CN105219677A - 一种降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂及其应用，属于微生态制剂领域。本发明的复合微生物制剂，由米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌组成，或由米曲霉培养液、枯草芽孢杆菌培养液和乳酸杆菌培养液组成；降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂中，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌数量比为1-3:1-3:1-3。本发明复合微生物制剂不仅代谢产生降解黄曲霉毒素酶以降解黄曲霉毒素，使黄曲霉毒素的降解率达到87-91%，并且用该复合微生物制剂发酵饲料，能提高饲料的品质；三种微生物能够分泌大量的纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，这些酶类能够将饲料中的大分子物质如：糖类、脂肪、蛋白质等大分子物质降解为小分子物质，有利于畜禽对饲料的消化与吸收。
Description
技术领域
本发明一种降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂及其应用，属于微生态制剂领域。
背景技术
饲料霉变是一个全球性问题。据联合国粮农组织评估，全世界由于霉菌污染饲料所造成的经济损失每年就达近千亿元。饲料霉变也是长期困扰我国饲料工业和畜牧业生产的严重问题，我国每年因饲料霉变导致的直接经济损失在100亿元以上。霉变饲料不但降低本身饲料的营养价值，而且降低畜禽的生长性能、免疫性能、繁殖性能，甚至在畜禽肉、蛋、奶中聚集，通过畜产品转移到人体内,从而危及人类健康。如黄曲霉毒素可导致肝癌，镰刀菌素可导致脑白质坏死，玉米赤霉烯酮可导致雌激素亢进等。去除霉菌毒素，保障食品安全，提高畜禽生产性能和繁殖性能称为全球普遍关注的重点。
山东省是我国畜牧大省。提高畜禽产品质量，保障人民的食品安全一直是全省乃至全国的重要工作。山东省十二五发展规划中大力发展现代农业、生物产业。最近几年山东省饲料工业获得大力发展。但山东省饲料企业、养殖业和全国其他企业一样仍面临饲料安全、畜禽产品质量等重大问题。研发去除霉菌毒素的发酵饲料，不但提升了饲料安全，提高了畜禽生产性能，保障了畜禽产品质量安全，而且将促进了山东省生物饲料工业的发展。本发明的实施一举多得，具有重要的意义。
目前霉菌毒素脱毒方法有物理脱毒法、化学脱毒法、吸附剂吸附法、生物脱毒法等。物理脱毒法与化学脱毒法无法满足饲料生产需求。目前吸附剂吸附法为主要应用技术，但吸附剂产品种类繁多，鱼目混珠，并且吸附剂在动物肠道吸附霉菌毒素的同时，也吸附其他营养元素，导致营养素的丢失。生物脱毒法为目前最有希望的方法，但该法目前还不成熟，还需开展大量试验研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种降解饲料中黄曲霉毒素的复合微生物制剂。
一种降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，含有米曲霉。
上述降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，由米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌组成，或由米曲霉培养液、枯草芽孢杆菌培养液和乳酸杆菌培养液组成；
降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂中，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌数量比为1-3:1-3:1-3。
上述降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌数量比：优选的，为2-3:1-3:1-3；更优选的，为3:1-3:1-3；更优选的，为3:1:2。
上述降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，优选的，
米曲霉培养液的制备方法：以1%-5%接种量，将米曲霉接种于米曲霉扩大培养基，在30-37℃条件下培养36h-48h；
枯草芽孢杆菌培养液的制备方法：以1%-5%接种量，将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基、在30-37℃条件下、培养36h-60h；
乳酸杆菌培养液的制备方法：以1%-5%接种量，将乳酸杆菌接种于MRS培养基，在30-37℃条件下培养至pH为3.5-4.5。
上述降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，优选的，
米曲霉扩大培养基组成为：豆粕20g，麸皮80g，水100mL，121℃、0.1Mpa下灭菌20min；
LB培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，加蒸馏水溶解至1000mL，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20mi；
MRS培养基组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g依次加入蒸馏水并将蒸馏水补充到1000mL，pH调至6.3，搅拌后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min。
本发明中，
米曲霉，拉丁文名称为Aspergillusoryzae、购自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏号为CICC40412；
枯草芽孢杆菌，拉丁文名称为Bacillussubtilis、购自中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC1.2163；
乳酸杆菌，拉丁文名称为Lactobacillus、购自中国农业微生物菌种保藏中心，保藏号为ACCC11026。
本发明在进行降解黄曲霉毒素的实验中发现，枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素（100ppb）的降解率最高为82%、乳酸杆菌对黄曲霉毒素（100ppb）的降解率最高为79%；对黄曲霉毒素的降解率有待提高。而将二者按照特定比例（活菌比）混合后，对黄曲霉毒素（100ppb）的降解率在81%左右。在研究微生物对黄曲霉毒素降解的过程中发现，米曲霉对黄曲霉毒素（100ppb）的降解率可以高达85%。而将三者按照特定比例（活菌比）混合后，对黄曲霉毒素（100ppb）的降解率为87%以上，最高可达91%。由此可见，三者按照特定比例配合使用能相互起到提高降解率的作用。
一种上述降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂的应用，用于降解黄曲霉毒素。
优选的，用于降解饲料中黄曲霉毒素。
一种降解黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：
以1%-5%接种量，将米曲霉接种于米曲霉扩大培养基，在30-37℃条件下培养36h-48h，得米曲霉培养液；
以1%-5%接种量，将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基、在30-37℃条件下、培养36h-60h，得枯草芽孢杆菌培养液；
以1%-5%接种量，将乳酸杆菌接种于MRS培养基，在30-37℃条件下培养至pH为3.5-4.5，得乳酸杆菌培养液；
将米曲霉培养液、枯草芽孢杆菌培养液和乳酸杆菌培养液按照1-3:1:2的活菌数量比例混合，然后加入含有黄曲霉毒素的物料，于30℃恒温200r/min振荡培养48h以上。
上述降解黄曲霉毒素的方法，优选的，所述物料为饲料。
本发明复合微生物制剂不仅代谢产生降解黄曲霉毒素酶以降解黄曲霉毒素，使黄曲霉毒素的降解率达到87-91%，并且用该复合微生物制剂发酵饲料，能提高饲料的品质；三种微生物能够分泌大量的纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，这些酶类能够将饲料中的大分子物质如：糖类、脂肪、蛋白质等大分子物质降解为小分子物质，有利于畜禽对饲料的消化与吸收。
具体实施方式
米曲霉（Aspergillusoryzae）、保藏号为CICC40412，购自中国工业微生物菌种保藏中心；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、保藏号为CGMCC1.2163，购自中国普通微生物菌种保藏中心；乳酸杆菌（Lactobacillus）、保藏号为ACCC11026，购自中国农业微生物菌种保藏中心；并由我公司实验室自行保存。
实施例1
米曲霉培养液的制备以1-5%的接种量接种于米曲霉扩大培养基中，于30℃恒温200r/min振荡培养，培养36-48h获得其培养液，并将其浓缩至活菌数为1×108个/mL。
枯草芽孢杆菌培养液的制备：以1-5%的接种量，在LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养，培养36-72h获得其培养液，并将其浓缩至活菌数为1×108个/mL。
乳酸杆菌培养液的制备：以1-5%的接种量，在MRS培养基中，37℃、200r/min恒温振荡培养待pH为3.5时获得其培养液，并将其浓缩至活菌数为1×108个/mL。
其中，
米曲霉扩大培养基组成为：豆粕20g，麸皮80g，水100mL，121℃、0.1Mpa下灭菌20min。
LB培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，加蒸馏水溶解至1000mL，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
MRS培养基组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g依次加入蒸馏水并将蒸馏水补充到1000mL，pH调至6.3，搅拌后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min。
蛋白胨，酵母粉，NaCl，牛肉浸取物、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙均为分析纯。
取上述培养的米曲霉培养液30mL、枯草芽孢杆菌培养液10mL、乳酸杆菌培养液20mL，混合均匀即组成了复合微生物制剂；复合微生物制剂中，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌比为3:1:2。
实施例2
取上述培养的米曲霉培养液20mL、枯草芽孢杆菌培养液10mL、乳酸杆菌培养液20mL，混合均匀即组成了复合微生物制剂；复合微生物制剂中，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌比为2:1:2。
实施例3
取上述培养的米曲霉培养液10mL、枯草芽孢杆菌培养液10mL、乳酸杆菌培养液10mL，混合均匀即组成了复合微生物制剂；复合微生物制剂中，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌比为1:1:1。
实施例4
取上述培养的米曲霉培养液10mL、枯草芽孢杆菌培养液10mL、乳酸杆菌培养液20mL，混合均匀即组成了复合微生物制剂；复合微生物制剂中，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌比为1:1:2。
降解黄曲霉毒素的实验
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1仪器设备
磁力搅拌器，旋涡混合仪，恒温培养箱，气浴振荡器，酸度计，电热恒温干燥箱，超净工作台，高压灭菌器，电子天平，10-100μL移液枪，烘箱，平皿，试管，250、300mL三角瓶，涂布器，酒精灯，接种环。
1.1.2实验试剂
蛋白胨，酵母粉，NaCl，牛肉浸取物、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙均为分析纯。黄曲霉毒素检测试剂盒，黄曲霉毒素购自上海生工生物工程有限公司。
1.2实验方法
1.2.1米曲霉对黄曲霉毒素的降解
取实施例1的米曲霉培养液，加入过滤除菌的黄曲霉毒素，使其在培养夜中的浓度为100ppb，于30℃恒温200r/min振荡培养，培养48h后测定黄曲霉毒素的含量并计算降解率W=(X1-X2)/X1为85%（多次平行实验的最高值）。对照实验：向无米曲霉的米曲霉扩大培养基加入过滤除菌的黄曲霉毒素，使其在培养基中的浓度为100ppb，于30℃恒温200r/min振荡培养，培养48h后测定黄曲霉毒素的含量并计算降解率。（注：W-黄曲霉毒素降解率；X1-初始黄曲霉毒素含量；X2-反应后黄曲霉毒素含量。）
1.2.2枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素的降解
取实施例1的枯草芽孢杆菌培养液，加入过滤除菌的黄曲霉毒，使其在培养基中的浓度为100ppb，37℃、200r/min振荡培养，培养48h后测定黄曲霉毒素的含量并计算降解率为82%（多次平行实验的最高值）。对照实验：向无枯草芽孢杆菌的LB培养基加入过滤除菌的黄曲霉毒素，使其在培养基中的浓度为100ppb，于30℃恒温200r/min振荡培养，培养48h后测定黄曲霉毒素的含量并计算降解率。
1.2.3乳酸杆菌对黄曲霉毒素的降解
取实施例1的乳酸杆菌培养液，加入过滤除菌的黄曲霉毒，使其在培养基中的浓度为100ppb，37℃、200r/min恒温振荡培养，培养48h后测定黄曲霉毒素的含量并计算降解率为79%（多次平行实验的最高值）。对照实验：向无乳酸杆菌的MRS培养基中加入过滤除菌的黄曲霉毒素，使其在培养基中的浓度为100ppb，于30℃恒温200r/min振荡培养，培养48h后测定黄曲霉毒素的含量并计算降解率。
1.2.4不同比例组成的复合微生物制剂对黄曲霉毒素的降解
取实施例1-3的复合微生物制剂，分别加入过滤除菌的黄曲霉毒，使其在复合微生物制剂中的浓度为100ppb，37℃、200r/min恒温振荡培养，培养48h后测定黄曲霉毒素的含量并计算降解率。
1.2.4米曲霉、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌按照不同活菌比混合后对黄曲霉毒素的降解率（实验方法同上）；如下表所示
| 米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌比 | 对黄曲霉毒素的降解率 |
| 0:1:1 | 81.0% |
| 0:1:2 | 81.6% |
| 0:1:3 | 80.9% |
| 0:2:1 | 81.2% |
| 0:3:1 | 80.7% |
| 1:1:1（实施例3） | 87.9% |
| 1:1:2（实施例1） | 88.7% |
| 1:1:3 | 88.2% |
| 1:2:1 | 88.0% |
| 1:2:2 | 87.7% |
| 1:2:3 | 87.5% |
| 1:3:1 | 87.3% |
| 1:3:2 | 87.1% |
| 1:3:3 | 87.1% |
| 2:1:1 | 88.8% |
| 2:1:2（实施例2） | 89.8% |
| 2:1:3 | 89.5% |
| 2:2:1 | 88.6% |
| 2:2:3 | 88.5% |
| 2:3:1 | 88.3% |
| 2:3:2 | 88.1% |
| 2:3:3 | 88.0% |
| 3:1:1 | 89.5% |
| 3:1:2（实施例4） | 91.0% |
| 3:1:3 | 90.8% |
| 3:2:1 | 90.7% |
| 3:2:2 | 90.5% |
| 3:2:3 | 90.5% |
| 3:3:1 | 90.3% |
| 3:3:2 | 89.8% |
Claims (10)
1.一种降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，其特征在于，含有米曲霉。
2.根据权利要求1所述的降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，其特征在于，由米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌组成，或由米曲霉培养液、枯草芽孢杆菌培养液和乳酸杆菌培养液组成；
降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂中，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌数量比为1-3:1-3:1-3。
3.根据权利要求2所述的降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，其特征在于，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌数量比为2-3:1-3:1-3。
4.根据权利要求2所述的降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，其特征在于，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌数量比为3:1-3:1-3。
5.根据权利要求2所述的降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，其特征在于，米曲霉、枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的活菌数量比为3:1:2。
6.根据权利要求2-5中任意一项所述的降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，其特征在于，
米曲霉培养液的制备方法：以1%-5%接种量，将米曲霉接种于米曲霉扩大培养基，在30-37℃条件下培养36h-48h；
枯草芽孢杆菌培养液的制备方法：以1%-5%接种量，将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基、在30-37℃条件下、培养36h-60h；
乳酸杆菌培养液的制备方法：以1%-5%接种量，将乳酸杆菌接种于MRS培养基，在30-37℃条件下培养至pH为3.5-4.5。
7.根据权利要求6所述的降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂，其特征在于，
米曲霉扩大培养基组成为：豆粕20g，麸皮80g，水100mL，121℃、0.1Mpa下灭菌20min；
LB培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，加蒸馏水溶解至1000mL，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20mi；
MRS培养基组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g依次加入蒸馏水并将蒸馏水补充到1000mL，pH调至6.3，搅拌后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min。
8.一种权利要求1-7中任意一项所述降解黄曲霉毒素的复合微生物制剂的应用，其特征在于，用于降解饲料中黄曲霉毒素。
9.一种降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以1%-5%接种量，将米曲霉接种于米曲霉扩大培养基，在30-37℃条件下培养36h-48h，得米曲霉培养液；
以1%-5%接种量，将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基、在30-37℃条件下、培养36h-60h，得枯草芽孢杆菌培养液；
以1%-5%接种量，将乳酸杆菌接种于MRS培养基，在30-37℃条件下培养至pH为3.5-4.5，得乳酸杆菌培养液；
将米曲霉培养液、枯草芽孢杆菌培养液和乳酸杆菌培养液按照1-3:1:2的活菌数量比例混合，然后加入含有黄曲霉毒素的物料，于30℃恒温200r/min振荡培养48h以上。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述物料为饲料。
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