CN115181711B - 人乳杆菌lhm11及菌剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是涉及微生物领域,具体涉及人乳杆菌LHM11及菌剂和应用。本发明的人乳杆菌(Lactobacillus hominis)M11能改善动物机体代谢,增加有益的代谢产物,从而增加睾丸有益代谢产物如视磺酸(调控精子发生的起始),从而提高雄性动物的精子质量和繁殖力;能在动物体内定植,并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
Description
技术领域
本发明是涉及微生物领域,具体涉及人乳杆菌LHM11及菌剂和应用。
背景技术
目前,雄性动物的雄性不孕不育率大幅度提高,主要是因为雄性生殖系统更容易受环境因素的影响。然而现在还没有良好的方法改善精液品质从而治疗雄性不孕不育。近年来研究发现肠道菌群与人及其他动物的健康息息相关,然而肠道菌群与雄性生殖轴的关系还没有确认,虽然已经有研究发现肠道菌群混合物可以改变雄性动物的精液品质,有益的肠道有益菌群可以改善动物的精液品质,但是还没有报道具体是哪种有益菌可以起到改善动物精液品质,提高雄性动物繁殖力,也没有任何文献公开哪种具体的肠道菌可以提高雄性繁殖力。
发明内容
本发明的目的是提供一种人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11。
本发明的另一目的是提供包含上述人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的菌剂。
本发明的另一目的是提供上述人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的应用。
本发明的人乳杆菌M11,该菌株于2022年 7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),分类命名为人乳杆菌Lactobacillus hominis,保藏编号为CGMCC No.25327。
本发明提供含有人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的菌剂,所述菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂,采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明提供了人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11用于制备以下用途的制剂的用途,
(1)改善肠道健康;
(2)改善血液及睾丸代谢组;
(3)增加雄性动物精子浓度;
(4)增加雄性动物精子活力;
(5)提高雄性动物交配成功率及交配的雌性动物怀孕率;和/或
(6)提高雄性动物交配的雌性动物产活仔数。
本发明的目的是提供一种人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11,该菌能改善动物机体代谢,增加有益的代谢产物,从而增加睾丸有益代谢产物如视磺酸(调控精子发生的起始),从而提高雄性动物的精子质量和繁殖力;而且人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11能在动物体内定植,并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
附图说明
图1为本发明的人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的生长曲线(MRS培养基);
图2显示本发明实施例2中试验小鼠在试验周期35天体重变化情况;
图3显示本发明实施例2中试验小鼠的精子浓度;
图4显示本发明实施例2中试验小鼠的精子活力;
图5显示本发明实施例2中试验小鼠的精子顶体完整性;
图6显示本发明实施例2中试验小鼠的精子的畸形率;
图7显示本发明实施例2中试验小鼠的怀孕率;
图8显示本发明实施例2中试验小鼠的产活仔数;
图9显示本发明实施例3中试验公猪的采精量;
图10显示本发明实施例3中试验公猪精子的浓度;
图11显示本发明实施例3中试验公猪精子的活力;
图12显示本发明实施例3中试验公猪精子的顶体完整性;
图13显示本发明实施例3中试验公猪精子的畸形率;
图14显示本发明实施例4中试验公牛精子的浓度;
图15显示本发明实施例4中试验公牛精子的活力;
图16显示本发明实施例4中试验公牛精子的顶体完整性;
图17显示本发明实施例4中试验公牛精子的畸形率。
本发明的人乳杆菌M11,分类命名为人乳杆菌Lactobacillus hominis,该菌株于2022年 7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No.25327。
具体实施方式
本发明验证了人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11(以下实施例缩写为LHM11)对雄性动物繁殖力的有益作用,以白消安(Busulfan)建立小鼠弱精、少精症模型,发现该菌株能够提高精子浓度、活力、顶体完整性,降低精子畸形率,提高雄鼠与正常雌鼠交配的成功率,交配后母鼠的怀孕率、产活仔数。夏季高温高湿会导致公猪、公羊精液品质下降,从而导致母猪、母羊怀孕率和产活仔数减少,LHM11可以提高夏季高温高湿状态下公猪和公羊的精子浓度和活力、顶体完整性,降低精子畸形率。
实施例1人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的分离
1、菌株分离:人乳杆菌Lactobacillus hominis分离自肠道内容物。取肠道内容物,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释,吸取合适稀释度的稀释液0.1mL在MRS琼脂上均匀涂布,37°C培养48h后, 将生长出的菌落通过平板划线接种到新的MRS固体培养基进行纯化培养48h。
2、菌株富集:将纯化培养后的菌株,在无菌操作台上用接种环逐一接种到无菌MRS肉汤培养基中,置于摇床中,37°C培养48h后进行16S rRNA鉴定,并将剩余部分与含有25%甘油的生理盐水混合,保存至-80°C冰箱。
3、16S rRNA鉴定:将富集后的菌液,使用细菌通用引物进行菌落PCR扩增后,进行16S rDNA测序鉴定,在NCBI上将各个菌株的16S rDNA序列与数据库中所有已测定细菌的16S rDNA序列进行比对,其中发现有5株与人乳杆菌属的Lactobacillus hominis JCM18988的16S rDNA 序列的同源相似性最高,相似度大于或等于99.8%,确定这5株菌种类别为人乳杆菌 (Lactobacillus hominis)。
实施例2人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的特性检测
1、人乳球菌LHM11的微生物学特性如下:
(1)菌落形态:圆形单菌落,直径大约1~2mm,乳白色,不透明,菌落表面光滑有微微的凸起,边缘是规则的。
(2)染色后细菌形态呈现短杆状,无鞭毛,不能运动。
(3)生长特性:在MRS液体培养基中,置于37°C摇床培养,5小时后开始进入对数生长期,14h进入平台期,最大活菌数为3.09×108CFU/mL (图1)。
2、耐胆盐检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液,分别取1ml接种到9ml含猪胆盐浓度为0.3g/100mL的无菌生理盐水中,1h后采用平板涂布法测定活菌数。
结果显示(表1),在0.3g/100mL的胆盐浓度下,与其它4株人乳杆菌比较,人乳杆菌(Lactobacillus hominis)M11具有最好的耐胆盐能力,存活率在21.33%左右。
表1人乳杆菌在强胆盐0.3%浓度下的存活率%
3、耐人工胃液检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液,分别取1ml接种到9ml PH=1.5的人工胃液中,1h后采用平板涂布法测定活菌数。
结果显示(表2),在pH=1.5的人工胃液1h后,与其它4株人乳杆菌比较,LHM11具有最好的耐人工胃液能力,存活率在 20.15%左右。
表2人乳杆菌在pH=1.5的人工胃液中的存活率%
4、耐人工肠液检测
将已活化并且菌液浓度在1×108CFU/mL的菌液,分别取1ml接种到9ml pH=6.8的人工胃液中,4h后采用平板涂布法测定活菌数。
结果显示(表3),在人工肠液4h后,与其它4株人乳杆菌比较,LHM11具有最好的耐人工肠液能力,存活率在22.12%左右。
表3人乳杆菌在人工肠液的存活率%
实施例3人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11对白消安模型雄性小鼠繁殖力的影响
在确定人乳杆菌LHM11菌株具有最好的益生特性,保留人乳杆菌LHM11菌株用于后续实验。
一、实验方法
1、选取100只21日龄的ICR雄性小鼠,饲养于中国农业科学院动物科学研究所动物中心。试验过程中,将鼠房的温度控制在22±2℃,光照/黑暗时间为12小时,并自由取食和饮水。
2、将所有小鼠随机分为5组(每组20只小鼠):对照组(Con组),白消安组(B组),B+LHM11(10^6)组,B+LHM11(10^8)组,B+LHM11(10^10)组。Con组:在试验过程中,每天灌胃一次0.1ml的生理盐水,为期14天;B组:在试验过程中,每天灌胃一次0.1ml的生理盐水,为期14天;B+LHM11(10^6)组:在试验过程中,每天灌胃一次0.1ml浓度为1×106CFU/mL的菌液,为期14天;B+LHM11(10^8)组:在试验过程中,每天灌胃一次0.1ml浓度为1×108CFU/mL的菌液,为期14天;B+LHM11(10^10)组:在试验过程中,每天灌胃一次0.1ml浓度为1×1010CFU/mL的菌液,为期14天。然后所有小鼠正常饲养21天(3周),不做任何处理,试验过程中,每天测量小鼠体重,观察并记录小鼠的状态,存活情况,有无临床异常症状等。总计35天后(14天+21天),第36天,每组随机选取10只小鼠,收集样品进行分析。每组剩余的10只小鼠与正常母鼠交配,每只公鼠与2只母鼠交配,交配4天。交配4天后母鼠单笼饲养,公鼠收样检测分析。交配21天后统计母鼠怀孕率,产活仔数。
二、检测指标
1、试验期间,每2天统计小鼠体重一次。
2、测量公鼠精子浓度、活力、顶体完整性、畸形率。
3、交配21天后统计母鼠的怀孕率、产活仔数。
4、并检测公鼠的血液指标和睾丸代谢物。
三、实验结果
1、生长情况:整个试验中小鼠生长变化情况如图2所示,白消安导致小鼠体重增长变慢,从处理的第5天白消安组(B)的体重要低于对照组,而且一直到实验结束,白消安组体重显著低于对照组,而白消安处理后饲喂LHM11的3个组的体重要高于白消安组。
2、精子浓度:如图3所示,白消安模型组小鼠的精子浓度远远低于对照组,白消安处理后饲喂LHM11的3个组的精子浓度远远高于百消安组,几乎达到对照组的水平。
3、精子活力:如图4所示,白消安模型组小鼠的精子活力远远低于对照组,白消安处理后饲喂LHM11的3个组的精子活力远远高于百消安组,几乎达到对照组的水平。
4、精子顶体完整性:如图5所示,白消安模型组小鼠的精子顶体完整性变差,远远低于对照组,白消安处理后饲喂LHM11的3个组的精子顶体完整性远远高于白消安组,几乎达到对照组的水平。
5、精子畸形率:如图6所示,白消安模型组小鼠的精子畸形率远远高于对照组,白消安处理后饲喂LHM11的3个组的精子畸形率远远低于白消安组,与对照组的水平相当。
6、怀孕率:如图7所示,白消安模型组小鼠与正常母鼠交配后的怀孕率远远低于对照组,白消安处理后饲喂LHM11的3个组的小鼠与正常母鼠交配后的怀孕率远远高于白消安组,几乎达到对照组的水平。
7、产活仔数:如图8所示,白消安模型组小鼠与正常母鼠交配后,母鼠产活仔数远远少于对照组,白消安处理后饲喂LHM11的3个组的小鼠与正常母鼠交配后,母鼠产活仔数远远多于百消安组,几乎达到对照组的水平。
8、另外,对处理后的公鼠的血液和睾丸代谢物分析发现,白消安增加了血液及睾丸中有害代谢物,减少有益代谢物。而白消安处理后饲喂LHM11增加血液及睾丸有益代谢物如谷胱甘肽、视磺酸及总还原能力等。
实施例4人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11对公猪精液品质的影响
一、实验方法
选用公猪站里健康公猪40头(2 ~ 3岁),体重大约300公斤(kg)。所有公猪分别被圈养在封闭的猪舍内,并提供商品饲料和自由饮水。猪圈环境保持清洁、通风,并定期消毒。实验在夏季的7,8月份。
所有公猪被随机分为4个组:对照组(Con);LHM11(10^9)组;LHM11(10^12)组;LHM11(10^15)组;每组10头公猪。Con组:饲喂商用饲料;LHM11(10^9)组:饲喂商用饲料+109CFU/头/天乳杆菌LHM11;LHM11(10^12)组:饲喂商用饲料+1012CFU/头/天乳杆菌LHM11;LHM11(10^15)组:饲喂商用饲料+1015CFU/头/天乳杆菌LHM11;LHM11饲喂两周(14天),然后所有组饲喂商用饲料56天(总实验周期70天),每天饲喂2次,定量饲喂。试验过程中,观察并记录公猪的状态。70天后收取公猪精液,并测试分析。
二、检测指标
1、试验期间,每天统计公猪的体征。
2、第71天开始检测公猪的精液品质。
三、实验结果
1、采精量:如图9所示,饲喂LHM11的3个组的采精量多于对照组。
2、精子浓度:如图10所示,饲喂LHM11的3个组的精子浓度高于对照组。
3、精子活力:如图11所示,饲喂LHM11的3个组的精子活力高于对照组。
4、精子顶体完整性:如图12所示,饲喂LHM11的3个组的精子顶体完整性高于对照组。
5、精子畸形率:如图13所示,饲喂LHM11的3个组的精子畸形率低于对照组。
实施例5人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11对公牛精液品质的影响
一、实验方法
选用健康公牛40只(2 ~ 3岁),体重大约1000公斤(kg)。所有公牛分别被圈养在封闭的牛舍内,并提供常规饲料(精料和草料)和自由饮水。牛圈环境保持清洁、通风,并定期消毒。实验在夏季的7,8月份。
所有公牛被随机分为4个组:对照组(Con);LHM11(3×10^9)组;LHM11(3×10^12)组;LHM11(3×10^15)组;每组10只公牛。Con组:饲喂常规饲料;LHM11(3×10^8)组:饲喂常规饲料+3×109CFU/头/天乳杆菌LHM11;LHM11(3×10^12)组:饲喂常规饲料+3×1012CFU/头/天乳杆菌LHM11;LHM11(3×10^15)组:饲喂商用饲料+3×1015CFU/头/天乳杆菌LHM11;LHM11饲喂两周(14天),然后所有组饲喂商用饲料56天(总实验周期70天),定量饲喂。试验过程中,观察并记录公牛的状态。70天后收取公牛精液,并测试分析。
二、检测指标
1、试验期间,每天统计公牛的体征。
2、第71天开始检测公牛的精液品质。
三、实验结果
1、精子浓度:如图14所示,饲喂LHM11的3个组的精子浓度高于对照组;
2、精子活力:如图15所示,饲喂LHM11的3个组的精子活力高于对照组;
3、精子顶体完整性:如图16所示,饲喂LHM11的3个组的精子顶体完整性高于对照组;
4、精子畸形率:如图17所示,饲喂LHM11的3个组的精子畸形率低于对照组。
与同属种的人乳杆菌相比,LHM11最大的优势是具有提高雄性动物繁殖性能的特性。而且在人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案,不限定本申请的保护范围。
Claims (4)
1.人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11,其特征在于,所述人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的保藏编号为CGMCC No.25327。
2. 包含权利要求1所述的人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂,其特征在于,所述菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
4.权利要求1所述的人乳杆菌(Lactobacillus hominis) M11用于制备以下用途的制剂的应用,
(1)改善血液及睾丸代谢组的制剂;
(2)增加雄性动物精子浓度的制剂;
(3)增加雄性动物精子活力的制剂;
(4)提高雄性动物交配成功率及交配的雌性动物怀孕率的制剂;和/或
(5)提高雄性动物交配的雌性动物产活仔数的制剂。
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