CN102391970B - 一种生产2,3-丁二醇的方法及其专用地衣芽孢杆菌 - Google Patents
一种生产2,3-丁二醇的方法及其专用地衣芽孢杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)5-2-D及利用其以42～55℃、培搅拌养20～60小时为发酵条件，以葡萄糖为底物发酵生产2，3-丁二醇的方法。本发明提供的生产2，3-丁二醇的方法充分利用高温发酵过程的优势，污染杂菌的机率小，且不对发酵培养基进行灭菌，减少了能量的消耗和营养物质的损失，同时获得的2，3-丁二醇最高浓度可达92克/升，生产强度可达2.56克/升/小时。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产2,3-丁二醇的方法及其专用地衣芽孢杆菌。
背景技术
2,3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域（Appl Microbiol Biotechnol,2001,55(1):10-18）。因其热值较高（27,200kJ/kg），同乙醇（29,100kJ/kg）相当，可用作燃料添加剂；可代替1,4-丁二醇，用于聚酯和聚亚安酯的合成；其脱水产物甲乙酮是一种低沸点溶剂，广泛应用于涂料、润滑剂、燃料等行业，同时又可作为有机合成香料、抗氧化剂等的中间体；其脱水产物1,3-丁二烯可用来合成橡胶单体，是一种重要的石油化工基础有机原料；同甲乙酮缩合加氢形成辛烷，可用于生产高级航空用油。
目前2,3-丁二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学法主要以石油裂解时产生的丁烯为原料，经过HClO的氧化及NaOH的作用后，在高温高压下水解得到几种不同种类的丁二醇，再通过减压分馏分离获得。相比于化学法，微生物发酵法具有环境友好，工艺简单等特点。自然界中具有2,3-丁二醇生产能力的细菌主要包括，克雷伯氏菌属（Klebsiella）、芽孢杆菌属（Bacillus）和肠杆菌属（Enterobacter）等（J Biotechnol,1993,27(3):317-329）。目前，国内外发酵生产2,3-丁二醇的研究常用菌株多为克雷伯氏菌，但其潜在的致病性，限制了克雷伯氏菌在工业化生产中的应用。芽孢杆菌具有生物安全性，现已有多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生产2,3-丁二醇的报道（CN201010026807.1,CN101851598A,World J.Microbial.Biotechnol.,8,378-381），但其发酵液浓度较低或发酵周期较长，限制了其在工业化生产中的应用。同时，已报道的2,3-丁二醇生产菌株发酵温度均为30～42℃，需要对培养基进行灭菌，造成了能源的浪费和营养的损失。
嗜热的芽孢杆菌由于其具有较高的发酵温度（42～60℃），大大减少了发酵过程中污染杂菌的机会。同时，以较高的温度进行发酵，可降低发酵液粘度，有利于后续处理步骤的操作，而且可以在培养基不灭菌的条件下进行发酵生产，降低了能耗和2,3-丁二醇的生产成本。
经检索，未见利用嗜热的地衣芽孢杆菌生产2,3-丁二醇的方法报道。
发明内容
针对现有2,3-丁二醇生产方法中的技术难点及存在问题，本发明的目的在于提供一种生产2,3-丁二醇的方法及其专用嗜热地衣芽孢杆菌。
本发明所述嗜热地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）5-2-D，其已于2011年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，中国.武汉.武汉大学），保藏号为：CCTCC M 2011371。
上述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）5-2-D CCTCC M 2011371菌株形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应成阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含100g/L NaCl的培养基中生长，可在42～60℃条件下生长。
上述地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的脂肪酸图谱是典型的芽孢杆菌的脂肪酸图谱。
上述地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的16S rDNA序列与其他已知不同种的地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列有99%～100%的相似性。
上述地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株可以在高糖（糖150克/升）LB培养基中生长。
本发明所述生产2,3-丁二醇的方法是：以42～55℃、培搅拌养18～60小时为发酵条件，以葡萄糖为底物发酵上述地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371，得到2,3-丁二醇。
具体步骤顺是：
（1）斜面培养：将地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌种接种于含有1.5～2wt%的琼脂的固体斜面培养基上，培养温度为42～55℃，培养时间为8～12小时；
（2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到种子培养基中，培养温度为42～55℃，培养方式为旋转式摇床培养，转速为120转/分钟，培养时间8～12小时；
（3）发酵培养：以5～10%的体积比的接种量，将步骤（2）的种子培养液接入发酵培养基，培养温度为42～55℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为200～400转/分钟，旋转半径为33mm，培养时间为18～60小时，制得含有2,3-丁二醇的发酵培养液；
（4）分离样品：将步骤（3）的发酵液以8,000转/分钟离心10分钟，留取上清液，得含有2,3-丁二醇的溶液；
（5）样品检测：取步骤（4）的上清液，稀释，检测葡萄糖含量和2,3-丁二醇含量。
其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。
其中，步骤（1）中所述的菌体培养时间优选是8～10小时。
其中，步骤（2）中所述的菌体培养时间优选是11～12小时。
其中，步骤（3）中所述的菌体培养时间优选是36～48小时。
其中，上述种子培养基配方是：葡萄糖30～50克/升，酵母粉10～15克/升，蛋白胨5～10克/升，余量为水；pH为6～7。
其中，上述发酵培养基配方是：如下酵母粉5～20克/升，蛋白胨5～20克/升，玉米浆5～20克/升，大豆肽5～20克/升或大豆蛋白胨5～20克/升，五种氮源中的至少一种；葡萄糖80-150克（初糖含量）/每升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升，其余为水；pH为6～7。
上述发酵培养基不需灭菌。
本发明的特点及有益效果是：
（1）本发明提供的嗜热的地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371是耐高糖且能高产2,3-丁二醇的生物安全菌株；（2）利用本发明提供的菌株以葡萄糖为底物，在本发明给出发酵条件下获得的2,3-丁二醇最高浓度可达92克/升，生产强度可达2.56克/升/小时；（3）本发明提供的生产2,3-丁二醇的方法充分利用高温发酵过程的优势，污染杂菌的机率小，且不对发酵培养基进行灭菌，减少了能量的消耗和营养物质的损失，同时实现了产量高，生产强 度大的目标。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实质作进一步阐述，但本发明所保护的内容不仅限于此。
实施例1：耐高糖并且能产2,3-丁二醇菌株的筛选
从果园等地取得土样，用筛选培养基浸泡2h，在500mL锥形瓶中装浸泡液50mL，在50℃条件下，置于摇床上以180r/min的转速培养24小时。将培养液以10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五个稀释度涂布在固体筛选培养基的培养皿中，50℃培养12h。挑单菌落，扩大培养，通过VP反应进行初筛。根据反应时间和颜色变化筛选出阳性菌株。筛选原理是2,3-丁二醇在碱性条件下氧化为双乙酰，与肌酸或胍类衍生物所合成红色物质，加入α-萘酚、肌酸可以促进反应。然后测定初筛的阳性细菌的2,3-丁二醇产量，挑选其中最高产量的菌株。其中得到的产量最高的菌株为地衣芽孢杆菌5-2-D。
上述筛选培养基配方为：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，115℃条件下灭菌20min。固体筛选培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂粉。
上述地衣芽孢杆菌5-2-D菌株形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应成阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含100g/L NaCl的培养基中生长，可在42～60℃条件下生长。其脂肪酸图谱是典型的芽孢杆菌的脂肪酸图谱。其16S rDNA序列与其他已知不同种的地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列有99%-100%的相似性。
将上述地衣芽孢杆菌定名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）5-2-D，所述菌株已于2011年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，中国.武汉.武汉大学），其保藏号为：CCTCC M 2011371。
实施例2：制备地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的细胞液体培养物
挑取固体高糖LB培养基斜面培养的地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株一环，接种在装有灭菌的100mL高糖LB培养基的500mL锥形瓶中，在55℃条件下，置于摇床上以180r/min的转速培养24h，即制得地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的细胞液体培养物。
上述高糖LB培养基配方如下：1L蒸馏水中含：150g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，115℃条件下灭菌15min。固体高糖LB培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂粉。
实施例3：利用地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株以发酵培养基1在锥形瓶中发酵生产2,3-丁二醇
将通过实施例2获得的地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的细胞液体培养物以50mL/L的接种量接种在装有灭菌的100mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，在50℃条件下，置于摇床上以180r/min的转速培养，间隔4h取样并检测2,3-丁二醇含量，在第34h检测2,3-丁二醇的浓度达到56.0g/L。在第60h将锥形瓶从摇床上取下停止发酵。
上述发酵培养基1配方如下：
葡萄糖120克/升，酵母粉10克/升，玉米浆5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升。
实施例4：利用地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株以发酵培养基2在锥形瓶中发酵生产2,3-丁二醇
重复实施例3的操作，只是将发酵培养基1改为发酵培养基2，经检测第42h 2,3-丁二醇的浓度达到67g/L。
上述发酵培养基2配方如下：
葡萄糖140克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升。
实施例5：利用地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株以发酵培养基3在锥形瓶中发酵生产2,3-丁二醇
重复实施例3的操作，只是将发酵培养基1改为发酵培养基3，经检测第32h 2,3-丁二醇的浓度达到52.0g/L。
上述发酵培养基3配方如下：
葡萄糖120克/升，玉米浆10克/升，蛋白胨5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升。
实施例6：利用地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株以发酵培养基1在5L发酵罐中发酵生产2,3-丁二醇
将通过实施例2获得的地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的细胞液体培养物以体积百分比10%的接种量接种在装有未灭菌的4L发酵培养基的5L发酵罐中，在55℃条件下，发酵罐搅拌转速400r/min，通气量为0.5vvm～1.0vvm，发酵36h。
经检测可得到浓度为92克/升的2,3-丁二醇发酵液。
上述发酵培养基2配方如下：
葡萄糖140克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升。
Claims (6)
1.一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）5-2-D，所述菌株已于2011年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC M 2011371。
2.一种生产2,3-丁二醇的方法，是以42～55℃、培搅拌养20～60小时为发酵条件，以葡萄糖为底物发酵权利要求1所述地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371，得到2,3-丁二醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵条件是培养温度为50～55℃；培养时间为36～48小时；搅拌转速为200～400转/分钟，旋转半径为33mm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方是：如下酵母粉5～20克/升，蛋白胨5～20克/升，玉米浆5～20克/升，大豆肽5～20克/升或大豆蛋白胨5～20克/升，五种氮源中的至少一种；葡萄糖80-150克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升，其余为水；pH为6～7。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基不需灭菌。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：发酵培养前，先将地衣芽孢杆菌CCTCCM 2011371接入种子培养基中，在42～55℃，以转速为120转/分钟，培养时间8～12小时后，再接入发酵培养基；其中，所述种子培养基配方是：葡萄糖30～50克/升，酵母粉10～15克/升，蛋白胨5～10克/升，余量为水；pH为6～7。
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