CN103333842B - 一株产3-羟基丁酮的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌SFA-H43（Bacillus subtilisSFA-H43），该菌株已于2013年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2013181。本发明还提供了一种可以进一步提高SFA-H43菌株3-羟基丁酮产率的发酵过程控制新工艺，即菌株SFA-H43在发酵3-羟基丁酮过程中，当发酵液中碳源耗尽后继续培养8～16小时，SFA-H43菌株3-羟基丁酮的产率会再增加15～20%。

Description

一株产3-羟基丁酮的芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌，及其在生产3-羟基丁酮中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

3-羟基丁酮（acetoin）又名乙偶姻、乙酰甲基甲醇，自然存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中，具有特有的奶油香味。

3-羟基丁酮是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，是国际上常用的香料品种。主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料，中国国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食品香料。80%含量的3-羟基丁酮俗称“醋嗡”，是酒类调香中一个重要的品种。3-羟基丁酮还是一种重要的化工合成原料和医药中间体。2004年美国能源部将其列为30种优先开发的平台化合物之一（黄和等CN101294143A）。

3-羟基丁酮的生产主要是以丁二酮或2,3-丁二醇为原料通过化学法合成（张晓舟等，江苏化工,2001,29(2):29-31.）。化学合成方法生产3-羟基丁酮一般都是以丁二酮或2,3-丁二醇为原料。丁二酮或2,3-丁二醇这两种化合物也是重要的合成香料，非大宗化学品，要大规模生产3-羟基丁酮，原料来源将会受到限制。同时化学合成方法制备3-羟基丁酮，反应过程相对复杂，转化率较低，产品纯度低，过程污染较重，因此，人们将目光逐步转向了生物转化生产3-羟基丁酮。

生物转化法生产3-羟基丁酮具有原料来源丰富、条件温和、环境友好等优势，能从根本上改变3-羟基丁酮生产过程中所面临的资源与环境压力。3-羟基丁酮是多种微生物糖代谢的中间产物（Xiao Z，Xu P.Acetoin metabolism in Bacteria.Criti-cal Reviews inMicrobiology，2007，33:127-140．），理论上讲以糖质为原料利用微生物发酵可以生产3-羟基丁酮。早期关于微生物产生3-羟基丁酮的文献报道多数是关于3-羟基丁酮代谢途径理论方面的研究（Lopez et.al.Acetoin Degradation in Bacillus subtilis by DirectOxidative Cleavage.Eur.J.Biochem.57,425-430(1975)），微生物在生长过程中会合成3-羟基丁酮，但在后续生长过程中3-羟基丁酮又会被作为碳源利用，培养液中3-羟基丁酮浓度很低，3-羟基丁酮不会过量积累。另外，3-羟基丁酮作为产物积累的研究一般是作为2,3-丁二酮和2,3-丁二醇发酵的副产物提及(Braneni et.al.Diacetyl and AcetoinProduction by Lactobacillus casei.Applied Microbiology,1971,(10):517-521；Yu et.al.Fed-batch approach to production of2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae grownon high substrate concentration.Appl Environ Microbial,1983,V46:630-635)，3-羟基丁酮作为主要目标产物的研究比较少见。但，近年来随着化石资源的逐渐枯竭，利用生物技术生产化学品成为工业生物技术的研究热点，有关3-羟基丁酮直接作为目标产物的文献报道也在逐年增多（李树波等，微生物生产3-羟基丁酮研究进展，生物加工过程，2011，9(6)：63-68．）。发明人注意到近年来文献报道的3-羟基丁酮产生菌株中，芽孢杆菌属的菌株3-羟基丁酮发酵产率普遍较高(许平等，一株高产3-羟基丁酮的短小芽孢杆菌，中国专利，CN100343385C，2004；赵祥颖等，一株产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌，中国专利，CN101016530A，2007；许正宏等，一株高产3-羟基丁酮地衣芽孢杆菌MEL09的筛选和应用，中国专利，CN101899407A，2010；任潇等，枯草芽孢杆菌发酵产3-羟基丁酮的条件优化，食品科技，2010,35(8)：13-17；范宜晓等，产3-羟基丁酮菌株的筛选及产物分析，食品发酵工业，2012,38(11):42-46)。芽孢杆菌属菌株与其他菌株相比3-羟基丁酮产率高、副产物少，同时芽孢杆菌属菌株还具有非致病菌、易培养等特点，是微生物发酵优先利用的微生物种类之一（Michael et.al..Bacillus introduction．Encyclopediaof Food Microbiology，1999:13-119．）。因此，本发明将芽孢杆菌菌株作为生物转化生产3-羟基丁酮目的菌株筛选的主要方向。

要实现生物发酵3-羟基丁酮的高效生产，除了要获取高产菌株外，目标菌株发酵培养基组成及发酵工艺的控制也非常关键，通常通过培养基优化和工艺控制优化可以显著提高目标菌株3-羟基丁酮的产率，比如：任潇等以葡萄糖为碳源，采用枯草芽孢杆菌发酵产生3-羟基丁酮，通过培养基优化，菌株3-羟基丁酮产率由原来的30g/L提高到40.6g/L，生产强度由原来的0.35g/L h提高到0.47g/L h（任潇等，枯草芽孢杆菌发酵产3-羟基丁酮的条件优化，食品科技，2010,35(8)：13-17）；范宜晓等，利用响应面法优化Bacillus subtilis SF4-3产3-羟基丁酮发酵培养基，优化后菌株3-羟基丁酮的产率提高了51%（食品科技，2013,38(3):18-21）。Liu et.al.通过培养基和发酵条件的优化，菌株3-羟基丁酮产率提高84.86%（Liu et.al.Efficient production of acetoin by the newly isolated Bacilluslicheniformis strainMEL09 Process Biochemistry46(2011)390–394）。工艺控制方面，Sun等在3.7L发酵罐采用两段控制转速工艺，改变发酵过程中氧的供给，也达到提高3-羟基丁酮产率的目的（Sun et.al，Enhanced Acetoin Production by Serratia marcescens H32Using Statistical Optimization and a Two-stage Agitation Speed Control Strategy，Biotechnology and Bioprocess Engineering，2012，17:598-605）。

通过以上论述分析可知：利用生物技术生产3-羟基丁酮是3-羟基丁酮规模化生产未来的发展方向，芽孢杆属菌株是3-羟基丁酮高产菌株主要的筛选目标之一，发酵培养基和发酵过程的优化控制有利于菌株3-羟基丁酮产量的提升。

发明内容

针对利用微生物发酵产3-羟基丁酮的现有技术，本发明提供了一株高产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株SFA-H43，通过优化获得了菌株SFA-H43高产3-羟基丁酮的发酵培养基组成和培养条件参数，并提供了一种利用该菌株进一步提高3-羟基丁酮产率的发酵进程控制新工艺。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌，是从白酒大曲砖中分离筛选到的，通过菌株形态观察、生理生化实验和16srDNA序列测定鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为枯草芽孢杆菌SFA-H43（Bacillus subtilis SFA-H43），该菌株已于2013年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2013181。

所述菌株SFA-H43在LB培养基平板上37℃培养生长迅速，培养12小时即可观察到明显的菌落，培养24h菌落直径约0.2-0.4cm，菌落基本呈圆形，边缘不整齐。菌落为乳白色，表面干燥无光泽，不透明，与枯草芽孢杆菌标准菌株类似；在LB液体培养基中，37℃摇床培养12-16小时，细胞呈直杆状，呈单个或短链存在，革兰氏染色阳性，继续培养至20-24小时，开始生芽孢，芽孢中生或偏端生，椭圆形，不膨大；LB半固体培养基穿刺培养，37℃培养24小时，可观察到菌体沿着穿刺线成发散雾状生长，说明菌体可以运动。生理生化实验表明菌株SFA-H43可以利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖产酸，发酵葡萄糖不产气，利用柠檬酸盐，接触酶阳性，还原硝酸盐；可以水解酪蛋白、淀粉和明胶，特征与文献记载的枯草芽孢杆菌特征相符。菌株SFA-H43 16S rDNA序列通过NCBI的BLAST程序在GenBank数据库中进行对比，发现菌株SFA-H43的16S rDNA序列与GenBank数据库中的多株枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列相似性达到99-100%。综合上述培养特征、生理生化实验特征以及16S rDNA序列特征，鉴定菌株SFA-H43为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。菌株SFA-H43 16S rDNA序列已提交GenBank的保存，序列号为KF318713。

所述菌株SFA-H43通过对其培养基组分（碳源、氮源、无机盐等）和培养条件（培养温度、pH、溶解氧等）的优化后，其3-羟基丁酮产率可达50g/L以上，具有工业开发价值。同时本发明还提供了一种可以进一步提高菌株SFA-H43 3-羟基丁酮产率的发酵进程控制新工艺，即菌株SFA-H43在发酵3-羟基丁酮过程中，当培养液中的碳源耗尽后，继续培养8～16小时，其3-羟基丁酮的产率会再增加15～20%。

一种利用菌株SFA-H43（CCTCC No.2013181）发酵生产3-羟基丁酮的发酵控制新工艺，为以下两种方式之一或它们的组合：

（1）摇瓶发酵：取35～40℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面，用接种环取1～2环斜面菌种，接种到50ml液体种子培养基中，37℃培养10～16小时，以1～10%（体积百分数）的接种量接种到摇瓶中，35～40℃、180～220rpm，发酵至碳源耗尽，继续培养12～20小时至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加，结束发酵。结果显示：碳源耗尽时，取样测定发酵液中3-羟基丁酮含量为38～45g/L，继续培养至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加时，发酵液中3-羟基丁酮的含量可达45～52g/L。可见，当发酵液中的碳源耗尽以后，继续培养一段时间，发酵液中3-羟基丁酮的含量会增加约15～20%。附图2为菌株SFA-H43摇瓶发酵发酵进程曲线。

（2）发酵罐发酵：在无菌操作的条件下用接种环取1～2环35～40℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种，接种到液体种子培养基中，37℃培养10～16小时，再以1～10%（体积百分数）的接种量接种到发酵罐中（65～75%的装液量），35～40℃进行通风搅拌培养，培养过程中控制pH在5～7，通过调节搅拌转速和通风比，保持发酵液中相对溶解氧浓度5～20%，发酵培养至碳源耗尽，再继续培养12～20小时，至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加，结束发酵。结果显示：碳源耗尽时，取样测定3-羟基丁酮含量为45～52g/L继续培养至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加，取样测定发酵液中3-羟基丁酮的含量为55～62g/L。可见，当发酵液中的碳源耗尽后，继续培养一段时间，发酵液中3-羟基丁酮的含量会增加约15～20%。图3为菌株SFA-H43 10L发酵罐发酵发酵进程曲线。

进一步地，所述斜面培养所用的斜面菌种培养基的组成为：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl3g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.0～7.2。

进一步地，所述液体种子培养基的组成为：葡萄糖60～100g/L，酵母浸提物2～10g/L，玉米浆8～12g/L，其余为水，pH7.0～7.2。

进一步地，所述发酵培养基组成为：葡萄糖140～160g/L，酵母浸提物3～6g/L，玉米浆5～10g/L，(NH₄)₂HPO₄2～3g/L，MgSO₄2g/L，MnSO₄0.2g/L，其余为水，pH7.0～7.2。

优选的，所述用液体种子培养基培养的时间为12～14小时。

优选的，所述摇瓶发酵或发酵罐发酵的培养温度为36～38℃。

优选的，所述发酵罐发酵的pH控制在5.5～6.5。

优选的，所述发酵罐发酵的溶解氧浓度保持在10～15%。

本发明提供的产3-羟基丁酮芽孢杆菌菌株，是通过以下方法筛选到的：

按常规菌种分离筛选方法，从市场或生产现场获取白酒大曲样品、豆瓣酱和纳豆等发酵食品样品、以及富含芽孢杆菌的腐殖质土壤样品等，在无菌操作的条件下，取上述各种样品2g，放入装有30mL无菌水的250mL三角瓶中，震荡后静置30min，沸水浴煮沸5min过滤，取滤液1mL接种到装有30mL富集培养基的250mL三角瓶中于35～40℃、180～220rpm摇床培养24h，再将富集液适当稀释涂布到分离平板培养基上，35～40℃恒温培养24～48h，待长出单菌落后，挑取类似芽孢杆菌的菌落（菌落生长速度快、无光泽或亚光、易扩散、边缘不整齐等）移接斜面，35～40℃恒温培养2～3天。斜面菌种培养成熟后，通过涂片、染色、显微镜观察，挑选芽孢杆菌菌株进行下一步筛选。将挑取的芽孢杆菌菌株，通过一支接一支的方式接种试管培养基（150*15的试管，装5ml培养基），35～40℃振动培养2～3天。取100*10的试管，分别加入菌株培养液10ul，加水1ml，加100ul5%的甲萘酚(用10%的氢氧化钠溶液配制)，加400ul0.1%的肌酸水溶液，混合均匀，37℃保温显色5min，挑选显色或显色颜色较深的对应菌株作为下一步筛选的目的菌株。通过初筛获得的菌株再通过一支接三瓶的方式接种摇瓶（250ml三角瓶，装30ml培养基），180～220rpm，35～40℃振荡培养2～3天。培养液4000～5000rpm离心5～10min，取上清液适当稀释，采用比色法测定3-羟基丁酮含量。通过上述筛选过程，本发明从中国传统白酒大曲砖样品中筛选到一株3-羟基丁酮高产菌株，编号为SFA-H43，经培养基和培养条件优化后，以葡萄糖为碳源摇瓶发酵72小时，菌株SFA-H433-羟基丁酮产率达40-45g/L。气相色谱分析表明菌株SFA-H43发酵液主要产物为3-羟基丁酮，含有少量的2,3-丁二醇副产物（图1）。通过菌株形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列测定，菌株SFA-H43鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌株已于2013年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2013181。

上述所涉及的富集培养基的组成为：葡萄糖20g/L，酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，其余为水，pH7.0～7.2。

上述所涉及的平板分离培养基的组成为：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.0～7.2。

进一步地，所述菌种筛选用发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L，酵母浸提物5g/L，(NH4)₂SO₄2g/L，MgSO₄2g/L，MnSO₄0.2g/L，K₂HPO₄1g/L，KH₂PO₄2g/L，其余为水，pH7.0～7.2。

本发明对菌株SFA-H43发酵液中3-羟基丁酮的定性检测方法为：

发酵液经4000～5000rpm离心去菌体；去除菌体后的发酵清液，加入0.1～0.3%活性炭脱色，脱色清液经阴阳离子交换树脂除离子，收集离交液采用气相色谱分析，与标准3-羟基丁酮样品比较。气相色谱(GC)条件：色谱柱：PEG-20M石英交联毛细管柱；载气：高纯氮气；载气流速：0.9mL/min；柱头压：0.1Mpa；色谱柱控温程序：70℃保持3min，3.5℃/min升温至100℃，保持1min，从100℃以5℃/min升温速度升温至220℃，保持20min。进样口温度：220℃；进样量：1μL；检测器类型：氢火焰离子化检测器（FID）；检测器温度：220℃。

本发明3-羟基丁酮的定量检测方法为比色法：

3-羟基丁酮在碱性条件下氧化为2,3-丁二酮，2,3-丁二酮与带有胍基的肌酸反应可产生粉红色复合物，加入甲萘酚可加速此反应，该复合物在波长530nm处有最大吸收峰，在吸光值在0.3～0.9范围内与3-羟基丁酮的浓度呈线性关系。发酵结束后，收集发酵液，4500r/min离心10min，上清液稀释至3-羟基丁酮含量至1～20μg/mL左右，取稀释样品4ml，加入5%的甲萘酚(用10%的氢氧化钠溶液配制）1ml，再加入0.1%的肌酸水溶液1ml，充分振荡混匀，60℃显色15min，530nm处测定吸光度，同时绘制3-羟基丁酮的标准曲线，根据标准曲线计算3-羟基丁酮产量。

本发明对葡萄糖进行检测的方法为：

采用SBA-40D生物传感分析仪测定葡萄糖含量，测定原理是固定化葡萄糖氧化酶膜催化氧化葡萄糖生成过氧化氢，通过电极的检测电信号，通过电流法检测出葡萄糖浓度。发酵结束后，收集发酵液，4500r/min离心10min，上清液稀释至葡萄糖含量约为1g/L，进行测定，用1g/L标准葡萄糖溶液做参比。

本发明的提供的产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株SFA-H43，3-羟基丁酮产量高，发酵工艺控制简单，具有工业开发价值。本发明提供的3-羟基丁酮的发酵控制工艺，可使3-羟基丁酮的发酵终产率再提高15～20%，效果突出，应用价值巨大。

附图说明

本发明提供的产3-羟基丁酮的芽孢杆菌SFA-H43，分类命名为枯草（Bacillus subtilis），已于2013年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2013181，保藏地址为：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

图1：菌株SFA-H43发酵液气相色谱图，主峰为3-羟基丁酮，两个次峰是为2,3-丁二醇的两种异构体。（2,3-丁二醇标样在同一位置也出现两个峰，参见文献：林清等，一株以葡萄糖为底物产2,3-丁二醇微生物，微生物学通报，2010,37(11):1581-1587）

图2：菌株SFA-H43摇瓶发酵进程。

图3：菌株SFA-H43 10L发酵罐发酵进程。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 菌种筛选

按常规菌种分离筛选方法，取白酒大曲曲砖样品粉碎，称取2g样品，放入装有30mL无菌水的250mL三角瓶中，震荡30min，煮沸5min，过滤，取滤液1mL接种到装有30mL富集培养基的250mL三角瓶中于37℃、180rpm摇床培养24h，再将富集液稀释涂布到平板培养基，37℃恒温培养24～48h，待长出单菌落后，挑取似芽孢杆菌的菌落移接斜面，37℃恒温培养2～3天。斜面菌种培养成熟后，通过涂片、单染色、显微镜观察，共得到芽孢杆菌菌株109株。将挑选的菌株斜面，通过一支接一支的方式接种试管（150*15的试管，装5ml菌株筛选发酵培养基），37℃振动培养2～3天。取100*10的试管，分别加入菌株培养液10ul，加水1ml，加100ul5%的甲萘酚(用10%的氢氧化钠溶液配制)，加400ul0.1%的肌酸水溶液，混合均匀，37℃保温显色5min，共挑选显色颜色较深的菌株12株。将这12株菌株，再通过一支接三支的方式接种摇瓶（250ml三角瓶，装30ml菌株筛选发酵培养基），180rpm，37℃摇瓶培养72小时。培养液经4000rpm离心5min，上清液适当稀释后用比色法测定3-羟基丁酮含量，获得到一株3-羟基丁酮产率达35.6g/L的菌株，统一编号为SFA-H43。该菌株通过菌株形态观察、生理生化实验和16srDNA序列测定，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌，该菌株已于2013年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2013181。

实施例2 产物定性鉴定

取35～40℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面，用接种环取1～2环斜面菌种，接种到液体种子培养基中，37℃培养14小时，5%的接种量接种发酵培养基，37℃摇瓶发酵培养72小时，发酵液经4500rpm离心10min，取上清液，加0.1%活性炭，60℃保温脱色30min，过滤去除活性炭，取清液过依次通过阳阴离子交换树脂柱（阳离子交换柱：30mm*500mm，装731阳离子交换树脂并按要求处理合格；阴离子交换柱：30mm*500mm，装D315阴离子交换树脂并按要求处理合格），收集合格离交液，进行气相色谱分析，结果显示菌株SFA-H43发酵液中的主体成分的出峰时间与标准3-羟基丁酮出峰时间一致，进一步确认菌株SFA-H43主体产物为3-羟基丁酮，同时通过2,3-丁二酮和2,3-丁二醇标准样的出峰时间比对，确认菌株SFA-H43发酵液中含有少量2,3-丁二醇，没有检测到2,3-丁二酮成分。

实施例3 发酵培养基优化

本发明对菌株SFA-H43发酵3-羟基丁酮培养基碳源、氮源等发酵培养基组成进行了优选。

碳源优选：取35～40℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面，用接种环取1～2环斜面菌种，接种到50ml液体种子培养基中，37℃培养12小时，5%的接种量接种含不同碳源的摇瓶发酵培养基（碳源分别为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、糖蜜、葡萄糖母液、果糖，浓度均为120g/L，其他组分相同），37℃摇瓶发酵培养72小时，取发酵液经4500rpm离心15min，上清液适当稀释用化学显色的方法测定3-羟基丁酮的含量，结果显示菌株SFA-H43利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、糖蜜、葡萄糖母液、果糖均可生产3-羟基丁酮，其中利用葡萄糖3-羟基丁酮产率最高（30～35g/L），利用麦芽糖、蔗糖、木糖、糖蜜、葡萄糖母液、果糖等，3-羟基丁酮的产率在15～25g/L不等，因此菌株SFA-H43发酵生产3-羟基丁酮碳源优选为葡萄糖。葡萄糖浓度在120～160g/L的范围内，随着葡萄糖浓度升高，菌株3-羟基丁酮产率也相应增加。

氮源优选：取35～40℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面，用接种环取1～2环斜面菌种，接种到液体种子培养基中，37℃培养12小时，5%的接种量接种含不同氮源的摇瓶发酵培养基（氮源分别为蛋白胨、酵母浸提物、玉米浆、脲、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵，浓度均为10g/L，碳源为葡萄糖，其他组分相同），37℃摇瓶发酵培养72小时，取不同氮源的发酵液经4500rpm离心15min，上清液适当稀释用显色法测定3-羟基丁酮的含量，结果显示菌株SFA-H43单独利用蛋白胨、酵母浸提物、玉米浆、脲、磷酸氢二铵、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵为氮源均可生产3-羟基丁酮，其中单独利用酵母浸提物为氮源3-羟基丁酮产量最高，其次为磷酸氢二铵和玉米浆。考虑到酵母浸出物价格比较高，本发明又对酵母浸提物、磷酸氢二铵和玉米浆复合氮源的各成分浓度进行优选，结果为当酵母浸提物添加量为3～6g/L，玉米浆添加量为5～10g/L，磷酸氢二铵添加量为2～3g/L时，菌株SFA-H43发酵3-羟基丁酮产率比单独使用10g/L酵母浸出物提高50～70%。

实施例4 3-羟基丁酮发酵进程

摇瓶培养

取35～40℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面，用接种环取1～2环斜面菌种，接种到液体种子培养基中，37℃培养14小时，5%的接种量接种摇瓶发酵培养基（葡萄糖140g/l），36℃摇瓶发酵，每间隔12小时取样，培养周期至60小时取样，离心上清液已经检测不到葡萄糖，此时发酵液3-羟基丁酮含量为42.5g/L，继续培养16小时，每隔4小时取样，离心测定上清液中3-羟基丁酮含量。培养周期至80小时取样3-羟基丁酮含量较76小时取样不再增加，此时3-羟基丁酮含量为50g/L。结果表明，当发酵液中葡萄糖耗尽以后，继续发酵培养16小时，发酵液中3-羟基丁酮的产量提高了17.6%。

图2为菌株SFA-H43摇瓶发酵发酵进程曲线。

实施例5 3-羟基丁酮发酵进程

发酵罐培养

用37℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种，接种液体种子培养基，37℃培养16小时，再以3%的接种量接种到10L发酵罐发酵培养基中（装液量7.0L，葡萄糖160g/L），35～37℃进行通风搅拌培养，培养过程中控制pH在5～7，相对溶氧浓度5～20%，每间隔一定时间取样。培养周期至56小时取样，离心上清液已经检测不到葡萄糖，此时3-羟基丁酮含量为51.8g/L。继续培养，培养周期至76小时取样的3-羟基丁酮含量较72小时取样没有明显增加，此时3-羟基丁酮含量为61.5g/L。葡萄糖耗尽以后继续发酵培养16小时，发酵液中3-羟基丁酮的产量提高了18.7%。

图3为菌株SFA-H43 10L发酵罐发酵发酵进程曲线。

实施例6 pH影响

用37℃培养3天的菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种，接种液体种子培养基，37℃培养16小时，再以5%的接种量接种到10L发酵罐发酵培养基中（装液量6.5L，葡萄糖160g/L），35～37℃进行通风搅拌培养，培养过程中控制pH5.5，控制发酵液中相对溶氧浓度10%，60小时葡萄糖耗尽，继续培养12小时，3-羟基丁酮产率为59.7g/L。

实施例7 pH影响

用37℃培养2天的菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种，接种液体种子培养基，37℃培养12小时，再以5%的接种量接种到10L发酵罐发酵培养基中（装液量7.0L，葡萄糖160g/L），35～37℃进行通风搅拌培养，培养过程中控制pH7.0，控制发酵液中相对溶氧浓度15%，48小时葡萄糖耗尽，继续培养14小时，取样测定3-羟基丁酮含量为55.3g/L。

实施例8 溶解氧浓度影响

用37℃培养2天的菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种，接种液体种子培养基，37℃培养14小时，再以6%的接种量接种到10L发酵罐发酵培养基中（装液量7.0L，葡萄糖160g/L），35～37℃进行通风搅拌培养，培养过程中pH控制5～7，通过调节搅拌转速和通风比，控制发酵液中相对溶氧浓度10～15%，发酵培养56小时葡萄糖耗尽，继续培养16小时，取样测定3-羟基丁酮含量为62.3g/L。

实施例9 溶解氧浓度影响

用37℃培养2天的菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种，接种液体种子培养基，37℃培养14小时，再以5%的接种量接种到10L发酵罐发酵培养基中（装液量7.0L，葡萄糖160g/L），35～37℃进行通风搅拌培养，培养过程中pH控制5～7，通过调节搅拌转速和通风比，控制发酵液中相对溶氧浓度20～30%，52小时葡萄糖耗尽，继续培养16小时，取样测定3-羟基丁酮含量为58.8g/L。

Claims (9)

1.一株产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌，其特征在于：分类命名为枯草芽孢杆菌SFA-H43(Bacillus subtilis SFA-H43)，已于2013年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2013181。 

2.利用权利要求1所述的产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌发酵生产3-羟基丁酮的过程控制工艺，其特征在于：以葡萄糖为碳源培养菌株进行3-羟基丁酮发酵，当发酵培养液中碳源耗尽后，继续发酵培养，直至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加时结束发酵。 

3.根据权利要求2所述的发酵生产3-羟基丁酮的过程控制工艺，其特征在于：通过以下两种方式之一或它们的组合实现： 

(1)摇瓶发酵：取35～40℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面，用接种环取1～2环斜面菌种到液体种子培养基中，37℃培养10～16小时，以1～10％接种量接种到发酵培养基中，180～220rpm、35～40℃摇瓶发酵至碳源耗尽，继续发酵培养至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加，结束发酵； 

(2)发酵罐发酵：取35～40℃培养2～3天菌株SFA-H43的新鲜斜面，用接种环取1～2环斜面菌种到液体种子培养基中，37℃培养10～16小时，再以1～10％的接种量接种到发酵培养基中，35～40℃进行通风搅拌培养，培养过程中控制pH在5～7，保持发酵液中相对溶氧浓度5～20％，至碳源耗尽，继续培养至3-羟基丁酮产率不再增加，结束发酵。 

4.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于：所述斜面培养所用的斜面菌种培养基的组成为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.0～7.2。 

5.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于：所述液体种子培养基的组成为：葡萄糖60～100g/L，酵母膏2～10g/L，玉米浆8～12g/L，其余为水，pH7.0～7.2。 

6.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：葡萄糖140～160g/L，酵母浸提物3～6g/L，玉米浆5～10g/L，(NH₄)₂HPO₄ 2～3g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，其余为水，pH 7.0～7.2。 

7.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于：所述用液体种子培养基培养的时间为12～16小时。 

8.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于：所述发酵罐发酵的相对溶解氧浓度控制在5～20％。 

9.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于：所述发酵罐发酵的pH控制在5.0～7.0。