CN112375712A

CN112375712A - 一株乳酸乳球菌及其应用

Info

Publication number: CN112375712A
Application number: CN202011337808.0A
Authority: CN
Inventors: 邓先余; 杨雪娇; 周晨煜; 张棋麟; 林连兵
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2021-02-19

Abstract

本发明公开了一株乳酸乳球菌KUST48，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.20699；将本发明菌株应用在对无乳链球菌感染的斑马鱼的治疗中，实验结果显示，该菌株显著能抑制无乳链球菌在斑马鱼肠道内的繁殖，降低无乳链球菌感染后斑马鱼的死亡率；本发明旨在替代抗生素，克服抗生素过度使用、药物残留、耐药性、食品安全以及环境污染等一系列缺陷，改善水产动物的免疫功能，增强其抗病功能，减少药物的使用量，推动水产养殖业绿色、生态发展。

Description

一株乳酸乳球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株乳酸乳球菌及其在水产养殖中的应用，属于水产养殖技术及病害防控技术领域。

背景技术

近几十年来，由于抗生素的滥用，造成抗生素的药效下降，据报道抗生素会破坏机体肠道内正常菌群的平衡，导致病原菌的易感性。同时抗生素会在体内残留，造成过敏及生态污染等问题。益生菌作为抗生素的替代，能避免抗生素的副作用，同时有助于宿主吸收营养，改善生存环境，增强宿主对疾病的快速响应，提高机体的免疫能力。目前，随着我国水产业的快速发展，益生菌也被用于鱼类免疫、疾病治疗和水质改善。

乳酸菌是人与动物胃肠道常见的有益菌，乳酸菌作为重要的益生菌已经广泛应用于食品、饮料和微生态制剂中，被公认为是安全级微生物。是近年发展起来的新型绿色添加剂，具有改善动物消化道的有益菌群，抑制或者杀死有害菌群，提高动物健康水平，促进动物生长发育及提高饲料的利用率等。此外，还具有无残留、无毒副作用，可改善养殖生态环境，达到生态防治的目的，使养殖生产良性发展，取得更好的生态效益和经济效益。

无乳链球菌属于B群链球菌，是兼性厌氧的革兰氏阳性菌，是水产类炎症和哺乳动物乳腺炎症的病原菌之一，鱼源无乳链球菌的基因表达显示其能够更好的适应鱼类宿主，可感染30种鱼类，使鱼类的死亡率高达50%以上。无乳链球菌能在巨噬细胞内存活，进入血脑屏障，从而进入血液和中央神经系统，这样就能快速进入其它器官和组织，使机体出现细菌性败血症状。该病主要集中在春、夏和秋季，出现在100g以上的幼鱼和成鱼之间，感染性强，感染率在20%~30%，给鱼类养殖和生产造成严重的损失。但目前在水产养殖中增强免疫、抗病毒和抗寄生虫等方面的研究极少。

发明内容

本发明提供了一株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）KUST48，该乳酸乳球菌KUST48是从健康的吉富罗非鱼肠道分离得到，该菌种已于2020年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.20699。

本发明另一目的是将上述菌种应用在制备增强水产动物免疫能力制剂中，或应用在制备增强水产动物抗病能力制剂中。

本发明所述的制剂是将乳酸乳球菌KUST48作为有效活性成分，或与其他其他活性成分复配制备增强免疫力或抗病药剂、饲料添加剂或饲料；还可以加入一种或多种病害防治制剂可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等；或者饲料制备中常用辅料。

所述抗病能力是指抵抗无乳链球菌的能力。

本发明的优点在于：采用乳酸乳球菌替代抗生素，克服抗生素过度使用、药物残留、耐药性、食品安全以及环境污染等一系列缺陷，改善水产动物的免疫功能，增强其抗病功能，减少药物的使用量，推动水产养殖业绿色、生态发展。

附图说明

图1为乳酸乳球菌菌落形态图；

图2为胆盐耐受性实验结果示意图；

图3 为人工胃液耐受性实验结果示意图；

图4 为人工肠液耐受性实验结果示意图；

图5为属水平的物种丰度分析结果；

图6为组间差异显著性检验。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂，培养基均为市售产品，按使用说明使用。

实施例1：乳酸乳球菌的分离及鉴定

1、菌株的分离和纯化

将吉富罗非鱼的肠道匀浆后，采用10倍稀释法用无菌生理盐水进行稀释，取10^-3 ~10^-6稀释范围的稀释液涂布于MRS固体平板培养基上；37℃恒温培养24h；挑取典型单菌落，反复划线分离至获得纯菌株；菌落成乳白色半透明凸起，边缘整齐光滑，将其编号为KUST48，如图1所示；

2、16S rRNA序列分析

对最终筛选出的菌株进行16sDNA分子生物学鉴定，用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司北京）分别提取菌株的总DNA，采用通用引物27F（5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′）和1492R（5′ -GGTTACCTTGTTAGGACTT- 3′ ）扩增其16sDNA片段；PCR的反应程序如下：94℃预变性4min；94℃，30s ，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温；PCR产物大小经过琼脂糖凝胶电泳检测验证后，将目标条带进行纯化，交由上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序，得到测序序列在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Informmion）网站GenBank数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行Blast比对，通过得分最高的已知种类确定种名；

经PCR扩增得到16S rRNA片段，经测序为723bp（SEQ ID NO:1）；应用BLAST比对，MEGA构建Neighbor-Joining树，菌株与已知的乳酸乳球菌聚集在一个分支上，相似性为99.17%，综合形态学观察和分子生物学检测测序结果可知，从健康吉富罗非鱼肠道分离的菌株为乳酸乳球菌。

实施例2：乳酸乳球菌的耐受性实验

本实验旨在评价乳酸乳球菌对感染了无乳链球菌的罗非鱼的治疗效果，为其能在水产动物肠道内定植提供基础数据；

1、强酸耐受性实验

挑取乳酸乳球菌KUST48的单菌落于5mL MRS培养液中，培养到生长期；取5mL菌液8000r/min离心10min，弃上清留沉淀，向沉淀中加入pH=4.0的MRS培养液，振荡均匀，取此液体做0h的平板稀释涂布计数，剩下的液体在150r/min、37℃的恒温摇床中培养3h，取培养3h的液体平板稀释涂布计数，设置3个平行，并计算存活率，结果见表1；

2、人工肠胃液耐受性实验

人工胃液的制备：将PBS溶液调节pH=4后灭菌，胃蛋白酶（源叶生物技术有限公司上海）按1g/100mL的浓度溶解在灭菌的PBS溶液中，过0.22μm的滤膜后分装到试管中备用；

人工肠液的制备：PBS溶液调节pH=6.8后灭菌，胰酶（源叶生物技术有限公司上海）按1g/100mL的浓度溶解在灭菌的PBS溶液中，过0.22μm的滤膜后分装到试管中备用；

取4mL乳酸乳球菌的菌液离心（8000r/min、10min），弃上清，留沉淀；将沉淀转入4mL人工胃液的试管中，在150r/min、37℃的恒温摇床中培养；取0h、1h、2h、3h的200μL培养液到96孔板中用酶标仪（USA）做600μm的OD值测量，各3个重复；并取0h、3h的培养液各100μL做稀释涂布，计算菌种在人工胃液中的存活率；

取上述在人工胃液培养3h的菌液100μL到5mL的人工肠液中，在150r/min、37℃的恒温摇床中培养；取0h、1h、2h、3h、4h的200μL培养液到96孔板中用酶标仪（USA）做600μm的OD值测量，各3个重复；并取0h、4h的培养液各100μL做稀释涂布，计算菌种在人工肠液中的存活率；

乳酸乳球菌KUST48在人工肠胃液中的存活率如表1，其存活率均为正数，说明乳酸乳乳球菌可以在肠道内存活；

表1 强酸耐受性、人工肠胃液耐受性的存活率

	强酸	人工肠液	人工胃液
				存活率（%）	38.03	10.95	31.50

图3结果显示乳酸乳球菌KUST48在人工胃液中虽然略有降低，但依然能在人工胃液里存活，说明该菌株能在适应人工胃液的环境，并存活；

图4结果显示将乳酸乳球菌KUST48从人工胃液中转入人工肠液依然存活，并继续生长，说明该菌株能在人工肠胃液中存活。

2、胆盐耐受性实验

在无菌操作台内将猪胆盐（Bomei ）溶解在无菌水中，过0.22μm孔径的滤膜配置成质量浓度0.3%的溶液分装到试管中备用；将乳酸乳球菌液体培养到生长期，各取100μL菌液添加到含有0.3%猪胆盐的试管中，接着将试管放到150r/min、37℃的恒温摇床中培养，取0h、2h、4h、6h、8h的培养液200μL到96孔板中用酶标仪（USA）做600m的OD值测量，各测3次；结果见图2，从图中可以看出乳酸乳球菌KUST48在胆盐内从0h到8h浓度逐渐增加，说明其在胆盐中能存活并繁殖生长。

实施例3：乳酸乳球菌KUST48对无乳链球菌感染的斑马鱼的治疗效果评价

本实验旨在评价乳酸乳球菌KUST48对无乳链球菌感染的斑马鱼的治疗效果，为其在水产上的应用提供基础数据。

1、实验动物与菌株

实验用斑马鱼90尾，体长（3.4±0.5）cm，身体质量（0.3±0.05）g，购自中国云南省昆明市世博园花鸟市场；参照斑马鱼的饲养方法，斑马鱼饲养于实验室水族箱中，水箱中注入充分曝气的自来水，水温（27±1）℃，投喂斑马鱼专用饲料，每日1次；实验室暂养7d，无异常死亡，实验前72h停止喂食，以清空肠道内容物；

将乳酸乳球菌KUST48划线接种于MRS琼脂培养基（上海博微生物科技有限公司）中，于37℃培养箱中培养24h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃、150r/min条件下培养24h，经过预实验可知，菌液用PBS稀释至1×10⁶ CFU/mL备用；

2、人工感染及治疗

将斑马鱼分成空白对照组（a）、感染组（b）和治疗组（c）三组，每组各30尾；实验前用甲磺酸三卡因（MS-222）对90尾斑马鱼进行麻醉，a组腹腔注射10μL PBS缓冲液，b组和c组注射10μL（浓度为1×10⁶CFU/mL）无乳链球菌；24h后，a组和b组注射10μL PBS缓冲液，c组注射10μL（浓度为1×10⁶ CFU/mL）KUST48菌液；观察斑马鱼的活动状态，120h后结束实验；各组的死亡率如表2：

表2 各组的死亡率

组名	空白组（a）	感染组（b）	治疗组（c）
				死亡率（%）	0	75	40

在120h实验结束前，将肚皮朝上、无力游动，即将死亡的斑马鱼捞出，用75%的酒精擦拭体表，在无菌操作台里取出肠道，用70%的酒精漂洗，放入装有无水乙醇的EP管中-80℃冻存备用；在120h时，将仍活着的斑马鱼在冰浴中安乐处死，用75%的酒精擦拭体表，在无菌操作台里取出肠道，用70%的酒精漂洗，放入装有无水乙醇的EP管中-80℃冻存备用；将a组、b组和c组的各30个样品分成5组，每组6个肠道，分别标记为a₁、a₂、a₃、a₄、a₅；b₁、b₂、b₃、b₄、b₅；c₁、c₂、c₃、c₄、c₅，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。

根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，最后获得Effective Tags。应用Uparse v7.0.1001(http://drive5.com/uparse)对全部的Effective Tags在97%的相似性水平下OTU（Operational taxonomic units）进行生物信息统计分析；利用Silva数据库（http://www.arb-silva.de）从种（Species）的分类水平统计各样本的群落物种组成；利用mothur软件进行Alpha多样性指数分析（sob，chao，ACE，shannon，coverage），反应群落的丰富度（community richness）、多样性（community diversity）、覆盖度（community coverage）。使用R语言对3组样本进行PCA分析和作图，确定各组之间的差异，接着在Genus水平进行物种丰度分析和组间差异显著性检验，得到群落组成柱形图和多物种差异柱形图。最后利用PICRUSt功能预测法，对各组微生物群落的功能进行预测。

在属（Genus）水平对各组物种丰度分析结果如图5，由图可直观看到空白对照组（a）中没有无乳链球菌，感染组（b）含有大量的无乳链球菌，治疗组（c）中无乳链球菌的丰度明显降低。组间差异显著性检验的柱形图如图6，除了志贺氏菌（Escherichia-Shigella）的平均相对丰度在各组间没有差异外（p>0.05），其他菌在各组间都有极显著的差异(0.01<p<0.05)。该图直观显示出平均相对丰度较高的前6个属中，感染组（b）中，由于无乳链球菌的大量繁殖，明显抑制了剑菌属（Ensiter）、志贺氏菌属（Shinella）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鲍氏菌属（Bosea）、军团菌属（Legionella）、假单胞菌属（Pseudomonas）这6种菌的生长，空白对照组（a）和治疗组（c）中，这6个属的菌中，除了不动杆菌属（Acinetobacter）的平均相对丰度是治疗组大于空白对照组，其余5个属都是治疗组小于空白对照组；从结果可以看出，乳酸乳球菌KUST48可以显著抑制无乳链球菌在斑马鱼肠道内的繁殖，降低无乳链球菌感染后的死亡率。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一株乳酸乳球菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 723

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌KUST48(Lactococcus lactis KUST48)

<400> 1

ggggaagggc ggcgtgctat acatgcagtt gagcgctgaa ggttggtact tgtaccgact 60

ggatgagcag cgaacgggtg agtaacgcgt ggggaatctg cctttgagcg ggggacaaca 120

tttggaaacg aatgctaata ccgcataaaa actttaaaca caagttttaa gtttgaaaga 180

tgcaattgca tcactcaaag atgatcccgc gttgtattag ctagttggtg aggtaaaggc 240

tcaccaaggc gatgatacat agccgacctg agagggtgat cggccacatt gggactgaga 300

cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg acgaaagtct 360

gaccgagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct gttggtagag 420

aagaacgttg gtgagagtgg aaagctcatc aagtgacggt aactacccag aaagggacgg 480

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtcccg agcgttgtcc ggatttattg 540

ggcgtaaagc gagcgcaggt ggtttattaa gtctggtgta aaaggcagtg gctcaaccat 600

tgtatgcatt ggaaactggt agacttgagt gcaggagagg agagtggaaa ttccatgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa ccccgggtgg cgaaagcggc tctcttggcc 720

tgt 723

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ggttaccttg ttaggactt 19

Claims

1.一株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）KUST48，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.20699。

2.权利要求1所述的乳酸乳球菌在制备增强水产动物免疫能力制剂中的应用。

3.权利要求1所述的乳酸乳球菌在制备增强水产动物抗病能力制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：抗病能力是指抵抗无乳链球菌的能力。