CN117737142B - 利用高浓度农业源发酵酸化液生产中链羧酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业废弃物发酵液利用领域，提供一种利用高浓度农业源发酵酸化液生产中链羧酸的方法。本方法中，发酵底物为畜禽粪污、作物秸秆、果蔬废弃物等农业废弃物或其混合物，所述方法包括：第一阶段：发酵底物经预发酵得到发酵酸化液，所述发酵酸化液的主要成分为乳酸及其他挥发性脂肪酸；第二阶段：稀释第一阶段发酵酸化液的浓度；第三阶段：向稀释后的发酵液中添加农业源接种物（反刍动物瘤胃液），进行碳链延长反应，进行中链羧酸生产。本发明通过三个阶段的反应，研究发酵酸化液浓度对中链羧酸生产的影响，利用农业源接种物中的微生物突破高浓度乳酸液对中链羧酸生产的限制，提高了利用高浓度发酵酸化液生产中链羧酸的效率。
Description
技术领域
本发明属于农业废弃物发酵液利用领域，具体地说，涉及一种利用高浓度农业源发酵酸化液生产中链羧酸的方法。
背景技术
随着我国农业的快速发展，农业领域产生的废弃物逐年增多，并且大量的农业废弃物处置不当还伴随着环境污染的问题。农业废弃物的处理与利用成为近些年研究的热点。植物纤维性废弃物和畜禽粪便是农业废弃物的主要部分，目前对于农业废弃物的处置方法主要有饲料化、肥料化和能源化三种处理技术，其中厌氧发酵技术的适用范围广、产物种类多，同时可以实现多种产品的综合利用，是近年来备受关注的农业废弃物处理与利用方法。
近年来，在研究利用农业废弃物进行厌氧发酵的过程中，研究者成功利用农业废弃物实现了附加值极高的短链羧酸和中链羧酸生产。例如，其中曹起涛利用猪粪与秸秆混合发酵，实现了短链羧酸的生产（曹起涛. 猪粪与青贮玉米秸秆混合发酵产短链羧酸特性研究. 中国农业科学院, 2020.）。CN112063661B公开了一种通过控制发酵中不同阶段的温度，实现在不添加外源电子供体的条件下生产中链酸酸的途径。由于畜禽粪便与农作物秸秆等农业废弃物混合发酵的产乳酸效果好，所以混合酸化液中的乳酸浓度高，基本可达32gCOD/L。在生产中链羧酸的原理中，乳酸作为电子供体被氧化时，有两种氧化途径：丙酮酸途径和丙烯酸途径。在丙酮酸途径中，乳酸进行一系列的复杂反应生成二氧化碳和乙酰辅酶A，然后顺利进入逆β氧化过程，发生碳链增长反应，进行中链羧酸生产。另一个途径是丙烯酸途径，乳酸流入丙烯酸途径会经过一系列的反应最终生成丙酸，丙烯酸途径生成的丙酸向庚酸的转化效率低，而难以达到生成中链羧酸的目的。而Kucek曾提出，当乳酸的负载率超过一定范围后，乳酸会大量进入到丙烯酸途径中，从而降低中链羧酸的产率 (KucekL A, Nguyen M, Angenent L T. Conversion of l-lactate into n-caproate by acontinuously fed reactor microbiome. Water Research. 2016.) 。在实际应用中，如果对高浓度乳酸发酵液进行稀释再生产中链羧酸，增加了生产成本，同时浪费了混合液中作为碳链增长反应原料的高浓度乳酸。目前针对以高浓度酸化液为原料来进行中链羧酸的生产方法鲜有研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用高浓度农业源发酵酸化液生产中链羧酸的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种利用高浓度农业源发酵酸化液生产中链羧酸的方法，所述方法包括：第一阶段：发酵底物经预发酵得到发酵酸化液，所述发酵酸化液的主要成分为乳酸及其他挥发性脂肪酸；第二阶段：稀释第一阶段发酵酸化液的浓度；第三阶段：向稀释后的发酵酸化液中添加农业源接种物，进行碳链延长反应，进行中链羧酸生产。
本发明中，所述发酵底物为畜禽粪污、作物秸秆、果蔬废弃物等农业废弃物或其混合物。其中，畜禽粪污是必需成分，即发酵底物为畜禽粪污与作物秸秆、果蔬废弃物等农业废弃物中的至少一种的混合物。
所述农业源接种物为反刍动物瘤胃液。
所述中链羧酸包括正己酸、正庚酸和正辛酸。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
A、第一阶段：按料液比1:1~1:2（优选1:1.3）向发酵底物中加入水，经预发酵得到发酵酸化液；发酵温度为35~50℃，pH值为4.0-6.0。
B、第二阶段：加水稀释第一阶段发酵酸化液的浓度，使稀释后的发酵酸化液中乳酸浓度为8~20gCOD/L。
C、第三阶段：向第二阶段稀释后的发酵酸化液中接种反刍动物瘤胃液，进行中链羧酸发酵生产；发酵温度为35-40℃，pH值为4.0-7.0。
步骤A中所述发酵底物为畜禽粪污和农作物秸秆的混合物，或者，发酵底物为畜禽粪污和果蔬废弃物的混合物。混合质量比为1:1~1:1.5。混合物总挥发性固体含量45~70%TS，挥发性固体含量80~90%TS（基于总固体含量）。
进一步地，所述发酵底物的碳氮比为(30-40):1，优选40:1。
本发明所述畜禽粪污为猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪等；所述农作物秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆中的一种或多种；所述果蔬废弃物为水果或蔬菜种植过程中产生的腐烂的果实、秧、藤、叶以及加工过程中的尾料；所述农作物秸秆的总固体含量为1~25%TS，挥发性固体含量为85~95%TS（基于总固体含量），粗纤维含量为35-55%，碳氮比为(45-60):1；果蔬废弃物的总固体含量1~25%TS，挥发性固体含量85~95%TS（基于总固体含量），总糖含量为10-20%（基于鲜重），碳氮比为(40-100):1。
优选地，步骤A中采用发酵罐进行厌氧发酵，发酵天数为6-10d。
优选地，步骤B中加水稀释发酵酸化液的浓度。
优选地，步骤C中采用反应器批式发酵进行中链羧酸的生产，发酵天数为18-24d。
优选地，步骤C中所述反刍动物瘤胃液为牛或绵羊瘤胃液，其中，绵羊瘤胃液中的优势微生物见图1。
在本发明的一个具体实施方式中，反刍动物瘤胃液可采自有瘘管的健康牛、羊试验动物或屠宰场牛、羊的瘤胃液。
进一步地，步骤C中发酵浓度为2%VS-15%VS；反刍动物瘤胃液的接种量为20-25%v/v。
进一步地，步骤C中接种绵羊瘤胃液的方法为在反应器中填充不吸水海绵为附着填料，以发酵酸化液作为微生物的营养源。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）本发明利用农业源的废弃物作为发酵底物，缓解农业废弃物对生态环境造成负担的现状，同时生成附加值高的中链羧酸，实现“变废为宝”。
（二）本发明利用农业源发酵液中本身含有的乳酸、乙酸等短链羧酸进行中链羧酸生产，无需外加乙醇等电子供体，降低了生产过程的成本。
（三）本发明利用农业源接种液中的微生物作为中链羧酸生产的功能菌，实现了利用高浓度混合发酵液进行中链羧酸生产，突破了高浓度乳酸对中链羧酸生产的限制作用，提高了高浓度发酵液生产中链羧酸的效率。
附图说明
图1为本发明实施例2中农业源接种物绵羊瘤胃液中的微生物组成及相对丰度图。
图2为本发明实施例3中各处理组生产中链羧酸的内部组成情况示意图。
图3为本发明实施例3中生产中链羧酸效果最好时的微生物组成及丰度图。
图4为本发明实施例3中三种浓度下生产中链羧酸浓度随时间变化的示意图。
图5为本发明实施例3中三种浓度下生产正己酸浓度随时间变化的示意图。
具体实施方式
本发明旨在提供一种高浓度农业源发酵酸化液生产中链羧酸的方法。该方法利用农业源接种物对发酵酸化液进行功能菌种接种，利用接种的绵羊瘤胃液中复杂的微生物反应，对乳酸进行不同程度的利用，实现利用含高浓度乳酸的酸化液进行中链羧酸生产的反应。提高利用高浓度农业源发酵酸化液进行中链羧酸生产的效率。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种高浓度农业源发酵酸化液生产中链羧酸的方法，具体步骤如下：
A、第一阶段：农业废弃物预发酵得到发酵酸化液，酸化液主要成分为乳酸及其他挥发性脂肪酸。发酵温度为35~50℃，pH值为4.0-6.0；
B、第二阶段：稀释调控第一阶段酸化液浓度，设置不同浓度处理组。
C、第三阶段：对发酵液添加农业源接种物（如绵羊瘤胃液），进行碳链延长反应，进行中链羧酸生产。发酵温度为35-40℃，pH值为4.0-7.0。
优选地，步骤A采用发酵罐进行厌氧发酵，发酵天数为6-10d。
优选地，步骤B中设置不同浓度处理组的方法为加水稀释。
优选地，步骤C进行中链羧酸生产的方式采用批式发酵，发酵天数18-24d。
优选地，步骤C中的农业源接种物主要为绵羊瘤胃液，接种量为20-25% v/v。
优选地，步骤C中接种绵羊瘤胃液的方法为在反应器中填充不吸水海绵为附着填料，以高浓度混合酸化液为营养源喂养微生物。
本发明所述发酵原料农业废弃物为畜禽粪便、农作物秸秆（或果蔬废弃物）的混合物，混合比例为1:1~1:1.5。混合物总挥发性固体含量45~70%TS，挥发性固体含量80~90%TS。果蔬废弃物或农作物秸秆总固体含量1~25%TS，挥发性固体含85~95%TS（基于总固体含量）。
本发明第一阶段中所得混合酸化液初始乳酸浓度为33gCOD/L，乙酸浓度为2.03gCOD/L，考虑到初始酸化液中作为电子供体的乙酸浓度较低，因此在试验中以乳酸浓度为参考标准对原液进行不同程度的稀释。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 混合酸化液的制备及稀释
将猪粪和苹果废弃物（TS: 6%、VS: 92%TS、总含糖量10%鲜重、C/N=60:1），按照一定比例投料进10L厌氧发酵罐中，混合物料碳氮比为40:1，然后按料液比1:1.3向混合物料中加入水，控制发酵温度37℃，初始pH值为5.0，发酵10天。10天后得到农业源发酵酸化液。
所得农业源发酵酸化液中的主要成分为乳酸及其他短链脂肪酸，其中乳酸是最主要成分。探究浓度对产中链羧酸的影响首先以混合酸化液中的乳酸浓度为参考，通过加水稀释的方法，设置三种浓度处理组，分别为乳酸浓度18.62gCOD/L的高浓度组（不加水稀释），乳酸浓度16.05gCOD/L的中浓度组（加水稀释），乳酸浓度8.03gCOD/L的低浓度组（加水稀释）。
实施例2 接种液添加
本实施例中通过向反应器中加入一定的不吸水带孔海绵充当微生物的附着填料，以实施例1中不同处理组的酸化液为营养源喂养微生物而不添加额外营养物质。研究表明，几种微生物都具有促进碳链延长的能力，能够引导碳链延长反应。主要包括克氏梭菌、梭菌属BS-1、埃氏巨型球菌、真古杆菌、红螺菌和粘液真杆菌。其中克氏梭菌、埃氏巨型球菌、真古杆菌都取自于反刍动物瘤胃液。本实施例中所添加的绵羊瘤胃液中含有超过150种微生物，复杂的微生物构成使这种混合菌接种物相比于纯菌体系更容易利用高浓度酸化液进行中链羧酸生产。其中图1展示了绵羊瘤胃液中丰度在前15位的微生物，优势菌属分别为g__Bacillus、g__norank_f__F082、g__Rikenellaceae_RC9_gut_group、g__Lysinibacillus，均属于拟杆菌门。拟杆菌门是参与碳水化合物发酵及其他固醇类的生物转化的重要微生物，普遍存在于人与动物的消化系统中。
本实施例中发酵浓度为10%VS；绵羊瘤胃液的接种量为20% v/v。发酵温度为37℃，pH值为6.5。
本实施例中，绵羊瘤胃液的制备方法如下：
选择1头安装瘘管的健康大尾寒绵羊作为试验动物，禁食24h，禁水12h，取绵羊瘤胃内容物，迅速搅拌并用四层纱布过滤，滤液保存于充满二氧化碳的塑料瓶中，即得绵羊瘤胃液；操作中尽量减少瘤胃液与氧气的接触。
实施例3 中链羧酸的合成
中链羧酸合成阶段的三种浓度处理组都在发酵温度35~39℃，pH值6.5~7.0条件下发酵20天。发酵浓度为10%VS；绵羊瘤胃液的接种量为20% v/v。本实验为严格厌氧发酵，投入物料后对发酵瓶上层进行鼓吹氮气操作，同时在发酵液中加入甲烷抑制剂2-溴乙基磺酸钠(10g/L)。不同浓度处理组中链羧酸产量最大的一天（第14天）的生成情况见图2。高浓度处理组中正己酸产量最大的一天（第14天）微生物组成见图3。三种不同浓度下生产中链羧酸、正己酸浓度随时间变化的示意图分别见图4和图5。
经过发酵后，产中链羧酸效果最好的高浓度处理组中的优势菌属变为g__Bacillus、g__Eubacterium_nodatum_group、g__Lactobacillus、g__Eubacterium，其中真古杆菌g__Eubacterium_nodatum_group和g__Eubacterium的丰度明显增加，是进行中链羧酸生产的重要微生物，它可以利用丙酮酸为底物利用的微生物，依靠氨基酸类物质生长。以乙醇、乳酸等为碳供体，在真古杆菌的作用下，乙酸和丙酸可以被转化为正丁酸、正戊酸，再进一步生成正己酸、正庚酸与正辛酸，微生物生长状况与图4和图5中的高浓度组（即实施例1中乳酸浓度18.62gCOD/L的高浓度组）中链羧酸生产状况相吻合，证明利用农业源接种液进行接种，可以提高高浓度发酵酸化液的中链羧酸生产效率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.利用高浓度农业源发酵酸化液生产中链羧酸的方法，其特征在于，所述方法包括：第一阶段：发酵底物经预发酵得到发酵酸化液，所述发酵酸化液的主要成分为乳酸及挥发性脂肪酸；第二阶段：稀释第一阶段发酵酸化液的浓度；第三阶段：向稀释后的发酵酸化液中添加农业源接种物，进行中链羧酸生产；
其中，所述发酵底物为畜禽粪污和果蔬废弃物的混合物；所述农业源接种物为反刍动物瘤胃液；所述中链羧酸包括正己酸、正庚酸和正辛酸；
包括以下步骤：
A、第一阶段：按料液比1:1~1:2向发酵底物中加入水，经预发酵得到发酵酸化液；发酵温度为35~50℃，pH值为4.0-6.0；
B、第二阶段：加水稀释第一阶段发酵酸化液的浓度，使稀释后的发酵酸化液中乳酸浓度为8~20gCOD/L；
C、第三阶段：向第二阶段稀释后的发酵酸化液中接种反刍动物瘤胃液，进行中链羧酸发酵生产；发酵温度为35-40℃，pH值为4.0-7.0；
步骤A中所述发酵底物的碳氮比为(30-40):1；
步骤C中发酵浓度为2%VS-15%VS；反刍动物瘤胃液的接种量为20-25% v/v。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中采用发酵罐进行厌氧发酵，发酵天数为6-10d。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中采用反应器批式发酵进行中链羧酸的生产，发酵天数为18-24d。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中所述反刍动物瘤胃液为牛或绵羊瘤胃液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤C中接种反刍动物瘤胃液的方法为在反应器中填充不吸水海绵为附着填料，以发酵酸化液作为微生物的营养源。
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