CN100455658C - 一株产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌 - Google Patents

一株产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SFA-H31，菌株已于2006年11月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.1869。本发明还公开了所述的枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用。本发明的枯草芽孢杆菌CGMCCNO.1869可发酵转化葡萄糖直接生成目的产物3-羟基丁酮，不产生丁二酮和2，3-丁二醇等3-羟基丁酮常见联产化合物，是一株极具研究开发价值的3-羟基丁酮生产菌株。

Description

一株产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌，尤其涉及一株可产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株，属于生物技术领域。
背景技术
3-羟基丁酮(acetoin)又名乙偶姻、乙酰甲基甲醇，自然存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中，具有特有的奶油香味，另外，啤酒风味、奶酪香味均与3-羟基丁酮有关。
3-羟基丁酮是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，是国际上常用的香料品种。主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料，中国国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食品香料。80％含量的3-羟基丁酮俗称“醋嗡”，是酒类调香中一个重要的品种。3-羟基丁酮还是一种重要的化工合成原料和医药中间体。以3-羟基丁酮为原料通过氧化、还原反应可生成双乙酰和2，3-丁二醇，这两种化合物在化学工业中都具有广泛的用途，特别是2，3-丁二醇除自身是一种高能燃料外，还可以用来合成航空燃料，一度成为研究热点。在制药工业中，3-羟基丁酮作为具有手性的化合物可以用来合成稀有药物和药物中间体，如3-羟基丁酮与光气可以高效合成4-氯-4，5-二甲基-1，3二氧杂环戊烷-2-酮(CDMDO)，CDMDO是一种重要的医药中间体，主要用于青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物的修饰，从而较大程度地提高药效，减轻药物的副作用，在欧美国家及日本得到大力推广与应用。3-羟基丁酮还可以合成伦氨苄西林盐酸盐，伦氨苄西林盐酸盐是半合成青霉素、氨苄青霉素的前体药物，可口服，肠胃中稳定性良好，吸收快，血液中浓度高，比氨苄青霉素的作用强2～4倍，不良反应小，毒性低，已在欧美和日本上市。
3-羟基丁酮生产方法主要包括化学合成法和生物转化法。化学合成主要采用两种方法：一种是通过丁二酮(双乙酰)部分加氢还原；另一种是通过2，3-丁二醇选择性氧化。生物转化法也有两种工艺，一种是利用酶法转化丁二酮生产，另外一种是通过微生物发酵糖质原料生产。丁二酮部分加氢还原是目前国内外研究及应用较多的3-羟基丁酮生产方法，该方法主要是以丁二酮为原料添加不同的还原剂、催化剂来加氢还原合成3-羟基丁酮，转化率在50-80％不等。用2，3-丁二醇选择性氧化工艺可以选用铜作为催化剂，产物为丁二酮和3-羟基丁酮的混合物(1945年，R.H.Blom)，另外还有研究者采用电化学氧化2，3-丁二醇制备3-羟基丁酮，选择性好，产率高，但该工艺仅处于研究阶段(1997年A.Hilmi)。酶法转化生产3-羟基丁酮：1992年Hummel等人曾从培养的乳酸杆菌或酵母菌分离纯化丁二酮还原酶及辅酶NAPH，在pH5、温度70℃下，催化转化2，3-丁二酮生成3-羟基丁酮，使用该方法产率最高可达100％，并且没有其它副产物。Susan Budavari还曾报道通过山梨糖菌或生膜菌转化2，3-丁二醇生成3-羟基丁酮。这些方法和化学合成相似，都是以丁二酮或丁二醇为原料，经酶法部分还原或氧化生成3-羟基丁酮。区别在于酶法转化工艺产物得率高，没有其它副产物，并且产物具有旋光度，但要获得大量特异性的酶比较困难。
化学合成生产和生物酶法转化都是以丁二酮或2，3-丁二醇为原料，但是丁二酮和2，3-丁二醇也是重要的合成香料，而非大宗化工产品，目前主要以化学合成工艺生产，因此原料来源、价格以及产品的应用都受到限制，这也是导致化学合成和生物酶法转化生产3-羟基丁酮工艺没有得到广泛应用的主要原因之一。
3-羟基丁酮是多种微生物糖代谢的中间代谢产物，以糖质为原料利用微生物发酵可以产生3-羟基丁酮，但是，据检索，目前有关微生物产3-羟基丁酮的文献报道多数是关于微生物代谢途径的理论方面的研究，少数涉及的3-羟基丁酮生产的报道也主要是作为丁二酮和2，3-丁二醇副产物提及。比如R.B.hespell报道多粘杆菌可利用木聚糖生成丁二酮和3-羟基丁酮，其总产量最高可达11.3g/L。Braneni和Keenan利用乳酸菌发酵产生丁二酮和3-羟基丁酮，同时该菌株还产生2，3-丁二醇。R.M.Teixeira等报道汉逊酵母发酵产3-羟基丁酮，产量最高可达0.36g/L。还未见有关于3-羟基丁酮作为微生物主要目的产物的研究报道，也未见应用枯草芽孢杆菌菌株生产高纯度3-羟基丁酮的报道。
参考文献：
1.Susan Budavari.The Merck Index[M].Twelfth Edition.，1996.12.
2.Hummel.USP；5164314，1992
3.Blom R H..Am Chem Soc，1945，67：494
4.Hilmi A，Belgsir E M，Leger J M，，等.J.Electro.Chem.，1997，435：69.
5.R.B.Hespell.Curr.Micro.1996，32：291
6.R.M.Teixeira，D.Cavalheiro，等.Braz.J.Chem.Eng.19(2)：181
7.A.L.Braneni and T.W.Keenan.Appl.Micro.，1971：517
发明内容：
本发明的目的是提供一株可产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株。以实现利用糖质原料微生物发酵法获得3-羟基丁酮为目的产物的愿望。
本发明所述菌株可有效地转化葡萄糖生成3-羟基丁酮，不产生丁二酮和2，3-丁二醇等3-羟基丁酮常见联产化合物，是一株极具研究开发价值的3-羟基丁酮生产菌株。
本发明所述产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一株通过诱变选育获得的枯草芽孢杆菌突变菌株SFA-H31，该菌株已于2006年11月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.1869。
上述产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌，其生物学特征是：不运动，生内生孢子，孢囊不膨大，没有伴孢晶体生成，37℃液体培养幼时呈现杆状，单个、成对或呈链状排列，16-18小时开始生孢子，24±2小时孢子成熟脱落(菌体营养体和芽孢形态参见附图1，附图2)；37℃固体培养菌落初期呈圆形，随着培养时间的延长逐渐呈不规则状；菌落扁平、毛玻璃状表面、不突起；斜面培养16-20小时开始生芽孢，48±2小时芽孢完全脱落；生理生化特征是：革兰氏染色阳性，好氧，化能异养菌，从葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖产酸，发酵葡萄糖不产气，不利用柠檬酸盐，接触酶阳性，还原硝酸盐；生理生化实验结果详见表1，与枯草芽孢杆菌模式菌株相比，本发明的CGMCCNO.1869菌株的生理生化特征只有一项与模式菌株不符，即不利用柠檬酸盐，这可能与该菌株在选育过程中的基因突变有关。
表1，CGMCC NO.1869菌株与标准枯草芽孢杆菌生理生化特征对比
特征  B.subtilis*  CGMCC NO.1869
细胞直径＞1.0um  -  -
  芽孢圆形   -   -
  包囊膨大   -   -
  伴孢晶体   -   -
  接触酶   +   +
  厌氧生长   -   -
  V-P测定   +   +
  产酸：
  D-葡萄糖   +   +
  L-阿拉伯糖   +   +
  D-木塘   +   +
  D-甘露醇   +   +
  葡萄糖产气   -   -
  水解：
  酪蛋白   +   +
  明胶   +   +
  淀粉   +   +
  利用：
  柠檬酸盐   +   -
  丙酸盐   -   -
  酪氨酸水解   -   -
  苯丙氨酸脱氨酶   -   -
  卵黄卵磷脂酶   -   -
  硝酸盐还原   +   +
  形成：
  吲哚   -   -
  需要NaCl、KCl   -   -
  需要尿酸盐   -   -
  生长pH：
  6.8营养肉汤   +   +
  5.7营养肉汤   +   +
  生长NaCl：
  2％   +   +
  5％   +   +
  7％   +   +
  10％   ND   -
  生长温度℃：
  5   -   -
  10   +   +
  30   +   +
    40     +     +
    50     d     +
    55     -     -
    65     -     -
*：东秀珠蔡妙英等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001，第一版，p62-63
对本发明的菌株CGMCC NO.1869测定16S rRNA的基因序列的结果显示，其基因序列长度为1468 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过使用美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比对，发现本发明的CGMCC NO.1869菌株16S rRNA的基因序列与NCBI注册的多株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)16S rRNA的基因序列具有高度同源性，说明CGMCC NO.1869菌株是一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
其中，本发明的菌株CGMCC NO.1869与两株枯草芽孢杆菌(CICC10147，CICC10073)的16S rRNA的基因序列的第2-1468个碱基之间的序列完全相同。区别在于基因长度不同，菌株目的产物不同，比对结果如表2。
CICC10147，CICC10073两株枯草芽孢杆菌均为中国工业微生物菌种保藏管理中心(China center of Industrial culture collection，CICC)保藏菌株。CICC10147菌株在保藏目录中所述用途为产耐温淀粉酶，CICC10073菌株在保藏目录中所述用途为产蛋白酶，与本发明菌株用途不同，说明本发明菌株与上述两株枯草芽孢菌不是同一菌株。
表2，CGMCC NO.1869菌株16S rDNA与GenBank提交菌株的16S rDNA相似度比较
菌株   16S rDNA长度bp   同源性 产物
Bacillus subtilisCGMCC NO.1869   1468 3-羟基丁酮
Bacillus subtilisCICC10147   1498   2-1468bp100％相似 耐温淀粉酶
Bacillus subtilisCICC10073   1487   2-1468bp100％相似 蛋白酶
上述用于菌体形态观察的液体培养基组成(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠3，硫酸镁0.1，pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述用于菌体形态观察的固体培养基组成(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠3，硫酸镁0.1，琼脂20，pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。
本发明所述的产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌种选育的基本方法是：
以一株少量积累3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株SFA-W15为出发菌株，以紫外线、亚硝基胍等物理、化学诱变剂对其进行诱变，诱变可重复多次，诱变方法采用常规方法，诱变后涂布筛选平板，挑取单菌落移接斜面，然后再进行摇瓶发酵，通过测定葡萄糖的消耗速率和3-羟基丁酮的产量筛选目的菌株，选取消耗葡萄糖速率快、3-羟基丁酮产量高的菌株，再经过多次分离筛选，获得SFA-H31菌株，该菌株已于2006年11月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.1869。
本发明所述的产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869在制备3-羟基丁酮中的应用。
利用CGMCC NO.1869菌株发酵生产3-羟基丁酮的方法如下：
摇瓶发酵：取35-40℃培养1-2天的新鲜斜面接种液体种子培养基37℃培养18-20小时，接种发酵培养基，35-40℃摇瓶发酵48-72小时，发酵结束发酵液中检测不到葡萄糖残留，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的的转化率为40-48％。
50L发酵罐发酵：37℃培养1-2天的新鲜斜面接种液体种子培养基35-40℃培养10-16小时，按1-5％的接种量接入到预先准备好的发酵培养基中，50L发酵罐装液量33-35L，35～40℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为150～200r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶0.5±0.1vvm，罐内压力0.1±0.02MPa，发酵时间为40～70小时；调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在5-20％的饱和度，发酵液初始pH值为7.0～7.5，发酵过程中流加酸碱使发酵液的pH维持为6.0～7.0，发酵过程中定时取样测定发酵液中的葡萄糖和3-羟基丁酮的浓度，当发酵液中葡萄糖浓度不再降低，3-羟基丁酮浓度不再上升时，结束发酵。
上述筛选用平板培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠3，硫酸镁0.1，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠3，硫酸镁0.1，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述液体种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20，酵母膏20，磷酸二氢钾0.1，磷酸氢二钾0.1，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
上述发酵培养基的组成(g/L)：葡萄糖80-140，酵母膏2，玉米浆10，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
上述3-羟基丁酮发酵的培养温度优选为37℃。上述在液体种子培养基上培养时间优选为12-14小时，发酵培养基初始葡萄糖浓度优选为100-120g/L，上述在发酵过程中溶解氧水平优选控制在10-15％的饱和度。上述50L发酵罐发酵发酵周期一般为50-60小时。葡萄糖转化3-羟基丁酮的平均转化率为45％-50％。
上述葡萄糖按下述方法测定：
使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4C型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。
上述3-羟基丁酮按下述方法测定：
化学比色法：参阅参考文献(W.W.Westerfeld，A COLORIMETRIC DETERMINATIONOF BLOOD ACETOIN.J.Biol.Chem.，1945；161：495-502)。
标准曲线的绘制：
按下表顺序加入各种试剂和溶液，60℃显色15min，使用分光光度计在530nm下测吸光值，绘制标准曲线。
Figure C20071001340200081
发酵液离心取上清液适当稀释至3-羟基丁酮的含量约在10μg，按上述方法显色，530nm测定吸光值，根据标准曲线及稀释倍数计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
气相色谱法定性分析：
气相色谱条件：使用GEP-20M毛细管柱，载气为氮气(N2)，流速为0.9mL/min；柱头压0.10MPa；进样口温度200℃；程序升温：100℃保时3分钟，8℃/min升温致180℃，保时3分钟；进样量1μL；分流比5∶1。在上述条件下3-羟基丁酮的保留时间为8.7分钟左右，双乙酰的保留时间为4.5分钟左右，2，3-丁二醇的保留时间为13.5分钟左右。
本发明所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869可发酵转化葡萄糖直接生成并获得目的产物3-羟基丁酮，单位体积发酵液中3-羟基丁酮产率高，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率高，产3-羟基丁酮纯度高，不产生丁二酮和2，3-丁二醇等3-羟基丁酮常见联产化合物，是一株极具研究开发价值的3-羟基丁酮生产菌株。本发明人未检索到有枯草芽孢杆菌产3-羟基丁酮与CGMCC NO.1869菌株相同的高纯度、高产率及高转化率的文献报道。
附图说明
本发明提供的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SFA-H31，已于2006年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC NO.1869。
图1示枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌体营养体形态(×1600)。
图2示枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869芽孢形态(×1600)。
图3示枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株发酵液减压蒸馏馏出份冷凝收集液气相色谱图。该图谱为一次发酵发酵液减压蒸馏馏出份冷凝收集液气相色谱图，图中保留时间为8.657分钟的是3-羟基丁酮，峰面积占总峰面积的95.8％。
具体实施方式
实施例1产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的选育
将出发菌株SFA-W15(一株少量积累3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株)接种于液体种子培养基，37℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×108-109个/ml。
取上述菌悬液10ml放入平皿中，置30W紫外灯下照射，照射距离15cm，照射时间为3分钟、5分钟、7分钟、10分钟，间隔取样适当稀释后涂布含有0.5％LiCl的筛选平板，避光37℃培养1-2天，挑取单菌落移接斜面，37℃培养1-2天，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，37℃摇瓶发酵60小时，取发酵液3000转/分钟离心5分钟，取上清液测定发酵液中残留葡萄糖浓度和3-羟基丁酮含量，选取残留葡萄糖浓度低、3-羟基丁酮含量高的菌株为目的菌株。
将目的菌株再经摇瓶发酵复筛和进一步分离筛选，得到一株稳定耗糖速率和3-羟基丁酮产量都有提高的突变菌株SFA-U97。
SFA-U97菌株接种初始葡萄糖浓度为78.2g/L的发酵培养基，37℃摇瓶培养60小时结束发酵，发酵液中检测不到葡萄糖，3-羟基丁酮含量为30.6g/L，转化率为39.1％。
实施例2产高纯度3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株的选育
将实施例1筛选到的突变菌株SFA-U97菌株接种于液体种子培养基中，37℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×108-109个/ml，备用。
亚硝基胍处理液配制：称取亚硝基胍20mg，放置于100ml无菌三角瓶中，加丙酮2ml使其溶解，再加入18ml Tris缓冲液(pH6.0，0.5mol/L)混匀，备用。
取上述亚硝基胍处理液10ml，加入10ml菌悬液，30℃保温振荡50-60分钟，每隔10分钟取样一次，取样后首先稀释1000倍终止反应，然后再适度稀释，涂布平板，37℃培养1-2天，挑取单菌落移接斜面，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，37℃摇瓶发酵60小时，发酵液3000转离心5分钟，取上清液测定发酵液中残留葡萄糖浓度和3-羟基丁酮含量，选取残留葡萄糖浓度低、3-羟基丁酮含量高的菌株为目的菌株。
将目的菌株再经摇瓶发酵复筛和进一步分离筛选，选育得到一株遗传性质稳定、3-羟基丁酮产量最高达55g/L的以上突变菌株SFA-H31。
上述菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SFA-H31，已于2006年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC NO.1869。
上述筛选用平板培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠3，硫酸镁0.1，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠3，硫酸镁0.1，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述液体种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20，酵母膏20，磷酸二氢钾0.1，磷酸氢二钾0.1，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
上述发酵培养基的组成(g/L)：葡萄糖80-140，酵母膏2，玉米浆10，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例3枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株16S rDNA测序
将实施例2选育得到的3-羟基丁酮高产菌株SFA-H31即CGMCC NO.1869菌株委托宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.)进行16S rDNA测序。
实验方法是：挑取斜面培养物于10μl灭菌水中，99℃变性后离心取上清液作为模板，使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)，以Forward/Reverse primer2为引物，扩增目的片段。取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收目的片断，以Seq Forward、Seq Reverse Seq Internal为引物对上述回收产物进行DNA测序。
测序结果：枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株16S rDNA序列长度为1468bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过使用美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比对，发现CGMCC NO.1869菌株16S rDNA序列与NCBI注册的多株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)16S rDNA序列具有高度同源性，说明CGMCCNO.1869菌株是一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例4枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1869；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，35℃条件下，静止培养40小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于30mL液体种子培养基中，置旋转转速为150转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35℃培养18小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以1％的体积比的接种量，将种子液接种于装有90mL发酵培养基的摇瓶中，35℃，转速为150转/分钟，摇瓶发酵，当发酵液中检测不到葡萄糖残留时，发酵结束，发酵时间58小时；
50L发酵罐发酵：以2％的体积比的接种量，将种子液接种于罐装有33L发酵培养基的50L发酵罐中，35℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为150r/min，通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·分钟计为1∶0.5±0.1vvm，罐内压力0.1±0.02MPa；调节发酵罐转速和通气比控制溶解氧水平在10-15％的饱和度，发酵液初始pH值为7.0～7.1，发酵过程中流加酸碱使发酵液的pH维持为6.1～6.2，发酵过程中定时取样测定发酵液中的葡萄糖和3-羟基丁酮的浓度，当发酵液中3-羟基丁酮浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为48小时；
(5)产物检测：取上述发酵液以3200转/分钟离心7分钟，测定上清液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量，并计算葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率；同时收集发酵液在80℃进行减压蒸馏，馏出份冷凝收集液进行气相色谱分析测定发酵产物中3-羟基丁酮的纯度。
发酵液检测3-羟基丁酮的含量为34.6g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为43.25％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的95.8％(参见附图3)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.2，蒸馏水配制；
上述液体种子培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，pH7.0-7.2，自来水配制；
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖80g/L，酵母膏2g/L，玉米浆10g/L，pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例5枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株的应用
将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1869菌株移接斜面活化；
按上述液体种子培养基的组成配制种子培养基，初始葡萄糖浓度实测为21.5g/L，250ml三角瓶装液量为30ml，118℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环，置旋转转速为150转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，37℃培养12小时，得种子液，取种子液稀释10倍置610nm测吸光值为0.358；
按上述发酵培养基的组成配制发酵培养基，初始葡萄糖浓度实测为115g/L，250ml三角瓶装液量为30ml，118℃蒸汽灭菌25分钟，冷却至室温，接种种子液1ml，置旋转转速为150转/分钟、旋转半径为40mm摇床上，37℃培养72小时结束发酵，发酵液以3000转/分钟离心5分钟，取上清液测定葡萄糖和3-羟基丁酮的含量分别为0g/L和48.5g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为42.2％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的95.3％。
或者：
以50L发酵罐按30L装液量配制发酵培养基，调整pH7.2，118℃实罐灭菌20分钟，循环水冷却至37℃后接种培养好的种子液600ml，接种后立即取样测定葡萄糖浓度为116.4g/L。
初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为200转/分钟，通气比1∶0.5vvm(料液容积与每分钟通气量(以容积计)的比值)，罐内压力0.1MPa。发酵过程中控制发酵温度37±0.2℃，通过调节搅拌转速和通气比控制溶解氧为5-10％，pH6.5±0.2。
发酵过程中每8小时取样，测定发酵液中葡萄糖和3-羟基丁酮的含量及菌体浓度，当葡萄糖含量低于10g/L时，每2小时取样测定发酵液中葡萄糖及3-羟基丁酮含量，至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加时结束发酵，发酵周期为56小时。
发酵结束后取发酵液以3000转/分钟离心5分钟，取上清液测定葡萄糖和3-羟基丁酮的含量分别为0g/L和54.5g/L，葡萄糖转化生成3-羟基丁酮的转化率为46.8％。
发酵液经减压蒸馏，馏出份冷凝收集液按上述方法经气相色谱分析3-羟基丁酮的峰形面积占总面积的96.2％。
上述葡萄糖按下述方法测定：
使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4C型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。
上述3-羟基丁酮按下述方法测定：
化学比色法：参阅参考文献(W.W.Westerfeld，A COLORIMETRIC DETERMINATIONOF BLOOD ACETOIN.J.Biol.Chem.，1945；161：495-502)，略有改动。
标准曲线的绘制：按下表顺序加入各种试剂和溶液，60℃显色15min，使用分光光度计在530nm下测吸光值，绘制标准曲线。
Figure C20071001340200121
发酵液离心取上清液适当稀释至3-羟基丁酮的含量约在10μg，按上述方法显色，530nm测定吸光值，根据标准曲线及稀释倍数计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
其中：
3-羟基丁酮标准溶液：精确3-羟基丁酮0.1g，用蒸馏水溶解并定容至100ml作为储备液，4保存，使用时精确吸取储备液1ml，定容至100ml。
5％肌酸溶液：用蒸馏水配制。
5％甲萘酚溶液：用2.5mol/LNaOH配制。需新鲜配制。
气相色谱法定性分析：
气相色谱条件：使用GEP-20M毛细管柱，载气为氮气(N2)，流速为0.9mL/min；柱头压0.10MPa；进样口温度200℃；程序升温：100℃保时3分钟，8℃/min升温致180℃，保时3分钟；进样量1μL；分流比5∶1。在上述条件下3-羟基丁酮的保留时间为8.7分钟左右，双乙酰的保留时间为4.5分钟左右，2，3-丁二醇的保留时间为13.5分钟左右。
序列表
<110>山东省食品发酵工业研究设计院
<120>一株产高纯度3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌
<141>2007-1-8
<160>1
<210>1
<211>1468
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<221>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.1869 16S rDNA
<222>(1)…(1468)
<400>1
acgacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc   60
tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa  120
ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc aaacataaaa  180
ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa  240
cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact  300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa  360
gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt  420
agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc  480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt  540
attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa  600
ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac  660
gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg  720
tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta  780
gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag  840
ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt  900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct  960
taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag 1020
tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc 1140
ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc 1260
ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc 1320
gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt taggagccag 1440
ccgccgaagg tgggacagat gattgggg                                    1468

Claims (2)

1.一株产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SFA-H31，菌株已于2006年11月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.1869。
2.权利要求1所述产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用。
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Assignor: SHANDONG FOOD FERMENT INDUSTRY RESEARCH & DESIGN INSTITUTE

Contract record no.: 2010370000452

Denomination of invention: Bacillus subtilis capable of producing high purity 3-hydroxy butanone

Granted publication date: 20090128

License type: Exclusive License

Open date: 20070815

Record date: 20100812

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