CN103451244B

CN103451244B - 一种屎肠球菌在制备l-乳酸中的应用

Info

Publication number: CN103451244B
Application number: CN201310383675.4A
Authority: CN
Inventors: 徐慧; 刘建军; 李文婧; 孙文涛
Original assignee: SHANDONG FOOD FERMENTATIVE INDUSTRY RESEARCH AND DESIGN INST
Current assignee: SHANDONG FOOD FERMENTATIVE INDUSTRY RESEARCH AND DESIGN INST
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: CN103451244A

Abstract

本发明公开了一株屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用。其中涉及的菌株已于2013年3月5日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC N0.7274。应用方法包括（1）菌种选择，（2）固体培养基培养活化，（3）种子培养，（4）发酵培养，（5）检测发酵产物等步骤；所述方法具有操作简单，成本低，目的产物L-乳酸产量高、纯度高（98.6%以上）、乙醇、富马酸和苹果酸等常见副产物少，应用前景广阔。

Description

一种屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用

（一）技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用。

（二）背景技术

乳酸（lactic acid）又名a-羟基丙酸、2-羟基丙酸，其分子内含有一个不对称碳原子，因此乳酸分子具有旋光异构体。L-乳酸为其左旋型，自然存在于动物、植物、微生物以及人体内，是人与哺乳动物可分解利用的唯一一种类型的乳酸。

L-乳酸对人体无毒副作用，易被人体吸收，并可直接参与体内代谢，因此L-乳酸及其衍生物作为高安全性的香料、保鲜剂、防腐剂、酸味剂、杀菌剂、稳定剂、增稠剂、固化剂、营养补充剂、保湿剂、乳化剂、增塑剂以及防冻剂等广泛应用于食品制造行业，另外在美国已经禁止使用磷酸调节pH，而全部改用乳酸。L-乳酸是一种重要的化工原料和医药中间体，L-乳酸用于合成无毒、无刺激、可完全降解的高分子材料聚L-乳酸，聚L-乳酸可被自然界中多种微生物完全降解为二氧化碳和水，对环境友好，是聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯等多种不可降解塑料的理想替代品。在皮革工业中L-乳酸可作为优良的除灰剂。在化妆品中使用L-乳酸可显著提高产品质量。在医药行业中，L-乳酸及乳酸盐可直接制备成药类或消毒剂；并且由其聚合物聚L-乳酸制成的手术缝合线、生物植片等都已在临床上被广泛应用。

乳酸的生产方法包括化学合成法、酶法以及微生物发酵法。化学合成法包括多种途径，由于经济及技术上的限制，具有现实意义的主要是乳腈法。乳腈法是乙醛与氢腈经碱性催化剂作用生成乳腈，粗乳腈通过蒸馏回收纯化并用浓盐酸或浓硫酸水解为乳酸，粗乳酸再用甲醇酯化，精馏后再水解为乳酸，生产过程中存在副产物氨基酸，该法也是目前工业上采用的化学法制取乳酸的方法。化学法生产的乳酸光学纯度较低，同时由于其原料和催化剂毒性较大，使得化学法制取的乳酸应用于食品及医药领域时对人体存在较大的安全风险，这使得化学法生产乳酸的应用及推广受到限制。酶法包括2-氯丙酸酶转化法和丙酮酸酶转化法两种，前者是酶法生产L-乳酸的主要方法，该法利用从恶臭假单胞菌（Pse Putide）中提取纯化的L-2-卤代酸脱卤酶催化DL-2-氯丙酸制取L-乳酸。酶催化法具有特异性，没有副产物，光学纯度高，但获得大量特异性的酶比较困难。

产品安全性以及经济技术上的缺陷，使得化学与酶法制取乳酸的工业化及生产规模的扩大受到限制，而微生物发酵法以其原料来源广泛、成本低廉、产品光学纯度高、食用安全等特点，成为目前L-乳酸最主要的生产方法，在世界范围内被广泛采用。微生物发酵法制备L-乳酸是以糖质为原料，利用微生物发酵生产L-乳酸的方法，自然界中具有多种乳酸产生菌，但产酸能力强，在工业上广泛应用的主要有根霉和细菌。同霉菌相比，细菌发酵具有转化率高（细菌L-乳酸理论转化率为100%，霉菌只有75%）、副产物少、产品分离提纯简单、生产过程能耗低等优点，因此细菌发酵成为发酵法制备L-乳酸研究的热点。

鉴于细菌发酵的优势，近几十年来对于细菌发酵L-乳酸的研究十分活跃，比如Danner等采用嗜热脂肪芽孢杆菌IFA6H和IFA9在以葡萄糖为碳源，65℃分批培养发酵生产L-乳酸，转化率和纯度分别为60.5%~84.0%和98.7%；Hujanen等对酪乳杆菌NRRLB.441产L-乳酸的研究表明，在160 g/L葡萄糖浓度下，乳酸产率达到118.6 g/L。美国、荷兰、巴西等国家已经开始利用德氏乳杆菌进行L-乳酸发酵，而国内的乳酸生产以根霉为主，副产物多，产品光学纯度低，与国际先进水平差距较大。国内对于细菌发酵生产L-乳酸的的研究菌主要集中在乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptoccoccus)、芽孢杆菌属(Bacillus)，尚没有以肠球菌属菌株发酵生产L-乳酸的研究报道，也未见应用屎肠球菌菌株发酵转化葡萄糖生成L-乳酸的报道。

（三）发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种副产物少、产品光学纯度高的屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用。

上述应用包括如下步骤：

（1）选用屎肠球菌，保藏标号为CGMCC No.7274；

上述菌株已于2013年3月5日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，菌种名为菌株屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36，其保藏编号为CGMCC N0.7274。

上述屎肠球菌，其生物学特征是：在固体培养（分离培养基）平板上28~37℃培养36~24h观察，菌落可形成灰白色、不透明、表面光滑、直径为0. 5~1mm的圆形或椭圆形菌落，电镜观察菌体为球形，多成对或链状排列，革兰氏染色结果为阳性，。生理生化特征是：菌株HY-U36最适生长温度为30~37℃，能在10℃和45℃生长，可在重量分数占6.5%NaCl培养基及pH9.6条件下生长；该菌可利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖产酸，发酵葡萄糖不产气，不利用柠檬酸盐，接触酶阴性，还原硝酸盐。测定16S rRNA的基因序列的结果显示，其基因序列长度为1027bp。

（2）将菌种穿刺接种于斜面培养基，35-40℃下静止培养24-48h，得到菌株备用；

（3）将菌株在无菌条件下，用接种环接1-2环于60-80ml液体种子培养基中，置于旋转转速为80-120转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35-40℃下培养12-18小时，得种子液；

（4）摇瓶发酵：以2-5%的体积比的接种量，将种子液接种于装有60-80 mL发酵培养基的摇瓶中，35-40℃，转速为80-120转/分钟，摇瓶发酵68-84小时，当发酵液中检测不到葡萄糖残留时，发酵结束；

50L发酵罐发酵：以2-5%的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33-35L发酵培养基的50L发酵罐中，35-40℃进行搅拌培养，其中搅拌转速为150-200r/min，调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在5-15%的饱和度，并于24h后停止通气进入厌氧培养，发酵时间为 68-84 小时；发酵液初始pH值为6.5-6.8，发酵过程中间隔2小时取样测定发酵液中的葡萄糖和L-乳酸的浓度，当发酵液中L-乳酸浓度不再上升时，葡萄糖浓度不再降低时结束发酵；

（5）取上述发酵液以4000-4500转/分钟离心5-10分钟，测定上清液中葡萄糖和L-乳酸的含量，当葡萄糖含量检测为0 g/L时，发酵液即可进行L-乳酸的测定。

本发明的更优技术方案为：

步骤（2）中，所述斜面培养基的组成为，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，琼脂20g/L， pH为6.5-6.8。

步骤（3）中，所述液体种子培养基的组成为，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆5g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH为6.5-6.8。

步骤（4）中，所述发酵培养基的组成为，葡萄糖80-140g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，吐温801mL/L，碳酸钙60g/L，pH为6.5-6.8。

步骤（2）、（3）和（4）中的培养温度为37±0.2℃，步骤（2）中培养时间为30小时，步骤（3）中培养时间为10-12小时。

步骤（4）中，发酵培养基初始葡萄糖浓度为100-120g/L，发酵过程中的发酵液初始pH为6.5±0.2。

上述葡萄糖按下述方法测定：

使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。

上述L-乳酸按下述方法测定：

使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型膜生物反应器测定。测定原理是固定化酶能特异性地作用于L(+)乳酸：

乳酸+O₂+H₂O->固定化L(+)乳酸氧化酶->丙酮酸+H₂O₂。

发酵液稀释50-100倍，要求稀释的发酵液中乳酸的含量在50-100mg/dL范围内。

上述L-乳酸纯度测定按下述方法测定：

使用德国拜发D-/L-乳酸试剂盒对发酵液中D-/L-乳酸的含量进行测定。测定原理是利用D-/L-乳酸脱氢酶（LDH）特异性地检测D-乳酸与L-乳酸：

D-乳酸+NAD+D-LDH->丙酮酸+NADH+H+X，

L-乳酸+NAD+D-LDH->丙酮酸+NADH+H+X，

丙酮酸+L-谷氨酸盐+GPT->L-丙氨酸+2-酮戊酸盐X，

L-乳酸纯度（%）=L-乳酸浓度/（L-乳酸浓度+D-乳酸浓度）。

本发明所述屎肠球菌CGMCC N0.7274可发酵转化葡萄糖直接生成并获得目的产物L-乳酸，单位体积发酵液中L-乳酸产率高，葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率高，产L-乳酸光学纯度高，菌种发酵性能稳定。

本发明所述的屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274可发酵转化葡萄糖直接生成并获得目的产物L-乳酸，葡萄糖转化生成L-乳酸的平均转化率高，纯度高，副产物少，是一株极具研究开发价值的L-乳酸生产菌株。

本发明人未检索到有利用屎肠球菌以生产高光学纯度L-乳酸为目的产物的文献报道，也未检索到屎肠球菌产L-乳酸与GMCC N0.7274菌株相同的高光学纯度的文献报道。

利用本发明所述屎肠球菌CGMCC N0.7274发酵，以葡萄糖为原料发酵生产L-乳酸葡萄糖转化生成L-乳酸的平均转化率为84%-92%，转化率高，光学纯度高于98.6%，同时乙醇、苹果酸和富马酸等常见副产物较少。

本发明采用生物发酵的方法，以葡萄糖为原料生产L-乳酸具有生产方法简单，条件温和，原料来源丰富，生产成本低等特点，极具诱人的应用前景。

（四）附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274 结晶紫染色图片；

图2为屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274革兰氏染色图。

（五）具体实施方式

实施例1：产高光学纯度L-乳酸屎肠球菌的选育

将出发菌株屎肠球菌H-36接种液体种子培养基，37℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×10⁸－10⁹个/ml。取上述菌悬液10ml放入平皿中，置30W紫外灯下照射，照射距离15cm，照射时间为3分钟、5分钟、7分钟、10分钟，间隔取样适当稀释后涂布于含有重量分数6%乳酸钙的溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板，37℃避光培养1~2天，挑取生长状况良好、变色透明圈大的单菌落进行保藏，37℃培养1~2天，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，37℃摇瓶发酵64小时，取发酵液4000r/min离心10分钟，取上清液测定发酵液中残留葡萄糖、乳酸及L-乳酸含量，选取残留葡萄糖浓度低、乳酸产酸量高且L-乳酸纯度高的菌株为目的菌株。

将目的菌株再经摇瓶发酵复筛以进一步分离筛选，选育得到一株耗糖速率稳定和L-乳酸产量及纯度都有提高的突变菌株H-U36。

H-U36菌株接种初始葡萄糖浓度为100g/L的发酵培养基，37℃摇瓶培养78小时结束发酵，发酵液中检测不到葡萄糖，乳酸产量最高为75.7g/L，L-乳酸纯度为98.2%。

实施例2：高产高光学纯度L-乳酸菌株屎肠球菌CGMCC N0.7274的选育

将实施例1筛选到的突变菌株H-U36菌株接种液体种子培养基中，37℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×10⁸－10⁹ 个/ml，备用。

亚硝基胍处理液配制：称取亚硝基胍20mg，放置于100ml无菌三角瓶中，加丙酮2ml使其溶解，再加入18ml Tris缓冲液（pH6.0,0.5mol/L）混匀，备用。

取上述亚硝基胍处理液10ml，加入10ml菌悬液，30℃保温振荡50~60分钟，每隔10分钟取样一次，取样后首先稀释1000倍终止反应，然后再稀释2~10倍，涂布溴甲酚紫-碳酸钙平板，37℃培养1-2天，挑取单菌落移接斜面，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，37℃摇瓶发酵60小时，发酵液4000r/min离心10分钟，取上清液测定发酵液中葡萄糖、乳酸及L-乳酸含量，选取残留葡萄糖浓度低、L-乳酸产量及纯度高的菌株为目的菌株。

将目的菌株再经摇瓶发酵复筛，经进一步分离筛选得到一株遗传性质稳定、L-乳酸产量高于81.2g/L，纯度大于98.6%的突变菌株HY-U36。

上述菌株屎肠球菌（Enterococcus faeciums）HY-U36，已于2013年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC N0.7274。

上述富集培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH为6.5~6.8。

上述平板分离培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，磷酸氢二钾2g/L，乳酸钙60g/L，溴甲酚紫0.01g/L，碳酸钙10g/L，pH为6.5-6.8。

上述液体种子培养基组成：葡萄糖20~30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，碳酸钙8g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH为6.5~6.8。

上述摇瓶发酵培养基组成：葡萄糖80~120g/L，蛋白胨5~15g/L，酵母膏2~8g/L，磷酸氢二钾1~3g/L，碳酸钙0~120g/L，柠檬酸氢二铵1~3g/L，硫酸镁0~0.5g/L，硫酸锰0~0.2g/L，吐温80 0.5~1.5mL/L，pH为6.5~6.8。

实施例3 屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用

应用方法涉及的步骤顺序如下：

（1）菌种选择：选用屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274；

（2）斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，37℃条件下，静止培养30小时，备用；

（3）种子培养：将步骤（2）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于80mL液体种子培养基中（250mL三角瓶），置旋转转速为100转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养12小时，得种子液；

（4）发酵培养：

摇瓶发酵：以3%的体积比的接种量，将种子液接种于装有60 mL发酵培养基的摇瓶（250mL三角瓶）中，37℃，转速为100转/分钟，摇瓶发酵84小时，当发酵液中检测不到葡萄糖残留时，发酵结束；

（5）产物检测：取上述发酵液以4000转/分钟离心10分钟，测定上清液中葡萄糖和L-乳酸的含量，并计算葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率；同时收集发酵液采用液相色谱分析测定发酵产物中L-乳酸的光学纯度。

发酵液检测L-乳酸的含量为82.5g/L，葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率为82.5%，L-乳酸光学纯度为99.2%。

上述斜面培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，琼脂20g/L， pH6.5-6.8。

上述液体种子培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆5g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH6.5-6.8。

上述发酵培养基的组成为：葡萄糖100g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，吐温-80 1mL/L， pH6.5-6.8，碳酸钙50~70g/L。

实施例4 屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用

应用方法涉及的步骤顺序如下：

（2）斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，37℃条件下，静止培养28小时，备用；

（3）种子培养：将步骤（2）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于60 mL液体种子培养基中（250mL三角瓶），重复接种20瓶，置旋转转速为80转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养14小时，得种子液；

（4）发酵培养：

50L发酵罐发酵：以4%的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33L发酵培养基的50L发酵罐中，37℃进行搅拌培养，其中搅拌转速为200r/min，通过调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在5-15%的饱和度，发酵液初始pH值为6.5~6.8，24h后，关闭通气阀转入厌氧发酵，发酵过程中定时取样测定发酵液中的葡萄糖和L-乳酸的浓度，当发酵液中L-乳酸浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为 82小时；

（5）产物检测：取上述发酵液以4500转/分钟离心8分钟，测定上清液中葡萄糖和L-乳酸的含量，并计算葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率；同时收集发酵液采用液相色谱分析测定发酵产物中L-乳酸的光学纯度。

发酵液检测L-乳酸的含量为89.5g/L，葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率为89.5%，L-乳酸光学纯度为99.3%。

上述斜面培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，琼脂20g/L， pH 6.5~6.8。

上述液体种子培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆5g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH6.5~6.8。

上述发酵培养基的组成为：葡萄糖100g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，吐温80 1mL， pH6.5~6.8，碳酸钙50~70g/L。

实施例5 屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用

（2）斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，34℃条件下，静止培养36小时，备用；

（3）种子培养：将步骤（2）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于60mL液体种子培养基中（250mL三角瓶），重复接种20瓶，置旋转转速为100转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养14小时，得种子液；

（4）发酵培养：

50L发酵罐发酵：以4%的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33L发酵培养基的50L发酵罐中，37℃进行搅拌培养，其中搅拌转速为200r/min，通过调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在5~15%的饱和度，发酵液初始pH值为6.5~6.8，24h后，关闭通气阀转入厌氧发酵，发酵过程中定时取样测定发酵液中的葡萄糖和L-乳酸的浓度，当发酵液中L-乳酸浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为 72小时；

（5）产物检测：取上述发酵液以4500转/分钟离心10分钟，测定上清液中葡萄糖和L-乳酸的含量，并计算葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率；同时收集发酵液采用液相色谱分析测定发酵产物中L-乳酸的光学纯度。

发酵液检测L-乳酸的含量为72.0g/L，葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率为90.0%，L-乳酸光学纯度为99.2%。

上述斜面培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，琼脂20g/L，pH 6.5~6.8。

上述发酵培养基的组成为：葡萄糖80g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，吐温80 1mL/L， pH6.5~6.8，碳酸钙50~70g/L。

实施例6 屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用

（2）斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，46℃条件下，静止培养24小时，备用；

（3）种子培养：将步骤（2）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于60 mL液体种子培养基中（250mL三角瓶），重复接种20瓶，置旋转转速为80转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，46℃培养9小时，得种子液；

（4）发酵培养：

50L发酵罐发酵：以2%的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33L发酵培养基的50L发酵罐中，46℃进行搅拌培养，其中搅拌转速为200r/min，通过调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在10%的饱和度，发酵液初始pH值为6.5-6.8， 24h后，关闭通气阀转入厌氧发酵，发酵过程中定时取样测定发酵液中的葡萄糖和L-乳酸的浓度，当发酵液中L-乳酸浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为 66小时；

（5）产物检测：取上述发酵液以4000转/分钟离心10分钟，测定上清液中葡萄糖和L-乳酸的含量，测定上清液中葡萄糖和L-乳酸的含量，并计算葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率；同时收集发酵液采用液相色谱分析测定发酵产物中L-乳酸的光学纯度。

发酵液检测L-乳酸的含量为64.0g/L，葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率为80.0%，L-乳酸光学纯度为98.6%。

上述发酵培养基的组成为：葡萄糖80g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，吐温80 1mL， pH6.5-6.8，碳酸钙50~70g/L。

实施例7 菌株屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274在制L-乳酸中的应用

将菌株屎肠球菌CGMCC N0.7274菌株菌种接种于斜面培养基活化，36℃条件下，静止培养40小时，备用；

按液体种子培养基的组成配制种子培养基，初始葡萄糖浓度实测为21.5 g/L ，250ml三角瓶装液量为80ml，115℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环，置旋转转速为70转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养12小时，得种子液，取种子液稀释10倍置610nm测吸光值为0.247；

按发酵培养基的组成配制发酵培养基，初始葡萄糖浓度实测为102g/L，250ml三角瓶装液量为80ml，115℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至室温，接种种子液3ml，置旋转转速为80转/分钟、旋转半径为40mm摇床上，37℃培养84小时结束发酵，发酵液以4000转/分钟离心10分钟，取上清液测定葡萄糖浓度和L-乳酸的含量分别为0g/L和90.8g/L，葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率为89.0%，光学纯度99.3%。

实施例8 菌株屎肠球菌（Enterococcus faeciums）CGMCC N0.7274在制L-乳酸中的应用

将菌株屎肠球菌CGMCC N0.7274菌株菌种接种于斜面培养基活化，37℃条件下，静止培养38小时，备用；

按液体种子培养基的组成配制种子培养基，初始葡萄糖浓度实测为20 g/L，250ml三角瓶装液量为60ml，115℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至室温，接种斜面菌种悬液5ml，置旋转转速为80转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上37℃培养12小时，得种子液，取种子液稀释10倍置610nm测吸光值为0.250。

以50L发酵罐按30L装液量配制发酵培养基，调整pH6.0，115℃实罐灭菌20分钟，循环水冷却至37℃后接种培养好的种子液600ml，接种后立即取样测定葡萄糖浓度为106.4g/L。

初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为200转/分钟。发酵过程中控制发酵温度37±0.2℃, pH6.0±0.2。

发酵过程中每8小时取样，测定发酵液中葡萄糖和L-乳酸的含量及菌体浓度，当葡萄糖含量低于10g/L时，每两小时取样测定发酵液中葡萄糖浓度及L-乳酸，至发酵液L-乳酸含量不再增加时结束发酵，发酵周期为82小时。

发酵结束后取发酵液以4000转/分钟离心8分钟，取上清液测定葡萄糖和L-乳酸的含量分别为0g/L和95.2g/L，葡萄糖转化生成L-乳酸的转化率为89.5%，光学纯度99.1%。

实施例所述葡萄糖按下述方法测定：

实施例所述L-乳酸按下述方法测定：

乳酸+O₂+H₂O->固定化L(+)乳酸氧化酶->丙酮酸+H₂O₂。

发酵液稀释50-100倍，要求稀释的发酵液中乳酸的含量在0~50mg/dL范围内。

实施例所述L-乳酸纯度测定按下述方法测定：

D-乳酸+NAD+D-LDH->丙酮酸+NADH+H+X，

L-乳酸+NAD+D-LDH->丙酮酸+NADH+H+X，

丙酮酸+L-谷氨酸盐+GPT->L-丙氨酸+2-酮戊酸盐X，

L-乳酸纯度（%）=L-乳酸浓度/（L-乳酸浓度+D-乳酸浓度）。

Claims

1.一种屎肠球菌在制备L-乳酸中的应用，其特征为，包括如下步骤：（1）选用屎肠球菌，保藏标号为CGMCC No.7274；（2）将菌种穿刺接种于斜面培养基，35-40℃下静止培养24-48h，得到菌株备用；（3）将菌株在无菌条件下，用接种环接1-2环于60-80ml液体种子培养基中，置于旋转转速为80-120转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35-40℃下培养12-18小时，得种子液；（4）摇瓶发酵：以2-5%的体积比的接种量，将种子液接种于装有60-80 mL发酵培养基的摇瓶中，35-40℃，转速为80-120转/分钟，摇瓶发酵68-84小时，当发酵液中检测不到葡萄糖残留时，发酵结束；再进行50L发酵罐发酵：以2-5%的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33-35L发酵培养基的50L发酵罐中，35-40℃进行搅拌培养，其中搅拌转速为150-200r/min，调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在5-15%的饱和度，并于24h后停止通气进入厌氧培养，发酵时间为 68-84 小时；发酵液初始pH值为6.5-6.8，发酵过程中间隔2小时取样测定发酵液中的葡萄糖和L-乳酸的浓度，当发酵液中L-乳酸浓度不再上升时，葡萄糖浓度不再降低时结束发酵；（5）取上述发酵液以4000-4500转/分钟离心5-10分钟，测定上清液中葡萄糖和L-乳酸的含量，当葡萄糖含量检测为0 g/L时，发酵液即可进行L-乳酸的测定。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，所述斜面培养基的组成为，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾2g/L，琼脂20g/L， pH为6.5-6.8。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3）中，所述液体种子培养基的组成为，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆5g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH为6.5-6.8。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（4）中，所述发酵培养基的组成为，葡萄糖80-140g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，吐温801mL/L，碳酸钙60g/L，pH为6.5-6.8。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）、（3）和（4）中的培养温度为37±0.2℃，步骤（2）中培养时间为30小时。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（4）中，发酵培养基初始葡萄糖浓度为100-120g/L。