CN104480059A - 一种表达菌丝霉素的重组菌及其应用 - Google Patents

一种表达菌丝霉素的重组菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达菌丝霉素的重组菌及其应用。该重组菌的分类命名为乳酸乳球菌 Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3，保藏编号为CCTCC NO: M 2014611，可以超高表达菌丝霉素蛋白的重组菌，其表达量远远超过其他阳性重组菌的表达量，并且还能够直接用于制备抑菌药剂的重组菌，其无安全隐患，几乎无副作用；本发明菌株具有抑制耐药性金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、粪肠球菌等的作用；本发明菌株能在自诱导下高效持续的表达，在发酵过程中表达并分泌含菌丝霉素的融合蛋白，白总产量在1.41g/L以上，其中菌丝霉素占70%以上，具有治疗乳腺炎和生殖道的感染性疾病的潜能。

Description

一种表达菌丝霉素的重组 菌 及其应用
技术领域
本发明涉及一株新菌种及其在治疗炎症方面的应用，具体涉及一株表达菌丝霉素的重组菌及其应用。
背景技术
乳酸菌（lactis acid bacteria，LAB）是一类能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌，其包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等10几个属，在食品工业各个领域中的长期应用已证明其无致病性。乳酸菌是人和大多数动物肠道内常见细菌，广泛分布于消化系统、呼吸系统、分泌系统、口腔系统和粪便中。
防御素（defensin）是广泛存在于生物体中的一种宿主防御肽，构成机体抵御病原微生物的第一道防线。一般为2-6kDa，富含正电荷氨基酸残基，含6-8个半胱氨酸（Cys），从而形成3-4对二硫键。1985年首次从人嗜中性白细胞中分离得到3个小肽，而后将它们与从兔、豚鼠中分离的同类小肽一起命名为防御素。防御素具有抗菌、抗病毒、趋化、免疫调节等多种生物学功能，其中广谱抗菌功能最重要。防御素为第一大类抗菌肽，迄今共发现了600种左右，约占已报道抗菌肽总量的1/3。主要来源于哺乳动物、植物、昆虫等。
菌丝霉素（Plectasin）是2005年首次由Hans-Henrik Kristensen 课题组从叫做腐生子囊菌假黑盘菌（Pseudoplectania nigrella）的一种真菌中分离得到，这种菌生长于北欧松树林中。Plectasin是首个从真菌中发现的防御素。菌丝霉素完整的开放阅读框编码一个长为95个氨基酸的多肽链，共由3部分组成。信号肽序列（1-23位氨基酸）、前肽（24-55位氨基酸）和C-末端成熟肽（56-95位氨基酸）。成熟的Plectasin由40个氨基酸残基组成，即56-95位氨基酸。包含有6个半胱氨酸Cys残基和5个赖氨酸Lys残基，另外还有一个独特的阴离子四肽模体。其净电荷数为+1～+3。Plectasin与细菌细胞壁形成的前体物质Lipid Ⅱ具有很强的亲和性，可以通过与Lipid Ⅱ结合阻止病菌细胞壁的形成，从而阻止病菌繁殖。Plectasin独特的作用机制不易诱导产生耐药性菌株。
随着抗生素在临床上的广泛使用，细菌耐药性问题日趋严重，增加了疾病治愈的难度并且给患者和社会带来了严重的经济负担。特别是近年来“超级细菌”逐渐增多，使得在合理用药的同时研发新一代安全高效的抗菌制剂显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达菌丝霉素的重组菌及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明通过将Usp45蛋白信号肽和菌丝霉素在乳酸乳球菌中进行融合表达，通过大量筛选和验证，获得一株可以超高表达菌丝霉素蛋白的重组菌，其表达量远远超过其他阳性重组菌的表达量，并且还能够直接用于制备抑菌药剂的重组菌，其无安全隐患，几乎无副作用；该重组菌的分类命名为乳酸乳球菌NZ9700-pGMN3 Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3，已于2014年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2014611。本发明菌株具有抑制耐药性金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、粪肠球菌等作用，其能够在自诱导下高效持续的表达，在发酵过程中表达并分泌含菌丝霉素的融合蛋白，具有治疗动物乳腺炎和生殖道的感染性疾病的潜能。在优化的发酵条件下，总蛋白产量大于1.41g/L，其中菌丝霉素的产量比例占70%以上。
本发明的有益效果是：
1）在本发明的重组菌中将信号肽Usp45与目的蛋白融合，以便于分泌到细胞外表达，并且大幅度增加了目的蛋白菌丝霉素的表达量，本发明重组菌的发酵液对几种耐药性金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、棒状菌均有明显的抑菌的作用，尤其对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌非常敏感，MIC在微克级别，可以将本发明的重组菌直接制备成药剂，用于上述两种菌引起的乳腺炎和皮肤感染等。
2）本发明重组菌融合表达的菌丝霉素可以在乳酸菌中表达，对于宿主乳酸乳球菌NZ9700没有抑菌效果，且本发明重组菌并可以在胃肠道及生殖道定植，并持续表达、分泌含菌丝霉素蛋白，可用于治疗相关的胃肠道及生殖道的感染性疾病。
3）本发明菌株可制备成抗菌类产品，如饲料添加剂、兽药等，可替代部分抗生素，为绿色、安全养殖，提供更多的选择。
附图说明
图1为pMG36e质粒图谱图；
图2为不同阳性重组菌中菌丝霉素在发酵上清液中的表达情况，其中目的条件约4～5kDa；
图3为纯化前后的菌丝霉素样品的抑菌情况； 1为纯化前，2、6为收集的穿透峰，3、7为收集的用0.3M NaCl洗脱的洗脱峰，4、5、8为收集的用0.5M NaCl洗脱的洗脱峰，“-”为阴性对照，NaCl溶液；“+”为阳性对照，Amp（氨苄青霉素）；
图4为本发明菌株Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3表达的菌丝霉素蛋白的RP-HPLC分析图；
图5为纯化后的菌丝霉素蛋白的质谱检测图；
图6为本发明重组菌表达的菌丝霉素蛋白对无乳链球菌的抑制情况：“-”为无菌水，作为阴性对照；1为20μL的发酵上清液；2为40μL的发酵上清液；3为60μL的发酵上清液；4为80μL的发酵上清液；5、为100μL的发酵上清液；“+”为氨苄青霉素Amp，作为阳性对照；
图7为本发明重组菌的发酵菌液对无乳链球菌的抑制情况：“1”为无菌水，作为阴性对照；2为稀释10倍的发酵菌液；3为100倍的发酵菌液；4为稀释1倍的发酵菌液；5为稀释100倍的发酵菌液；6为稀释200倍的发酵菌液；7为氨苄青霉素Amp，作为阳性对照；
图8为本发明重组菌表达的菌丝霉素蛋白金黄色葡萄球菌CMCC26003的抑制情况：“-”为无菌水，作为阴性对照；1为20μL的发酵上清液；2为40μL的发酵上清液；3为60μL的发酵上清液；4为80μL的发酵上清液；5、为100μL的发酵上清液；“+”为氨苄青霉素Amp，作为阳性对照。
具体实施方式
实施例 1 ：表达菌丝霉素的重组乳酸乳球菌的构建方法
一、重组菌株的构建
从乳酸乳球菌MG1363中克隆到Usp45蛋白信号肽的核苷酸序列，将Usp45基因片段与穿梭质粒pMG36e（pMG36e图谱如图1所示）连接构成质粒pGMN1；将质粒pGMN1与从乳酸菌质粒pNZ8408扩增出来的Pnis-MCS段基因连接，构建质粒pGMN2；人工合成的乳酸菌密码子偏好型菌丝霉素基因片段，优化后的菌丝霉素碱基序列为：GGT TTT GGT TGT AAT GGT CCA TGG GAT GAA GAT GAT ATG CAA TGT CAT AAT CAT TGT AAA TCA ATT AAA GGT TAT AAA GGT GGT TAT TGT GCT AAA GGT GGT TTT GTT TGT AAA TGT TAT（SEQ ID NO:1），将优化后的菌丝霉素基因片段与质粒pGMN2连接，得质粒pGMN3，在pGMN3中Usp45位于菌丝霉素上游。并将pGMN3质粒电转至乳酸乳球菌NZ9700中。PCR筛选出阳性转化子，经测序验证序列正确。
上述菌丝霉素（Plectasin）有40个氨基酸，含有6个半胱氨酸，形成3对分子内二硫键，大小4.41kDa，氨基酸序列：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。
上述信号肽Usp45的氨基酸序列为：MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA。
二、菌丝霉素蛋白的表达及重组菌的筛选
将上述多个测序验证正确的重组菌均分别转接至GM17培养基，在28～30℃条件下，兼性厌氧培养48h后，离心收集菌体上清，测定上清液中的蛋白浓度进行定量，将各组所获得的上清液进行SDS-PAGE电泳检测（如图2），每孔加入20μL发酵上清液，保证加入的蛋白质总量相同，以筛选出高效表达菌丝霉素的阳性重组菌株，检测结果如图2所示，从图2中可以看出，3号组重菌（即为本发明保藏的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3）中菌丝霉素的表达量明显高于其他阳性重组菌。
本发明重组菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3在摇瓶发酵液中总蛋白产量可达0.23g/L，其中菌丝霉素的产量比例占70%以上；在15L发酵罐中发酵液的蛋白总量约为1.41g/L，其中菌丝霉素的产量比例占有70%以上。
三、菌丝霉素蛋白的纯化及鉴定
阳离子交换层析纯化
取上述3号重组菌（命名为：Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3）的蛋白发酵液，4000rpm/min，离心20分钟，弃沉淀，留上清。上清过0.45μm滤膜，用硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，硫酸铵饱和度为50～55%，于4℃，13000rpm/min，离心30分钟，收集沉淀，弃上清。用pH5.0的0.02M的PB缓冲液溶解沉淀，过0.45μm的滤膜，再上样至Sephadex G25柱层析，用pH5.0的0.02M的PB缓冲液冲洗；蛋白溶解液经Sephadex G25层析脱盐后，利用阳离子交换层析CM柱进一步纯化，脱盐后的蛋白溶解液经CM阳离子层析处理，用pH5.0的PB洗脱，收集穿透峰，再收集分别用0.3M NaCl（洗脱杂质蛋白不含菌丝霉素）、0.5 M NaCl（洗出目的蛋白菌丝霉素）洗出的洗脱峰。
将上述纯化前后的样品，点样20μL到含有金黄色葡萄球菌CMCC26003的琼脂平板上，37℃过夜培养，出现抑菌圈， 如图3所示。
上述结果说明了上述纯化过程中，目的蛋白菌丝霉素不存在于穿透峰中，在洗脱过程中，菌丝霉素几乎不能被0.3M NaCl洗脱，但可被0.5M NaCl洗脱，并具有很好的抑升菌效果。
高效液相色谱纯化
取上述纯化实验中0.5M NaCl洗脱液溶液100μL进行反相高效液相色谱纯化，RP-HPLC（反相高效液相色谱）的条件为：C18，300Å，5μm，4.6mm×250mm；梯度洗脱60min，浓度为8%～80% 乙腈，添加0.1%TFA，流速0.8mL/min；RP-HPLC色谱图如图4所示。
从图4中可以看出，纯化后的菌丝霉素蛋白纯度很高，可达到95%以上，为药用级。
质谱鉴定
对上述纯化后的菌丝霉素蛋白进行质谱检测，检测结果如图5所示。从质谱图中可以看出在4412.69处有最高峰，菌丝霉素预计分子量为4410道尔顿，与预计结果一致。
四、抑菌作用检测
（ 1 ）对无乳链球菌的抑制作用
取本发明菌株Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3的发酵上清液点样到含有无乳链球菌的琼脂平板上，从1号到5号分别点样20、40、60、80、100μL，37℃过夜培养，出现抑菌圈， 如图6所示。
另外，取本发明菌株Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3的发酵菌液，点样到含有无乳链球菌的琼脂平板上，37℃过夜培养，出现抑菌圈， 如图7所示。
（ 2 ）对金黄色葡萄球菌的抑制作用
取本发明菌株Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3的发酵上清液点样到含有金黄色葡萄球菌CMCC26003的琼脂平板上，37℃过夜培养，出现抑菌圈， 如图8所示。
（ 3 ）发酵液对金黄色葡萄球菌 CMCC26003 和无乳链球菌的最小抑菌浓度测试
方法：将受试菌液用生理盐水调节至在625nm波长检测，吸收值为0.09～0.10，然后用灭菌的各种肉汤按比例稀释，摇匀。取1mL分别于上述各个样品试管中。
取本发明菌株Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵72小时后的发酵液上清消夜（总蛋白为1.41g/L），进行不同倍数的稀释，最终稀释倍数分别为1000倍，1100倍，1200倍，1300倍，1400倍，1500倍，1600倍，1700倍，1800倍，1900倍、2000倍。
每支试管中的Amp 中浓度分别为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62μg/ml、31μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.062μg/ml、0.031μg/ml。
发酵上清对金葡CMCC26003的MIC，为稀释1300倍，Amp对金葡26003的MIC是0.062μg/mL；发酵上清对无乳链球菌的MIC，为稀释1200倍，Amp对无乳链球菌的MIC是0.25μg/mL。上述结果说明，本发明重组菌的发酵液具有灵敏的杀菌效果。
另外，还检测了本发明乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3的发酵液对肺炎链球菌、猪链球菌、肠球菌和棒状菌的抑菌作用，检测结果显示本发明乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3对这类菌类均具有较好的抑菌效果。
五、本发明菌株对金黄色葡萄球菌感染引起的皮肤炎症的效果试验
接种金黄色葡萄球菌单克隆于5mL肉汤培养基中，28-30℃培养过夜（10-12小时），再按1:50的比例接种于营养肉汤培养基中，放大培养至对数生长期，6000rpm/min离心，弃菌体，取上清，喷雾干燥浓缩，测定其中的总蛋白含量和菌丝霉素占总蛋白的比例。
取斑马鱼120尾，分为6组，每组20尾，在养殖的水域中添加丁香酚进行麻醉，空白对照组不进行特殊处理，其它5组用无菌解剖刀刮伤斑马鱼侧面胸鳍至真皮层，面积约为1mm2。将100尾处理过的斑马鱼放入1×106CFU/mL的金黄色葡萄球菌溶液中浸泡15h，取出后其中4组加入本发明菌株乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3的上清喷干粉末，至养殖水体中，终浓度分别为0（作为阴性对照）、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，阳性对照加入氨苄青霉素10μg/mL。
结果显示，无处理空白对照组斑马鱼鱼体正常，在金黄色葡萄球菌处理组中，添加本发明菌株的量越高，皮肤创伤治愈效果越好。不添加本发明菌株的阴性对照组有80%伤口发生了感染，仅有20%没有感染，添加10μg/mL剂量时，有55%斑马鱼伤口不发生感染，添加20μg/mL剂量时，有75%斑马鱼伤口不发生感染，添加40μg/mL剂量时，有90%斑马鱼伤口不发生感染，阳性对照组氨苄青霉素10μg/mL也使90%斑马鱼伤口不发生感染，说明本发明菌株制备的高剂量组的抗感染效果与抗生素相当。
六、本发明菌株对仔猪腹泻的效果试验
本试验旨在研究本发明菌株对金黄色葡萄球菌感染引起的仔猪腹泻的体内抑菌效果。我们以乳酸菌重组菌株及其表达产物菌丝霉素为主要活性成分，将本发明菌株的发酵液（含菌体和分泌蛋白菌丝霉素）直接喷干成粉末，记为乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末，将其制成饲料添加剂产品后喂养21日龄断奶仔猪，仔猪品种为杜长大三元杂交种。
将400头仔猪分为4组，对照组100头，试验组300头。试验期从21日龄断奶到51日龄，共30天时间，试验开始与结束时称重，并观察死亡率和腹泻率。对照组不使用药物，试验组分别使用乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末，按1kg/t、2kg/t添加到饲料中，阳性对照组为硫酸新霉素，按1kg/t添加到饲料中。
结果如表1所示，可以看出试验组的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末1kg/t和阳性药物组都使断奶仔猪死亡率下降57.9%， 2kg/t乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末使断奶仔猪死亡率下降63.2%；1kg/t乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末的腹泻发病率下降71.4%，2kg/t乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末和阳性药物组都使断奶仔猪的腹泻发病率下降76.2%；2kg/t乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末组料肉比1.62，与对照组1.66相比，料肉比降低2.4%，乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末1kg/t和硫酸新霉素1kg/t组的料肉比均为1.63，与对照组相比降低1.8%；试验组可提前5-10天出栏，提高猪场效益。在试验组中，乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末1kg/t组与阳性药物组效果基本相当，乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3发酵液粉末2kg/t组略好于阳性药物组。
上述结果说明本发明菌株可制备成抗菌类产品，如饲料添加剂、兽药等，可替代部分抗生素，为绿色、安全养殖，提供更多的选择。
表1本发明菌株发酵液作为饲料添加剂对断奶仔猪的饲喂试验
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
<110> 广东海纳川药业股份有限公司
<120> 一种表达菌丝霉素的重组菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工合成菌丝霉素序列
<400> 1
ggttttggtt gtaatggtcc atgggatgaa gatgatatgc aatgtcataa tcattgtaaa 60
tcaattaaag gttataaagg tggttattgt gctaaaggtg gttttgtttg taaatgttat 120

Claims (7)

1.一种表达菌丝霉素的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO: M 2014611。
2.权利要求1所述的表达菌丝霉素的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3在制备抗菌药剂中的应用。
3.权利要求1所述的表达菌丝霉素的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3在制备治疗乳腺炎药剂中的应用。
4.权利要求1所述的表达菌丝霉素的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3在制备治疗皮肤感染药剂中的应用。
5.权利要求1所述的表达菌丝霉素的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3在制备治疗生殖道炎药剂中的应用。
6.权利要求1所述的表达菌丝霉素的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3在制备治疗胃肠道炎药剂中的应用。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：权利要求1所述的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9700-pGMN3在制备抗无乳链球菌的药剂中的应用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106615849A (zh) * 2017-01-12 2017-05-10 湖南师范大学 一种含抗菌肽的保育后期用仔猪配合饲料及其制备方法
CN106721027A (zh) * 2017-01-12 2017-05-31 湖南师范大学 一种含抗菌肽的断奶仔猪教槽料及其制备方法
CN106721316A (zh) * 2017-01-12 2017-05-31 湖南师范大学 一种含抗菌肽的保育前期仔猪配合饲料及其制备方法
CN110438139A (zh) * 2019-07-04 2019-11-12 东北农业大学 一种利用毕赤酵母菌制备抗菌肽t9w的方法
CN112375712A (zh) * 2020-11-25 2021-02-19 昆明理工大学 一株乳酸乳球菌及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191256A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 中国农业科学院饲料研究所 一种菌丝霉素基因及其原核融合基因工程菌

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191256A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 中国农业科学院饲料研究所 一种菌丝霉素基因及其原核融合基因工程菌

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
仝雷: "重组aFGF乳酸菌的构建、表达及其对小鼠溃疡性结肠炎的药效研究", 《湖北农业科学》 *
刘淑杰: "重组乳酸乳球菌表达外源蛋白的研究进展", 《中国预防兽医学报》 *
管韬: "菌丝霉素的串联表达及其菌内抑菌活性分析", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106615849A (zh) * 2017-01-12 2017-05-10 湖南师范大学 一种含抗菌肽的保育后期用仔猪配合饲料及其制备方法
CN106721027A (zh) * 2017-01-12 2017-05-31 湖南师范大学 一种含抗菌肽的断奶仔猪教槽料及其制备方法
CN106721316A (zh) * 2017-01-12 2017-05-31 湖南师范大学 一种含抗菌肽的保育前期仔猪配合饲料及其制备方法
CN110438139A (zh) * 2019-07-04 2019-11-12 东北农业大学 一种利用毕赤酵母菌制备抗菌肽t9w的方法
CN112375712A (zh) * 2020-11-25 2021-02-19 昆明理工大学 一株乳酸乳球菌及其应用

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