小时小菜蛾存活率为1.7％，120小时存活率为0％；而清除肠道菌群的小菜蛾，添食Cry1Ac原毒素48小时小菜蛾存活率为60％，84小时小菜蛾存活率为16.7％，120小时小菜蛾存活率为1.7％，132小时存活率为0％；表明本发明分离鉴定到了PxG1菌株具有增效Cry1Ac原毒素快速致死小菜蛾的作用，本发明分离得到的小菜蛾蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)PxG1菌株可以作为新型生物防治的细菌，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株及其应用

<141> 2020-07-16

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 蛾蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii PxG1)

<400> 1

gggtgctata ctgcagtcga acgcttcttt tcccaccgga gcttgctcca ccgggaaaag 60

aggagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc catcagaagg ggataacact 120

tggaaacagg tgctaatacc gtataacaat cgaaaccgca tggtttcgtt ttgaaaggcg 180

ctttacggtg ccgctgatgg atggacccgc ggtgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240

tcaccaaggc cacgatgcat agccgacctg agagggtgat cggccacatt gggactgaga 300

cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg acgaaagtct 360

gaccgagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct gttgttagag 420

aagaacaagg gtgagagtaa ctgttcaccc cttgacggta tctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg 540

gcgtaaagcg agcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600

gagggtcatt ggaaactggg agacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccatgtgta 660

gcggtgaaat gcgtagatat atggaggaac accagtggcg aaggcggctc tctggtctgt 720

aactgacgct gaggctcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac 840

gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg 900

gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960

ggtcttgaca tcctttgacc actctagaga tagagcttcc ccttcggggg caaagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080

cgcaaccctt attgttagtt gccatcattt agttgggcac tctagcaaga ctgccggtga 1140

caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200

cacgtgctac aatgggaagt acaacgagtc gcgaagtcgc gaggctaagc taatctctta 1260

aagcttctct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagccg gaatcgctag 1320

taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa cctttttgga gccagccgcc 1440

taagggtatg ag 1452

Claims (9)

1.一株小菜蛾蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)PxG1菌株，其特征在于，所述菌株于2020年06月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，菌种保藏号为GDMCC No：61067。

2.权利要求1所述的小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株在提高Bt蛋白杀虫活性中的应用。

3.权利要求1所述的小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株在降低小菜蛾羽化率中的应用。

4.权利要求1所述的小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株在防治小菜蛾中的应用。

5.一种用于防治小菜蛾的方法，其特征在于，将权利要求1所述的小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株饲喂小菜蛾，或将权利要求1所述的小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株与Bt蛋白共同饲喂小菜蛾。

6.权利要求1所述的小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株在制备防治小菜蛾的药剂中的应用。

7.一种用于防治小菜蛾的药剂，其特征在于，包含权利要求1所述的小菜蛾蒙氏肠球菌PxG1菌株。

8.根据权利要求7所述的药剂，其特征在于，还包含Bt蛋白。

9.根据权利要求2所述的应用或权利要求5所述的方法或权利要求8所述的药剂，其特征在于，所述Bt蛋白为Cry1Ac原毒素。

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