CN101679984B

CN101679984B - 具有抗微生物活性的RumC肽

Info

Publication number: CN101679984B
Application number: CN2008800179264A
Authority: CN
Inventors: 埃马纽埃尔·克罗斯; 米歇尔·冯斯; 皮埃尔·安德烈·热阿特
Original assignee: Adisseo France SAS
Current assignee: Adisseo France SAS
Priority date: 2007-05-29
Filing date: 2008-05-16
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2028-05-16
Also published as: EP2152881A2; RU2009144577A; US20120263688A1; CA2689050A1; WO2008152252A3; DK2152881T3; CO6251332A2; JP2010527625A; BRPI0812486A2; AU2008263754A1; PT2152881E; FR2916759A1; US8697636B2; BRPI0812486B1; FR2916759B1; WO2008152252A2; RU2464274C2; CA2689050C; ZA200907583B; EP2152881B1

Abstract

本发明涉及具有抗微生物活性的肽RumC1、RumC2和RumC3，以及还涉及编码这些肽并分离自活泼瘤胃球菌E1的基因。

Description

具有抗微生物活性的RumC肽

本发明涉及具有抗微生物活性的肽RumC1、RumC2和RumC3，以及还涉及编码这些肽并分离自活泼瘤胃球菌E1(Ruminococcus gnavus E1)的基因。

某些菌株具有释放对其竞争剂有抑菌或杀菌作用的物质的能力。这些抗微生物物质可以具有有机物性质，例如，有机酸或过氧化氢(Ross等，Int.J.Food Microbiol.79，3-16，2002)，或具有肽性质。酶促合成的抗微生物肽——其形成抗生素类(Mootz等，Curr.Opin.Chem.Biol.1，543-551，1997；Keating等，Curr.Opin.Chem.Biol.3，598-606，1999)，以及核糖体产生的肽——其形成细菌素类(Jacob等，Ann.Inst.Pasteur(巴黎)84，222-224，1953)也是著名的。

细菌素在研究和工业领域正在引起越来越多的兴趣；它们可对抗生素应用提供可选的方案，特别是饲养方面(Luchansky，Antonie VanLeeuwenhoek 76，335，1999；O’Sullivan等，Biochimie 84，593-604，2002)。

近年来，已经开发出这些细菌素的很多异源表达系统。具体而言，Morriset等(Morisset等，Appl.Environ.Microbiol.，70，4672-4680，2004)已经在肠膜样明串珠菌亚种DSM20484(Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum DSM20484)中表达了肠膜菌素Y105(mesentricin Y105)的变体，肠膜菌素Y105是由肠膜样明串珠菌亚种Y105生产的IIa类细菌素(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides Y105)。同样，Flynn等(Microbiol.，148，973-984，2002)完成了ABP-118——最初由唾液乳酸杆菌亚种UCC 118(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius UCC 118)生产的IIb杆菌素——在宿主植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)中的表达。

另外，已经进行了几项测试，以在细菌大肠杆菌(Escherichia coli)中表达细菌素(McCormick等，Appl.Environ.Microbiol.，64，4757-4766，1998；Garneau等，Appl.Environ.Microbiol.，69，1352-1358，2003；Biet等，Microbiol.，144，2845-2854，1998；Miller等，Appl.Environ.Microbiol.，64，14-20，1998；Richard等，J.Bacteriol.，186，4276-4284，2004；Kloche等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，67：532-538，2005)，在酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)中表达细菌素(Schoeman等，Yeast，15，647-656，1999；VanReenen等，Int.J.Food Microbiol.，81，29-40，2003)，以及在乳酸菌中表达细菌素(Rodriguez等，Int.J.Food Microbiol.，80，101-116，2003)。

因此已经进行了很多研究，目的是鉴定新细菌素以及如何生产这些细菌素。

消化生态系统由丰富且非常复杂的结合有细菌、酵母和古细菌(Archeae)的微生物系统组成。这种小型生物群本质上是厌氧的，并且主要发现的是类杆菌属(Bacteroides)、真细菌属(Eubacterium)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和梭形杆菌属(Fusobacterium)等属的细菌(Suau等，Appl.Environ.Microbiol.65，4799-4807，1999)。微生物系统对宿主的健康具有重要的影响。其尤其参与源自食物的代谢化合物的毒化(toxification)和解毒(Hughes and Rowland Microbial Ecology HealthDisease 2，179-185，2000)。其也能够调节肠细胞(enterocytic)功能的表达(Bry等，Science 273，1380-1383，1996；Hooper等，Science 291，881-884，2001)。最后，其在保护宿主免受潜在致病性外源细菌侵袭上起着基本的作用(Ducluzeau等，Microbial Ecology and Intestinal Infections，1988；Fons等，Microbial Ecology in Health and Disease 2，240-246，2000)。

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)属于已知的肠病原体，其是一种严格的厌氧型革兰氏阳性细菌，其能够形成孢子并且其非常广泛地分布于环境中。这种病原体可以源自食物，但也可以以低浓度存在于肠内，并且在应激效应下开始增殖并分泌毒素。针对它们所产生的毒素的功能，产气荚膜梭菌的菌株被分成五种毒素型(toxinotype)(Petit等，Trends Microbiol.7，104-110，1999)。A型产气荚膜梭菌菌株对人的胃肠道疾病负责。1997年，超过245000个感染产气荚膜梭菌的病例在美国被记载。这导致41人住院治疗，其中7人死亡(Mead等，Emerg.Infect.Dis.5，607-625，1999)。A型和C型的产气荚膜梭菌菌株可能分别是猪和家禽的坏死性肠炎的起因。在家禽中，坏死性肠炎是一种迅速发展的急性病理，其死亡率可达1％至2％/天。除了其在健康动物上的发病率之外，这种病理因此可具有值得重视的经济影响。一直到1999，通过使用抗生素作为生长因子，这种疾病才得到令人满意的控制。然而，为避免选择抗性细菌以及因此避免降低抗生素在人中的功效，欧盟已经禁止它们用于动物饲料。因为这种禁止，由产气荚膜梭菌在猪和家禽中引起的坏死性肠炎在欧洲不再受到控制。在Réseau National d’ObservationsEpidémiologiques en Aviculture(RNOEA)(AFSSA Ploufragan)宣称的病例数量在1999和2000年显著增加(Valancony，Bulletin des GTV 12，9-12，2001)。

目前，寻找可选的解决方案用以控制和治疗这种疾病因此非常重要。

活泼瘤胃球菌是严格厌氧菌，其在梭菌目中属于毛螺菌(Lachnospiraceae)家族。Dabard等(Appl.Environ.Microbiol.，67，4111-4118，2001)显示，分离自人的显性菌群的菌株活泼瘤胃球菌E1能够产生被称为瘤胃球菌素A(ruminococcin A)或RumA的抗微生物物质，其积聚在培养上清液中。其是属于硫醚抗生素家族的细菌素，对各种致病性梭菌种(Clostridium sp.)的各种菌株均有活性。Gomez等(J.Bacteriol.，184，18-28，2002)已经显示，参与瘤胃球菌素A生物合成的基因的表达在胰岛素存在下被诱导。该作者还显示，某些消化酶可能抑制RumA生产的诱导。

本发明人因此开始关注其它细菌素。

本发明涉及对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)具有抗菌活性的肽RumC1、RumC2和RumC3，以及还涉及编码这些肽的基因。序列描述

SEQ ID No.1：活泼瘤胃球菌E1的RumC肽的保守肽序列

SEQ ID No.2：通过埃德曼降解方法实验测定的活泼瘤胃球菌E1的RumC肽的肽序列

SEQ ID No.3：通过埃德曼降解方法实验测定的活泼瘤胃球菌E1的RumC肽的肽序列

SEQ ID No.4：推导自SEQ ID No.7的活泼瘤胃球菌E1的肽RumC1的肽序列

SEQ ID No.5：推导自SEQ ID No.8的活泼瘤胃球菌E1的肽RumC2的肽序列

SEQ ID No.6：推导自SEQ ID No.9的活泼瘤胃球菌E1的肽RumC3的肽序列

SEQ ID No.7：活泼瘤胃球菌E1的rumC1基因的核苷酸序列

SEQ ID No.8：活泼瘤胃球菌E1的rumC2基因的核苷酸序列

SEQ ID No.9：活泼瘤胃球菌E1的rumC3基因的核苷酸序列

SEQ ID No.10、11和12：实验测定的肽序列

发明的描述

本发明涉及具有抗微生物活性的肽，其特征在于其包括选自下述肽的肽：序列SEQ ID No.1的肽；包含与SEQ ID No.1的多肽具有至少80％同一性的肽；序列SEQ ID No.2的肽；以及包含与SEQ ID No.2的多肽具有至少80％同一性的肽。根据本发明的一个实施方式，这种肽也包括肽序列SEQ ID No.3。根据本发明的另一实施方式，这种肽包括的肽选自肽序列SEQID No.4、5或6。

本发明也涉及编码抗微生物活性的多核苷酸，其特征在于其包括选自下述的多核苷酸：按照序列SEQ ID No.7、8或9中任一种的多核苷酸；与按照序列SEQ ID No.7、8或9中任一种的多核苷酸杂交的多核苷酸；编码如上定义的多肽的多核苷酸。

本发明也涉及表达盒，其特征在于其在转录方向包括：启动子，其在宿主生物中起作用；如上定义的多核苷酸；和在同一宿主生物中的终止序列。

本发明还涉及载体，其包含如上定义的多核苷酸和/或如上定义的表达盒。

本发明也涉及宿主生物，其用如上定义的多核苷酸、如上定义的表达盒和/或如上定义的载体转化。

本发明涉及活泼瘤胃球菌的菌株，其于2006年12月19日以编号CNCMI-3705保藏在CNCM(法国巴斯德研究所国家微生物菌种中心(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur)，25rue du DocteurRoux，F-75015Paris)，以及还涉及遗传未修饰的分离形式的菌株，所述菌株产生上述如上所述的肽。

本发明涉及蛋白质混合物或发酵添加剂(fermentation must)，其可以通过上面定义的宿主生物或菌株获得。

本发明也涉及组合物，其包括如上定义的肽、如上定义的宿主生物、如上定义的菌株、如上定义的宿主生物的发酵添加剂或者如上定义的菌株的发酵添加剂。根据本发明的一个实施方式，组合物是液体形式或粉末形式。

本发明也涉及营养添加剂，其包括如上定义的肽、如上定义的宿主生物、如上定义的菌株、如上定义的宿主生物的发酵添加剂或者如上定义的发酵添加剂。根据本发明的一个实施方式，营养添加剂是液体形式或粉末形式。

本发明也涉及动物饲料，其特征在于其包括用于动物的营养基和如上定义的营养添加剂。

本发明也涉及如上定义的肽、如上定义的宿主生物、如上定义的菌株、如上定义的宿主生物的发酵添加剂或者如上定义的菌株的发酵添加剂用于制造药物、营养添加剂或动物饲料的应用。根据本发明的一个实施方式，这种药物或这种营养添加剂意图用于预防或治疗家禽或猪中的坏死性肠炎。根据本发明的另一实施方式，这种药物或这种营养添加剂意图用于预防或治疗人的胃肠疾病。

最后，本发明也涉及如上定义的肽用于治疗动物的非治疗应用。根据本发明的一个实施方式，所述肽得自所述动物的内源菌株或得自所述动物的外源菌株。根据本发明的另一实施方式，所述肽得自所述动物的内源菌株，并且借助所述内源菌株的肽的生产被促进。根据本发明的又一实施方式，所述肽得自所述动物的内源菌株，并且，所述内源菌株的生长被促进。

肽

本发明因此涉及具有抗微生物活性的肽。优选地，这些肽分离自活泼瘤胃球菌，例如分离自活泼瘤胃球菌的突变株。作为指导，这些肽可以分离自2006年12月19日以编号CNCM I-3705保藏在CNCM(法国巴斯德研究所国家微生物菌种中心，25rue du Docteur Roux，F-75015 Paris)的活泼瘤胃球菌的菌株，即菌株LEM 9-17。

术语“抗微生物活性”意指抑制靶细菌生长或发育的能力或者杀死靶细菌的能力。测量抗微生物活性的技术是本领域技术人员已知的。在本发明中，通过在琼脂培养基上培养的菌株产气荚膜梭菌CpA的活性试验，展示抗微生物活性。将含有本发明的肽之一的样品置于在琼脂培养基中形成的孔中。当抑制孔环(inhibition halo)在孔周围形成时，显示出抗微生物活性。

活泼瘤胃球菌E1的肽RumC1、RumC2和RumC3的肽序列分别以序列SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6表示。这些序列分别推导自分别由序列SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9表示的基因rumC1、rumC2和rumC3的核苷酸序列。

本发明也涉及具有抗微生物活性的活泼瘤胃球菌E1的这些肽RumC1、RumC2和RumC3的片段。术语“肽片段”表示包含从中衍生的肽的一部分而非全部。本发明因此涉及序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的肽。

这些片段保留了它们的抗微生物活性。本发明涉及生物活性片段。术语“生物活性片段”表示保留了其从中衍生的多肽功能的多肽片段。

本发明也涉及具有抗微生物活性的肽，其具有至少80％、90％、95％、98％以及优选至少99％的氨基酸与序列SEQ ID No.1、2或3的任一种肽相同。

制备序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的肽的方法是本领域技术人员已知的。

RumC肽通过细菌分泌(或释放)到胞外环境中。可能的是，任一种序列SEQ ID No.4、5和/或6的肽包含特定数目氨基酸的信号肽。在这种情况中，本发明也涉及信号肽切割之后得到的成熟肽。根据本发明的一个实施方式，本发明涉及其序列在序列SEQ ID No.4、5和6的20位与63位之间的肽。

在另一实施方式中，肽SEQ ID No.4、5或6的潜在信号肽可以用异源信号肽置换，以通过异源宿主生物执行该肽的表达和分泌。

本发明的主题也是具有抗微生物活性的肽，其与SEQ ID No.4、5或6的肽具有至少80％的同一性。根据本发明的一个实施方式，这种肽分离自活泼瘤胃球菌的菌株。根据本发明的另一实施方式，这种肽分离自瘤胃球菌属的其它菌株或者分离自其它细菌。可选地，这种肽可以通过化学合成获得。

本发明的一个主题是具有至少90％、95％、95％以及优选至少99％的氨基酸与序列SEQ ID No.4、5或6的任一种肽相同的肽。

术语“相同的氨基酸”是指在两个序列之间不变或没有变化的氨基酸。这些肽相对于由序列SEQ ID No.4、5或6表示的肽可以具有至少一个氨基酸的缺失、添加或取代。在转录之后修饰的氨基酸，例如通过脱水、一硫化物桥(monosulfide bridges)、羊毛硫氨酸形成等修饰的氨基酸，被认为是在两个序列之间未改变的氨基酸。

本发明的主题还是与序列SEQ ID No.4、5或6的任一种肽具有至少80％、90％、95％、98％以及优选至少99％相似性的肽。

术语“相似性”是指蛋白质或核酸序列之间的相似度量度。这些肽相对于由序列SEQ ID No.4、5或6表示的肽可以具有至少一个氨基酸的缺失、添加或取代。由分数来量化的两个序列之间的相似程度基于序列中的同一性和/或保守置换的百分比。

用于测量和鉴定多肽之间的同一性程度和相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，通过Vector NTi 9.1.0——比对程序AlignX(ClustalW算法)(Invitrogen INFORMAX，http://www.invitrogen.com)或利用工具CLUSTAW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)，进行序列比对。

根据本发明的肽可以从它们的自然环境分离或纯化。所述肽可以通过不同的方法制备。这些方法特别是从自然来源诸如自然表达这些肽的细菌进行纯化、通过合适的宿主细胞生产重组肽及其随后对其纯化、通过化学合成生产，或者最后这些不同方法的组合。因此，本发明序列SEQ ID No.1至6的肽可以分离自活泼瘤胃球菌菌株，其于2006年12月19日以编号CNCMI-3705保藏在CNCM。本发明的肽分离自重组宿主生物，其表达根据本发明的RumC肽或者表达具有抗微生物活性的RumC肽的片段。

本发明的主题也是包含根据本发明的肽的融合蛋白、重组蛋白或嵌合蛋白。

本发明的肽可以分离自聚藏菌株活泼瘤胃球菌E1的单菌大鼠(monoxenic rat)的盲肠内含物以及分离自活泼瘤胃球菌的突变株，更具体地，分离自于2006年12月19日以编号CNCM I-3705保藏在CNCM的活泼瘤胃球菌的菌株。这些肽具有抗微生物活性，通过对产气荚膜梭菌的活性试验展示。

质谱法能够测定根据本发明的RumC肽的近似分子量。该分子量在4000与4600Da之间，以及更具体地在4100与4500Da之间。

根据本发明的一个实施方式，肽适于营养或药物应用，例如用于动物营养。

术语“适于营养或药物应用的肽”是指这样的肽，其特征使得其适合于营养或药物。对于营养或药物应用而言基本的特征特别是肽能够耐受的pH。具体而言，人和动物的消化系统的pH是酸性的，因此基本的是肽应当抵抗这种pH。用于营养应用的另一基本特征是温度，在该温度下抗微生物物质是活性的。具体而言，抗微生物物质在药物、营养添加剂或动物饲料中的加工，例如，包括处理和室温以上的温度。所使用的抗微生物的活性因此在工艺条件下特别是温度条件下必须是稳定的。

根据本发明的一个实施方式，根据本发明的肽或肽混合物在中性pH下具有抗微生物活性，并且在酸性pH下例如7以下以及优选4.4以下保留其抗微生物活性。

根据本发明的一个实施方式，根据本发明的肽或肽混合物在37℃具有抗微生物活性，并且在低于和高于室温的温度下例如50℃以上保留这种活性。

本发明也涉及具有抗微生物活性的肽，其分离自单菌大鼠的盲肠内含物或分离自活泼瘤胃球菌的菌株，对产气荚膜梭菌菌株具有活性，具有通过质谱法测定的4000与4600Da之间的分子量，并且对于小于或等于7的pH是耐受的。根据一个实施方式，肽包括序列SEQ ID No.1和/或序列SEQ ID No.2。根据另一实施方式，其也包括序列SEQ ID No.3的肽。有利地，肽包括选自具有序列SEQ ID No.4、5或6的肽的任一种的肽。

本发明还涉及具有抗微生物活性的肽，其可以得自活泼瘤胃球菌的突变株，例如，于2006年12月19日以编号CNCM I-3705保藏在CNCM的活泼瘤胃球菌的菌株。根据一个实施方式，所述肽对于产气荚膜梭菌菌株具有抗微生物活性。根据另一实施方式，其具有4000与4600Da之间的分子量，以及优选地具有4100与4500Da之间的分子量，如通过质谱法测定。根据另一实施方式，肽在中性pH下具有抗微生物活性，并且在酸性pH下例如7以下以及优选4.4以下保留其抗微生物活性。根据一个实施方式，肽包括序列SEQ ID No.1和/或序列SEQ ID No.2。根据另一实施方式，其也包括序列SEQ ID No.3的序列。可选地，肽包括选自具有序列SEQ IDNo.4、5或6的肽的任一种的肽。

本发明也涉及分离自单菌大鼠的盲肠内含物、具有抗微生物潜力的肽，其对应于图4A的色谱图，该色谱图在214nm通过反相HPLC获得，该肽对产气荚膜梭菌的各种菌株具有活性，特别是对毒素型A具有活性。

多核苷酸

本发明也涉及编码抗微生物活性的多核苷酸。优选地，这些多核苷酸编码瘤胃球菌属的抗微生物活性。

根据本发明，术语“多核苷酸”是指可以属于DNA型或RNA型的单链多核苷酸链或其互补链，或者是可以属于互补或基因组DNA类型的双链核苷酸链。优选地，本发明的多核苷酸属于DNA类型，特别是双链DNA。术语“多核苷酸”还表示修饰的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以从它们的自然环境分离或纯化。本发明的多核苷酸也可以通过化学合成制备，或通过由Sambrook，Fristsch and Maniatis在其名称为“Molecular cloning：a laboratory manual”，edition：Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的书中描述的标准分子生物学技术制备。

本发明涉及根据序列SEQ ID No.7、8或9任一种的多核苷酸。本发明也涉及与根据序列SEQ ID No.7、8或9任一种的多核苷酸杂交的多核苷酸。本发明也涉及编码如上定义的具有抗微生物活性的肽的多核苷酸。

本发明也涉及这样的多核苷酸，其与根据序列SEQ ID No.7、8或9任一种的多核苷酸具有至少80％、85％、90％、95％、98％以及优选至少99％的同一性。这种多核苷酸编码抗微生物活性。根据一个实施方式，多核苷酸编码针对产气荚膜梭菌菌株的抗微生物活性。

术语“相同的核苷酸”是指在两个序列之间不变或没有变化的核苷酸。这些多核苷酸相对于参考多核苷酸可以具有至少一个核苷酸的缺失、添加或取代。

本发明也涉及与根据序列SEQ ID No.7、8或9任一种的多核苷酸具有至少80％、85％、90％、95％、98％以及优选至少99％相似性的多核苷酸。这种多核苷酸编码抗微生物活性。根据一个实施方式，多核苷酸编码针对产气荚膜梭菌菌株的抗微生物活性。

术语“相似性”是指蛋白质序列或核酸序列之间的相似性量度。这些多核苷酸相对于参考多核苷酸可以具有至少一个核苷酸的缺失、添加或取代。由分数来量化的两个序列之间的相似程度基于序列的同一性和/或保守置换的百分比。

用于测量和鉴定核酸序列之间的同一性程度和相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，通过Vector NTi 9.1.0——比对程序AlignX(Clustal W算法)(Invitrogen INFORMAX，http://www.invitrogen.com)或利用工具CLUSTAW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)，进行序列比对。

本发明也涉及能够与根据序列SEQ ID No.7、8或9任一种的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。优选地，选择性杂交在适度严格条件下进行并且优选在高度严格条件下进行。根据本发明，术语“能够选择性杂交的序列”是指这样的序列，其与参考序列杂交的水平显著高于背景噪声。能够选择性杂交的序列与参考序列之间相互作用产生的信号水平通常比产生背景噪声的其它DNA序列的相互作用的信号强10倍以及优选强100倍。允许选择性杂交的严格杂交的条件是本领域技术人员已知的。一般而言，在特定地pH以及针对特定的离子强度，杂交和洗涤温度在参考序列的Tm之下至少5℃。通常，对于15至50个核苷酸的多核苷酸，杂交温度是至少30℃，而对于大于50个核苷酸的多核苷酸，杂交的温度是至少60℃。以举例的方式，在下述缓冲液中进行杂交：6X SSC、50mM Tris-HCI(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA，500μg/ml变性鲑精DNA。进行洗涤，例如，连续在下述条件下进行：在2X SSC、0.1％SDS缓冲液中在非严格性下，在0.5X SSC、0.1％SDS缓冲液中在中等严格性下，以及在0.1X SSC、0.1％SDS缓冲液中在高严格性下。当然，杂交可以按照本领域技术人员已知的其它普通方法进行(特别参见Sambrook，Fristsch and Maniatis in their bookentitled“Molecular cloning：a laboratory manual”，edition：Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。优选地，与参考多核苷酸选择性杂交的多核苷酸保留参考序列的功能。在本情况中，选择性地与根据序列SEQ ID No.7、8或9任一种的多核苷酸杂交的多核苷酸编码抗微生物活性。

本发明一般涉及编码根据本发明的肽的多核苷酸。因为遗传密码的简并(degeneracy)，不同的多核苷酸可以编码相同的多肽。

表达盒

根据本发明的一个实施方式，利用本领域技术人员熟知的克隆技术，将编码根据本发明的肽的多核苷酸插入表达盒中。这种表达盒包括根据本发明的多肽编码序列进行转录和翻译必需的元件。

有利地，这种表达盒包括用于通过宿主细胞产生肽的元件以及调控这种表达必需的元件。

这些表达盒在转录方向包括：

-启动子，其在宿主生物中起作用；

-根据本发明的多核苷酸；

-在同一宿主生物中起作用的终止序列。

任何类型的终止序列可以用于根据本发明的表达盒中。对启动子的选择将特别取决于针对相关基因表达所选择的宿主生物。某些启动子允许组成型表达，而另一方面其它启动子是诱导型的。

在真菌的功能启动子中，特别要提到的是来自构巢曲霉菌(Aspergillusnidulans)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子(Roberts等，Current Genet.15，177-180，1989)。

在细菌的功能启动子中，特别要提到的是来自噬菌体T7的RNA聚合酶的启动子(Studier等，Methods in Enzymology，185，60-89，1990)。

在酵母的功能启动子中，特别要提到的是基因GAL1的启动子(Elledge等，Proc.Natl Acad.Sciences，USA.88，1731-1735，1991)或者酿酒酵母(S.cerevisiae)的Gal4和ADH启动子。所有这些启动子都在文献中描述并且是本领域技术人员熟知的。

对于在绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)中的表达，例如将选择包含H4B组蛋白启动子、门冬氨酸蛋白酶启动子或csl13启动子(WO 00/68401)的表达盒。

对于在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达，例如将选择包含甲醇-诱导型AOX1启动子(Tschopp等，Biotechnology，5，1305-1308，1987)或GAP强组成型启动子(Waterham等，Gene 186，37-44，1997)的表达盒。

对于在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的表达，例如将选择包含由硫胺素抑制并且在硫胺素不存在时激活的Nmt1调节启动子(Maundrell，J.Biol.Chem.265，10857-10864，1989)的表达盒。

根据本发明的表达盒也可以包括多肽或多核苷酸表达必需的任何其它序列，例如允许由宿主生物产生的多肽分泌的调节元件或信号序列。特别可能的是使用任何调节序列，其使得能够增加被插入表达盒中的编码序列的表达水平。根据本发明，特别可能的是与启动子调节序列相结合而使用其它调节序列，其位于启动子与编码序列诸如转录激活子(“增强子”)之间。

另外，根据本发明的表达盒可以包括由宿主生物产生的多肽分泌必需的任何其它序列，诸如信号序列。对于巴斯德毕赤酵母的分泌，例如使用α因子序列作为分泌信号是可能的。

很多种终止序列可以用在根据本发明的表达盒中，这些需要允许转录终止以及mRNA的多腺苷酸化。可以使用在已选宿主生物中起作用的任何终止序列。

对于在绳状青霉菌中的表达，例如将选择包含H4.B组蛋白终止子、门冬氨酸蛋白酶终止子或csl13终止子(WO 00/68401)的表达盒。

本发明的主题还是构成根据本发明的表达盒的多核苷酸；有利地，根据本发明的表达盒被插入载体中。

载体

本发明也涉及用于宿主生物转化的克隆或表达载体，其包含根据本发明的至少一种多核苷酸或表达盒。这种载体特别是可以对应于质粒、粘粒、噬菌体或病毒，根据本发明的多核苷酸或表达盒被插入其中。用于构建这些载体以及将本发明的多核苷酸插入这些载体中的技术是本领域技术人员已知的。一般而言，可以使用任何能够在宿主细胞中维持其自身、自主复制或繁殖以便尤其是诱导多核苷酸或多肽表达的载体。作为待被转化的宿主生物的函数以及作为所使用的转化技术的函数，本领域技术人员将选择合适的载体。

本发明的载体被特别用于转化宿主生物，用于复制载体和/或在该宿主生物中表达根据本发明的肽的目的。

本发明也涉及用于制备根据本发明的肽的方法，包括下述步骤：

-用包括根据本发明的表达盒的表达载体和/或根据本发明的多核苷酸来转化宿主生物，

-分离通过宿主生物产生的肽。

宿主生物

本发明的主题还是通过将根据本发明的至少一种多核苷酸、至少一种表达盒或至少一种载体整合到宿主生物中而转化所述宿主生物的方法。多核苷酸可以被整合到宿主生物的基因组中，或者可以在宿主生物中稳定复制。转化宿主生物的方法是本领域技术人员已知的并且在文献中广泛描述。

本发明也涉及用根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体转化的宿主生物。

根据本发明，术语“宿主生物”具体而言是指任何高等或低等的单细胞或多细胞生物体，特别地选自细菌、酵母或真菌。具体而言，术语“宿主生物”是指非人生物体。有利地，酵母例如选自巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)和许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)。真菌例如选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)和青霉菌(Penicilliums)，优选选择绳状青霉菌、里氏木酶(Trichoderma reesei)、黑曲霉素(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、白曲霉(Aspergillus kawachii)和康宁木霉(Trichoderma koningii)。在本发明的一些实施方式中，宿主生物是绳状青霉菌的菌株，其中根据本发明的肽被表达或过量表达。在另一实施方式中，宿主生物是卡氏德巴利酵母(Debaromyces castellii)的菌株，其中根据本发明的肽被表达或过量表达。在又一实施方式中，宿主生物是活泼瘤胃球菌的菌株，其中根据本发明的肽被表达或过量表达。

用于构建载体、用于转化宿主生物以及用于在这些生物体中表达异源蛋白的技术广泛描述于文献中，特别是由Sambrook，Fristsch and Maniatis在名称为“Molecular cloning：a laboratory manual”，edition：Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的书中所述，或者由Ausubel等在“Current Protocols in Molecular Biology”，edition：Greene PublishingAssociates，Inc.，and John Wiley and Sons，NY，1992的书中所述。

菌株

活泼瘤胃球菌的新菌株于2006年12月19日以编号CNCM I-3705保藏在CNCM(法国巴斯德研究所国家微生物菌种中心，25 rue du Docteur Roux，F-75015 Paris)。根据布达佩斯条约第7条，CNCM是国际保藏单位。

新菌株通过菌株活泼瘤胃球菌L14的随机诱变获得。该菌株是活泼瘤胃球菌E1的自发突变体，其已经失去体外生产RumA的能力但是仍能体内合成RumC。强烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)被用于诱变。利用另一起源的DNA或RNA，通过重组技术，没有获得遗传修饰。

菌株LEM 9-17的培养基优选是补充有酵母提取液和氯化血红素的BHI培养基(BHI-YH)。

蛋白质混合物、发酵添加剂

本发明也涉及制备根据本发明的具有抗微生物活性的肽的方法，所述方法包括下述步骤：

a)在诱导肽表达的条件下，培养活泼瘤胃球菌的菌株或根据本发明的转化宿主生物，和

b)回收包含所述肽的培养上清液。

肽与培养上清液的分离可以通过电荷、大小和/或疏水性质进行。本领域技术人员知晓作为各种培养基组成的电荷、大小和/或疏水性质的函数的各种制备技术。

这种培养上清液或发酵添加剂然后可以被浓缩或冻干以配制食品添加剂或动物饲料。该过程可以包括从培养上清液中提纯抗微生物物质的附加步骤。

如果宿主生物不分泌抗微生物物质到培养上清液中，则细胞溶解和细胞提取的另外步骤可能是必需的。

本发明的肽也可以从单菌大鼠的盲肠内含物获得。

组合物

根据本发明的组合物包括根据本发明的肽、根据本发明的宿主生物、根据本发明的菌株、根据本发明的宿主生物的发酵添加剂或者根据本发明的菌株的发酵添加剂。所述组合物处于液体形式或者处于粉末形式。这些组合物包括各种成分。

液体组合物例如可以包括另一种抗微生物剂，例如山梨酸或山梨酸盐、苯甲酸或苯甲酸盐，或者富马酸或富马酸盐。本发明的组合物也可以包括山梨糖醇。山梨糖醇是稳定剂和配制剂。本发明的组合物也可以包括防冻剂，例如乙二醇、甘油、丙二醇和1，2-丙二醇。

粉末形式的组合物包含支持物。这种支持物可以选自小麦面粉、淀粉、糊精、石膏或玉米芯。

根据本发明的组合物具有抗微生物活性。它们对抗生素应用提供可选方案。它们可以用于例如动物饲养或用作人的药物。

本发明的组合物包含至少一种根据本发明的肽，但是它们也可以包含其它物质，例如维生素、其它活性成分、氨基酸或矿物盐。

根据本发明的组合物使得例如预防或治疗猪或家禽中的坏死性肠炎以及预防或治疗人的胃肠疾病成为可能。

本发明的组合物例如被添加至动物饲料中或者例如与营养基料相结合。本发明因此也涉及包含根据本发明的组合物的动物饲料。这种饲料通常处于可以被掺入具有抗菌活性的组合物中的粉或颗粒的形式。本发明的主题还是动物饲料，其包含根据本发明的肽、根据本发明的宿主生物或者根据本发明的宿主生物的发酵添加剂/培养上清液。

术语“饲料”是指可以用作动物食物的任何物质。术语“营养基(nutritionalbase)”是指组成动物食物定量的基本部分的任何物质，例如，其由谷类、蛋白质和动物和/或植物来源的脂肪的混合物组成。通常，这些营养基包括例如玉米、小麦、豌豆和大豆。这些营养基适应其预期的各种动物种类的需求。所述动物例如可以是家禽(蛋鸡、肉鸡、火鸡和鸭子)或猪(生肥育猪(growingand finishing pigs)或小猪)。

肽的应用

本发明也涉及根据本发明的肽、根据本发明的宿主生物、根据本发明的菌株、根据本发明的宿主生物的发酵添加剂或者根据本发明的菌株的发酵添加剂在制造药物中的应用。

本发明也涉及根据本发明的肽、根据本发明的宿主生物、根据本发明的菌株、根据本发明的宿主生物的发酵添加剂或者根据本发明的菌株的发酵添加剂作为营养添加剂或者与其它化合物结合作为动物饲料的应用。

根据本发明的一个实施方式，这种药物或这种营养添加剂意图用于预防或治疗家禽或猪中的坏死性肠炎。

根据本发明的另一实施方式，这种药物或这种营养添加剂意图用于预防或治疗人的胃肠疾病。

附图简述

图1：通过在Sephadex G-75上可溶性馏分的分子筛选获得的色谱图，所述可溶性馏分含在聚藏菌株活泼瘤胃球菌E1的单菌大鼠的10g盲肠内含物中；x-轴给出洗脱体积，以mL计；y-轴给出280nm处的吸收；阴影面积对应于对产气荚膜梭菌有活性的馏分(馏分325至358)。

图2A：通过在Sephadex G-75上标准蛋白质分子筛选获得的谱图；x-轴给出洗脱体积，以mL计；y-轴给出280nm处的吸收；a：白蛋白67kDa；b：卵白蛋白43kDa；c：糜蛋白酶25kDa；d：核糖核酸酶A 13.7kDa

图2B：得自图2A的色谱图的log校准曲线(MM)＝f(Ve)；x-轴给出洗脱体积，以mL计；y-轴给出分子量对数

图3：在阳离子交换柱上通过HPLC获得的活性GF馏分的色谱图；y-轴左侧，给出214nm处的吸收；y-轴右侧给出NaCl浓度，以M计；x-轴给出时间，以分钟计

图4A：通过反相HPLC获得的活性CM馏分的色谱图；y-轴，左侧给出给出214nm处的吸收；y-轴右侧给出乙腈洗脱剂的百分比；x-轴给出时间，以分钟计；

图4B和4C：从反相HPLC得到的馏分的质谱；x-轴给出质量/电荷；y-轴给出信号强度

图5：用于从聚藏菌株活泼瘤胃球菌E1的单菌大鼠的盲肠内含物纯化RumC的方案规划

图6：在阳离子交换树脂上通过FPLC得到的脱盐馏分SN 9-17的色谱图；x-轴给出时间，以分钟计；y-轴给出214nm处的吸收

a：在214nm的吸光度

b：NaCl浓度

c：导电率

d：流速，以mL/分钟计

图7：在RumC纯化过程中各种馏分的质谱；x-轴给出质量/电荷；y-轴给出信号强度

图7A：SN 9-17

图7B：活性CM馏分

图7C：R 10kDa

图8：馏分GF 47-50的质谱；x-轴给出质量/电荷；y-轴给出信号强度

图9：从突变株LEM 9-17纯化RumC的方案规划

实施例

材料与方法

1.细菌菌株和培养基

菌株活泼瘤胃球菌E1——其产生RumC，分离自健康成人的显性排泄物小型生物群(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol.，67，4111-4118，2001)。菌株活泼瘤胃球菌L14是活泼瘤胃球菌E1的自发突变体，其已经失去体外生产RumA的能力但是仍能体内合成RumC。

于2006年12月19日以编号CNCM I-3705保藏于CNCM的活泼瘤胃球菌菌株衍生自菌株L14的随机诱变。其能够在胰岛素补充的琼脂培养基(500μg/ml，但不在液体培养基中)上体外生产RumC。其是菌株LEM 9-17。

用作活性试验靶标的菌株是菌株产气荚膜梭菌CpA(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol.，67，4111-4118，2001)。

在受控大气压下在“Freter”型室中厌氧培养这四种菌株(85％N₂、10％H₂、5％CO₂)。使它们在37℃在补充由酵母提取液和氯化血红素的BHI培养基(BHI-YH)中温育。

液体BHI-YH：37g/L BHI(Brain Heart Infusion，Difco Laboratories)

5g/L酵母提取液(Yeast Extract，Fluka)

5mg/L氯化血红素(Hemin，Sigma)

琼脂BHI-YH：同前+15g/L琼脂(BACTOTM agar，Difco Laboratories)

2.利用液体样品的抗微生物活性试验

为了由液体样品进行抗微生物活性试验，将10⁴至10⁵个产气荚膜梭菌CpA细胞铺板在琼脂培养基上。室温下30分钟后，利用巴斯德吸管在琼脂中制成直径为6mm的孔。然后，体积为100μL以下的样品被置于孔中，并且培养皿在37℃被温育16至24小时。如果样品含有直接对抗产气荚膜梭菌CpA的抗微生物物质，细菌的生长得到抑制，这导致在孔周围形成“抑制孔环(inhibition halo)”。

也可以通过直接将10μL测试样品放到用产气荚膜梭菌提前接种的琼脂上进行活性测试。

3.利用在琼脂培养基中生长的菌落的抗微生物活性测试

在补充有或另外具有50μg/mL胰岛素的琼脂培养基上培养24小时之后，潜在生产抗微生物物质的菌株用含有靶菌株的“软”琼脂培养基(含有7.5g琼脂/L)覆盖。这种软琼脂通过临时混合5mL表面灌流的琼脂培养基与5mL含有10⁴至10⁵个靶菌株细胞的液体培养基来制备。然后将培养皿在37℃再温育16至24小时。在产生抗微生物物质的菌落周围观察到抑制孔环。

4.从盲肠内含物中取出细胞碎片和食物残留物

10g盲肠内含物在30mL PBS(NaCl 137mM、KCl 2.68mM、Na₂HPO₄8.1mM、KH₂PO₄ 1.47mM，pH 7.4)中稀释，然后在10000×g以及4℃下离心15分钟。移走含有细胞碎片和食物残渣的片状沉淀物。

5.离心过滤装置

作为离心后其分子量的函数，这些是用于将蛋白质分离成两部分的滤膜器。这些体系也可以被用于浓缩样品或使样品脱盐。

几家制造商销售这种类型的产品。在大多数情况下，膜由再生纤维素制成，但是它们也可以由聚醚砜制成。系统的选择成为待被处理的样品体积以及膜的截止阈值(cut-off threshold)的函数(表1)。这些过滤装置按照制造商提供的关于选择转子类型和离心速度的说明书使用。然而，离心时间作为样品粘度的函数是可变的。

表1：在RumC纯化测试过程中使用的过滤装置的特性

*商品名Millipore的产品；**商品名Sartorius的产品

6.在Sephadex G-75上的分子筛选

在G-75柱(2.4×187cm)上进行盲肠内含物上清液的分子筛选。样品(其体积是柱体积的大约2％)被放置在柱上，在4℃在1mL/分钟的流速下利用PBS进行洗脱，并收集600个2-mL馏分。通过读取每种馏分在280nm处的吸收获得色谱图。

7.在FPLC上的分子筛选

在FPLC系统上进行活性CM馏分的分子筛选。将样品装载到HiLoad26/60 Superdex 30pg柱(GE Healthcare)上。在2.5mL/分钟的流速下利用PBS进行洗脱。通过测量280nm处的吸收变化，检测所洗脱的蛋白质材料。自动收集对应于2分钟洗脱的馏分。

8.在阳离子交换CM柱上的HPLC

在装备有Waters 616 Pump注射器的Waters 600S Controller上进行阳离子交换HPLC。将样品(0.5mL)装载到来自TSK的CM-3SW Spherogel半制备柱上。在pH 5的20mM乙酸钠缓冲液中在0.8mL/分钟的流速下，利用从0至1M的NaCl浓度梯度进行洗脱。在第一个20分钟期间，在没有NaCl的情况下以无梯度模式进行洗脱，然后利用从0至0.5M的线性NaCl浓度梯度洗脱30分钟。洗脱然后在无梯度条件下继续5分钟，然后在1分钟内进行交换至1M的NaCl浓度，之后在无梯度条件下继续15分钟，最后，回到最初的条件。通过使用Waters 486 Tunable Absorbance Detector测量280或214nm处的吸收，检测所洗脱的蛋白质物质。自动收集馏分，然后利用Ultra PL-5系统脱盐。

9.在阳离子交换柱上的FPLC

在FPLC系列上进行阳离子交换色谱法。将样品装载到Hi-Prep 16/10 CMFF柱(GE Healthcare)上。在pH 5的20mM乙酸钠缓冲液中，利用从0至0.4M的NaCl浓度梯度进行洗脱。在没有NaCl的情况下以无梯度模式进行洗脱50分钟，流速为2mL/分钟。然后在5mL/分钟的流速下，利用从0至0.4M的线性NaCl浓度梯度在40分钟内进行洗脱。通过测量在280nm处的吸收变化，检测所洗脱的蛋白质物质。自动收集1mL馏分，然后在Sep-C18柱体上脱盐。

10.反相HPLC

在Alliance Waters 1690 Separations Module系列上进行反相HPLC。将预先用0.1％三氟乙酸(TFA)酸化的样品(100μL)装载到Vydac 218TP52 250×2分析柱上。在恒定流速(0.5mL/分钟)下进行洗脱。在15％乙腈下以无梯度模式洗脱10分钟后，在60分钟内应用15％至30％乙腈的线性梯度。然后在1分钟内进行交换至70％乙腈，并且在无梯度条件下继续洗脱19分钟，之后回到初始条件。通过使用Waters 996 Photodiode Array Detector测量214nm处的吸收变化，检测所洗脱的蛋白质物质。自动收集0.5mL馏分。利用SpeedVac Concentrator(Savant)蒸发掉乙腈。

11.质谱法

在Timone proteomic plateau(School of Pharmacy，Marseilles，France)进行质谱法分析。

在以正线性模式使用的Ettan Maldi-Tof Pro光谱仪(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)上利用延迟萃取获得Maldi类型的质谱。样品与5mg/mL α-氰基-4-羟基桂皮酸溶液在Maldi靶上通过干点滴法共结晶。利用20kV的加速电势获得光谱，并且激光功率被设定为最低水平，以便获得优良信号。在外部模式下通过采集已知质量的标准肽混合物获得光谱校准(Pepmix4，Laserbiolabs，Nice，France)。

对于某些难于结晶的样品，利用2，5-二羟基苯甲酸的溶液进行共结晶。

12.Edman测序

该技术基于蛋白质的游离末端胺基团与异硫氰酸苯酯(C₆H₅N＝C＝S)的反应。这种环状化合物在碱性介质中在蛋白质的第一氨基酸残基上进行亲核攻击。然后肽的苯氨基硫甲酰基(phenylthiocarbamyl，PTC)衍生物通过水解作用被切割。获得第一氨基酸的苯胺基-噻唑啉酮(ATZ)和已经失去这种氨基酸的蛋白质。ATZ-氨基酸然后被转化为乙内酰苯硫脲-(PTH)氨基酸。

分离连续获得的PTH-氨基酸，并通过RP-HPLC通过测量280nm处的吸收以及通过比较洗脱时间进行鉴定。

反应周期可以重复，并因此产生蛋白质的序列。

13.随机诱变

在37℃温育24小时的14mL菌株L14的培养物被分入七个2mL试管中，然后将试管在5800×g下离心10分钟。将细胞沉淀用2mL 0.1M柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸21mg/mL，NaOH 8.8mg/mL，pH 5.5)洗涤两次，然后溶解在含有增加浓度的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)——有效地诱变剂——的柠檬酸盐缓冲液中。

表2：在Sep-Pak上脱盐期间使用的溶液的体积

试管	1(T₀)	2	3	4	5	6	7
								[NG]最终，以μg/mL计	0	25	50	100	200	400	1000

然后将试管在37℃上温育30分钟，之后在5800×g离心10分钟。片状沉淀物用0.1M磷酸盐缓冲液(KH₂PO₄ 13.6mg/mL，NaOH 2.32mg/mL，pH7)洗涤，然后溶解在液体BHI-YH培养基中。

14.在Sep-

C18柱体(Waters)上脱盐

根据模型，这些柱处于所述相被倾倒入注射器中的形式，或者这些柱处于固定至注射器末端的微型柱的形式。缓冲液的流量通过蠕动泵得以保障。在第一阶段，通过使H₂O经过，然后使CH₃CN以及最后使含有0.05％TFA的H₂O经过，平衡柱。然后施加预先用0.05％TFA酸化的样品。通过连续加入H₂O-0.05％TFA、40％CH₃CN-0.05％TFA和CH₃CN-0.05％TFA，以三步进行洗脱。

因此收集三种馏分：对应于未被柱保留的蛋白质的馏分以及对应于盐的馏分(馏分NR)、含有用40％CH₃CN稀释的蛋白质的馏分(40％CAN馏分)以及含有用100％CH₃CN稀释的蛋白质的馏分(100％CAN馏分)。取决于体积，利用Speed Vac Concentrator或旋转蒸发器蒸发掉溶剂。

表3显示使得自RumC纯化的馏分脱盐所使用的每种溶液的体积(cf.结果和讨论)。这些体积取决于Sep-Pak的相体积。

表3：作为施加的函数在Sep-Pak期间所使用的溶液体积

15.温度耐受性测试

加热含有RumC的等分部分的馏分，每种达到不同的温度，利用导热釜(heating block)进行5或15分钟，然后在4℃保藏。然后使它们经历抗微生物活性试验。

16.pH耐受性测试

将含有RumC的等分部分的馏分在期望的缓冲液大约稀释十倍。室温下10分钟后，将每种溶液置于Vivaspin 500 3kDa过滤装置上，然后按照制造商的指令离心。将缓冲液添加至由Vivaspin 500保留的馏分中，然后再离心过滤装置。由Vivaspin 500 3kDa保留的每种馏分——即含有RumC——的体积用缓冲液调节，以便对应于起始体积。然后在进行抗微生物活性试验之前将各种馏分保藏在4℃下。

Vivaspin 500 3kDa滤器不耐受大于9的pH。因此仅测试酸性或中性pH的缓冲液。成分如下：

pH 2缓冲液：50mM KCl-13mM HCl

pH 4.4缓冲液：0.2M pH 4.4乙酸钠缓冲液

pH 7缓冲液：50mM KH₂PO₄-39mM NaOH

结果和讨论

1.来自盲肠内含物的RumC的纯化

尽管菌株活泼瘤胃球菌E1是可培养的，但是在测试的培养条件下RumC不能体外生产。为纯化RumC，因此必需利用来自聚藏菌株E1的单菌大鼠的盲肠内含物来操作，或者产生能够体外生产RumC的活泼瘤胃球菌的突变株(见第2节)。

1.1.来自单菌大鼠的盲肠内含物的稀释

第一步由在PBS中稀释盲肠内含物组成。

1.2.细胞碎片的移除

在第二步纯化期间，细菌、细胞碎片和食物残渣通过离心盲肠内含物而被移走。

1.3.浓缩

然后在

Ultra-15PL-5系统上浓缩溶液，之后应用于分子筛选柱。

1.4.抗微生物活性试验

在菌株产气荚膜梭菌CpA上测试所得到的所有馏分，这证实抗-产气荚膜梭菌物质在单菌大鼠的盲肠内含物中的存在。

利用来自无菌大鼠(无微生物)的盲肠内含物进行阴性对照。未检测到抗-产气荚膜梭菌活性。在单菌大鼠的盲肠内含物中存在的抗-产气荚膜梭菌物质的确是活泼瘤胃球菌E1特定的。

之后，每一纯化试验之后进行抗-产气荚膜梭菌活性试验。在第一阶段，仅研究活性的存在或缺乏，注意要确保阴性结果与技术的灵敏度阈值(sensitivity threshold)无关。当明确的方案被确定时，在第二阶段进行定量试验。

1.5.在G-75柱上的分子筛选

在Sephadex G-75柱(2.4×187cm)上进行分子筛分。通过读取所收集的600个2-mL馏分中每一种在280nm处的吸收，监测洗脱。

在利用YM-3预先浓缩的馏分上进行抗微生物活性试验。

馏分325至358证实对产气荚膜梭菌具有活性，并且其被汇集以形成新的活性GF馏分(图1的阴影部分)。

利用来自无菌大鼠的盲肠内含物进行的对照产生的洗脱曲线与利用来自单菌大鼠的盲肠内含物得到的洗脱曲线相当，但是未检测到抗-产气荚膜梭菌活性。

1.6.RumC大小的评价

为了评价在活性GF馏分中存在的RumC的大小，将已知分子量的标准蛋白质置于同一Sephadex G-75柱上，并测量各洗脱体积(图2A)。然后绘制定义物质的分子量对数(log(MM))与其洗脱体积(Ve)之间比例的校准曲线(图2B)。平均洗脱体积是683mL的情况下，抗微生物物质不在选择的标准蛋白质范围内，但是通过外推，其分子量可以近似评价为5200Da。

1.7.在阳离子交换树脂上的色谱法

利用活性GF馏分，使用HPLC系统，考虑在羧甲基(CM)-Spherogel^TM柱上的阳离子交换色谱。在pH 5，通过NaCl浓度梯度进行洗脱，并在214nm监测(图3)。

在32分钟与38分钟之间发现活性(活性CM馏分)，其对应于0.2至0.3M的NaCl浓度。该技术使得消除未被保留的馏分中的污染物特别是消除所有的黄色颜料成为可能。

通过质谱法进行的活性CM馏分的分析显示其含有大约4200Da的单一肽(结果未显示)。

使该馏分经历N-末端测序。最初的11个氨基酸因此被测定：AGVIX(N/S)GTXAV(SEQ ID No.10)。该序列未显示与已知蛋白质具有任何强同源性。

测序也显示出两个较小的序列。

1.8.反相HPLC色谱

获得在214nm处的各种吸收峰。

在被称为a(或“双峰”)和b(或“单峰”)的两种馏分中显示出活性(图4A)。通过质谱法对这两种馏分进行分析显示存在三种主要的肽，它们各自的分子量在4230与4460Da之间(图4B和4C)。

利用所开发的三种色谱法，即，分子筛选、阳离子交换色谱法和反相色谱法，再次进行RumC自盲肠内含物的纯化。得到的洗脱曲线与所展开的第一次测试的那些洗脱曲线相当。RumC纯化方法因此是可再现的，并且因此可以被采用。

总结从盲肠内含物纯化RumC方案示出图5中。

1.9.纯化收率和纯化因子

按惯例，在溶液中存在的随意活性单位(arbitrary activity unit，AAU)的数目被定义为最后活性稀释的倒数。因此在得自纯化的每种活性馏分的连续稀释(两倍)上进行抗-产气荚膜梭菌活性测试。

通过比较以AAU/mg蛋白质表达的每种馏分的比活性获得纯化因子(purification factor)。对各种馏分中蛋白质数量的估计得自其在280nm处的吸收测量，利用的是1.8的质量消光系数E^0.1％。

表4给出了用于自单菌大鼠盲肠内含物纯化RumC的方案步骤的活性收率和纯化因子。

表4：在从10g单菌大鼠盲肠内含物体内制备RumC过程中的活性收率和纯化因子

n.d.＝未测定

V：馏分的总体积，以mL计

抗-CpAA.：抗-产气荚膜梭菌活性，即在馏分中包含的活性单位总数

M_蛋白质：馏分中的蛋白质质量，以mg表达

SA：抗-产气荚膜梭菌比活性，以AAU/mg计

SA＝抗-CpAA./m_蛋白质

收率：纯化的活性收率

收率＝100×抗-CpAA._测试馏分/抗-CpAA._匀浆

F_纯化：纯化因子

F_纯化＝SA_测试馏分/SA_SN

1.10.肽序列的测定

尽管在“双峰”和“单峰”馏分中存在的产物的分子量不同，但是Edman测序使得建立单一主要N-末端序列：AGXIXSGSVAV(SEQ ID No.3)成为可能。

在所关注的两种馏分中，也显示了较小的17个残基的序列：AGPAYXVGYXGNNGAVT(SEQ ID No.2)。

2.通过随机诱变产生突变株

所采用的技术是菌株活泼瘤胃球菌L14的随机诱变。该菌株是活泼瘤胃球菌E1的自发突变体，其已经失去体外生产RumA的能力，但是仍能体内合成RumC。将该菌株暴露于有效的烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)。

因此，将等分部分的菌株L14的同一培养物暴露于增加浓度的NG(0至1000μg/mL)。处理后，稀释各种细胞悬液，然后将其铺板在培养皿上。在培养之后计数菌落使得能够评价在各种悬液中的活细胞浓度。

通过与对照浓度(试管1，无NG处理)比较，可以测定每种处理的死亡率。其表明用NG的处理是有效的：死亡率在50％至99％之间，并且随浓度增加。

为了发现感兴趣的突变体(多种)，近860个随机选自在各种处理中存活的克隆的菌落在胰岛素补充的琼脂培养基上进行次培养，然后使其经受抗-产气荚膜梭菌活性试验。

发现83个克隆是在胰岛素存在下抗-产气荚膜梭菌物质的潜在生产者。

在这些当中，选择20个进行更严格的表征。

在第一阶段，检查影响克隆的突变，以确保它们没有通过PCR在rumA中恢复染色体组成(chromosomal organization)。

然后，在胰岛素存在或不存在下，使该20个已选克隆在琼脂培养基上和在液体培养基中经历抗-产气荚膜梭菌活性试验。

在胰岛素补充的琼脂培养基上，在所测试的20个克隆中的7个克隆周围出现抑制孔环。

另一方面，在无胰岛素的琼脂培养基上，不存在产生任何抗-产气荚膜梭菌物质的克隆：因此胰岛素对于杆菌素的合成总是必需的。

甚至在胰岛素存在的情况下，在液体培养基中培养的克隆没有产生抗-产气荚膜梭菌。

3.利用突变株的纯化

在七个生产克隆之一——突变体9-17上进行生产和纯化试验。

利用可变浓度的细胞和胰岛素，在软琼脂上进行试验。在培养突变体之后，磨碎琼脂然后离心，回收上清液(SN 9-17)。然后针对产气荚膜梭菌测试该上清液，其证明是活性的。在该活性上清液上进行通过质谱法的分析(图7A)。

3.1.利用FPLC系统在阳离子交换树脂上的色谱法

在进行离子交换色谱法之前，样品需要脱盐。

第一试验显示，SN 9-17在Amicon上的脱盐是不足的。因此，应当考虑样品在Sep-Pak上脱盐，作为初步纯化步骤。

用40％乙腈溶液进行蛋白质从Sep-Pak的洗脱。在旋转蒸发器上蒸发掉乙腈之后，通过在20mM，pH 5乙酸钠缓冲液中稀释溶液，使其在pH 5平衡。从65mL SN 9-17中获得50mL在pH 5平衡的SN 9-17，并将其装载到羧甲基-Sepharose阳离子交换柱上。

将0至0.4M NaCl的浓度梯度运行40分钟。在用0.2至0.3M NaCl洗脱的馏分中检测抗-产气荚膜梭菌活性，尽管当参比在280nm处的吸收变化时非常少的蛋白质物质存在于这些馏分中(图6)。在RumC从盲肠内含物纯化过程中已经观察到这种现象。汇集活性馏分然后脱盐并在Sep-Pak上浓缩。通过质谱法分析该馏分(“活性CM馏分”)证实通过阳离子交换色谱法提供的纯化增加显著，并且显示污染物都具有小于2500Da的分子量(图7B)。

3.2.CM馏分的分子筛选

通过FPLC系统在柱上进行活性CM馏分的分子筛选，这使得分离出具有10kDa以下分子量的肽。通过读取280nm处吸收的变化监测洗脱；蛋白质物质的量小，而且分离证实不令人满意(未显示)。虽然如此，在收集的馏分中测试了抗-产气荚膜梭菌活性。在筛选之后仅发现5％的已装载活性。因此，对于纯化而言，不采用这种技术。另一方面，活性馏分(“GF 47-50”)通过质谱法分析并且证实其事实上是纯的，其中肽为4235 Da(图8)。

3.3.CM馏分的过滤

利用过滤装置，进行了从活性CM馏分去除污染物的另一种尝试。因为RumC被5kDa滤器保留(尽管具有稍微较低的分子量)，因此利用Vivaspin500过滤装置——其截止阈值是5kDa——进行了第一次试验。遗憾的是，杂种还是被滤器保留，尽管它们的分子量小于2.5kDa。具体而言，质谱分析没有显示任何纯度增加(结果未显示)。因此利用Microcon过滤装置——其截止阈值是10kDa——尝试了第二次试验。具体而言，尽管其分子量，但是先前观察到RumC可被10kDa滤器保留(“10kDa R馏分”)。质谱法分析证实了先前的结果，并且使得能够显示大部分污染物在未保留的馏分中被去除(图7C)。

3.4.在HPLC系统上10kDa R馏分的反相色谱法

然后含有三个RumC峰的10kDa R馏分(4235D、4324Da和4456Da)经历反相HPLC。流速与梯度条件与从盲肠内含物纯化RumC所开发的那些条件相同，并且得到的结果相当：两种不同的馏分——“双峰”馏分和“单峰”馏分对产气荚膜梭菌有活性。

3.5.纯化收率和纯化因子

为评价纯化方案，利用每种活性馏分的两倍连续稀释进行定量活性试验。然后计算在每种馏分中包含的随意活性单位数(AAU)，并推导活性收率(表5)。在培养上清液脱盐、阳离子交换色谱之后另一次脱盐的步骤过程中观察到活性物质损失重大。损失很可能是发生在阳离子交换色谱过程中，但是这不会使该方案的有效性被质疑。

表5：来自突变体9-17的培养上清液的RumC纯化的收率

V：馏分总体积，以mL计

抗-CpA A.(抗-产气荚膜梭菌活性)：包含在馏分中的活性单位总数目，以AAU计

收率＝100×抗-CpAA._测试馏分/抗-CpAA._SN9-17；以％表达

评价纯化方案的另一种重要的标准是展示通过每一步骤所提供的纯化增长。纯化因子通过比较每一步骤的比活性(AAU/mg白质)确定，但是为了完成此工作，必须测量每种馏分中含有的蛋白质的质量。由于该方法的灵敏性，通过质谱法监测纯化，这使得能够避免“消耗”太多生物材料。尽管该方法不是定量的，但是纯化的增加得到非常清楚地展示。

3.6.质谱法

通过质谱法分析“双峰”和“单峰”馏分。得到的结果与得自使用盲肠内含物的纯化的馏分的那些结果相同：“双峰”馏分含有4324Da和4456Da肽，而“单峰”馏分含有4235Da肽。

3.7.测序

这些馏分因此被测序。

对于“单峰”馏分，得到的序列与已经测定的序列相同：AGXIXSGSVAV(SEQ ID No.3)。较小的序列出现在第五周期：AGPAY(SEQ ID No.11)。

关于“双峰”馏分，注意到轻微的差异：AGXVXSGSTAV(SEQ ID No.12)。较小序列是相同的：AGPAY(SEQ ID No.11)。

总结从突变株纯化RumC的方案示于图9中。

纯化RumC的生产被极大简化。

4.RumC肽的表征

4.1.对不同菌株的抗微生物活性

测试RumC对不同Gram+和Gram-治病菌株的抗微生物活性，在第一阶段利用来自菌株活泼瘤胃球菌E1的单菌大鼠的盲肠内含物的浓缩上清液(SN CCE1)。然后用两种对抗对SN CCE1敏感的菌株的纯化组分进行其它试验。结果示于表6中。

表6：RumC对抗不同致病菌株的活性试验结果

所测试的所有产气荚膜梭菌菌株对RumC肽都是敏感的。

4.2.对产气荚膜梭菌的抗微生物功效

通过估计每种纯化RumC馏分的“体内”最小抑制浓度并使其与甲硝唑——所使用的对抗产气荚膜梭菌的参比抗生素——的最小抑制浓度比较，也评价了RumC的抗微生物功效。

为进行此工作，制备“双峰”和“单峰”馏分两倍连续稀释(可达1/512稀释)。利用这些各种稀释以及还利用不同浓度下的甲硝唑溶液，进行抗-产气荚膜梭菌活性试验(结果未显示)。根据该实验，甲硝唑的最小抑制浓度是25μg/mL。该结果与先前由Dabard等(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol.，67，4111-4118，2001)获得的结果一致。

关于“双峰”和“单峰”馏分，仅有浓溶液(稀释1)是活性的。尽管并没有精确地知晓这些溶液的浓度，根据Edman测序，其可以被估计为大约40μg/mL。

RumC对产气荚膜梭菌的抗微生物功效因此显示与甲硝唑的相当。

4.3.温度耐受性

通过在不同的温度下温育相同数量的肽15分钟，进行RumC耐热性的第一初步试验。对于两种“体内”RumC馏分(“双峰”和“单峰”馏分)，在75℃下15分钟的处理对活性没有影响。然而，在100℃，肽在15分钟内完全灭活。

利用从菌株9-17的培养上清液纯化的RumC样品，完成这些试验。在不同温度下的温育时间是5分钟。在100℃下的温育时间是15分钟。

测试的第一温度是80℃。利用活性CM馏分进行第一试验，该活性CM馏分是含有三种肽的预纯化馏分。

与“双峰”和“单峰”馏分相反，活性CM馏分耐受100℃下15分钟的处理。

然后测试馏分GF 47-50。这种仅含有4235Da肽的纯馏分对100℃下15分钟的处理是敏感的。其对90℃下5分钟的处理也是敏感的(表7)。

表7：温度耐受性测试的总结表

R＝抗性的；s＝敏感的；/＝未测试

4.4.对pH的抵抗性

在pH 2、pH 4.4和pH 7下，还测试了活性CM馏分中存在的肽对pH的抗性。

在pH 2观察到的活性与pH 7时观察的活性相当。在4℃温育24小时之后，在pH 2没有观察到活性损失。

本发明的肽因此对酸性pH有抗性并且特别适合用在动物养分或药物领域。