CN103773819A - 一种生产乳酸同时耦合制备gaba的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产乳酸同时耦合制备GABA的方法，包括：将米根霉接入发酵培养基中进行发酵，当发酵液的pH小于4.8时，向发酵液中加入谷氨酸脱羧酶、磷酸吡哆醛和L-谷氨酸钠，之后持续向发酵液中加入L-谷氨酸钠，利用谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成GABA的活力，消耗环境中的H+，使发酵液的pH维持在4.8～6.0，达到解除酸抑制对乳酸发酵的抑制、实现乳酸与GABA的同时生产的目的。本发明为乳酸发酵提供了一种新的解除底物抑制的方法，并且在发酵过程中耦合产生功能化合物γ-氨基丁酸，不仅增加了乳酸的产量，而且提高了过程的经济性。
Description
技术领域
本发明属于生物化学工程领域，尤其涉及一种生产乳酸同时耦合制备GABA的方法。
背景技术
乳酸是一种重要的工业原料，长期以来被广泛应用于食品、医药、化妆品、农业和化工领域。此外，乳酸可以用来制备聚乳酸等工程材料。而聚乳酸可被用来制造完全生物降解性塑料，生产绿色包装材料和农用薄膜，以消除“白色污染”所带来的环境危机。另外，由于聚乳酸具有良好的生物相容性，还广泛应用于医药工业领域，包括医用缝合线、药物缓释材料、骨固定修复材料及其它组织工程用材料等。随着市场对聚乳酸需求量的不断增大，也进一步促进了市场对乳酸需求量的不断增大。因此，开发高效的乳酸生产技术长期以来一直受到广泛的关注。
乳酸的生产主要有化学合成法和发酵法，与化学合成法相比，由于生物发酵法的原材料丰富、操作温度低、能耗低以及产物的光学纯度高的特点，而被广泛采用。目前，全世界的乳酸主要都是通过发酵法生产（Abdel-Rahman et al.,2011）。但是，对于乳酸发酵来说，由于乳酸引起的产物抑制已成为有效发酵的主要瓶颈问题。在乳酸发酵过程中，不断生成的乳酸使发酵液pH逐渐降低，较低的pH值对菌体正常生长和产酸过程会产生强烈的抑制，因此必须通过控制发酵过程中的pH来解除产物抑制。
目前，常用的pH控制方法是添加碱性物质如各种碳酸盐、氢氧化物及氨水等，其中CaCO3是最常用的中和剂。然而，在使用CaCO3作为中和乳酸发酵中产生的乳酸时，发酵罐中大量的CaCO3容易使取料口堵塞；在发酵中后期，高浓度的乳酸钙使发酵液变得黏稠，生成大量泡沫，造成逃液；或发生固化现象，使发酵难以继续。此外，使用CaCO3作为中和剂存在提取工艺流程长，消耗工业原料多以及回收率低，同时产生大量硫酸钙废渣和废水，环保压力大，增加处理成本，能耗高等问题。
因此，开发新的解除乳酸发酵过程中产物抑制的方法来代替传统的CaCO3中和法具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明提供了一种生产乳酸同时耦合制备GABA的方法，为乳酸发酵提供了一种新的解除底物抑制的方法，并且在发酵过程中还可以耦合制备功能化合物γ-氨基丁酸。
一种生产乳酸同时耦合制备GABA的方法，其特征在于，包括：
将米根霉接入发酵培养基中进行发酵，当发酵液的pH小于4.8时，向发酵液中加入谷氨酸脱羧酶、磷酸吡哆醛和L-谷氨酸钠，之后持续向发酵液中加入L-谷氨酸钠维持发酵液的pH为4.8～6.0。
谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD；EC4.1.1.15）可以在酸性条件下，通过消耗H+，催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）。GABA具有降血压、利尿、抗惊厥、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、促进激素分泌和保肝利肾等多种生理功能。此外，GABA可作为前体物质来合成生物可降解材料聚酰胺-4和环境有好的塑料溶剂N-吡咯烷酮等化工产品。本发明将乳酸发酵与谷氨酸脱羧酶的脱羧反应进行耦合，利用谷氨酸脱羧酶的脱羧反应来消耗掉乳酸发酵过程中产生的H+，来解除乳酸发酵过程中的产物抑制，同时实现乳酸与GABA的同时生产。发酵中发生的主要反应为：
另外，本发明通过谷氨酸脱羧酶的脱羧反应维持发酵液的pH为4.8～6.0，在该pH条件下，有利于发酵反应的进行，产生大量的乳酸，同时该pH条件还保证了脱羧反应的顺利进行，以解除发酵过程中的产物抑制。
乳酸发酵时，本发明采用米根霉为发酵微生物，米根霉的耐酸性较强，在乳酸发酵过程中，具体的，可以为米根霉As3.819。
磷酸吡哆醛作为谷氨酸脱羧酶的辅酶，通过在发酵液中添加磷酸吡哆醛，可避免在长时间、多批次的发酵过程中谷氨酸脱羧酶的失活，促进谷氨酸脱羧，增进γ-氨基丁酸的生成，所述磷酸吡哆醛的终浓度为0.01～1mM，优选为0.1mM。
为了提高谷氨酸脱羧酶在体系中的稳定性，简化酶的后续分离，所述的谷氨酸脱羧酶加入前经固定化处理。固定化处理的方法具体可采用常规的手段。
所述固定化的谷氨酸脱羧酶的来源形式可以为纯化后的谷氨酸脱羧酶、含谷氨酸脱羧酶的粗酶液或者表达有谷氨酸脱羧酶的细胞。为避免酶提取与纯化步骤成本，提高酶的利用率与稳定性，优选的，以重组表达有谷氨酸脱羧酶的菌体细胞的方式进行添加。
所述菌体细胞优选为重组谷氨酸脱羧酶工程菌，该重组谷氨酸脱羧酶工程菌为转入谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌。通过基因工程技术（一般为先将谷氨酸脱羧酶基因连入表达载体，构建得到重组表达载体，再将重组表达载体转入大肠杆菌中；其中，表达载体可以为pET-28a、pET-29、pET-30、pET-34、pRSET等。）将谷氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌中进行表达，可以有效提高菌体的催化活性。
所述的大肠杆菌具体可以为（E.coli）BL21、大肠杆菌（E.coli）BLR、大肠杆菌（E.coli）Origami、大肠杆菌（E.coli）NovaBlue或大肠杆菌（E.coli）Rosetta等。
优选的，所述的谷氨酸脱羧酶基因源自短乳杆菌（Lactobacillus brevis）CGMCC1306。该菌种的谷氨酸脱羧酶基因（gadB）的转录产物具有较好的热稳定性。
尽管通过基因工程技术能够提高谷氨酸脱羧酶的催化活力，但是菌体细胞壁及细胞膜的屏障作用，限制了底物及产物在细胞内外的传递，使菌体胞内的谷氨酸脱羧酶活力难以充分发挥，因此，为改善细胞壁和细胞膜对底物的传质阻力，可对表达有谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌进行透性化，所述透性化的方法为：将表达有谷氨酸脱羧酶的重组谷氨酸脱羧酶工程菌菌体溶于缓冲液中，65～75℃处理25～35min即可（优选为70℃处理30min）。透性化的谷氨酸脱羧酶工程菌可以采用已知的固定化完整细胞的方法进行固定化。
固定化的谷氨酸脱羧酶添加量为每升发酵液加入相当总谷氨酸脱羧酶活力为1500U～5000U的固定化酶。优选的，以每升发酵液加入相当总谷氨酸脱羧酶活力为3000U的固定化酶。
为达到合适的乳酸发酵条件，所述发酵的温度为25～37℃，转速为160～220r/min；优选的200r/min，所述发酵的温度为32℃，转速为200r/min。
所述发酵培养基的配方为：葡萄糖，120g/L；（NH4）2SO4，2g/L；KH2PO4，0.14g/L；NaH2PO4，0.16g/L；MgSO4·7H2O，0.25g/L；ZnSO4·7H2O，0.11g/L；CaCO3，5g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种乳酸发酵过程中解除底物抑制的新方法，该方法可以避免了使用中和剂CaCO3解除产物抑制时给乳酸发酵工艺带来的不利影响（如逃液、堵塞取料口等）。
另外，本发明在解除乳酸发酵产物抑制时，实现了功能化合物GABA的同时生产，降低二者的生产成本，也克服了因CaCO3添加所产生的大量硫酸钙废渣和废水等，更加环保。
本发明的方法得到的产物含量高，发酵液中乳酸的含量可76～79g/L，同时GABA的含量可达37～40g/L。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。
菌种：米根霉As3.819；菌种保藏斜面培养基：PDA培养基。
工程菌E.coli BL21（DE3）/pET28a-gadB：谷氨酸脱羧酶基因（gadB）源自短乳杆菌（Lactobacillus brevis）CGMCC1306。
种子培养基：葡萄糖，120g/L；（NH4）2SO4，4g/L；KH2PO4，0.15g/L；ZnSO4·7H2O，0.22g/L；MgSO4·7H2O，0.45g/L。
发酵培养基：葡萄糖，120g/L；（NH4）2SO4，2g/L；KH2PO4，0.14g/L；NaH2PO4，0.16g/L；MgSO4·7H2O，0.25g/L；ZnSO4·7H2O，0.11g/L；CaCO3，5g/L。
LB培养基：酵母粉，5g/L；胰蛋白胨，10g/L；NaCl，10g/L。
一个酶活力单位定义为在37℃条件下，1min生成1μmol GABA（1U=1μmol GABA in1min at37℃）所需的酶量。
GAD的比活力定义为每毫克干重细胞所具备的酶活力单位（U·mg-1cells，dry weight）。
实施例1
固定化谷氨酸脱羧酶工程菌的制备：
（1）从活化的LB固体培养基上挑取谷氨酸脱羧酶的工程菌（E.coliBL21（DE3）/pET28a-gadB，（可参见“Cloning,sequencing and expressionof a glutamate decarboxylase gene from the GABA-producing strainLactobacillus brevis CGMCC1306[J].ANNALS OF MICROBIOLOGY.2012,62(2):689-698”）单克隆菌体接入含卡那霉素（50μg·mL-1）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，获得种子液。
（2）将种子液按体积分数1%接种量接种到含有卡那霉素（50μg·mL-1）的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD6000.6时加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，30℃，150r/min诱导培养6h。
（3）将表达有谷氨酸脱羧酶的菌体在70℃温度下处理30min后，离心收集菌体，得到透性化的谷氨酸脱羧酶（GAD）工程菌，此时透性化GAD工程菌的催化活力为8.35U/mg。
（4）将透性化的GAD工程菌加入到15g·L-1的海藻酸钠溶液中混合均匀，使菌体密度为9mg·mL-1（细胞干重），然后再将混合液逐滴滴入到20g·L-1的氯化钙溶液中，4℃过夜。用无菌水洗涤固定化菌体3次，置于4℃备用。
实施例2
（1）接种2%（v/v）的米根霉As3.819孢子悬液（5×106个/mL）于种子培养基中，30℃，220r/min摇床上振荡培养24小时，获得种子液。
（2）以4%的接种量将种子液接种至50mL发酵培养基中，在32℃，200r/min的条件下培养，当发酵液pH低于4.8时，向发酵液中加入固定化的谷氨酸脱羧酶工程菌（菌体细胞干重含量为23.2mg，谷氨酸脱羧酶总活力为150U）、终浓度为0.1mM的磷酸吡哆醛，同时不断加入L-谷氨酸钠，使发酵液全程pH值维持在4.8-5.0之间，继续培养60小时。同时以不加固定化的谷氨酸脱羧酶的发酵液为空白对照。
经测定耦合过程发酵液中乳酸的含量为79g/L，GABA的含量为40g/L。而空白对照用品中的乳酸产量39.49g/L,而GABA检测不到。
实施例3
（1）接种2%（v/v）的米根霉孢子悬液（5×106个/mL）于种子培养基中，30℃，220r/min摇床上振荡培养24小时，获得种子液。
（2）以4%的接种量将种子液接种至50mL发酵培养基中，在32℃，200r/min的条件下培养，当发酵液pH低于4.8时，向发酵液中加入固定化的谷氨酸脱羧酶菌体（菌体细胞干重含量为23.2mg，谷氨酸脱羧酶总活力为150U），终浓度为0.1mM的磷酸吡哆醛，同时不断加入L-谷氨酸钠，使发酵液全程pH值维持在5.2-5.6之间，继续培养60小时。同时以不加固定化的谷氨酸脱羧酶的发酵液为空白对照。
经测定发酵液中乳酸的含量为76g/L，GABA的含量为37g/L。而空白对照用品中的乳酸产量36g/L，而GABA检测不到。
实施例4
（1）接种2%（v/v）的米根霉孢子悬液（5×107个/mL）于种子培养基中，30℃，220r/min摇床上振荡培养24小时，获得种子液。
（2）以5%的接种量将种子液接种至50mL发酵培养基中，在32℃，220r/min的条件下培养，当发酵液pH低于5.0时，向发酵液中加入固定化的谷氨酸脱羧酶工程菌（菌体细胞干重含量为23.2mg，谷氨酸脱羧酶总活力为150U）、终浓度为0.1mM的磷酸吡哆醛，同时不断加入L-谷氨酸钠，使发酵液全程pH值维持在5.0-5.2之间，继续培养60小时。同时以不加固定化的谷氨酸脱羧酶的发酵液为空白对照。
经测定耦合过程发酵液中乳酸的含量为77g/L，GABA的含量为41g/L。而空白对照用品中的乳酸产量38g/L，而GABA检测不到。
Claims (8)
1.一种生产乳酸同时耦合制备GABA的方法，其特征在于，包括：
将米根霉接入发酵培养基中进行发酵，当发酵液的pH小于4.8时，向发酵液中加入谷氨酸脱羧酶、磷酸吡哆醛和L-谷氨酸钠，之后持续向发酵液中加入L-谷氨酸钠维持发酵液的pH为4.8～6.0。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸吡哆醛的终浓度为0.01～1mM。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的谷氨酸脱羧酶加入前经固定化处理。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的来源形式为纯化后的谷氨酸脱羧酶、含谷氨酸脱羧酶的粗酶液或者表达有谷氨酸脱羧酶的菌体细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌体细胞为谷氨酸脱羧酶工程菌，该谷氨酸脱羧酶工程菌为转入谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的谷氨酸脱羧酶基因源自短乳杆菌（Lactobacillus brevis）CGMCC1306。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，固定化的谷氨酸脱羧酶的添加量为：每升发酵液加入相当谷氨酸脱羧酶总活力为1500U～5000U的固定化酶。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为25～37℃。
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