CN101008019A - 一株枯草芽孢杆菌在制备3－羟基丁酮中的应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌在制备3－羟基丁酮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌在制备3－羟基丁酮中的应用。其中涉及的菌株已于2006年11月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.1869。应用方法包括(1)菌种选择，(2)斜面培养活化，(3)种子培养，(4)发酵培养，(5)检测并收集发酵产物等步骤；所述方法具有操作简单，成本低，目的产物3－羟基丁酮产率高、纯度高、不产生丁二酮和2，3丁二醇等3－羟基丁酮常见联产化合物的特点，极具诱人的应用前景。

Description

一株枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌的应用，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
3-羟基丁酮(acetoin)又名乙偶姻、乙酰甲基甲醇，自然存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中，具有特有的奶油香味，另外，啤酒风味、奶酪香味均与3-羟基丁酮有关。
3-羟基丁酮是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，是国际上常用的香料品种。主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料，中国国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食品香料。80％含量的3-羟基丁酮俗称“醋嗡”，是酒类调香中一个重要的品种。3-羟基丁酮还是一种重要的化工合成原料和医药中间体。以3-羟基丁酮为原料通过氧化、还原反应可生成双乙酰和2，3-丁二醇，这两种化合物在化学工业中都具有广泛的用途，特别是2，3-丁二醇除自身是一种高能燃料外，还可以用来合成航空燃料，一度成为研究热点。在制药工业中，3-羟基丁酮作为具有手性的化合物可以用来合成稀有药物和药物中间体，如3-羟基丁酮与光气可以高效合成4-氯-4，5-二甲基-1，3二氧杂环戊烷-2-酮(CDMDO)，CDMDO是一种重要的医药中间体，主要用于青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物的修饰，从而较大程度地提高药效，减轻药物的副作用，在欧美国家及日本得到大力推广与应用。3-羟基丁酮还可以合成伦氨苄西林盐酸盐，伦氨苄西林盐酸盐是半合成青霉素、氨苄青霉素的前体药物，可口服，肠胃中稳定性良好，吸收快，血液中浓度高，比氨苄青霉素的作用强2～4倍，不良反应小，毒性低，已在欧美和日本上市。
3-羟基丁酮生产方法主要包括化学合成法和生物转化法。化学合成主要采用两种方法：一种是通过丁二酮(双乙酰)部分加氢还原；另一种是通过2，3-丁二醇选择性氧化。生物转化法也有两种工艺，一种是利用酶法转化丁二酮生产，另外一种是通过微生物发酵糖质原料生产。丁二酮部分加氢还原是目前国内外研究及应用较多3-羟基丁酮生产方法，该方法主要是以丁二酮为原料添加不同的还原剂、催化剂来加氢还原合成3-羟基丁酮，转化率在50-80％不等。用2，3-丁二醇选择性氧化工艺可以选用铜作为催化剂，产物为丁二酮和3-羟基丁酮的混合物(1945年，R.H.Blom)，另外还有研究者采用电化学氧化2，3-丁二醇制备3-羟基丁酮，选择性好，产率高，但该工艺仅处于研究阶段(1997年A.Hilmi)。酶法转化生产3-羟基丁酮：1992年Hummel等人曾从培养的乳酸杆菌或酵母菌分离纯化丁二酮还原酶及辅酶NAPH，在pH5，温度70℃下，催化转化2，3-丁二酮生成3-羟基丁酮，使用该方法产率最高可达100％，并且没有其它副产物。Susan Budavari还曾报道通过山梨糖菌或生膜菌转化2，3-丁二醇生成3-羟基丁酮。这些方法和化学合成相似，都是以丁二酮或丁二醇为原料，经酶法部分还原或氧化生成3-羟基丁酮。区别在于酶法产物得率高，没有其它副产物，并且产物具有旋光度，但要获得大量特异性的酶比较困难。
化学合成法和生物酶转化法都是以丁二酮或2，3-丁二醇为原料，但是丁二酮和2，3-丁二醇也是合成香料，而非大宗化工产品，因此原料来源、产品价格及使用范围都受到限制，这也是两种工艺没有得到大规模推广应用的主要原因之一。
3-羟基丁酮是多种微生物糖代谢的中间代谢产物，以糖质为原料利用微生物发酵可以产生3-羟基丁酮，但是，据检索目前有关微生物产生3-羟基丁酮的文献，多数报道是有关微生物代谢途径理论方面的研究，少数涉及的3-羟基丁酮生产的报道也主要是作为丁二酮和2，3-丁二醇发酵的副产物提及。比如R.B.hespell报道多粘杆菌可利用木聚糖生成丁二酮和3-羟基丁酮，其总产量最高可达11.3g/L。Braneni和Keenan利用乳酸菌发酵产生丁二酮和3-羟基丁酮，同时该菌株还产生2，3-丁二醇。R.M.Teixeira等报道汉逊酵母发酵产3-羟基丁酮，产量最高可达0.36g/L。目前，还未见有关于3-羟基丁酮作为微生物主要目的产物的研究报道，也未见应用枯草芽孢杆菌菌株发酵转化葡萄糖直接生成并获得目的产物3-羟基丁酮的报道。
参考文献：
1.Susan Budavari.The Merck Index[M].Twelfth Edition.，1996.12.
2.Hummel.USP；5164314，1992
3.Blom R H..Am Chem Soc，1945，67：494
4.Hilmi A，Belgsir E M，Leger J M，，等.J.Electro.Chem.，1997，435：69.
5.R.B.Hespell.Curr.Micro.1996，32：291
6.R.M.Teixeira，D.Cavalheiro，等.Braz.J.Chem.Eng.19(2)：181
7.A.L.Braneni and T.W.Keenan.Appl.Micro.，1971：517
发明内容：
针对现有技术的不足，本发明要解决问题是提供一株枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用。利用本发明所述菌株可有效地转化葡萄糖生成3-羟基丁酮，不产生丁二酮和2，3-丁二醇等3-羟基丁酮常见联产化合物，实现通过微生物发酵法获得以3-羟基丁酮为主要目的产物愿望。
本发明所述枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用。
其中，所述应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1869；
上述菌株已于2006年11月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，菌株名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SFA-H31，保藏号为CGMCCNO.1869。
上述的枯草芽孢杆菌，其生物学特征是：不运动，生内生孢子，孢囊不膨大，没有伴孢晶体生成，37℃液体培养幼时呈现杆状，单个、成对或呈链状排列，16-18小时开始生孢子，24±2小时孢子成熟脱落(菌体营养体和芽孢形态参见附图1，附图2)；37℃固体培养菌落初期呈圆形，随着培养时间的延长逐渐呈不规则状；菌落扁平、毛玻璃状表面、不突起；斜面培养16-20小时开始生芽孢，48±2小时芽孢完全脱落；生理生化特征是：革兰氏染色阳性，好氧，化能异养菌，从葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖产酸，发酵葡萄糖不产气，不利用柠檬酸盐，接触酶阳性，还原硝酸盐；测定16SrRNA的基因序列的结果显示，其基因序列长度为1468bp。
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，35～40℃条件下，静止培养24～48小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于30～40mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为150～180转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35～40℃培养12～18小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以1～5％的体积比的接种量，将种子液接种于装有80-100mL(500mL三角瓶)发酵培养基的摇瓶中，35～40℃，转速为150～180转/分钟，摇瓶发酵48-72小时，当发酵液中检测不到葡萄糖残留时，发酵结束；
50L发酵罐发酵：以1～5％的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33～35L发酵培养基的50L发酵罐中，35～40℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为150～200r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶0.5±0.1vvm，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵时间为40～70小时；调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在5-20％的饱和度，发酵液初始pH值为7.0～7.5，发酵过程中流加酸碱使发酵液的pH维持为6.0～7.0，发酵过程中间隔定时取样测定发酵液中的葡萄糖和3-羟基丁酮的浓度，当发酵液中葡萄糖浓度不再降低，3-羟基丁酮浓度不再上升时，结束发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以3000～3500转/分钟离心5～8分钟，测定上清液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量，并计算葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率；同时收集发酵液在80℃进行减压蒸馏，馏出份冷凝收集液进行气相色谱分析测定发酵产物中3-羟基丁酮的纯度。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L，  pH7.0-7.2，蒸馏水配制；
上述液体种子培养基组成：葡萄糖20～25g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，pH7.0-7.2，自来水配制；
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖80-140g/L，酵母膏2g/L，玉米浆10g/L，pH7.0-7.2，自来水配制。
上述的应用中，步骤(2)、(3)、(4)所述培养温度优选37±0.2℃。
上述的应用中，步骤(2)所述培养时间优选30小时。
上述的应用中，步骤(3)所述培养时间优选12-14小时。
上述的应用中，步骤(4)所述发酵培养基初始葡萄糖浓度优选100-120g/L。
上述的应用中，步骤(4)所述溶解氧水平优选10-15％的饱和度。
上述的应用中，步骤(4)所述发酵过程中的发酵液pH优选6.5±0.2。
上述葡萄糖按下述方法测定：
使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4C型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。
上述3-羟基丁酮按下述方法测定：
化学比色法：参阅参考文献(W.W.Westerfeld，A COLORIMETRIC DETERMINATIONOF BLOOD ACETOIN.J.Biol.Chem.，1945；161：495-502)。
标准曲线的绘制：按下表顺序加入各种试剂和溶液，60℃显色15min，使用分光光度计在530nm下测吸光值，绘制标准曲线。
发酵液离心取上清液适当稀释至3-羟基丁酮的含量约在10μg，按上述方法显色，530nm测定吸光值，根据标准曲线及稀释倍数计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
气相色谱法定性分析：
气相色谱条件：使用GEP-20M毛细管柱，载气为氮气(N2)，流速为0.9mL/min；柱头压0.10MPa；进样口温度200℃；程序升温：100℃保时3分钟，8℃/min升温致180℃，保时3分钟；进样量1μL；分流比5∶1。在上述条件下3-羟基丁酮的保留时间为8.7分钟左右，双乙酰的保留时间为4.5分钟左右，2，3-丁二醇的保留时间为13.5分钟左右。
本发明所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869可发酵转化葡萄糖直接生成并获得目的产物3-羟基丁酮，单位体积发酵液中3-羟基丁酮产率高，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率高，产3-羟基丁酮纯度高，菌种发酵性能稳定。
本发明所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869可发酵转化葡萄糖直接生成并获得目的产物3-羟基丁酮，产物纯度高，不产生丁二酮和2，3丁二醇等3-羟基丁酮常见联产化合物，是一株极具研究开发价值的3-羟基丁酮生产菌株。
本发明采用生物发酵的方法，以葡萄糖为原料生产3-羟基丁酮具有生产方法简单，条件温和，原料来源丰富，生产成本低等特点，极具诱人的应用前景。
本发明人未检索到有利用枯草芽孢杆菌以生产3-羟基丁酮为目的产物的文献报道，也未检索到枯草芽孢杆菌产3-羟基丁酮与CGMCC NO.1869菌株相同的高纯度、高产率及高转化率的文献报道。
利用本发明所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869发酵，以葡萄糖为原料发酵生产3-羟基丁酮产率最高可达55g/L以上，葡萄糖转化3-羟基丁酮的平均转化率为45％，最高达50％。馏出份冷凝收集液经气相色谱分析测定发酵产物中3-羟基丁酮的峰面积平均为总面积的95％左右，最高可达98％以上。
附图说明
本发明提供的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于2006年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC N0.1869。
图1示枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌体营养体形态(×1600)。
图2示枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869芽孢形态(×1600)。
图3示枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株发酵液减压蒸馏馏出份冷凝收集液气相色谱图。该图谱为一次发酵发酵液减压蒸馏馏出份冷凝收集液气相色谱图，图中保留时间为8.768分钟的是3-羟基丁酮，峰面积占总峰面积的96.4％。
具体实施方式
实施例1 产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的选育
将出发菌株SFA-W15(一株少量积累3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株)接种于液体种子培养基，37℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×108-109个/ml。
取上述菌悬液10ml放入平皿中，置30W紫外灯下照射，照射距离15cm，照射时间为3分钟、5分钟、7分钟、10分钟，间隔取样适当稀释后涂布含有0.5％LiCl的筛选平板，避光37℃培养1-2天，挑取单菌落移接斜面，37℃培养1-2天，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，37℃摇瓶发酵60小时，取发酵液3000转/分钟离心5分钟，取上清液测定发酵液中残留葡萄糖浓度和3-羟基丁酮含量，选取残留葡萄糖浓度低、3-羟基丁酮含量高的菌株为目的菌株。
将目的菌株再经摇瓶发酵复筛和进一步分离筛选，得到一株稳定耗糖速率和3-羟基丁酮产量都有提高的突变菌株SFA-U97。
SFA-U97菌株接种初始葡萄糖浓度为78.2g/L的发酵培养基，37℃摇瓶培养60小时结束发酵，发酵液中检测不到葡萄糖，3-羟基丁酮含量为30.6g/L，转化率为39.1％。
实施例2 高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株的选育
将实施例1筛选到的突变菌株SFA-U97菌株接种液体种子培养基中，37℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×108-109个/ml，备用。
亚硝基胍处理液配制：称取亚硝基胍20mg，放置于100ml无菌三角瓶中，加丙酮2ml使其溶解，再加入18ml Tris缓冲液(pH6.0，0.5mol/L)混匀，备用。
取上述亚硝基胍处理液10ml，加入10ml菌悬液，30℃保温振荡50-60分钟，每隔10分钟取样一次，取样后首先稀释1000倍终止反应，然后再适度稀释，涂布平板，37℃培养1-2天，挑取单菌落移接斜面，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，37℃摇瓶发酵60小时，发酵液3000转离心5分钟，取上清液测定发酵液中残留葡萄糖浓度和3-羟基丁酮含量，选取残留葡萄糖浓度低、3-羟基丁酮含量高的菌株为目的菌株。
将目的菌株再经摇瓶发酵复筛和进一步分离筛选，选育得到一株遗传性质稳定、3-羟基丁酮产量最高达55g/L以上的突变菌株SFA-H31。
上述菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SFA-H31，已于2006年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC NO.1869。
上述液体种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20，酵母膏20，磷酸二氢钾0.1，磷酸氢二钾0.1，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
上述筛选用平板培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠3，硫酸镁0.1，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠3，硫酸镁0.1，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述发酵培养基的组成(g/L)：葡萄糖80-140，酵母膏2，玉米浆10，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例3 枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1869；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，37℃条件下，静止培养30小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于30mL液体种子培养基中(250mL三角瓶)，置旋转转速为160转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养12小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以3％的体积比的接种量，将种子液接种于装有80mL发酵培养基的摇瓶(500mL三角瓶)中，37℃，转速为160转/分钟，摇瓶发酵60小时，当发酵液中检测不到葡萄糖残留时，发酵结束；
(5)产物检测：取上述发酵液以3000转/分钟离心8分钟，测定上清液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量，并计算葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率；同时收集发酵液在80℃进行减压蒸馏，馏出份冷凝收集液进行气相色谱分析测定发酵产物中3-羟基丁酮的纯度。
发酵液检测3-羟基丁酮的含量为47.5g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为43.2％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的94.7％。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.2，蒸馏水配制；
上述液体种子培养基组成：葡萄糖22g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，pH7.0-7.2，自来水配制；
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖110g/L，酵母膏2g/L，玉米浆10g/L，pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例4 枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1869；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，37℃条件下，静止培养28小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于60mL液体种子培养基中(500mL三角瓶)，重复接种20瓶，置旋转转速为150转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养14小时，得种子液；
(4)发酵培养：
50L发酵罐发酵：以4％的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33L发酵培养基的50L发酵罐中，37℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为200r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶0.5vvm，罐内压力0.1 MPa；调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在10-15％的饱和度，发酵液初始pH值为7.0～7.2，发酵过程中流加酸碱使发酵液的pH维持为6.5，发酵过程中定时取样测定发酵液中的葡萄糖和3-羟基丁酮的浓度，当发酵液中3-羟基丁酮浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为52小时；
(5)产物检测：取上述发酵液以3500转/分钟离心5分钟，测定上清液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量，并计算葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率；同时收集发酵液在80℃进行减压蒸馏，馏出份冷凝收集液进行气相色谱分析测定发酵产物中3-羟基丁酮的纯度。
发酵液检测3-羟基丁酮的含量为55.5g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为48.26％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的96.4％(参见附图3)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.2，蒸馏水配制；
上述液体种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，pH7.0-7.2，自来水配制；
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖115g/L，酵母膏2g/L，玉米浆10g/L，pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例5 枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1869；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，35℃条件下，静止培养40小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于30mL液体种子培养基中(250mL三角瓶)，置旋转转速为150转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35℃培养18小时，得种子液；
(4)发酵培养：
50L发酵罐发酵：以2％的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33L发酵培养基的50L发酵罐中，35℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为150r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶0.5±0.1vvm，罐内压力0.1±0.02MPa；调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在5-10％的饱和度，发酵液初始pH值为7.0～7.1，发酵过程中流加酸碱使发酵液的pH维持为6.1～6.2，发酵过程中定时取样测定发酵液中的葡萄糖和3-羟基丁酮的浓度，当发酵液中3-羟基丁酮浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为48小时；
(5)产物检测：取上述发酵液以3200转/分钟离心7分钟，测定上清液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量，并计算葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率；同时收集发酵液在80℃进行减压蒸馏，馏出份冷凝收集液进行气相色谱分析测定发酵产物中3-羟基丁酮的纯度。
发酵液检测3-羟基丁酮的含量为34.6 g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为43.25％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的96.8％。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.2，蒸馏水配制；
上述液体种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，pH7.0-7.2，自来水配制；
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖80g/L，酵母膏2g/L，玉米浆10g/L，pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例6 枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1869；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，40℃条件下，静止培养26小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于40mL液体种子培养基中(250mL三角瓶)，置旋转转速为180转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，40℃培养18小时，得一级种子液，以5％的体积比的接种量，将种子液接种于装有100mL种子培养基的摇瓶中(500mL三角瓶)，40℃，转速为180转/分钟，摇瓶培养20小时，得二级种子液；
(4)发酵培养：
50L发酵罐发酵：以5％的体积比的接种量，将二级种子液接种于罐装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，40℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为200r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶0.5±0.1vvm，罐内压力0.1±0.02MPa；调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在20％的饱和度，发酵液初始pH值为7.4～7.5，发酵过程中流加酸碱使发酵液的pH维持为6.8～7.0，发酵过程中间隔2小时取样测定发酵液中的葡萄糖和3-羟基丁酮的浓度，当发酵液中3-羟基丁酮浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为70小时；
(5)产物检测：取上述发酵液以3400转/分钟离心6分钟，测定上清液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量，并计算葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率；同时收集发酵液在80℃进行减压蒸馏，馏出份冷凝收集液进行气相色谱分析测定发酵产物中3-羟基丁酮的纯度。
发酵液检测3-羟基丁酮的含量为55.67g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为45.63％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的95.8％。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.2，自来水配制；
上述液体种子培养基组成：葡萄糖25g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，pH7.0-7.2，自来水配制；
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖122g/L，酵母膏2g/L，玉米浆10g/L，pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例7 枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869在制备3-羟基丁酮中的应用
将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株菌种接种于斜面培养基活化，36℃条件下，静止培养40小时，备用；
按液体种子培养基的组成配制种子培养基，初始葡萄糖浓度实测为21.5g/L，250ml三角瓶装液量为30ml，118℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环，置旋转转速为150转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养12小时，得种子液，取种子液稀释10倍置610nm测吸光值为0.358；
按发酵培养基的组成配制发酵培养基，初始葡萄糖浓度实测为115g/L，500ml三角瓶装液量为80ml，118℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至室温，接种种子液3ml，置旋转转速为150转/分钟、旋转半径为40mm摇床上，37℃培养68小时结束发酵，发酵液以3000转/分钟离心5分钟，取上清液测定葡萄糖浓度和3-羟基丁酮的含量分别为0g/L和53.5g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为46.52％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的94.3％。
实施例8 枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1 869在制备3-羟基丁酮中的应用
将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株菌种接种于斜面培养基活化，37℃条件下，静止培养38小时，备用；
按液体种子培养基的组成配制种子培养基，初始葡萄糖浓度实测为20g/L，250ml三角瓶装液量为40ml，118℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至室温，接种斜面菌种悬液5ml，置旋转转速为150转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上37℃培养12小时，得种子液，取种子液稀释10倍置610nm测吸光值为0.326。
以50L发酵罐按30L装液量配制发酵培养基，调整pH7.2，118℃实罐灭菌20分钟，循环水冷却至37℃后接种培养好的种子液600ml，接种后立即取样测定葡萄糖浓度为116.4g/L。
初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为200转/分钟，通气比1∶0.5vvm(料液容积与每分钟通气量(以容积计)的比值)，罐内压力0.1MPa。发酵过程中控制发酵温度37±0.2℃，通过调节搅拌转速和通气比控制溶解氧为5-10％，pH6.5±0.2。
发酵过程中每8小时取样，测定发酵液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量及菌体浓度，当葡萄糖含量低于10g/L时，每两小时取样测定发酵液中葡萄糖浓度及3-羟基丁酮含量，至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加时结束发酵，发酵周期为56小时。
发酵结束后取发酵液以3000转/分钟离心5分钟，取上清液测定葡萄糖和3-羟基丁酮的含量分别为0g/L和54.5g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为46.8％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的96.2％。
实施例所述葡萄糖按下述方法测定：
使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4C型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。
实施例所述3-羟基丁酮按下述方法测定：
化学比色法：参阅参考文献(W.W.Westerfeld，A COLORIMETRIC DETERMINATIONOF BLOOD ACETOIN.J.Biol.Chem.，1945；161：495-502)，略有改动。
标准曲线的绘制：按下表顺序加入各种试剂和溶液，60℃显色15min，使用分光光度计在530nm下测吸光值，绘制标准曲线。
Figure A20071001340300121
发酵液离心取上清液适当稀释至3-羟基丁酮的含量约在10μg，按上述方法显色，530nm测定吸光值，根据标准曲线及稀释倍数计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
其中：
3-羟基丁酮标准溶液：精确3-羟基丁酮0.1g，用蒸馏水溶解并定容至100ml作为储备液，4保存，使用时精确吸取储备液1ml，定容至100ml。
5％肌酸溶液：用蒸馏水配制。
5％甲萘酚溶液：用2.5mol/LNaOH配制。需新鲜配制。
气相色谱法定性分析：
气相色谱条件：使用GEP-20M毛细管柱，载气为氮气(N2)，流速为0.9mL/min；柱头压0.10MPa；进样口温度200℃；程序升温：100℃保时3分钟，8℃/min升温致180℃，保时3分钟；进样量1μL；分流比5∶1。在上述条件下3-羟基丁酮的保留时间为8.7分钟左右，双乙酰的保留时间为4.5分钟左右，2，3-丁二醇的保留时间为13.5分钟左右。

Claims (8)

1.一株枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1869；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，35～40℃条件下，静止培养24～48小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于30～40mL液体种子培养基中，置旋转转速为150～180转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35～40℃培养12～18小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以1～5％的体积比的接种量，将种子液接种于装有80～100mL发酵培养基的摇瓶中，35～40℃，转速为150～180转/分钟，摇瓶发酵48-72小时，当发酵液中检测不到葡萄糖残留时，发酵结束；
50L发酵罐发酵：以1～5％的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33～35L发酵培养基的50L发酵罐中，35～40℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为150～200r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶0.5±0.1vvm，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵时间为40～70小时；调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在5-20％的饱和度，发酵液初始pH值为7.0～7.5，发酵过程中流加酸碱使发酵液的pH维持为6.0～7.0，发酵过程中定时取样测定发酵液中的葡萄糖和3-羟基丁酮的浓度，当发酵液中葡萄糖浓度不再降低，3-羟基丁酮浓度不再上升时，结束发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以3000～3500转/分钟离心5～8分钟，测定上清液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量，并计算葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率；同时收集发酵液在80℃进行减压蒸馏，馏出份冷凝收集液进行气相色谱分析测定发酵产物中3-羟基丁酮的纯度；
上述斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.2，蒸馏水配制；
上述液体种子培养基组成：葡萄糖20～25g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，pH7.0-7.2，自来水配制；
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖80-140g/L，酵母膏2g/L，玉米浆10g/L，pH7.0-7.2，自来水配制。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)所述培养温度为37±0.2℃。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述培养时间为30小时。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述培养时间为12-14小时。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述发酵培养基初始葡萄糖浓度为100-120g/L。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述溶解氧水平为10-15％的饱和度。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述发酵过程中的发酵液pH为6.5±0.2。
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