CN115895933B - 一种乳杆菌firm5 M27及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种乳杆菌（Lactobacillus sp.）firm5 M27，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.24805；本发明将乳杆菌firm5 M27应用在提高熊蜂饮食量、生育能力、免疫能力、授粉能力中，实验结果显示乳杆菌firm5 M27可以显著提高地熊蜂的饮食量，并且显著提高了地熊蜂后代蛹的平均质量；在肠道微生物方面，可以改变抗生素处理后的地熊蜂肠道微生物组成；将其应用在田间大棚的地熊蜂授粉中可以显著提高地熊蜂在前期的访花数量，延长蜂群的寿命，提高熊蜂的免疫能力及存活蜂的体重。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种乳杆菌firm5 M27及其在提高熊蜂饮食量、生育能力、授粉能力中的应用。
背景技术
熊蜂(Bombus Spp.)是膜翅目，蜜蜂总科，熊蜂属，是一类多食性的社会性昆虫。熊蜂是野生植物和作物的重要传粉者。熊蜂通过授粉所创造的价值很高，大约为一公顷963美元。目前，全世界已知熊蜂约250个品种，中国的熊蜂多样性最高，在本土有125种熊蜂类别，占所有已知的大黄蜂种类的50%。比如在秦岭地区熊蜂的多样性最高(多达45种)，是世界上研究熊蜂多样性的最大热点地区。具体来说，一些熊蜂种类，如美洲东部熊蜂(Bombus impatiens)和地熊蜂(Bombus terrestris)，已经被驯化用于商业授粉服务，主要用于温室或室外作物授粉。然而，近几十年来，世界范围内的熊蜂数量有所下降，造成这一现象的因素有很多，其中包括农药的广泛使用、寄生虫的入侵、病原体的侵染以及农业发展所导致的栖息地的丧失和食物的短缺。熊蜂数量的下降会对生态系统带来严重的影响，并造成生态失衡，进一步威胁到人类的粮食安全。中国作为熊蜂多样性最多的国家也面临着同样的境遇，所以进一步对熊蜂展开研究，可以为保护熊蜂多样性提供理论基础和支撑。许多内源性细菌与其昆虫宿主具有共生关系，并在消化、营养补充、以及抵抗病原体中发挥作用。熊蜂(Bombus)等社会型昆虫具有独特的肠道微生物群。研究表明，这些肠道微生物群的失调与蜜蜂健康状况的下降有关，这预示着肠道微生物群可能会有助于蜂群的建立。
商业饲养的蜜蜂和地熊蜂作为传粉媒介具有很高的经济价值。然而，在商业化生产蜜蜂和地熊蜂的过程中使用的一些饲养技术会对肠道中的微生物群落产生不利影响。比如，在美国，经常会使用抗生素来预防商业化饲养的蜜蜂感染臭虫，但这同时也会损害蜜蜂的肠道菌群，降低蜜蜂肠道微生物的多样性。地熊蜂的大规模饲养通常都会在密闭的温室中进行，这可以有效避免致病菌的污染，但同时也会造成地熊蜂肠道中微生物多样性的减少。
乳酸菌(LAB)是人类和动物的肠道微生物中公认的益生菌，这些益生菌对宿主的健康有益。在人类和其他几种动物中，乳酸杆菌和双歧杆菌菌株已经广泛应用于益生菌制剂中。例如，在哺乳动物和鱼类的养殖场中，使用益生菌菌株可以在不使用抗生素的情况下改善动物生长情况并减少疾病的发生。对蜜蜂的几项研究表明，乳酸杆菌可以抑制引起美国臭虫病的幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)并降低受感染幼虫的死亡率。此外，不同的研究显示，在蜜蜂中施用市售益生菌剂，主要成分为乳杆菌kunkeei等乳酸菌，可以降低幼虫死亡率，增加蜂巢重量，提高蜜蜂脂肪体和相关腺体的大小并增加腺体周围营养膜的数量，从而提供更好的消化功能。在另外一种无刺蜜蜂中，在饮食中添加芽孢杆菌可以刺激肠道微生物分泌用来软化花粉壁的酶，并以此来发挥重要的消化作用。蜜蜂胃肠道是一个非常复杂的微生物生态系统，影响着营养物质的吸收和代谢以及宿主的营养和保护功能。同时，作为健康肠道菌群的正常居民，乳杆酸菌株通过改善肠道内微生物群落的平衡来预防或治疗肠道疾病，这表明了乳杆菌能够在肠道内生存并定植和粘附宿主组织。
发明内容
本发明提供了一种乳杆菌（Lactobacillus sp.）firm5 M27，其于2022年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24805，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明乳杆菌firm5 M27是从山东省地熊蜂（Bombus terrestris）肠道中分离纯化的到的，其为革兰氏阳性菌，细胞形态为棒状，无芽胞，无鞭毛；单菌落大小为1-5mm，颜色呈灰白色，不透明，菌落表面光滑，边缘规则；
提取乳杆菌firm5 M27的总DNA，用细菌16S rDNA通用引物扩增目的片段，对片段进行回收、克隆、测序，16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示；对细菌16S rDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST进行16S rDNA的相似性比对，结果显示与乳杆菌Firm5的关系最近，相似性达到99%，因此，鉴定为该菌株为乳杆菌，命名为乳杆菌firm5 M27。
本发明另一目的是将上述乳杆菌 firm5 M27应用在提高熊蜂饮食量、生育能力、免疫能力、授粉能力中。
本发明所述的用途，是将乳杆菌firm5 M27用作制备提高熊蜂饮食量、生育能力、免疫能力、授粉能力的菌剂，即以乳杆菌firm5 M27为活性成分，应用在制备口服益生菌菌剂，并将其作为益生菌制剂添加到地熊蜂的日常饮食中。
本发明提高熊蜂饮食量、生育能力、免疫能力、授粉能力的菌剂的成分（或有效成分）为乳杆菌firm5 M27，还可以加入一种或多种菌剂上可接受的辅料，制成菌剂适用的剂型，按常规添加量添加使用，菌剂中有效活菌数不低于1011cfu/g。
本发明的有益效果在于：
本发明旨在建立从地熊蜂肠道中筛选分离具有益生菌潜能的菌株，为增强地熊蜂的健康，增强生育能力，加强授粉能力的益生菌的市场化开发和产业化应用奠定基础。
本发明乳杆菌firm5 M27可以显著提高地熊蜂的饮食量，并且显著提高了地熊蜂后代蛹的平均质量；在肠道微生物方面，可以改变抗生素处理后的地熊蜂肠道微生物组成；在商品化地熊蜂出厂之前以及授粉过程中持续在饮食中添加乳杆菌firm5 M27可以提高授粉前期的授粉效率，显著提高地熊蜂单位时间内的访花数量，延长蜂群的寿命，提高地熊蜂的免疫能力及存活蜂的体重。
附图说明
图1为无王工蜂群中糖水（A）和花粉（B）消耗量结果；
图2为无王工蜂群中蛹的总数量（A）、总质量（B）以及平均质量（C）的统计结果；
图3为对照组和乳杆菌firm5 M27添加组在实验结束后肠道微生物的组成柱状结果图；
图4为实验前三天对照组和乳杆菌firm5 M27菌悬溶液添加组授粉率的统计结果；
图5为实验前三天对照组和乳杆菌firm5 M27菌悬溶液添加组地熊蜂单位时间访花数量的统计结果；
图6为授粉第二周时对照组与乳杆菌firm5 M27添加组的肠道微生物构成，上图为地熊蜂肠道微生物相对含量图，下图为乳杆菌firm5 M27相对含量图；
图7为蜂箱中糖水剩余量以及蜂巢重量的量化比较；
图8为熊蜂存活指标的量化比较结果，其中A图为地熊峰剩余数量，B图为地熊峰每只体重；
图9为实时荧光定量PCR相关免疫基因表达。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂，培养基均为市售产品，按使用说明使用；
实施例1：乳杆菌Firm5 M27的分离及鉴定
将来源于山东省的地熊蜂解剖，取出蜜蜂完整肠道，在100μL 25%（v/v）甘油中用研磨棒手动研磨将肠壁研磨破碎，并保存在-80℃超低温医用冰箱中；将肠道样品于乳酸细菌培养基（MRS）上三区划线，于35℃、5%二氧化碳培养箱中培养2-3天，观察菌落形态，从中挑取单菌落重新在MRS培养基上八个分区域划线，于35℃、5%二氧化碳培养箱中纯化培养，在培养基上选取若干个单菌落，分别进行编号，选取20个单菌落进行16s rDNA测序；
细菌总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取，采用16s rDNA的通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），在50μL的PCR体系（ddH2O 21μL、2×SanTaq PCR Mix 25μL、Primer F 1μL、Primer R 1μL、DNA模板2μL）中扩增；PCR条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸5min。
本实施例16sr DNA扩增测序结果用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，结果显示编号为M27的菌株与乳杆菌Firm5关系最近，相似性达到99%。因此，鉴定其为乳杆菌，命名为乳杆菌firm5 M27。
实施例2：冻干菌剂的制备
将乳杆菌firm5 M27用MRS培养基活化，接种量为3%，将活化好的菌种，按照4%接种量转接到MRS大瓶中在37 ℃培养25h，离心（5000 g，15 min）收获菌体，备用。
将上述收获的菌体按照体积比为3∶1加入保护剂，混合均匀备用，其中保护剂为含海藻糖质量浓度1%、谷氨酸钠0.5%、脱脂乳1%、抗坏血酸0.25%、葡聚糖0.25%的水溶液。
在进行冷冻干燥之前，样品需在-80℃超低温冰箱预冻3h，随后采用三段式冷冻干燥，在512Pa压力下冻干6h，随后在256Pa压力下冻干5h，之后在103Pa下冻干直至获得粉末产品。
将冻干的菌剂分别在4℃和25℃保存菌粉，每隔2个月测每种菌粉的活菌数，平行3次实验，结果如表1所示，由表可知，冻干的菌剂在4℃和25℃保存10个月后，活菌数仍保持在较高的水平；在25℃下的稳定性较4℃保存下虽然有一定的差距，但是仍然保持在90%的存活水平。其中乳杆菌 Firm5 M27菌粉的有效菌数不低于3×1011cfu/g。
表1
。
实施例3：乳杆菌firm5 M27对地熊蜂的生理特性和肠道微生物的影响实验
1、受试品乳杆菌firm5 M27混悬溶液的配置：取实施例2冻干菌剂1 g（其中有效活菌数不低于1011 cfu/g）置于1 L的烧杯中，加入450mL质量浓度50%蔗糖溶液与450mL 1×PBS缓冲液的混合溶液搅拌混悬，同时加入100g花粉继续混悬，即得乳杆菌firm5 M27混悬溶液；
2、蜜蜂饲养及试验
随机选取20个蜂箱，并将蜂箱放入气体处理箱中使用二氧化碳气体麻醉处理90s，然后开箱使用镊子挑选蜂箱中还未出房的蛹，并将所有20箱中挑选的黑蛹集中到一个蜂箱中进行培养；由于地熊蜂大约会在1-2天从黑蛹中孵化出来，所以需要在蜂箱中放入糖水和花粉用来保证新生蜂的存活率，培养条件为温度28℃，湿度65％±5％；将收集好的2日龄地熊蜂分装进无王工蜂群容器中，每个容器中装6只；将实验组分为对照组和乳杆菌firm5M27添加组，每组设置5个平行。
实验前5天，对照组与乳杆菌firm5 M27添加组均喂食450μg/mL四环素，用来降低地熊蜂原有肠道微生物的干扰；在第六天开始，对照组喂食正常糖水和花粉，乳杆菌firm5M27添加组则喂食乳杆菌firm5 M27混悬溶液，花粉则正常饲喂；每三天换一次糖水和花粉，同时乳杆菌firm5 M27混悬溶液也重新配置并添加至蜂巢内。
3、地熊蜂的生理特性指标检测
每周观察蜂巢的情况并统计所产卵包数，幼虫数以及蛹数，并在无王工蜂群建群第28天时将蜂巢解剖，同时统计每个处理组中幼虫和蛹的数量和总质量以及平均质量，并将糖水和花粉的消耗总量统计并分析；
结果见图1-3，从图1可以看出整个实验过程中乳杆菌firm5 M27添加组的饮食量增加，说明菌株M27能促进雄蜂的食欲，根据糖水和花粉的消耗总量进行了统计学分析，糖水和花粉消耗量乳杆菌firm5 M27混悬溶液添加组显著高于对照组(P<0.05)。从图2可以看出无王工蜂群的实验中，乳杆菌firm5 M27混悬溶液添加组在蛹的平均质量方面显著高于对照组，这代表着乳杆菌firm5 M27的添加可以促进地熊蜂在蛹阶段的发育。
4、地熊蜂肠道微生物的检测
无王工蜂群实验结束后，随机取对照组以及乳杆菌Firm5 M27添加组各六只地熊蜂，抽取肠道，提取DNA并送公司进行16S rRNA测序；
结果见图3，从图3中可以看出对照组和乳杆菌firm5 M27添加组均含有地熊蜂的五种核心菌种，但对照组的Lactobacillus属要明显少于乳杆菌firm5 M27添加组，添加了乳杆菌firm5 M27的地熊蜂肠道微生物的结构有显著改变，因此乳杆菌firm5 M27能提高Lactobacillus属的丰度因此改善地熊蜂的健康状态。
实施例4：乳杆菌firm5 M27对地熊蜂田间授粉的影响实验
1、受试品乳杆菌firm5 M27混悬溶液的配置：取实施例2冻干菌剂1 g（其中有效活菌数不低于1011 cfu/g）置于1L的烧杯中，加入450mL质量浓度50%蔗糖溶液与450mL 1×PBS缓冲液的混合溶液搅拌混悬，同时加入100g花粉继续混悬，即得乳杆菌firm5 M27混悬溶液；
2、地熊蜂的培养及田间大棚的准备
挑选长势一致并且符合行业标准的商品化地熊蜂6箱，其中3箱蜂喂食乳杆菌firm5 M27混悬溶液作为乳杆菌firm5 M27添加组，在授粉工作之前三天将乳杆菌firm5M27混悬溶液饲喂给地熊蜂，另外3箱蜂则正常饲喂糖水作为对照组。
随机挑取六个种植同一品种番茄并且长势一致均在授粉期的温室大棚，其中三个大棚作为对照组并将准备好的对照组蜂箱放入，另外三个大棚作为实验组并将添加乳杆菌firm5 M27饮食的蜂箱放入；
3、熊蜂蜂箱使用的方法
蜂箱放置好并静置一小时后，再打开蜂箱门，此时可以看到一个闸板和两个挡板，将两个黄色挡板向外掰开，闸板就可以左右滑动了，熊蜂喜欢安静并且黑暗的环境，熊蜂使用过程中请勿拍打蜂箱，或者将蜂箱盖打开。
4、田间实验
将实验大棚和对照大棚分为前中后三个区域，每个区域随机挑选20朵完全开放且未授粉的番茄植株使用塑料标记片进行标记，并用马克笔在未授粉的花朵上做下标记，番茄花朵授粉程度有三种（授粉程度低、未被授粉、授粉程度高），七天内每日上午十点记录植株的授粉率，并通过以下公式计算授粉率（授粉率=授粉标记花朵数量/标记花朵总数量×100％）。
在对照棚和乳杆菌firm5 M27添加棚中随机追踪3只各个区域内的熊蜂在5分钟之内访花的数量(五分钟有效时间)；
授粉试验过程中每周为蜂箱内拍照来记录蜂群情况，由于商品化蜂箱的糖水供给量充足，所以在授粉期不用为地熊蜂额外补充糖水饮食，但每周需要为乳杆菌firm5 M27添加组蜂箱中滴入适量的菌液，以此来使地熊蜂尽可能多的接触乳杆菌firm5 M27并达到预期的效果。
授粉期持续约一个月左右，结束后将蜂箱转运回实验室进一步测量蜂箱的重量、糖水的剩余量来与实验前做对比，同时每个蜂箱随机挑选5只存活蜂测量总重量；
5、肠道微生物取样
在授粉阶段我们在实验进行到第二周时从对照组随机取6只，从乳杆菌Firm5 M27添加组随机挑选7只地熊蜂抽取肠道，提取DNA并进行16S rRNA测序；
6、免疫基因表达定量分析
使用BTN81220 柱式昆虫RNA提取试剂盒提取对照组与乳杆菌firm5 M27添加组地熊蜂头部总RNA，使用Applied Biosystems 实时荧光定量PCR仪器来对Defensin、Abaecin、Apidaecins三种免疫基因进行定量分析，管家基因RPS18用作内源对照；
三种免疫基因扩增引物如下: Defensin（F-GTCTGCCTTTGTCGCAAGAC, R-GACATTAGTCGCGTCTTCTTCG）；Abaecin（F-GCCACAATATGTGGAATCCT, R-ATGACCAGGGTTTGGTAATG）；Apidaecin（F- CCCGACTAATGTACCTGCCA, R-GAAGGTGCGAATGTGTTGGA）.
本实施例中乳杆菌firm5 M27的添加可以增加地熊蜂在前期的访花数量，在授粉过程中观察到的乳杆菌firm5 M27添加组地熊蜂单位时间内访花数量的显著增多，乳杆菌firm5 M27的添加提升了地熊蜂学习和记忆能力（图4、5）。在授粉阶段的第二周、第三周和结束时分析了地熊蜂的肠道微生物组成，第三周和第四周授粉试验结束时乳杆菌firm5M27添加组中的Lactobacillus属明显高于对照组（图6），同时无王工蜂群实验和田间实验中乳杆菌firm5 M27添加组中地熊蜂糖水消耗量的显著上升（图7）。值得关注的是，在授粉试验结束时观察到乳杆菌firm5 M27添加组中的熊蜂数量及熊蜂体重均优于对照组（图8）；通过添加乳杆菌firm5 M27的蜂群从实时定量PCR结果来看可以提高雄蜂的免疫能力，从而增加蜂群的存活蜂的数量以及平均质量（图9）。总之，提高地熊蜂在田间授粉时的免疫能力对地熊蜂的商业化应用十分有帮助，这不仅可以提高地熊蜂的存活率并且还可以延长商业化授粉蜂群的寿命。
本发明菌株蜜蜂乳杆菌firm5 M27作为益生菌添加到正常及商业化熊粉授粉中的应用效果讨论：
本发明提供的益生菌剂由于其包含有乳杆菌firm5 M27，可以显著提高地熊蜂的饮食量，并且显著提高了地熊蜂后代蛹的平均质量；在肠道微生物方面，可以改变抗生素处理后的地熊蜂肠道微生物组成；将益生菌剂应用在田间大棚的地熊蜂授粉中可以显著提高地熊蜂在前期的访花数量，延长蜂群的寿命，提高熊蜂的免疫能力及存活蜂的体重。虽然，以上通过实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应了解，在不偏离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的改进和变型，均应属于本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种乳杆菌（Lactobacillus sp.）firm5 M27，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.24805。
2.权利要求1所述的乳杆菌firm5 M27在提高熊蜂饮食量、熊蜂蛹的平均质量、熊蜂免疫能力、熊蜂授粉能力中的应用。
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