CN108244334B

CN108244334B - 复合制剂、饲料或添加剂以及降解黄曲霉毒素的方法

Info

Publication number: CN108244334B
Application number: CN201611248784.5A
Authority: CN
Inventors: 苏会波; 林海龙; 熊强; 李凡; 陈博; 朱镜羲; 唐堂; 黄锦; 张子剑
Original assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: CN108244334A

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及复合制剂、饲料或添加剂以及降解黄曲霉毒素的方法。本发明的复合制剂包括酵母菌和酶，所述酵母菌为耐盐性假丝酵母菌(Candida versatilis)和/或鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)，所述酶为葡糖氧化酶。本发明将特定种类的酵母菌和酶进行组合使用，能够有效地降解黄曲霉毒素，尤其是能够降解致癌性较强的黄曲霉毒素B1。本发明中创造性地将菌和酶配合用于制备复合制剂，该复合制剂能够简便地处理或者添加到饲料材料中，从而能够降低饲料中黄曲霉的含量，有利于饲养动物的健康。

Description

复合制剂、饲料或添加剂以及降解黄曲霉毒素的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及复合制剂、饲料或添加剂以及降解黄曲霉毒素的方法。

背景技术

真菌毒素是产毒真菌在危害过程中产生的一类次生代谢物质，主要包括黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(又称呕吐毒素，DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏马毒素(FUM)、赭曲霉毒素和T-2毒素等。

近几年，由于我国极端气候的频繁出现，导致了以危害小麦、玉米为主的赤霉病的大流行，真菌产生的伏马毒素(FUM)、赭曲霉毒素和T-2污染加重，污染超标的小麦和玉米不断增加。研究毒素超标粮食的安全利用，不仅可保护我国农民的种粮利益，同时防止流入口粮市场维护国家粮食食品质量安全已迫在眉睫。

黄曲霉毒素(AFT)是一类化学机构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等产生的次级代谢产物，主要存在于土壤，动植物，各种坚果，特别是花生和核桃中。在大豆，稻谷，玉米，通心粉，调味品，牛奶，奶制品，食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。黄曲霉毒素尤其是黄曲霉毒素B1具有较强的致癌作用，因此，各国对其在食品、饲料中的含量有严格的限制标准。

目前去除黄曲霉毒素的措施有很多种，主要包括物理方法、化学方法、生物学方法和酶解法。物理方法主要有(1)挑选霉粒，碾磨加工，反复搓洗；(2)吸附法：常用的吸附剂有沸石、活性白陶土、活性炭等，选择毒素吸附剂时，一方面应注意吸附能力必须具备实验室及动物实验双重资料方能证明有效，另一方面考虑吸附剂的高度吸附能力。(3)辐射处理：黄曲霉毒素在紫外光下照射不稳定，可用紫外光照射下去毒。化学方法有(1)碱处理法：黄曲霉毒素的内酯环可被碱破坏，形成香豆素钠盐；(2)有机溶剂萃取法：黄曲霉毒素易溶于有机溶剂，可用有机溶剂进行提取分离、去毒；(3)氧化去除法：漂白粉、氯气、双氧水、臭氧等氧化剂可以迅速将黄曲霉毒素氧化去除；(4)中草药去毒：1976年我国首次发现山苍子中的挥发油可以彻底除去食品中的黄曲霉毒素。挥发油中的某些成分与黄曲霉毒素发生反应，改变毒素的结构，从而达到去毒的目的。生物学方法是通过微生物的作用达到去除黄曲霉毒素的目的。酶解法是利用酶的专一性达到去除黄曲霉毒素的目的。

然而上述方法对黄曲霉毒素的去除效果均还有待提高，因此亟需开发出一种能够节能环保且高效降解黄曲霉毒素制剂和方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种降解效率较高的复合制剂、饲料或添加剂以及降解黄曲霉毒素的方法。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供一种复合制剂，该复合制剂包括酵母菌和酶，所述酵母菌为耐盐性假丝酵母菌(Candida versatilis)和/或鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)，所述酶为葡糖氧化酶。

第二方面，本发明提供了上述复合制剂在降解黄曲霉毒素中的应用。

第三方面，本发明提供了一种饲料或添加剂，该饲料或添加剂中含有上述复合制剂。

第四方面，本发明提供了一种降解黄曲霉毒素的方法，该方法包括：向待处理样品中加入复合制剂或添加剂，在中性盐溶液、25-37℃下进行接触反应1-96h，其中，所述复合制剂为上述复合制剂或上述添加剂。

本发明中，将酵母菌和酶进行组合使用，能够有效地降解黄曲霉毒素，尤其是能够降解致癌性较强的黄曲霉毒素B1。现有技术并没有关于菌剂和酶配合使用来降解黄曲霉毒素的报道，本发明的发明人在研究中发现，单独使用酶制剂或者菌制剂，其效果较联合使用菌和酶制剂差，究其原因可能是因为本发明所述的特定微生物的次级代谢产物能够使得酶的特异性提高。因此，本发明中创造性地将菌剂和酶配合用于制备复合制剂，该复合制剂能够简便地处理或者添加到饲料材料中，从而能够降低饲料中黄曲霉的含量，有利于饲养动物的健康。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种复合制剂，该复合制剂包括酵母菌和酶，所述酵母菌为耐盐性假丝酵母菌(Candida versatilis)和/或鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)，所述酶为葡糖氧化酶。

此处需要说明的是，本发明所述的复合制剂中含有的各微生物既可为各微生物的活菌体，也可为各微生物的死菌体，优选使用各微生物的活菌体。

根据本发明的复合制剂，其还可能不可避免地含有用于培养酵母菌的培养基成分。其中，酵母菌培养基可以为本领域各种常规的培养基，例如可以为YEB培养基，YEB培养基的组成包括：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，牛肉提取物5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄ 2mmol/L，PH值为7.0，若配制固体培养基则加入1.5重量％的琼脂。

根据本发明所述的复合制剂，酵母菌和酶的比例可以在较宽泛的范围内，优选地，以干重计，所述酵母菌和酶的重量比为1：0.1-10，更优选为1：0.2-5，进一步优选为1：0.5-0.8，从而能够提高降解黄曲霉毒素的效果。

根据本发明所述的复合制剂，可以将商购的耐盐性假丝酵母菌和鲁氏酵母菌分别进行常规培养，然后制成干粉，再将干粉混合。具体地，干粉混合物的制备方法具体可以包括：将耐盐性假丝酵母菌和鲁氏酵母菌分别在32-37℃、150-200rmp下，在液体YEB培养基中培养8-15h，使得耐盐性假丝酵母菌浓度为1-5×10⁹CFU/ml，鲁氏酵母菌的浓度为1-5×10⁹CFU/ml，然后离心得到上清液和沉淀物，将沉淀物分别冷冻干燥得到菌体干粉，然后将得到的菌体干粉混合，得到干粉混合物。其中，离心和冷冻干燥均为本领域常规方法，在此不再赘述。

本发明的耐盐性假丝酵母菌(Candida versatilis)可以为各种商购的耐盐性假丝酵母菌(Candida versatilis)，例如可以为保藏号为CGMCC No.3790的耐盐性假丝酵母菌。鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)可以为各种商购的鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)，例如可以为保藏号为CGMCC No.2.371的鲁氏酵母。

在本发明一种优选实施方式中，所述酵母菌为耐盐性假丝酵母菌(Candidaversatilis)和鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的混合物，所述耐盐性假丝酵母菌(Candida versatilis)和鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)重量比为1：10-20，从而能够提高降解黄曲霉毒素的效果。

根据本发明所述的复合制剂，葡糖氧化酶可以为商购的葡糖氧化酶，例如可以购自Sigma公司，牌号为G7141。

本发明的复合制剂的制备方法可以包括：将菌混合干粉与固态酶混合并在室温下进行密封保存。本发明中的“室温”一般指20-30℃。

根据本发明，所述饲料或添加剂中含有的复合制剂优选以干粉的形式存在。

在优选的实施方案中，饲料或添加剂以至少0.001g/kg、至少0.01g/kg、至少0.1g/kg、至少1g/kg、至少5g/kg、至少7.5g/kg、至少10.0g/kg、至少15.0g/kg、至少20.0g/kg、至少25.0g/kg的水平含有本发明所述复合制剂。

根据本发明，所述饲料和添加剂中还含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石粉和PVA以及它们的混合物。

对本领域技术人员显而易见的是，可将这些添加剂添加至被黄曲霉毒素污染的饲料材料中以减少动物消费的饲料中存在的毒素水平。

本发明的饲料材料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。

对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的饲料或添加剂可还包含其他组分如稳定剂和/或增量剂和/或酶类。

优选地，制备根据本发明的饲料或添加剂的方法包括混合步骤，该混合步骤包括混合所述复合制剂，任选与至少一种生理上可接受的载体一起混合。

对技术人员显而易见的是，作为预防步骤，可将添加剂添加至任何饲料材料中。

在本发明的一种优选实施方式中，当所述饲料或添加剂为养殖动物的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的至少一种。

在本发明的另一种优选实施方式中，当所述饲料或添加剂为青贮饲料或牛饲料时，所述饲料或添加剂还含有产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)中的至少一种。

在本发明的另一种优选实施方式中，当所述饲料或添加剂为肉鸡、生长育肥猪或水产养殖动物的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。

在本发明的另一种优选实施方式中，当所述饲料或添加剂为肉鸡、肉鸭、猪或虾的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporu)。

本发明的复合制剂易于储存和运输，且可以与已受黄曲霉毒素污染的材料混合来有效地脱除黄曲霉毒素，也可以在制备各种饲料时将其作为添加剂添加到饲料中，以预防黄曲霉毒素的产生，因此，本发明的复合制剂能够简便地处理或者添加到饲料材料中，从而降低了饲料中黄曲霉的含量，有利于饲养动物的健康。本发明中，复合制剂可以单独添加或者与上述生理学上可接受的载体一起添加到饲料中。

优选地，接触反应的时间为2-72h，更优选为2-48h，更优选为2-24h，进一步优选为2-10h。

根据本发明的方法，中性盐溶液的盐浓度可以为100-500mg/L，其中，所述盐可以为氯化钠和/或氯化钾。

根据本发明的降解黄曲霉毒素的方法，所述待处理样品可以为未受黄曲霉毒素污染的饲料，也可以为已受黄曲霉毒素污染的饲料。

在优选的实施方案中，饲料或添加剂以至少0.001g/kg、至少0.01g/kg、至少0.1g/kg、至少1g/kg、至少5g/kg、至少7.5g/kg、至少10.0g/kg、至少15.0g/kg、至少20.0g/kg、至少25.0g/kg的水平含有本发明所述复合制剂。在此均以干重计。

根据本发明的降解黄曲霉毒素的方法，本领域的技术人员知晓，接触反应在液体中才能进行，因此，可以使得接触反应在固含量为20-40重量％的条件下进行。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

YEB培养基：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，牛肉提取物5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄2mmol/L，PH为7.0，若配制固体培养基则加入1.5重量％的琼脂。

制备例

将商购的耐盐性假丝酵母菌(购自CGMCC，保藏号为：CGMCC No.3790，如专利申请CN102197861A所记载的)和鲁氏酵母菌(购自CGMCC，保藏号为：CGMCC No.2.371)分别以1％的接种量分别接种在液体YEB培养基中，于150rmp、37℃条件下培养，培养的时间使耐盐性假丝酵母菌浓度为10⁹CFU/ml，鲁氏酵母菌的浓度为10⁹CFU/ml，然后分别制成干粉，再混合。

葡糖氧化酶购自Sigma公司，牌号为G7141。

表1

实施例1-7

用于说明本发明提供的复合制剂对黄曲霉毒素的降解作用。

按照表1中各实施例的配比进行复合制剂的配制，然后分别向配制好的菌剂中加入0.5ppm黄曲霉毒素B1，然后加入水使得固含量为30重量％，添加毒素后于500mg/L NaCl浓度、37℃、pH值为7的条件下反应2h后，取处理好的样品按照国标GBT 30955-2014检测样品中的黄曲霉毒素的浓度，并按照如下公式(1)计算毒素脱除率。

毒素脱除率＝(样品中毒素初始浓度-处理后样品中毒素浓度)/样品中毒素初始浓度×100％式(1)。

实施例8

用于说明本发明提供的复合制剂对黄曲霉毒素的降解作用

按照实施例1的方法进行黄曲霉毒素的降解作用的测试，不同的是，黄曲霉毒素不采用黄曲霉毒素B1而采用黄曲霉毒素G1。毒素脱除率的计算方法与实施例1-7相同，其结果见表2。

对比例1

本对比例用于说明参比的复合制剂对黄曲霉毒素的降解作用。

按照实施例1的方法进行黄曲霉毒素降解作用的测试，不同的是，所使用的复合制剂仅由耐盐性假丝酵母菌和鲁氏酵母菌组成。结果见表2。

对比例2

按照实施例1的方法进行黄曲霉毒素降解作用的测试，不同的是，所使用的复合制剂由葡糖氧化酶组成。结果见表2。

对比例3

按照实施例1的方法进行黄曲霉毒素降解作用的测试，不同的是，将耐盐性假丝酵母菌(Candida versatilis)替换为商购的毕赤酵母(Pichia pastoris)酵母，结果见表2。

表2

编号	黄曲霉毒素脱除率(％)
		实施例1	90
实施例2	88
		实施例3	88
实施例4	82
		实施例5	83
实施例6	86
		实施例7	85
实施例8	80
		对比例1	60
对比例2	50
		对比例3	70

由以上表2的数据可以看出，将特定种类的酵母菌和酶进行组合使用，能够有效地降解黄曲霉毒素，尤其是能够降解致癌性较强的黄曲霉毒素B1。本发明中创造性地将菌和酶配合用于制备复合制剂，该复合制剂能够简便地处理或者添加到饲料材料中，从而能够降低饲料中黄曲霉的含量，有利于饲养动物的健康。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种复合制剂，其特征在于，该复合制剂包括酵母菌和酶，所述酵母菌为耐盐性假丝酵母菌（Candidaversatilis）和鲁氏酵母菌（Zygosaccharomycesrouxii）的混合物，所述酶为葡糖氧化酶；

其中，以干重计，所述酵母菌和酶的重量比为1：0.5-0.8；

所述耐盐性假丝酵母菌（Candida versatilis）和鲁氏酵母（Zygosaccharomycesrouxii）重量比为1：10-20。

2.权利要求1所述的复合制剂在降解黄曲霉毒素中的应用。

3.一种饲料，其特征在于，该饲料中含有权利要求1所述的复合制剂。

4.根据权利要求3所述的饲料，其中，相对于1kg的饲料，所述复合制剂的用量至少为0.001g。

5.根据权利要求3所述的饲料，其中，所述饲料为养殖动物的饲料时，所述饲料还含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的至少一种；

所述饲料为青贮饲料或牛饲料时，所述饲料还含有产丙酸丙酸杆菌（Propionibacter iumacidipropionici）、布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）中的至少一种。

6.根据权利要求3所述的饲料，其中，所述饲料为肉鸡、生长育肥猪或水产养殖动物的饲料时，所述饲料还含有凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）；

所述饲料为肉鸡、肉鸭、猪或虾的饲料时，所述饲料还含有侧孢短芽孢杆菌（Brevibacilluslaterosporu）。

7.一种添加剂，其特征在于，该添加剂中含有权利要求1所述的复合制剂。

8.根据权利要求7所述的添加剂，其中，相对于1kg的添加剂，所述复合制剂的用量至少为0.001g。

9.根据权利要求7所述的添加剂，其中，所述添加剂为养殖动物的添加剂时，所述添加剂还含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的添加剂，其中，所述添加剂为肉鸡、生长育肥猪或水产养殖动物的添加剂时，所述添加剂还含有凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）；

所述添加剂为肉鸡、肉鸭、猪或虾的添加剂时，所述添加剂还含有侧孢短芽孢杆菌（Brevibacilluslaterosporu）。

11.一种降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，该方法包括：向待处理样品中加入复合制剂或添加剂，在中性盐溶液、25-37℃下进行接触反应1-96h，其中，所述复合制剂为权利要求1所述的复合制剂，所述添加剂为权利要求7-10中任一项所述的添加剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，相对于1kg的待处理样品，所述复合制剂或添加剂的用量至少为0.001g。