CN102618458B - 一株地芽孢杆菌及其在高温发酵生产2，3-丁二醇和乙偶姻中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株地芽孢杆菌及其在高温发酵生产2，3-丁二醇和乙偶姻中的应用。该菌株为地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)XT15CCTCC No.M2011022，革兰氏染色呈阳性，产芽孢；细胞形态为杆状，长0.9-1.8μm，直径0.4-0.5μm；可在28-65℃生长，45-55℃时增殖最快；产2，3-丁二醇和乙偶姻发酵培养基的最适pH值为8.0。利用本发明菌株，以葡萄糖为碳源，在55℃摇瓶发酵48h可以产生总和为46.1-57.9g/L的2，3-丁二醇和乙偶姻。本发明提供的高温发酵生产2，3-丁二醇和乙偶姻方法具有抗杂菌污染、反应速率快、节约冷却水、操作粗放等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株地芽孢杆菌及其应用。
背景技术
2,3-丁二醇是一种新型的化工原料和燃料，广泛应用于化工合成、食品、燃料、防冻等各个领域(Ji et al.，2011)。乙偶姻(3-羟基丁酮)天然痕量存在于玉米、葡萄、苹果、香蕉、奶酪等许多食物中，在食品、香料、化妆品、手性合成等领域有重要的用途(Xiao et al.，2010)。2,3-丁二醇和乙偶姻可由可再生原料发酵生产，是重要的新兴平台化合物(Xu et al.，2012)。两者是细菌中乙偶姻代谢途径的产物，可以在细胞内通过2,3-丁二醇脱氢酶相互转化。2,3-丁二醇和乙偶姻在发酵产物中往往同时存在，但它们两者沸点相差较大，可以通过蒸馏很容易地相互分离。
发酵法生产2,3-丁二醇和乙偶姻具有良好的市场前景，吸引了大量国内外开发研究人员，取得了一些研究进展(Xiao et al.，2007)。但迄今所有已知关于发酵法生产2,3-丁二醇和乙偶姻的研究文献报道都是采用中温发酵法(30-40℃)，最典型的温度是37℃。为了防止2,3-丁二醇和乙偶姻发酵过程中污染杂菌，培养基要经过高温蒸汽灭菌，这就必然涉及一系列灭菌设备，操作繁琐、消耗大量的蒸汽和冷却水，而且高温灭菌容易引起大量的糖损失和产生很多影响正常发酵的有害化学物质。一般发酵过程是放热的，所以中间过程也需要消耗冷却水(Cripps et al.，2009)。虽然发酵过程中采取各种措施控制污染，但往往仍存在不同程度的倒灌率，有时甚至影响到正常生产运行(Skinner and Leathers，2004)。
研究者通常将温度为50-65℃的发酵方法称为高温发酵法，近年来开始受到研究重视(Cripps et al.，2009)。一般情况下环境中的杂菌在45℃以上就很难生长，高温发酵时杂菌营养体可被绝大部分杀死，有些芽孢等非营养体虽不能彻底杀灭，但也不能繁殖，所以高温发酵可以较好地解决污染杂菌问题。较高的发酵温度还可以加快反应速率、节约冷却水、操作粗放，甚至可以免灭菌(Qin etal.，2009)。因此高温发酵较中温发酵而言具有独到的优势，极具开发潜力。但迄今国内外未见高温发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻的研究报道。
参考文献：
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发明内容
针对上述目前研究和生产现状的缺点与不足，本发明提供一株地芽孢杆菌及其在高温发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻中的应用方法。
本发明提供的地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)XT15菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：武汉市武昌珞珈山；保藏号：CCTCC No.M2011022；保藏日期：2011年1月17日。
开发高温发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻技术的关键之一就是筛选获得嗜热并且高产2,3-丁二醇和乙偶姻的菌株。本发明提供的菌株地芽孢杆菌XT15革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状，长0.9-1.8μm，直径0.4-0.5μm(附图)。通过细菌16S rDNA测序，并用美国国立生物技术信息中心(简称NCBI)的BLAST程序对本发明菌株的16S rDNA序列和GenBank数据库中已收录的序列进行核苷酸同源性比对，发现本发明菌株的16S rDNA序列与已知地芽孢杆菌(Geobacillus)属的菌株的16S rDNA序列同源性大于99％。本发明菌株的16S rDNA序列已提交到GenBank数据库中，登录号为HQ891030。
本发明菌株地芽孢杆菌XT15可在28-65℃范围内生长，45-55℃范围内增殖最快，约每2h细胞数量增加一倍。除了嗜热性与已报道2,3-丁二醇和乙偶姻生产菌不同外，本发明菌株产2,3-丁二醇和乙偶姻发酵培养基的最适pH值为8.0，偏向弱碱性，也与以往报道菌株不同。
本发明提供的利用地芽孢杆菌XT15高温发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻的应用方法，其涉及的实施步骤如下：
(1)活化菌株：将本发明提供的菌株地芽孢杆菌XT15划线接种到固体种子培养基上，置于55℃的恒温箱中培养12h以上，至菌落生长丰满。所述固体种子培养基每升中含有：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉，17克琼脂粉。调培养基pH至7.0。
(2)制备液体种子：用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到液体种子培养基中，55℃摇床培养8h。用到的摇瓶体积为100mL，装液量为30mL；用到的摇床为往复式水浴摇床，转速为140rpm。所述液体种子培养基每升中含有：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉。调培养基pH至8.0。
(3)发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻：将上述步骤获得的液体种子按5％体积比接种到发酵培养基中，55℃摇床培养48h。用到的摇瓶体积为100mL，装液量为30mL；用到的摇床为往复式水浴摇床，转速为140rpm。所述发酵培养基每升中含有：220g葡萄糖，60-120g蛋白胨，10g酵母粉。调培养基pH至8.0。
利用本发明所述地芽孢杆菌XT15，在55℃摇瓶发酵48h即可以产生总和为46.1-57.9g/L的2,3-丁二醇和乙偶姻，高于多数文献报道，极具科学研究和实际应用潜力。
附图说明
附图是地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)XT15CCTCC No.M2011022扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例1：菌株富集筛选与分离纯化
1.1配制富集培养基
从胜利油田采集采出水样品，按每升水样加入：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉。调整pH至7.0，得到富集培养基。
1.2菌株富集
将上述富集培养基分装到摇瓶中，迅速加热至100℃，然后再迅速转入60℃的水浴摇床中进行往复振荡(140rpm)培养2d。本步骤中100℃短时间灭菌可以杀死绝大多数不耐热的干扰杂菌，60℃摇床培养可以进一步扩增嗜热菌，淘汰普通的芽孢杆菌和厌氧菌。
1.3菌株分离纯化
配制固体种子培养基，每升中含有：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉，17克琼脂粉。调培养基pH至7.0。
将上述1.2实验富集得到的培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布到上述固体种子培养基上，置于60℃的恒温箱中培养2d，用接种环挑取单菌落，对每个单菌落进行VP反应测定，选取反应颜色(红色)最深的菌株，即得目的菌株。VP(Voges-Proskauer)反应测定法是微生物分类学生理生化实验中的一项常规方法，可以快速检测培养物中乙偶姻的存在，反应颜色(红色)越深，说明培养物中乙偶姻含量越高。
将得到的目的菌株采用斜面传代法、低温甘油法、冻干真空管法等常规方法保存备用。
实施例2：菌株鉴定与保藏
2.1形态特征观察
通过上述实施例1得到的目的菌株的菌落呈白色，表面有褶皱，边缘不齐。革兰氏染色呈阳性，产芽孢。细胞形态为杆状，长0.9-1.8μm，直径0.4-0.5μm(附图)。
2.2菌株16S rDNA鉴定与保藏
用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R为扩增引物，采取PCR方法扩增上述1.3实验得到的目的菌株的16S rDNA片段，电泳检测后，送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得测序结果，并用美国国立生物技术信息中心(简称NCBI)的BLAST程序对该菌的16S rDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比对，发现与之序列同源性大于99％的已知菌株是地芽孢杆菌(Geobacillus)属的，因此本发明菌株鉴定为地芽孢杆菌，并命名为地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)XT15。将该菌株的168rDNA序列提交到GenBank数据库中，登录号为HQ891030。
2011年1月17日将本发明菌株地芽孢杆菌XT15保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC No.M2011022。
2.3菌株生理生化特征
对菌株地芽孢杆菌XT15进行了生理生化特征鉴定，结果如表1所示。
表1地芽孢杆菌XT15的生理生化特征
| 实验项目 | 结果 |
| 乳糖 | - |
| 脲酶 | - |
| 硫化氢 | - |
| 鸟氨酸 | - |
| 赖氨酸 | - |
| 精氨酸 | - |
| 苦杏仁甙 | + |
| 蜜二糖 | - |
| 鼠李糖 | - |
| 明胶 | + |
| VP | + |
| 葡萄糖 | + |
| 肌醇 | - |
| 蔗糖 | + |
| 阿拉伯糖 | + |
实施例3：确定最佳培养温度
按照微生物学实验中确定最佳培养温度的常规方法进行。简要地说，将实施例2所述地芽孢杆菌XT15接种于液体种子培养基中，在不同的温度条件下摇床培养。用分光光度计测定培养物OD值的变化，并计算细胞平均增殖速率。所述液体种子培养基每升中含有：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉。
经上述实验测定，本发明菌株地芽孢杆菌XT15可在28-65℃范围内生长；45-55℃范围内增殖最快，约每2h细胞数量增加一倍。45-55℃范围内增殖速率相差很小，为满足高温发酵需要，选取55℃为最佳温度。
实施例4：确定最佳培养基pH值
按照微生物学实验中确定最佳培养基pH值的常规方法进行。简要地说，将实施例2所述地芽孢杆菌XT15接种于不同pH值的液体种子培养基中，在55℃条件下摇床培养。用气相色谱测定发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻的产量，并计算总和。所述液体种子培养基每升中含有：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉。调整培养基的初始pH值分别至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0。
经上述实验测定，采用本发明菌株地芽孢杆菌XT15发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻的最佳培养基pH值为8.0，其次为7.5和7.0，最差为6.0。
实施例5：利用地芽孢杆菌XT15高温发酵生产2，3-丁二醇和乙偶姻的应用方法
按照实施例3确定的最佳温度和实施例4确定的最佳pH值进行。具体实施步骤如下：
5.1活化菌株
将本发明提供的菌株地芽孢杆菌XT15划线接种到固体种子培养基上，置于55℃的恒温箱中培养12h以上，至菌落生长丰满。所述固体种子培养基每升中含有：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉，17克琼脂粉。调培养基pH至7.0。
5.2制备液体种子
用接种环挑取步骤5.1获得的菌落，接种到液体种子培养基中，55℃摇床培养8h。用到的摇瓶体积为100mL，装液量为30mL；用到的摇床为往复式水浴摇床，转速为140rpm。所述液体种子培养基每升中含有：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉。调培养基pH至8.0。
5.3发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻
将步骤5.2获得的液体种子按5％体积比接种到发酵培养基中，55℃摇床培养48h。用到的摇瓶体积为100mL，装液量为30mL；用到的摇床为往复式水浴摇床，转速为140rpm。所述发酵培养基每升中含有：220g葡萄糖，60g蛋白胨，10g酵母粉。调培养基pH至8.0。
用气相色谱测得发酵液中产物2,3-丁二醇浓度为15.8g／L，乙偶姻浓度为32.3g／L，两者总和为48.1g／L。
实施例6：利用地芽孢杆菌XT15高温发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻的应用方法
同实施例5，但步骤5.3每升发酵培养基中蛋白胨用量改为80g。用气相色谱测得发酵液中产物2,3-丁二醇浓度为8.3g／L，乙偶姻浓度为49.6g／L，两者总和为57.9g／L。
实施例7：利用地芽孢杆菌XT15高温发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻的应用方法
同实施例5，但步骤5.3每升发酵培养基中蛋白胨用量改为100g。用气相色谱测得发酵液中产物2,3-丁二醇浓度为6.8g／L，乙偶姻浓度为39.4g／L，两者总和为46.2g／L。
实施例8：利用地芽孢杆菌XT15高温发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻的应用方法
同实施例5，但步骤5.3每升发酵培养基中蛋白胨用量改为120g。用气相色谱测得发酵液中产物2,3-丁二醇浓度为5.2g／L，乙偶姻浓度为40.9g／L，两者总和为46.1g/L。
Claims (5)
1.地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)XT15，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNo.M2011022。
2.一种利用权利要求1所述地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)XT15CCTCC No.M2011022高温发酵生产2，3-丁二醇和乙偶姻的方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：利用所述地芽孢杆菌XT15高温发酵生产2，3-丁二醇和乙偶姻时的发酵温度为55℃。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：利用所述地芽孢杆菌XT15高温发酵生产2，3-丁二醇和乙偶姻时的发酵培养基每升中含有：220g葡萄糖，60-120g蛋白胨，10g酵母粉。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：利用所述地芽孢杆菌XT15高温发酵生产2，3-丁二醇和乙偶姻时的发酵培养基的pH值为8.0。
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