CN105420168A - 利用乳酸产己酸的瘤胃梭菌及其用途 - Google Patents

利用乳酸产己酸的瘤胃梭菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新的瘤胃梭菌CPC-11(Clostridium？sp.CPC-11)及其用途。本发明的提供的新的瘤胃梭菌Clostridium？sp.CPC-11能将乳酸转化为己酸，可利用乳酸或黄水发酵产己酸，同时可用于人工窖泥的强化培养或窖池发酵的“增已降乳”工艺，提高己酸产量，具有很好的应用前景。

Description

利用乳酸产己酸的瘤胃梭菌及其用途
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种新的瘤胃梭菌Clostridiumsp.CPC-11,以及该菌在己酸生产中的应用。
背景技术
己酸(n-caproate)为含有六个碳原子的中链脂肪酸(C5H11COOH)，疏水性强，能量密度高，是一种重要的化工原料，可用于食品香料、动物饲料、绿色抗菌剂和缓蚀剂生产等领域。特别地，己酸是合成己酸乙酯(浓香型白酒品质的主体香味物质)的重要前体物。其酯类产品还广泛应用于树脂、橡胶、制药等工业。
微生物催化产己酸是一个碳链延长过程，研究最多和最为深入的是克氏梭菌(Clostridiumklyuveri)，该菌通过乙醇氧化和逆β氧化途径的结合，以乙醇为电子供体，乙酸为电子受体合成己酸。目前普通认为浓香白酒中己酸的产生也是以克氏梭菌为主的己酸功能菌，通过上述途径合成己酸；进一步地，己酸与乙醇再通过酯化反应生成浓香型白酒的主体香成份—己酸乙酯。
理论上，乳酸类似于乙醇，也是一种还原剂，应可以为逆β氧化途径提供乙酰辅酶A，从而进行碳链延长合成中链脂肪酸，如己酸。但目前的研究表明，多数微生物以乳酸为底物时，只能生成丁酸或丙酸，基本不产己酸或其他中链脂肪酸。仅有MegasphaeraelsdeniiJ1据报道可以产生微量己酸(约23.2mg/L)。本领域急需开发将乳酸转化为己酸的技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有技术难以将乳酸转化为己酸。本发明解决技术问题的技术方案是一是提供一种瘤胃菌科(Ruminococcaceae)第4梭菌簇(ClostridiumclusterIV)的一个新种，为Clostridiumsp.CPC-11，模式菌株的保藏号为CGMCCNo：9926。
该新种的模式菌株已于2014年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCCNo:9926。
同时，本发明提供了利用上述的瘤胃菌科细菌新种在用乳酸转化生产己酸中的用途。
此外，本发明还提供了上述的瘤胃菌科细菌新种在发酵酿酒中的用途。
同时，本发明提供了上述的的瘤胃菌科细菌新种在制备人工窖泥中的用途。
此外，本发明也还提供了上述的瘤胃菌科细菌新种在酒厂酿酒废水处理中的用途。
同时的，本发明也提供了一种菌剂，该菌剂包含上述的新种细菌。
本发明也还提供了一种窖泥，该窖泥包含上述的新种细菌。同时也提供了包含上述窖泥的窖池。
根据本发明的第一个方面，本发明的通过前期大量研究发现，以酿酒窖池中窖泥为接种物，可将乳酸转化为己酸，表明窖泥中存在以乳酸为底物合成己酸的功能微生物及己酸合成的新途径。进一步通过以乳酸为唯一碳源的培养基，从窖泥中采用梯度稀释分离获得一乳酸利用型产己酸菌。该菌为严格厌氧梭菌，能够显著地利用乳酸产生己酸。
该菌的菌落特征：
本发明所述菌株在上述培养基固体平板上培养5天后，菌落圆形，呈乳白色，光滑湿润，稍凸起，较粘稠，易挑取。革兰氏染色阳性。
该菌的生理生化特征为：革兰氏染色阳性，菌体的适宜生长温度25-35℃，pH5.0-7.0。可以利用的碳源主要有：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、蜜二糖、海藻糖、半乳糖、蜜三糖、鼠李糖、L-乳酸和D-甘露糖等(详见表1)等。不能利用的碳源主要有：乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、松三糖、乙酸、鼠李糖、D,L-乳酸、丙酸等(详见表1)等。
根据形态、生理生化、16SrDNA等特征，鉴定其应为瘤胃菌科(Ruminococcaceae)第4梭菌簇(ClostridiumclusterIV)的一个新种。
根据本发明的另一个方面，由于乳酸在窖池积累影响风味，本发明获得的菌株可应用于窖池发酵，促进乳酸转化为己酸，降低乳酸含量，增加己酸含量，从而改善与提高白酒的风味与品质。
同时，本发明的细菌可用于新窖池(或新窖泥)的微生物强化改良，将新窖中过高的乳酸快速转化为己酸。因此可提高己酸，以及己酸乙酯的浓度，同时降低乳酸及乳酸乙酯浓度过高对白酒风味的不利影响，改善白酒的风味和品质。也就是说还可以用于人工窖泥的制备。
根据本发明的再一个方面，该菌还可用于黄水的综合利用，即通过该菌的二次发酵将黄水中乳酸进一步发酵转化成己酸，同时减少废水COD排放。
本发明的有益效果在于，提供了一种新的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)细菌，该菌具有高产己酸的特性及较好的生长稳定性，经扩大培养后可制备高浓度的强化产己酸菌液，可用于利用乳酸或酿酒过程产生的黄水来发酵生产产己酸，同时可用于人工窖泥的强化培养或窖池发酵的“增已降乳”工艺，提高己酸产量，改善白酒的风味和品质，具有很好的应用前景。
保藏说明
本发明涉及瘤胃菌科(Ruminococcaceae)第4梭菌簇(ClostridiumclusterIV)的一个新种，命名为Clostridiumsp.CPC-11。该新种的模式菌株已于2014年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCCNo:9926。
附图说明
图1、细菌Clostridiumsp.CPC-11的扫描电镜照片；
图2、细菌Clostridiumsp.CPC-11的系统发育进化树；
图3、细菌Clostridiumsp.CPC-11的黄水发酵实验结果。
具体实施方式
实施例一菌种的分离、纯化与培养
1、用于分离和培养的培养基基
培养基组成(每100mL)：1g酪蛋白胨,0.25g酵母汁,0.4gNaHCO3,0.1g半胱氨酸,0.045gK2HPO4,0.045gKH2PO4,0.09gNaCl,0.009gMgSO4·7H2O,0.009gCaCl2,0.1mg刃天青,1mg氧化血红素,0.5mL乳酸，微量元素溶液0.1ml，维生素溶液1ml。蒸馏水100ml。其中:
微量元素溶(每L)：FeCl2.4H2O1.5g；CoCl2.6H2O0.19g；MnCl2.4H2O0.1g；ZnCl20.07g；NaMO4.2H2O0.036g；NiCl2.6H2O0.024g；H3BO30.006g；CuCl2.2H2O0.002g；HCl(25％solution)10ml.
维生素溶液(每L)：p-氨基苯甲酸0.04g；生物素0.01g；烟酸0.1g；B50.05g；B60.15g；B10.1g；B120.05g；D.L-硫辛酸0.03g；B20.03g；叶酸0.01g。
2、分离过程
(1)菌种的富集
取窖泥1g，加入上述液体培养基，除氧，在30℃下振荡厌氧培养5天后，用高效液相色谱测定乳酸含量及代谢产物，选择乳酸明显降解的培养液转化到新鲜培养基中继续培养、富集，经多次(5次以上)转接富集，最终以乳酸彻底降解并产生己酸的培养液为目标菌种分离源。
(2)菌种的分离纯化
以生理盐水，将产己酸含量高的厌氧培养液按10-1梯度稀释，用涂布法接种于固体分离培养基中在30℃、严格厌氧条件下培养5-7天。选取单个菌落继续在相同条件下划线培养7天以进一步纯化，反复多次，直到得到纯菌株。然后挑选单菌落斜面保存，或接入液体培养基中进行培养，培养液用甘油保存在-80℃冰箱。
(2)菌种复筛
将获得的纯菌株，再次接入以乳酸为碳源的液体培养基中，在30℃严格厌氧条件下培养5-7天，观察并验证是否能够转化乳酸并产生己酸，复选出转化速率快、己酸产量高的菌株保存备用。
(3)纯菌检测与验证
首先通过菌落形态、颜色和显微镜检观察细菌，初步判定是否是纯菌株；然后通过PCR扩增菌液的16srRNA基因序列，直接测序确定是否为纯菌株。
3、菌种培养
挑取一环斜面菌种接入含上述培养基的厌氧管中，150rpm,，30℃培养3天，可获得浓度约108CFU/mL的种子培养液。
实施例二菌种的培养与鉴定
1、形态特征
菌落形态：梭菌CGMCCNo:9926在平板上培养7天后，菌落圆形，呈乳白色，光滑湿润，稍凸起，较粘稠，易挑取，菌落直径1.5mm。
菌体形态：革兰氏染色阳性，菌体呈球状，直径2.0-2.5um。电镜照片参见图1(SEM，5200×)
2、生理生化特征
用BiologANMicroPlatesTM和API20A厌氧鉴定系统分析得出该梭菌的生理生化特征如表1。
表1CPC-11的生理生化特征
3、分子生物学特征
采用细菌16SrRNA通用引物对27f-1492r扩增菌株CPC-11的16SrRNA，将扩增约1500bp的目的片断克隆到E.coliDH5a中，采用ABI3730测序仪测序。获得CPC-11的16SrRNA基因长度为1325bp，参见SEQIDNo.1。
通过序列比对分析，该菌株与数据库中的梭菌模式种(ClostridiumsporosphaeroidesDSM1294)94.48％相似，与ClostridiumleptumDSM753有93.27％相似。根据细菌新种判定的重要标准(16SrRNA序列相似性<97％)判断CPC-11为瘤胃菌科ClostridiumclusterIV(第IV簇)的一个新种。与CPC-11最相似的模式菌株如表2，基于16SrRNA的系统发育进化树如图2所示。
表2与CPC-11最相似的模式菌株
4、菌株的保藏
将获得的CPC-11(Clostridiumsp.CPC-11)纯菌株，寄到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行专利菌种保藏。保藏中心经菌种复核与活性检测后，于2014年11月3日出具专利菌种保藏证书，编号CGMCCNo:9926。
实施例三初始pH值对产己酸的影响试验
采用液体培养基(见实施例1)，加乳酸至终浓度为10g/L，用氢氧化钠和盐酸调节培养基的酸碱度，得到初始pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共6个酸碱梯度，充N215分钟，然后分装50mL于250ml厌氧瓶中，121℃灭菌15min。按5％(v/v)接种CPC-11菌液(浓度约108CFU/mL)，于30℃摇床150rppm振荡培养7天，测定己酸产量和转化率。结果见表3。
表3、不同pH对产己酸的影响
由表可知，CPC-11在PH5.0-6.5范围内均能较好利用乳酸产己酸，最佳产己酸pH为6.0-6.5，高于7.0乳酸转化基本停止，只能产生微量的己酸。
实施例四底物对CPC-11产己酸的影响试验
以实施例1中培养基为基础培养基，配制三种不同底物培养基如下，1#，乳酸(10g/L)；2#，乳酸(10g/L)和乙酸(2g/L)；3#，乙醇(10g/L)和乙酸(2g/L)，充氮气除氧15min，灭菌后在厌氧操作箱接种5％的CPC-11菌液(浓度约108CFU/mL)，在30℃培养箱中培养7天。结果如下：底物仅为乳酸的，己酸产量为3.02g/L，；底物为乳酸加乙酸的己酸产量为3.53g/L，而底物为乙醇和乙酸的没有己酸产生。说明CPC-11可以利用乳酸，或乳酸和乙酸为底物合成己酸，其中添加乙酸可促进和加快乳酸的转化。但该菌不能利用乙醇和乙酸为底物产生己酸。表明该菌合成己酸的途径是不同于以往以克氏梭菌为代表的微生物合成己酸途径(以乙醇和乙酸为底物合成己酸)。
表4不同底物对CPC-11产己酸的影响
实施例四利用黄水发酵产己酸实验
将稀释的黄水(乳酸浓度约40g/L)为发酵培养液，加入除氧剂半胱氨酸，再用氢氧化钠调节pH为6.0，通氮气除氧，然后接种5％的CPC-11种子液(浓度约108CFU/mL)，在半连续发酵反应器中厌氧培养，控制温度30±2℃。以半连续的培养方式进行实验，即当乳酸降解完或即将降解完时，排出25％的发酵液，再加入等量的黄水，保证总反应体积不变。通过液相色谱法测定发酵产物。结果表明，从第3开始产丁酸，到第7天丁酸产量达21.4g/L，之后丁酸积累逐渐减少；己酸从第9天开始显著增加，至第13天可达19g/L。
本发明瘤胃菌科(Ruminococcaceae)新种Clostridiumsp.CPC-111的16SrRNA序列(SEQIDNo.1)：
AGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGTAACCTGCCTTTCAGAGGGGGATAACGTTCTGAAAAGAACGCTAATACCGCATGACATTTCGAAGCCGCATGGTTTTGGAATCAAAGGAGCAATCCGCTGAAAGATGGACTCGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACAAAGGCGACGATCGGTAGCCGGATTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGGATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGTTTTCGGATTGTAAACCTCTGTCCTTGGTGACGATAATGACGGTAGCCAAGGAGGAAGCTCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGAGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGTGCGTAGGCGGCACTGCAAGTCAGGCGTGAAAGGCGGAGGCTTAACCTCCGAGTTGCGTTTGAAACTGTGGTGCTTGAGTGAAGTAGAGGTAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTACTGGGCTTTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGATTACTAGGTGTGGGGGGTCTGACCCCTTCCGTGCCGGAGTTAACACAATAAGTAATCCACCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAACTAACGAAGCAGAGATGCGTTAGGTGCCCTTCGGGGAAAGTTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAATGAGACTGCCGTTGACAAAACGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCTTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGATCGTTAACAGAGGGAAGCAAAGCCGCGAGGTGGAGCAAAACCCTAAAAACG-GTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACCCGCCTACATGAAGTTGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCCGGTAATACCCGAAGTCAGTAGTCTAAC。

Claims (8)

1.瘤胃菌科(Ruminococcaceae)细菌新种，命名为Clostridiumsp.CPC-11，其模式株的保藏号为CGMCCNo：9926。
2.权利要求1所述的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)细菌新种在用乳酸转化生产己酸中的用途。
3.权利要求1所述的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)细菌新种在发酵酿酒中的用途。
4.权利要求1所述的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)细菌新种在酒厂酿酒废水处理中的用途。
5.权利要求1所述的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)细菌新种在制备人工窖泥中的用途。
6.包含权利要求1所述的细菌的菌剂。
7.包含权利要求1所述的细菌的窖泥。
8.包含权利要求7所述的窖泥的窖池。
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