CN108244348B - 酶复合制剂、饲料或添加剂以及脱除呕吐毒素的方法 - Google Patents

酶复合制剂、饲料或添加剂以及脱除呕吐毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一种酶复合制剂、饲料或添加剂以及脱除呕吐毒素的方法。该酶复合制剂包括蛋白激动剂和转移酶，所述转移酶为糖基转移酶和/或乙酰基转移酶。本发明将蛋白激动剂与糖基转移酶和乙酰基转移酶中的至少一种进行组合使用，能够高效地脱除呕吐毒素，且本发明的酶复合制剂能够简便地处理或者添加到呕吐毒素污染的谷物和/或饲料中，从而能够有效降低呕吐毒素污染的谷物和/或饲料中呕吐毒素的含量，能够提高谷物和/或饲料利用率、有利于饲养动物的健康，保证畜牧业的安全生产。

Description

酶复合制剂、饲料或添加剂以及脱除呕吐毒素的方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种酶复合制剂及其在脱除呕吐毒素中的应用、一种饲料或添加剂和一种脱除呕吐毒素的方法。
背景技术
呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，化学名称为3α,7α,15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，由于它可以引起猪的呕吐而得名，主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)感染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物产生的单端孢霉烯族毒素。在全世界范围内，呕吐毒素是粮食、饲料、食品的主要污染霉菌毒素之一，严重影响人和牲畜的健康。人畜摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，其严重危害性已经引起了各国的普遍重视。
呕吐毒素对我国谷物类原料的污染相当普遍，其检出率和检出量都是霉菌毒素中最高的一种，据甄阳光等人调查显示，中国饲料和原料呕吐毒素的超标比例接近70％，玉米中呕吐毒素的超标率为57.1％，毒素平均含量为1.01mg/kg，最高含量为2.13mg/kg。由于呕吐毒素在谷物、饲料中的普遍存在性、高含量特性和急慢性毒性，降低或者去除其毒性显得尤为重要与迫切。目前，国内外呕吐毒素脱毒方法主要有物理法、化学处理和生物方法三大类。虽然物理、化学方法脱毒已经取得一定程度的成功，但仍然存在脱毒效果有限、可能造成重要营养物质的丢失、成本较高等缺点。生物降解法是利用霉菌毒素降解酶破坏霉菌毒素的结构，将毒素变成无毒的产物，从而达到解毒的作用。采用生物降解法脱毒的先进性在于：(1)能将毒素彻底分解而不会有毒性物质残留；(2)特异性高，只针对霉菌毒素起作用而不会破坏谷物、饲料等原料中的其它成分，不会降低谷物和饲料的营养价值，不改变产品的物理和感官状态成分。
综上所述，为解决谷物、饲料等中的呕吐毒素的污染问题，有必要研发一种能够高效、安全脱除呕吐毒素的酶制剂，以提高谷物和/或饲料利用率，保证畜牧业的安全生产，提高畜牧业经济效益。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种酶复合制剂及其在脱除呕吐毒素中的应用以及饲料或添加剂和脱除呕吐毒素的方法。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种酶复合制剂，该酶复合制剂包括蛋白激动剂和转移酶，所述转移酶为糖基转移酶和/或乙酰基转移酶。
第二方面，本发明提供了本发明所述的酶复合制剂在脱除呕吐毒素中的应用。
第三方面，本发明提供了一种饲料或添加剂，该饲料或添加剂含有本发明所述的酶复合制剂。
第四方面，本发明提供了一种脱除呕吐毒素的方法，该方法包括：将本发明所述的酶复合制剂与呕吐毒素污染的样品接触，以脱除样品中的呕吐毒素。
本发明将蛋白激动剂与糖基转移酶和乙酰基转移酶中的至少一种进行组合使用，由此得到的酶复合制剂能够高效脱除呕吐毒素，具有环保易操作、呕吐毒素脱除安全、高效等优点。本发明提供的酶复合制剂可以用于谷物和/或饲料等呕吐毒素污染的样品中呕吐毒素的脱除，对于解决谷物和/或饲料中呕吐毒素污染问题、提高谷物和/或饲料利用率、保证畜牧业的安全生产、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。根据本发明的一种优选的实施方式，酶复合制剂包括特定比例的蛋白激动剂、糖基转移酶和乙酰基转移酶时，能够更进一步提高对呕吐毒素的脱除率。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种酶复合制剂，该酶复合制剂包括蛋白激动剂和转移酶，所述转移酶为糖基转移酶和/或乙酰基转移酶。
本发明中，本领域技术人员应该理解的是，该酶复合制剂可以包括蛋白激动剂和糖基转移酶，或者包括蛋白激动剂和乙酰基转移酶，或者包括蛋白激动剂、糖基转移酶和乙酰基转移酶。
为了进一步提高酶复合制剂对呕吐毒素的脱除效果，优选情况下，蛋白激动剂与转移酶的重量比为1：(3-1000)，进一步优选为1：(3-30)，更进一步优选为1：(4-10)。其中，蛋白激动剂与转移酶的重量比可以为1：3、1：4、1：5、1：8、1：10、1：20、1：30、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100、1：200、1：300、1：400、1：500、1：600、1：700、1：800、1：900、1：1000以及前述数值之间的任意值(转移酶可以过量)。本领域技术人员应该理解的是，当转移酶为糖基转移酶和乙酰基转移酶中的一种时，转移酶的重量即为该一种酶的重量。
本发明的酶复合制剂中，本发明的发明人在研究中进一步发现，当该酶复合制剂包括蛋白激动剂、糖基转移酶和乙酰基转移酶且各组分为特定比例时，能够进一步提高酶复合制剂对呕吐毒素的脱除效果，因此，为了进一步提高酶复合制剂对呕吐毒素的脱除效果，优选情况下，转移酶为糖基转移酶和乙酰基转移酶，且糖基转移酶和乙酰基转移酶的重量比为1：(0.5-6)，进一步优选为1：(1.25-3)。
本发明的酶复合制剂中，优选情况下，所述糖基转移酶为UDP-葡萄糖基转移酶。
本发明的酶复合制剂中，优选情况下，所述乙酰基转移酶为3-O-乙酰基转移酶。
本发明的酶复合制剂中，优选情况下，所述蛋白激动剂为磷脂酰丝氨酸。
本发明中，糖基转移酶和乙酰基转移酶均可通过现有方法制备得到，蛋白激动剂均可通过商购获得，也可通过正规的其他途径进行获取。
本发明中，为了方便使用，优选情况下，所述酶复合制剂的各组分可以混合在一起包装，也可以各自独立包装，然后在使用时再进行混合。
本发明还提供了上述酶复合制剂的制备方法，该方法包括：按照前述重量比例将糖基转移酶、乙酰基转移酶和蛋白激动剂混合。
第二方面，本发明提供了上述酶复合制剂在脱除呕吐毒素中的应用。
第三方面，本发明还公开了一种饲料或添加剂，其中，该饲料或添加剂含有如上所述的酶复合制剂。
在优选的实施方案中，以饲料或添加剂的总重量为基准，所述酶复合制剂的用量为1-15ppm，进一步优选为2-10ppm，更优选为4-8ppm。此处，“ppm”表示的是“μg/g”。
根据本发明，所述饲料和添加剂中还含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉和PVA以及它们的混合物。
对本领域技术人员显而易见的是，可将这些添加剂添加至污染有呕吐毒素的饲料材料以减少动物消费的饲料中存在的呕吐毒素水平。
本发明的饲料材料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦、稻谷以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍、玉米或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。
对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的饲料或添加剂可还包含其他组分如菌体和/或稳定剂和/或增量剂。
优选地，制备根据本发明的饲料或添加剂的方法包括混合步骤，该混合步骤包括将所述酶复合制剂，任选与至少一种生理上可接受的载体一起混合。
对本领域技术人员显而易见的是，作为预防步骤，可将添加剂添加至任何饲料材料。
例如，所述饲料或添加剂为养殖动物的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的至少一种。
例如，所述饲料为青贮饲料或牛饲料时，所述饲料还含有产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)中的至少一种。
例如，所述饲料或添加剂为肉鸡、生长育肥猪和水产养殖动物的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
例如，所述饲料或添加剂为肉鸡、肉鸭、猪或虾的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)。
第四方面，本发明还提供了一种脱除呕吐毒素的方法，其中，该方法包括：将如上所述的酶复合制剂与呕吐毒素污染的样品接触，以脱除样品中的呕吐毒素。
根据本发明，所述接触优选在所述酶复合制剂中糖基转移酶和乙酰基转移酶能够发挥酶活性的条件下进行。其中，术语“发挥酶活性的条件”是指符合酶活性发挥的温度和pH等条件。
根据本发明，所述呕吐毒素污染的样品可以包括任何含有呕吐毒素的样品，例如，可以为谷物和/或饲料等。优选情况下，以呕吐毒素污染的样品的总重量为基准，所述酶复合制剂的用量为1-15ppm，进一步优选为2-10ppm，更优选为4-8ppm。在本发明中，当呕吐毒素污染的样品为液体时，“ppm”表示的是“μg/mL”；当呕吐毒素污染的样品为固体时，“ppm”表示的是“μg/g”。
其中，谷类可以为小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦、稻谷以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍、玉米或高粱，饲料可以为前述谷物加工而成的饲料。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但并不因此限制本发明。以下制备例、实施例和对比例中，如无特别说明，各材料均可商购获得，各方法均为本领域的常规方法。
磷脂酰丝氨酸购自上海信帆生物科技有限公司。
制备例1
本制备例用于说明UDP-葡萄糖基转移酶的制备方法。
根据参考文献《Ma L L,Y.Shang,A.Z.Cao,et al.Molecular cloning andcharacterization of an up-regulated UDP-glucosyltransferase gene induced byDON from Triticum aestivum L.cv.Wangshuibai[J].Molecular Biology Reports,2010,37(2):785-795.》，从小麦(Triticum aestivum L.)变种中获得UDP-葡萄糖基转移酶基因片段(TaUGT3)，将该UDP-葡萄糖基转移酶基因片段(TaUGT3)通过分子克隆方法克隆至载体PET30a质粒(具有His标签，购于美国Invitrogen公司)，得到重组载体，将该重组载体转化BL21(DE3)大肠杆菌菌株(购自北京华越洋生物科技有限公司，货号为NRR01210，下同)，使BL21(DE3)大肠杆菌菌株中表达UDP-葡萄糖基转移酶，得到重组菌株。挑取单菌落接种至LB液体培养基(LB培养基：牛肉膏5克，蛋白胨10克，氯化钠5克，补足水分至1000毫升115℃灭菌20min备用，pH7.0)中，于37℃培养至OD600值在2-6之间，收集菌悬液冰浴30min，在4℃条件下，10000rpm离心20min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液(PBS，135mM NaCl，2.7mMKCl，1.5mM KH2PO4，8mM K2HPO4，pH 7.2)溶液悬浮后，超声波破碎，然后在4℃条件下，10000rpm离心20min，收集上清液，即为粗酶液。
将粗酶液置于冰上，缓慢加入磨碎的硫酸铵粉末，边加边搅拌，添加到硫酸铵饱和为止。在4℃静置24h，12000r/min离心50min，弃上清，用少量PBS(pH 7.2)溶解沉淀。将PBS溶解的沉淀透析，除去硫酸铵，重悬于缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)中。由于表达出的重组酶含有His标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化，1mL/min平衡Ni柱后，以流量0.5mL/min直接将重悬的粗酶液上样，继续使用缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)1mL/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白，然后以缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，500mM咪唑)洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液。将酶液在-40℃下预冻12h，然后经冷冻干燥机处理制得UDP-葡萄糖基转移酶的干粉。
制备例2
本制备例用于说明3-O-乙酰基转移酶的制备方法。
根据参考文献《Khatibi P,J.Monysnyi,N.Nghiem,et al.Conversion ofdeoxynivalenol to 3-acetyldeoxynivalenol in barley-derived fuel ethanol co-products with yeast expressing trichothecene 3-O-acetyltransferases[J].Biotechnology for Biofuels,2011,4:26-38.》获取3-O-乙酰基转移酶基因片段FgTRI101，将3-O-乙酰基转移酶基因片段FgTRI101通过分子克隆方法克隆至载体PET30a质粒(具有His标签，购于美国Invitrogen公司)，得到重组载体，将该重组载体转化BL21(DE3)大肠杆菌菌株，使BL21(DE3)大肠杆菌菌株中表达3-O-乙酰基转移酶，得到重组菌株。然后按照制备例1的相同方法从重组菌株中分离并制得3-O-乙酰基转移酶的干粉。
实施例1-7、对比例1-3
用于说明本发明提供的酶复合制剂对呕吐毒素的脱除作用。
按照表1中各实施例和对比例的配比进行酶复合制剂的配制，向1kg污染有200ppm呕吐毒素的玉米粉中加入8ppm各实施例和对比例配制的酶复合制剂作为试验组，以不加入酶复合制剂的1kg污染呕吐毒素的相同玉米粉作为对照组，并向各试验组和对照组分别加入1kg蒸馏水，每组做三个重复，混合均匀后于37℃、pH 7下脱毒1天。分别从各试验组和对照组称量样品，按照《GB/T 30956-2014饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法》测定处理1天后各样品中呕吐毒素的含量，并计算脱除率，结果见表2。其中，对照组无任何降解脱除现象。
其中，呕吐毒素脱除率＝(样品中呕吐毒素初始浓度-处理后样品中呕吐毒素浓度)/样品中呕吐毒素初始浓度×100％。
表1
Figure BDA0001197632570000091
表2
编号 呕吐毒素脱除率(％)
实施例1 95.4
实施例2 94.8
实施例3 94.5
实施例4 89.1
实施例5 90.8
实施例6 92.1
实施例7 84.6
实施例8 87.9
对比例1 62.7
对比例2 57.3
对比例3 59.4
由以上表2的数据可以看出，将蛋白激动剂与糖基转移酶和乙酰基转移酶中的至少一种进行组合使用，能够高效地脱除呕吐毒素，且本发明的酶复合制剂能够简便地处理或者添加到呕吐毒素污染的谷物和/或饲料中，从而能够有效降低呕吐毒素污染的谷物和/或饲料中呕吐毒素的含量，能够提高谷物和/或饲料利用率、有利于饲养动物的健康，保证畜牧业的安全生产。
将表1中实施例1与实施例4-5的结果比较可知，糖基转移酶和乙酰基转移酶的重量比为1：(1.25-3)时，能够更进一步提高对呕吐毒素的脱除率。
将表1中实施例1与实施例6的结果比较可知，蛋白激动剂的重量与糖基转移酶和乙酰基转移酶的总重量的比例为1：(4-10)时，能够更进一步提高对呕吐毒素的脱除率，且能够节约成本。
将表1中实施例1与实施例7-8的结果比较可知，酶复合制剂同时含有蛋白激动剂、糖基转移酶和乙酰基转移酶时，能够更进一步提高对呕吐毒素的脱除率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种酶复合制剂，其特征在于，该酶复合制剂包括蛋白激动剂和转移酶，所述转移酶为糖基转移酶和乙酰基转移酶，所述糖基转移酶和乙酰基转移酶的重量比为1：（1.25-3），所述糖基转移酶为UDP-葡萄糖基转移酶，所述乙酰基转移酶为3-O-乙酰基转移酶，所述蛋白激动剂为磷脂酰丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的酶复合制剂，其中，蛋白激动剂与转移酶的重量比为1：（3-1000）。
3.根据权利要求2所述的酶复合制剂，其中，蛋白激动剂与转移酶的重量比为1：（3-30）。
4.根据权利要求3所述的酶复合制剂，其中，蛋白激动剂与转移酶的重量比为1：（4-10）。
5.权利要求1-4中任意一项所述的酶复合制剂在脱除呕吐毒素中的应用。
6.一种饲料或添加剂，其特征在于，该饲料或添加剂含有权利要求1-4中任意一项所述的酶复合制剂。
7.根据权利要求6所述的饲料或添加剂，其中，以饲料或添加剂的总重量为基准，所述酶复合制剂的用量为1-15ppm。
8.根据权利要求6所述的饲料或添加剂，其中，所述饲料或添加剂为养殖动物的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的至少一种；或者
所述饲料为青贮饲料或牛饲料时，所述饲料还含有产丙酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）、布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）中的至少一种；或者
所述饲料或添加剂为肉鸡、生长育肥猪或水产养殖动物的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）；或者
所述饲料或添加剂为肉鸡、肉鸭、猪或虾的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporu）。
9.一种脱除呕吐毒素的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1-4中任意一项所述的酶复合制剂与呕吐毒素污染的样品接触，以脱除样品中的呕吐毒素。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述呕吐毒素污染的样品为谷物和/或饲料，且以所述样品的总重量为基准，所述酶复合制剂的用量为1-15ppm。
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