CN107118885A - 一种利用耐乙醇片球菌生产含gaba发酵酒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法，属于发酵型功能饮品加工领域。首次分离得到既能耐受乙醇，又具有生产GABA能力的耐乙醇片球菌CICC 6282，专利菌保藏号为CGMCC NO.13929。本发明方法利用耐乙醇片球菌CICC 6282对酒精的耐受性，可作为发酵菌种，解决发酵过程中酒精累积与产GABA微生物无法细胞繁殖及累积GABA的矛盾。以芦笋等果蔬为原料，利用耐乙醇片球菌CICC 6282，通过分步控制发酵条件和外源添加谷氨酸或谷氨酸钠，发酵生产含γ‑氨基丁酸发酵酒。该方法具有简化发酵工艺、降低生产成本、操作简便等优点。

Description

一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法
技术领域
本发明涉及一种利用耐乙醇片球菌（Pediococcus ethanolidurans）生产含GABA发酵酒的方法，属于发酵型功能饮品加工领域。
背景技术
芦笋(Asparagus officinalis Linn.)又名石刁柏，享有“蔬菜之王”美称，不仅含有多种维生素和氨基酸及硒、钼、锰等微量元素，而且富含有多种活性成分，如芦笋黄酮、皂苷、多糖类物质，具有降血脂、降血糖和降血压、增强免疫力、抗氧化、抗癌等药理作用。
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA），又称4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸，是一种普遍存在的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质。它由谷氨酸脱羧酶（GAD）催化L-谷氨酸发生不可逆的α-脱羧反应而生成。它具有多种生理功能，如调节血压、治疗癫痫、促进细胞新陈代谢、保护肝脏、促进生长激素分泌、预防肥胖、促进酒精代谢等功效。
目前GABA主要生产方法包括化学合成和生物合成。化学合成过程中所用化学溶剂具有毒性和腐蚀性，产品中副产物多，缺乏安全性；相反，生物合成生产过程条件温和、环境污染较低，且产品中副产物少、安全性高。因此利用微生物生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。2009年我国卫生部批准希氏乳杆菌发酵生产的GABA为新资源食品，可用于普通食品及保健食品的生产。
在我国的专利及文献中有利用微生物发酵生产GABA的方法，如乳酸乳球菌(专利号ZL 201310486474.7)、短乳杆菌( 专利号ZL 200510049188.X)、植物乳杆菌（专利号ZL201010167058.7）、嗜热链球菌（专利号ZL 201410480097.0）、发酵乳杆菌(专利号ZL201210136696.1）、屎肠球菌（专利号ZL 200910114018.3）、红色红曲霉(专利号ZL201010167058.7)、酿酒酵母（专利号ZL 201010194431.8）等。
片球菌为有益的乳酸菌，在参与肉类、蔬菜及白酒的发酵过程中，往往会产生一些发酵食品的风味物质。刘莉萌等在文献（酿酒科技,2007, 2:22-28）中报道：从不同白酒酒醅发酵窖池中分离出20株片球菌，包括耐乙醇片球菌、戊糖片球菌及窖池片球菌等，并指出窖池中片球菌种类及数量是影响白酒风味的重要因素。陈功等在文献（食品与发酵工业,2013,39 (3):1-4）中研究表明耐乙醇片球菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌等乳酸菌是四川泡菜发酵的优势菌群，是影响四川泡菜风味物质及功能性的重要因素。可见，耐乙醇片球菌属于有益的乳酸菌，可用于普通食品的生产与加工。
通过上述专利文献和非专利文献的检索，但目前尚未见有耐乙醇片球菌产γ- 氨基丁酸及其应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于利用耐乙醇片球菌为菌种，分步控制发酵条件以解决发酵过程中酒精累积与产GABA微生物无法细胞繁殖及累积GABA的矛盾。耐乙醇片球菌既能耐受一定浓度酒精而生长繁殖，又可以利用谷氨酸脱羧酶生产GABA。本发明通过分步控制发酵条件，既可以深层发酵产生酒精，又能生产γ- 氨基丁酸，达到生产含γ- 氨基丁酸发酵酒的目的，简化了发酵工艺、提高了设备利用率和降低了生产成本，同时提升了发酵酒饮品的保健功能，属于发酵型功能饮品加工领域。
本发明提供一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 以新鲜芦笋、山楂等果蔬为原料，洗净、加水破碎，转移至发酵罐中匀浆，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解，获得酶解液后灭菌；
(2) 接种酿酒酵母CICC1001进行第一阶段发酵，当乙醇浓度达到4%以上时，获得第一发酵液；
(3) 向第一发酵液接入耐乙醇片球菌CGMCC NO.13929，进行第二阶段初期发酵，然后加入谷氨酸或谷氨酸钠，进行第二阶段后期发酵，当发酵液中GABA含量高于200mg/L时，获得第二发酵液；
(4) 将所述第二发酵液混匀后，离心、均质及过滤除菌后，制得含GABA发酵酒。
步骤（2）中所述的酿酒酵母CICC1001，静置厌氧发酵，控制发酵温度为28-40℃，发酵时间为36-96 h，乙醇浓度为4%-12%；
步骤（3）中所述的耐乙醇片球菌CICC 6282，菌种保藏号CGMCC NO.13929，保藏日期为2017年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；初期发酵时间为16-36h，控制谷氨酸或谷氨酸钠（MSG）终浓度为0.5-2 g/L，发酵温度为28-40℃，后期发酵时间为60-120h，摇床转速为80-150 r/min，GABA浓度为200-600 mg/L。
本发明的优点：
首次发现耐乙醇片球菌具有很高的谷氨酸脱羧酶活性，可深层发酵生产γ- 氨基丁酸。本发明方法利用耐乙醇片球菌对酒精的耐受性，可作为发酵菌种，通过分步控制发酵条件，解决发酵过程中酒精累积与产GABA微生物无法细胞繁殖及累积GABA的矛盾，最终达到生产含γ- 氨基丁酸发酵酒的目的，简化了发酵工艺，提高了设备利用率，大大降低了生产成本。
附图说明
图1为本发明中薄层层析法检测耐乙醇片球菌产GABA。
图2为本发明中HPLC法检测耐乙醇片球菌产GABA。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来进一步对本发明作详细描述，以使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚。以下实施例仅仅用于举例说明，并不对本发明构成任何限制。
实施例1
本发明产GABA耐乙醇片球菌的分离方法，采用梯度稀释混菌法，从新疆巴音郭楞蒙古自治州博湖县发酵辣椒酱中分离。包括以下步骤：取25 g的辣椒酱加入到225 mL无菌生理盐水中，用涡旋振荡器摇匀，制得10-1的稀释液，梯度稀释以制得10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。分别取100 μL稀释液涂布于添加了2% CaCO3的MRS培养基，置于37 ℃下培养48 h。挑取有溶钙圈的单菌落进行平板划线纯化，并将分离的菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 6282。将菌株CICC 6282接种于MRS固体培养基，置于37 ℃培养48h，菌落呈乳白色，圆形扁平，不透明，边缘整齐；显微镜下观察菌体呈球状，大小为（0.3-0.5）μm，成对或呈四联球状排列，革兰氏染色阳性。通过接触酶实验和API 50CHL试剂条对菌株CICC 6282的酶活性、碳源利用等生理生化特征检测，结果显示菌株CICC 6282接触酶反应阴性，能够利用半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、龙胆二糖为碳源生长，不能利用其他的碳源。
菌株CICC 6282的16S rDNA PCR扩增产物大小约为1.4 kb，在GenBank上的登录号为KY681774。将该序列通过EzBioCloud数据库比对，结果显示：同CICC 6282 的16S rDNA序列相似性高于97%的序列全部是片球菌属的模式菌株序列，其中菌株CICC 6282同耐乙醇片球菌Pediococcus ethanolidurans Z-9T的16S rDNA序列相似性最高，为99.86%。以Lactobacillus ozensis Mizu2-1T序列为外群，构建CICC 6282与相关近缘模式菌株的系统发育树，结果显示，通过16S rDNA序列系统发育分析可将菌株CICC 6282 鉴定为片球菌属（Pediococcussp.）。菌株CICC 6282的pheS基因PCR扩增产物大小约为400 bp，在GenBank上的登录号为KY681775。通过MEGA软件进行比对，结果显示：CICC 6282 的pheS基因序列与耐乙醇片球菌Pediococcus ethanolidurans模式菌株相似性最高，为100%，而与片球菌属其余菌株pheS基因序列的相似性均低于90%。以Lactobacillus shenzhenensis LY-73T序列为外群，构建CICC 6282与相关近缘模式菌株的系统发育树，pheS基因序列系统发育分析显示，菌株CICC 6282 鉴定为耐乙醇片球菌Pediococcus ethanolidurans。通过形态学观察并结合16S rDNA 和pheS基因序列系统发育分析，结合微生物代谢类型差异，菌株CICC6282 被鉴定为耐乙醇片球菌Pediococcus ethanolidurans。
本发明中耐乙醇片球菌产GABA 定性检测，采用薄层层析法，具体步骤包括：取出发酵液，震荡均匀，8000r/min离心10min，弃沉淀，取上清。层析板为商品化10×20cm微晶纤维素玻璃板。以1 mg/mL的GABA标准液、1 mg/mL的L-Glu标准液为对照，每组点样量为0.5 μL，点样间距为1cm，点样的同时迅速用吹风机将点样处吹干，以防样品溶液扩散，影响层析效果。以正丁醇：冰醋酸：水（4：3：1，V/V）作展层剂，以0.4%茚三酮水饱和正丁醇试剂作显色剂，置于80℃烘箱内，显色10 min。观察薄层层析结果，耐乙醇片球菌CICC6282发酵液具有与GABA 标品相同层析距离的条带，如图1所示。
本发明中耐乙醇片球菌产GABA 定量检测，采用高效液相法，具体步骤如下：取100μL发酵液上清或GABA标准液，加入800μL OPA衍生液，震荡5s，过0.45 μm滤膜。色谱分析条件：色谱柱：C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）。流动相：流动相A为纯乙腈；流动相B为25mmol/L乙酸钠，用5%乙酸调pH至5.90。设置液相色谱流动相流速为1 mL/min，保持柱温40℃，进样量5 μL，检测波长334 nm。耐乙醇片球菌CICC 6282产GABA 定量检测结果如图2所示。
上述发明中的耐乙醇片球菌发酵菌，保藏号CGMCC NO.13929，保藏日期为2017年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
首先用YPD培养基制备酿酒酵母种子液，用MRS培养基制备耐乙醇片球菌种子液。其次，选取新鲜芦笋、山楂表面清洗、消毒，按3:1（质量比）比例加水破碎，经40目震荡筛过滤得芦笋浆，转移至发酵罐中匀浆，向其中加入果胶酶和纤维素酶进行酶解2 h，获得酶解液。然后采用超高温瞬时灭菌，条件为125℃15s。冷却至室温后无菌条件下，按5 %（v/v）接种酿酒酵母CICC1001，30℃静置厌氧发酵，当乙醇浓度达到4 %以上时，获得第一发酵液。采用超高温瞬时灭菌，条件为125℃15s。冷却至室温后无菌条件下，接入耐乙醇片球菌CGMCCNO.13929，发酵16 h后，加入谷氨酸钠（MSG）终浓度为0.5 g/L，进行第二阶段发酵，发酵温度为37℃，搅拌速度为80 r/min，当发酵液中GABA含量达到200 mg/L时，获得第二发酵液，然后离心、均质及过滤除菌后，得到发明品—含GABA芦笋发酵酒产品1。
实施例2
首先，按质量比选取2份芦笋和1份山楂，清洗、消毒、去籽，加入1份水破碎，转移至发酵罐中匀浆，向其中加入果胶酶和纤维素酶进行酶解4 h，获得酶解液，然后采用超高温瞬时灭菌，条件为125℃15s。其次，冷却至室温后无菌条件下，按10 %（v/v）接种酿酒酵母CICC1001，30℃静置厌氧发酵，当乙醇浓度达到10 %时，获得第一发酵液。采用超高温瞬时灭菌，条件为125℃15s，冷却至室温后无菌条件下，接入耐乙醇片球菌CGMCC NO.13929，发酵16 h后，加入谷氨酸钠（MSG）终浓度为1.0 g/L，进行第二阶段发酵，发酵温度为37℃，搅拌速度为100 r/min，当发酵液中GABA含量达到600mg/L时，获得第二发酵液，然后离心、均质及过滤除菌后，得到发明品—含GABA芦笋发酵酒产品2。
以上结合具体实施方式对本发明进行了说明，这些具体实施方式仅仅是示例性的，不能以此限定本发明的保护范围，本领域技术人员在不脱离本发明实质的前提下可以进行各种修改、变化或替换。因此，依照本发明所作的各种等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (4)

1.一种利用耐乙醇片球菌生产含GABA发酵酒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以新鲜芦笋、山楂等果蔬为原料，洗净、加水破碎，转移至发酵罐中匀浆，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解，获得酶解液后灭菌；
（2）接种酿酒酵母CICC 1001进行第一阶段发酵，当乙醇浓度达到4%以上时，获得第一发酵液；
（3）向第一发酵液接入耐乙醇片球菌CGMCC NO.13929，进行第二阶段初期发酵，然后加入谷氨酸或谷氨酸钠，进行第二阶段后期发酵，当发酵液中GABA含量高于200mg/L时，获得第二发酵液；
（4）将所述第二发酵液混匀后，离心、均质及过滤除菌后，制得含GABA发酵酒。
2.根据权利要求1所述的含GABA发酵酒的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的酿酒酵母CICC 1001，静置厌氧发酵，控制发酵温度为28-40℃，发酵时间为36-96 h，乙醇浓度为4%-12%。
3.根据权利要求1所述的含GABA发酵酒的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的耐乙醇片球菌CICC 6282，菌种保藏号CGMCC NO.13929，第二阶段初期发酵时间为16-36h，控制谷氨酸或谷氨酸钠终浓度为0.5-2 g/L，发酵温度为28-40℃，后期发酵时间为60-120h，搅拌速度为80-150 r/min，GABA浓度为200-800 mg/L。
4.一种含GABA发酵酒，其特征在于，按照权利要求1 至3所述的制备方法制得。
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