CN101831394B - 耐热的芽孢杆菌及其在制备苯乳酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐热的芽孢杆菌，该菌株的名称为Bacillus sp.SDM，已于2010年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC No.M 2010012。本发明还同时公开了所述耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用，包括(1)斜面培养，(2)种子培养，(3)细胞悬液的制备，(4)转化，(5)样品处理与检测等步骤。本发明利用该耐热的芽孢杆菌制备苯乳酸的方法具有操作简单，底物转化效率高、速率快，产物苯乳酸产量高的特点，在制备生物防腐剂苯乳酸中具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株耐热的芽孢杆菌及其应用，尤其涉及所述耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用。
背景技术
苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，又名3-苯基乳酸或β-苯乳酸，是一种近年来引起人们关注的新型抑菌物质。与Nisin等细菌素相比，具有广范的抑菌谱，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真核微生物均有抑制作用。苯乳酸溶解性好、能在各种食品体系中扩散；稳定性高、具有宽广的pH范围和热稳定性。苯乳酸还是一种重要的化学合成前体，在医药、化工、生物合成等领域具有宽广的应用范围。
目前，苯乳酸合成方法有化学合成法和生物转化法两种。化学合成法在不同程度上存在技术复杂、污染环境等缺点。生物转化法主要有两种方法：微生物发酵和生物催化。
中国专利申请号200610088430.9报道了利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentose)作为菌株以苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠为底物，添加碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵法生产苯乳酸；中国专利申请号200810021498.4报道用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS1.550控制pH和补料发酵生产苯乳酸，发酵时间70～90小时，最高产量为17.38克/升，转化率51.1％，生产强度0.241克/升·小时。苯丙酮酸是一种难溶物质，其溶解度随温度的升高明显增加，从而可以提高苯乳酸的产量和生产速率。耐热的芽孢杆菌最适生长温度高于乳杆菌，同时培养基简单，生长速度快，因而更适合苯乳酸生产，然而利用耐热的芽孢杆菌生物转化苯丙酮酸生产苯乳酸尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM，以及利用其全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸的应用。
本发明所述耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM菌株已于2010年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国 武汉 武汉大学)，保藏登记号为CCTCC No.M 2010012。
本发明所述耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM是从果园长期堆放腐烂水果的垃圾堆周围土壤中筛选得到。该菌株细胞长杆状，有芽孢，能运动，革兰氏染色阳性。在培养基上产生为圆形、凸起、透明，表面干燥光滑、直径2～3毫米的菌落。它可利用葡萄糖、木糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖，不能利用丙酸盐，接触酶阳性，不能水解明胶。其16S rDNA序列与多株芽孢杆菌的16S rDNA序列比对相似性达到96～98％。
本发明所述耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用。
其中，所述应用是利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，其方法步骤如下：
(1)斜面培养：将耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012接种到固体斜面培养基上，在30～60℃条件下，静置培养8～16小时；
(2)种子培养：刮取1～2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到100～300毫升液体种子培养基中，在30～60℃、pH值5.0～7.5的条件下，100±10转/分钟振荡培养8～20小时，制得种子培养液；
(3)细胞悬液的制备：以体积比计，按3～5％的的接种量将步骤(2)所得的种子培养液接入6～8升发酵培养基中；在30～60℃、pH值5.0～7.5的条件下，100转/分钟振荡培养6～20小时；然后以4,500±500转/分钟的转速离心15±5分钟收集菌体沉淀，用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为100克/升；
(4)转化：将(3)所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖或木糖混合，调节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为50～220毫摩尔/升，辅助底物葡萄糖或木糖的浓度为10～80克/升，细胞悬液菌体干重为10～80克/升；在30～60℃、pH值5.0～7.5，100±10转/分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸；转化反应4～24小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液；
(5)样品处理与检测：取步骤(4)获得的细胞转化液先加热至100℃，再1,2000±1000转/分钟离心5±2分钟，取上清液稀释至苯乳酸浓度为0.5～2毫摩尔后，以HPLC检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。
其中，步骤(1)、(2)、(3)或(4)中所述菌体培养的温度优选40～55℃。
其中，步骤(2)、(3)或(4)中所述菌体培养的pH优选5.5～7.0。
其中，步骤(1)中所述斜面培养的时间优选10～14小时。
其中，步骤(2)中所述种子培养的时间优选10～15小时。
其中，步骤(3)中所述菌体培养的时间优选8～12小时。
其中，步骤(4)所述反应混合物中苯丙酮酸的浓度优选100～200毫摩尔/升，辅助底物葡萄糖或木糖的浓度优选30～60克/升，细胞悬液菌体干重优选为20～60克/升。
其中，步骤(4)中所述转化反应的时间优选为10～20小时。
其中，步骤(4)中所述的pH控制用碳酸钙或氢氧化钠调节。
其中，步骤(5)中所述的HPLC检测苯丙酮酸和苯乳酸含量的方法为，稀释至苯乳酸浓度为0.5～2毫摩尔的上清液用0.22微米滤膜过滤，采用Agilent 1100液相色谱仪，配备ZORBAX 300SB C18(5微米、4.6×250毫米)分离柱。具体操作条件：流动相为85％的1毫摩尔硫酸和15％的乙腈，流速为0.7毫升/分钟，进样量5微升，紫外检测器，检测波长210纳米，柱温箱温度为30℃。利用苯丙酮酸和苯乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中苯丙酮酸和苯乳酸的含量。
在上述利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸的过程中，种子培养使用的液体种子培养基配方为：葡萄糖或木糖50克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，碳酸钙25克/升。固体斜面培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比1.8％的琼脂。115℃条件下灭菌20分钟。发酵培养基配方为：葡萄糖或木糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙25克/升。
目前报道的苯乳酸生产菌主要是乳杆菌(Lactobacillus)，但乳杆菌发酵生产苯乳酸的温度一般在30℃，容易污染杂菌。本发明提供的耐热的芽孢杆菌生长温度高，是一种新的可用于苯乳酸生产的微生物，目前尚未见报道。
本发明优势在于：
①本发明所选芽孢杆菌要求的培养基成分简单、生长周期短，生产成本低；
②由于本发明所选芽孢杆菌具有较高的培养温度(45～60℃)，提高了反应过程速率，缩短了生产周期；
③底物苯丙酮酸是难溶物质，由于该催化过程反应温度高，增加了底物的溶解度，提高了产物苯乳酸的浓度。利用本发明所选耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCCNo.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，最终苯乳酸产量可达到30克/升，苯乳酸得率可达90％以上，生产强度为1.56克/升·小时；
④由于菌体培养温度高，可不对培养基进行灭菌，减少了能量的消耗和营养物质的损失，降低了能耗和生产成本；
⑤利用全细胞催化法生产苯乳酸，反应体系成分单一，后续分离提取费用低。
附图说明
本发明所述耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM已于2010年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏登记号为CCTCC No.M 2010012。
图1为利用耐热的芽孢杆菌Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸所得结果及苯丙酮酸和苯乳酸标准品的液相色谱图。A为苯丙酮酸标准品，B为苯乳酸标准品，C为细胞转化液样品。
具体实施方式
下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。
实施例1
芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM的筛选及鉴定：
从某果园长期堆放腐烂水果的垃圾堆周围取得土样，称取2克土样放入50毫升液体培养基中，100转/分钟，55℃富集培养8～10小时后加入质量体积比为1％的苯丙酮酸，100转/分钟振荡培养10小时，重复这一过程3～5次。将培养的菌液稀释10,000,000倍涂布固体培养基上，在55℃条件下静置培养12小时。选取长出的单菌落接种50毫升的发酵培养基中，振荡培养10小时后加入1％质量体积比的苯丙酮酸，100转/分钟振荡培养15小时后检测生成的苯乳酸含量，筛选能够转化苯丙酮酸生成苯乳酸的菌株。最终获得一株转化能力较好、能大量积累苯乳酸的菌株。该菌株细胞长杆状，有芽孢，能运动，革兰氏染色阳性。在培养基上产生为圆形、凸起、透明，表面干燥光滑、直径2～3毫米的菌落。它可利用葡萄糖、木糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖，不能利用丙酸盐，接触酶阳性，不能水解明胶。其16S rDNA序列与多株芽孢杆菌的16S rDNA序列比对相似性达到96～98％。将该菌株命名为耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM。
在上述筛选能够转化苯丙酮酸制备苯乳酸的菌株的方法中，使用的液体培养基配方为：葡萄糖20克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙10克/升，pH为6。固体培养基配方为在该培养基基础上添加质量体积比1.8％的琼脂。
在上述筛选能够转化苯丙酮酸生产苯乳酸的菌株的方法中，使用的发酵培养基配方为：葡萄糖80克/升，酵母粉20克/升，碳酸钙40克/升，pH为6。
上述筛选得到的耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM已于2010年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏登记号为CCTCC No.M 2010012。
实施例2
利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，其方法步骤如下：
(1)斜面培养：将耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012接种到固体斜面培养基上，在55℃条件下，静置培养10小时；
(2)种子培养：刮取2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到300毫升液体种子培养基中，在55℃、pH值7.0的条件下，100转/分钟振荡培养11小时，制得种子培养液；
(3)细胞悬液的制备：取步骤(2)所得的种子培养液，按4％的体积比的接种量接入8升发酵培养基中；在55℃、pH值7.0的条件下，100转/分钟振荡培养11小时；然后以4,500转/分钟的转速离心15分钟收集菌体沉淀，用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为100克/升；
(4)转化：将(3)所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖混合，调节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为200毫摩尔/升，辅助底物葡萄糖的浓度为60克/升，细胞悬液菌体干重为60克/升；在55℃、pH值7.0，100转/分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸；转化反应20小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液；
(5)样品处理与检测：取步骤(4)获得的细胞转化液先加热至100℃，再1,2000转/分钟离心5分钟，取上清液稀释至苯乳酸浓度为0.5～2毫摩尔后，HPLC检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。
其中，HPLC检测苯丙酮酸和苯乳酸含量的方法为，稀释至0.5～2毫摩尔的上清液用0.22微米滤膜过滤，采用Agilent 1100液相色谱仪，配备ZORBAX 300SB C18(5微米、4.6×250毫米)分离柱。具体操作条件：流动相为85％的1毫摩尔硫酸和15％的乙腈，流速为0.7毫升/分钟，进样量5微升，紫外检测器，检测波长210纳米，柱温箱温度为30℃。利用苯丙酮酸和苯乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中苯丙酮酸和苯乳酸的含量。
在上述利用耐热的芽孢杆菌Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸的过程中，种子培养使用的液体种子培养基配方为：葡萄糖或木糖50克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，碳酸钙25克/升。固体斜面培养基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比1.8％的琼脂。115℃条件下灭菌20分钟。发酵培养基配方为：葡萄糖或木糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙25克/升。
转化结束后，苯乳酸产量为29.6克/升，苯乳酸得率为89.1％，生产强度为1.56克/升·小时。
转化结果的液相色谱图见图1。
实施例3
利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，其方法步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012接种到固体斜面培养基上，在50℃条件下，静置培养12小时；
(2)种子培养：刮取1环步骤(1)所得的斜面培养物，接种到200毫升液体种子培养基中，在50℃、pH值6.0的条件下，100转/分钟振荡培养11小时，制得种子培养液；
(3)细胞悬液的制备：取步骤(2)所得的种子培养液，按3.5％的体积比的接种量接入7升发酵培养基中；在50℃、pH值6.0的条件下，100转/分钟振荡培养10小时；然后以4,500转/分钟的转速离心15分钟收集菌体沉淀，用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为100克/升；
(4)转化：将(3)所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖混合，调节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为180毫摩尔/升，辅助底物葡萄糖的浓度为50克/升，细胞悬液菌体干重为55克/升；在50℃、pH值6.0，100转/分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸；转化反应18小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液；
其它方法步骤均与实施例2相同。
转化结束后，以实施例2所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸产量为27.2克/升，苯乳酸得率为90.9％，生产强度为1.51克/升·小时。
实施例4
利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，其方法步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012接种到固体斜面培养基上，在55℃条件下，静置培养13小时；
(2)种子培养：用步骤(1)所得的斜面培养物，刮取1环接种到300毫升液体种子培养基中，在55℃、pH值6.0的条件下，100转/分钟振荡培养12小时，制得种子培养液；
(3)细胞悬液的制备：取步骤(2)所得的种子培养液，按3％的体积比的接种量接入6升发酵培养基中；在55℃、pH值6.0的条件下，100转/分钟振荡培养10小时；然后以4,500转/分钟的转速离心15分钟收集菌体沉淀，用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为100克/升；
(4)转化：将(3)所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖混合，调节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为140毫摩尔/升，辅助底物葡萄糖的浓度为40克/升，细胞悬液菌体干重为40克/升；在55℃、pH值6.0，100转/分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸；反应14小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液；
其它方法步骤均与实施例2相同。
转化结束后，以实施例2所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸产量为21.8克/升，苯乳酸得率为93.6％，生产强度为1.56克/升·小时。
实施例5
利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，其方法步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012接种到固体斜面培养基上，在50℃条件下，静置培养11小时；
(2)种子培养：刮取2环步骤(1)所得的斜面培养物，接种到200毫升液体种子培养基中，在50℃、pH值5.5的条件下，100转/分钟振荡培养10小时，制得种子培养液；
(3)细胞悬液的制备：取步骤(2)所得的种子培养液，按4.5％的体积比的接种量接入6升发酵培养基中；在50℃、pH值5.5的条件下，100转/分钟振荡培养9小时；然后以4,500转/分钟的转速离心15分钟收集菌体沉淀，用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为100克/升；
(4)转化：将(3)所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物木糖混合，调节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为100毫摩尔/升，辅助底物木糖的浓度为30克/升，细胞悬液菌体干重为20克/升；在50℃、pH值5.5，100转/分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸；转化反应10小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液；
其它方法步骤均与实施例2相同。
转化结束后，以实施例2所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸产量为15.8克/升，苯乳酸得率为95％，生产强度为1.58克/升·小时。
实施例6
利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，其方法步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012接种到固体斜面培养基上，在40℃条件下，静置培养11小时；
(2)种子培养：刮取2环步骤(1)所得的斜面培养物，接种到200毫升液体种子培养基中，在40℃、pH值5.5的条件下，100转/分钟振荡培养13小时，制得种子培养液；
(3)细胞悬液的制备：取步骤(2)所得的种子培养液，按5％的体积比的接种量接入7升发酵培养基中；在40℃、pH值5.5的条件下，100转/分钟振荡培养8小时；然后以4,500转/分钟的转速离心15分钟收集菌体沉淀，用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为100克/升；
(4)转化：将(3)所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物木糖混合，调节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为160毫摩尔/升，辅助底物木糖的浓度为45克/升，细胞悬液菌体干重为50克/升；在40℃、pH值5.5，100转/分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸；反应16小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液；
其它方法步骤均与实施例2相同。
转化结束后，以实施例2所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸产量为24.5克/升，苯乳酸得率为92.1％，生产强度为1.53克/升·小时。
实施例7
利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，其方法步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012接种到固体斜面培养基上，在40℃条件下，静置培养14小时；
(2)种子培养：刮取1环步骤(1)所得的斜面培养物，接种到200毫升液体种子培养基中，在40℃、pH值6.5的条件下，100转/分钟振荡培养14小时，制得种子培养液；
(3)细胞悬液的制备：取步骤(2)所得的种子培养液，按4.5％的体积比的接种量接入8升发酵培养基中；在40℃、pH值6.5的条件下，100转/分钟振荡培养12小时；然后以4,500转/分钟的转速离心15分钟收集菌体沉淀，用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为100克/升；
(4)转化：将(3)所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖混合，调节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为120毫摩尔/升，辅助底物葡萄糖的浓度为30克/升，细胞悬液菌体干重为30克/升；在40℃、pH值6.5，100转/分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸；反应12小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液；
其它方法步骤均与实施例2相同。
转化结束后，以实施例2所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸产量为18.3克/升，苯乳酸得率为92％，生产强度为1.53克/升·小时。
Claims (2)
1.一株耐热的芽孢杆菌，其特征在于，该菌株的名称为Bacillus sp.SDM，已于2010年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC No.M 2010012。
2.权利要求1所述耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101508960A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-08-19 | 常熟理工学院 | 一株根霉菌株及其应用 |
| CN101608169A (zh) * | 2009-06-25 | 2009-12-23 | 昆明理工大学 | 嗜热短小芽孢杆菌株Tamy12及其产高温淀粉酶 |
-
2010
- 2010-02-05 CN CN2010101065039A patent/CN101831394B/zh active Active
Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JP特开2000-300284A 2000.10.31 |
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