CN117737141B - 一种调控电子受体和电子供体比例以促进中链羧酸生产的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业废弃物利用领域，提供一种调控电子受体和电子供体比例以促进中链羧酸生产的方法，发酵底物为畜禽粪污、作物秸秆、果蔬废弃物等农业废弃物或其混合物，该方法包括：第一阶段：对底物进行预发酵，发酵菌为乳酸菌，发酵温度为30~50℃，pH值为4.0‑6.0；第二阶段：调控第一阶段所得发酵液中电子供体与电子受体的比例（控制摩尔比1‑6:1）；第三阶段：向第二阶段发酵液中接种反刍动物瘤胃液进行厌氧发酵，发酵温度为30‑40℃，pH值为5.5‑7.5。本发明通过三个阶段的反应，调控发酵液中电子供体、电子受体的比例促进畜禽粪污和农业废弃物发酵过程中中链羧酸的生产效率，为农业废弃物高值化利用提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于农业废弃物利用领域，具体地说，涉及一种调控电子受体和电子供体比例以促进中链羧酸生产的方法。
背景技术
我国是农业大国，每年都产生大量的畜禽粪污和农业废弃物，如果不经处理随意堆放，会造成严重的环境污染甚至疾病的传播，且废弃物中含有丰富的有机质成分，是宝贵的物质资源。厌氧发酵产沼气技术是常用的农业废弃物处理技术，但其存在发酵时间长，产气率低等，沼渣难以处理问题，限制了沼气工程大规模推广。而中链羧酸能量密度高、溶解度低，易提取分离，具有广泛的用途和更好的市场前景。现有研究发现，中链酸可以利用短链羧酸和乙醇等物质通过逆β氧化反应生成，为农业废弃物合成中链羧酸提供新方向。
在探究逆β反应的过程中，研究者发现体系中电子供体和电子受体的比例会影响中链羧酸的生产效果。例如，李芸溪等以餐厨垃圾为原料，发现在乳酸和乙酸为5:1的条件下，最适合己酸的生产(李芸溪. 餐厨垃圾资源化产短链/中链羧酸. 哈尔滨工业大学,2020.)。吴清莲以城市污泥为底物，发现乳酸和乙酸比例为2:1时最有利于中链羧酸的生产(吴清莲. 乙醇和乳酸引导的碳链增长技术生产中链羧酸的研究. 哈尔滨工业大学,2019.)。
近年来，利用有机废弃物进行中链羧酸生产的研究逐渐增多，CN116426576A公开了一种通过调控体系pH值及羧酸离子浓度来促进中链羧酸生产的方法。在农业废弃物处理领域，CN112063661B公开了一种利用两段阶梯控温发酵技术在不添加外源电子供体的条件下生产中链羧酸的方法。但现有的有机废弃物转化为中链羧酸的技术对电子供体和电子受体的最佳比例并无定论，且利用不同物料进行混合发酵时的最佳比例鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控电子受体和电子供体比例以促进中链羧酸生产的方法。
本发明构思如下：通过调控体系中电子供体和电子受体比例以促进中链羧酸的生产。该方法根据逆β氧化反应的反应原理，通过调控电子供体和电子受体的比例，使体系中的乳酸在丙酮酸途径中转化为乙酰辅酶A从而进行碳链延长反应生成中链羧酸，减少丙烯酸途径竞争的影响，而更多的作为逆β反应中的电子供体参与中链羧酸的生产，提高利用农业废弃物进行中链羧酸生产的效率。
为了实现本发明目的，本发明提供一种调控电子受体和电子供体比例以促进中链羧酸生产的方法，发酵底物为畜禽粪污、作物秸秆、果蔬废弃物等农业废弃物或其混合物。其中，畜禽粪污是必需成分，即发酵底物为畜禽粪污与作物秸秆、果蔬废弃物等农业废弃物中的至少一种的混合物。
其中，所述中链羧酸包括正己酸、正庚酸和正辛酸等。
所述方法包括以下步骤：
A、第一阶段：按料液比1:1~1:2（优选1:1.3）向发酵底物中加入水，然后进行预发酵（厌氧发酵），发酵菌为乳酸菌，发酵温度为30~50℃，pH值为4.0-6.0；
B、第二阶段：调控第一阶段所得发酵液中电子供体与电子受体的比例，将所述发酵液中电子供体和电子受体的摩尔比控制在(1-6):1；
所述电子供体为乳酸和/或乙醇，所述电子受体为短链脂肪酸；其中，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸等；
C、第三阶段：向第二阶段的发酵液中接种反刍动物瘤胃液（瘤胃液中主要发酵菌为梭菌和真古杆菌），进行厌氧发酵，发酵温度为30-40℃，pH值为5.5-7.5。
步骤A中所述发酵底物为畜禽粪污和作物秸秆的混合物，或者，发酵底物为畜禽粪污和果蔬废弃物的混合物。
进一步地，所述发酵底物的碳氮比为(30-40):1。
本发明所述畜禽粪污为猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪等；所述作物秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆中的一种或多种；所述果蔬废弃物为水果或蔬菜种植过程中产生的腐烂的果实、秧、藤、叶以及加工过程中的尾料；所述作物秸秆的总固体含量为40-70%TS，挥发性固体含量为80-90%TS（基于总固体含量），粗纤维含量为30-50%，碳氮比为(45-60):1；果蔬废弃物的总固体含量1-20%TS，挥发性固体含量90-98%TS（基于总固体含量），总糖含量为10-20%（基于鲜重），碳氮比为(40-100):1。
进一步地，步骤A中所述乳酸菌包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）等中的一种或多种。
进一步地，步骤A中发酵浓度为2%VS-15%VS（按质量计）；菌液接种量为5%-10% v/v，菌液中的活菌数为106-109CFU/mL。
进一步地，步骤C中所述反刍动物瘤胃液为健康牛或羊的瘤胃液。其中，绵羊瘤胃液中的梭菌和真古杆菌包括g__Clostridium_sensu_stricto_1、g__Clostridium_sensu_stricto_12、g__Eubacterium、g__Eubacterium_nodatum_group等。
在本发明的一个具体实施方式中，反刍动物瘤胃液可采自安装瘘管的健康牛羊等试验动物、或从屠宰场牛羊瘤胃中采集。采集的瘤胃液经四纱布过滤后保存于充满氮气的玻璃培养瓶中，外接500mL气袋，操作中尽量减少瘤胃液与氧气的接触。
进一步地，步骤C中发酵浓度为2%VS-15%VS（按质量计）；反刍动物瘤胃液的接种量为5%-10% v/v。
进一步地，步骤B中电子供体和电子受体的摩尔比控制在1:1、2:1、3:1或4:1，优选摩尔比1:1。
进一步地，步骤A中采用批式发酵工艺，每批发酵天数为6-10d（优选10d）。
进一步地，步骤C中厌氧发酵天数为15~25d（优选20d）。
进一步地，步骤B中调控电子供体、电子受体比例的方法为外加乙酸。
进一步地，步骤C中通过加碱调控pH值为5.5-7.5。
优选地，所述碱为20%~30%（优选20%）氢氧化钠溶液。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）本发明利用畜禽粪污、作物秸秆和果蔬废弃物等为发酵底物，原料来源广泛，成本低，且发明所涉及技术简单方便操作，同时一定程度上改善了生态环境。
（二）本发明利用碳链延长反应原理，结合混合发酵液自身成分情况，通过外加少量乙酸调节体系内电子供体和电子受体的比例可以有效提高中链羧酸的产量，可使超过50%的内源短链羧酸转化为高附加值的中链羧酸，具有良好的市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中进行预发酵后得到酸化液的各组分浓度示意图。
图2为本发明实施例2中外加乙酸后，各处理组体系中各成分浓度示意图。
图3为本发明实施例3中电子供体和电子受体比例不同的各处理组中的中链羧酸生成情况折线图。
图4为本发明实施例3中调控电子供体和电子受体比例前后产总中链羧酸浓度示意图。
图5为本发明实施例3中调控电子供体和电子受体比例前后产正己酸浓度示意图。
具体实施方式
本发明提供一种调控不同电子受体和电子供体比例以促进中链羧酸生产的方法，具体步骤如下：
A、第一阶段：废弃物预发酵（厌氧发酵），发酵菌为乳酸菌。发酵温度为30~50℃，pH值为4.0-6.0；
B、第二阶段：调控第一阶段所得发酵液中电子供体与电子受体的比例，设置不同比例处理组。
C、第三阶段：向第二阶段的发酵液中接种绵羊瘤胃液，进行厌氧发酵（绵羊瘤胃液中主要发酵菌为梭菌和真古杆菌）。发酵温度为30-40℃，pH值为5.5-7.5。
优选地，步骤A中采用批式发酵工艺，每批发酵天数为6-10d。
优选地，步骤B中电子供体主要为发酵液中的乳酸及乙醇等物质、电子受体主要为发酵液中的短链脂肪酸。
优选地，步骤B中调控电子供体、电子受体的比例方法为外加乙酸。
优选地，步骤C中通过加碱调控5.5≤pH≤7.5，采用的碱为20%的氢氧化钠溶液。
本发明所述农业废弃物的总固体含量为40-70%TS，挥发性固体含量为80-90%TS（基于总固体含量），粗纤维含量为30-50%；果蔬废弃物总固体含量1-20%TS，挥发性固体含量90-98%TS（基于总固体含量）。
本发明第一阶段中所得混合发酵液中电子供体浓度为20-30g/L，电子受体浓度为5-10g/L，电子受体和电子供体摩尔为(6-10):1。
本发明第二阶段中外加乙酸后调控的电子供体浓度为15-20g/L，电子受体浓度为2-15g/L，电子受体和电子供体摩尔为(1-6):1。
本发明中第一阶段的优势菌属为乳酸菌，第三阶段的优势菌属为梭菌及真古杆菌。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 混合酸化液的制备
试验所需混合酸化液中的主要成分为乳酸及其他短链脂肪酸。本阶段发酵的主要功能菌为乳酸菌，发酵温度为30-40℃，培养时间为6-10d。主要包括如下步骤：
1、乳酸菌培养：使用MRS肉汤(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)接种佰生优乳酸菌粉（嗜热链球菌，4g/L，购自善恩康生物科技(苏州)有限公司）在中性条件下放置35-39℃培养箱内培养36h，得到乳酸菌接种液（活菌数为107CFU/mL）备用。
2、将猪粪和苹果废弃物（TS: 6%、VS: 92%TS、总含糖量10%鲜重、C/N=60:1），按照一定比例投料进厌氧发酵罐中，混合物料碳氮比为40:1，然后按料液比1:1.3向混合物料中加入水，加乳酸菌接种液10％v/v至发酵罐，发酵浓度为5%VS，控制发酵温度35-37℃，发酵10天。10天后得到初步所需的混合酸化液，此时酸化液中的主要成分为乳酸，具体乳酸及各短链脂肪酸浓度见图1。其中，LA、C2、C3、i-C4、n-C4、i-C5分别表示乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸。
实施例2 调控酸化液中电子供体和电子受体的比例
根据图1所示计算混合酸化液中电子供体和电子受体的初始比例。鉴于初始酸化液中乳酸浓度较高（电子供体和电子受体的摩尔比约为9.342:1），本试验通过外加乙酸（分析纯）的方式调控电子供体（乳酸）和电子受体（短链脂肪酸）的比例。分别设置五个处理组，将电子供体和电子受体的摩尔比分别设置为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1（分别对应1~5号处理组）。调控后各处理组混合酸化液中各成分浓度示意图见图2。
从图2可以看出，电子供体和电子受体的最佳摩尔比为1:1（对应1号处理组），中链羧酸产量最高，而不添加乙酸组（不添加乙酸组与上述5号处理组结果相当）的中链羧酸产量很不理想。
实施例3 中链羧酸的合成
本阶段发酵的主要微生物为健康绵羊的瘤胃液中的微生物，包括梭菌、真古杆菌中的g__Clostridium_sensu_stricto_1、g__Clostridium_sensu_stricto_12、g__Eubacterium、g__Eubacterium_nodatum_group，均属于厚壁菌门的梭菌目，是参与碳链延长反应的重要功能微生物。通过外加20%氢氧化钠溶液，将混合发酵液pH值调至6.0~7.0，而后加入绵羊瘤胃液10%v/v，控制发酵温度35~39℃，发酵时间为20天。本实验为严格厌氧发酵，投入物料后对发酵瓶上层进行吹氮气操作，同时在发酵液中加入甲烷抑制剂2-溴乙基磺酸钠(10g/L)（购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。不同电子供体和电子受体比例组的中链羧酸生成情况折线图见图3。调控电子供体和电子受体比例前后产总中链羧酸、正己酸浓度示意图分别见图4、图5。
本实施例中，绵羊瘤胃液的制备方法如下：
选择1头安装瘘管的健康大尾寒绵羊作为试验动物，禁食24h，禁水12h，取绵羊瘤胃内容物，迅速搅拌并用四层纱布过滤，液保存于充满氮气的玻璃培养瓶中，外接500mL气袋，即得绵羊瘤胃液；操作中尽量减少瘤胃液与氧气的接触。
本实施例所得发酵产物中的优势菌属为梭菌与真古杆菌。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种调控电子受体和电子供体比例以促进中链羧酸生产的方法，其特征在于，发酵底物为畜禽粪污、作物秸秆、果蔬废弃物或其混合物；
其中，所述中链羧酸包括正己酸、正庚酸和正辛酸；
包括以下步骤：
A、第一阶段：按料液比1:1~1:2向发酵底物中加入水，然后进行预发酵，发酵菌为乳酸菌，发酵温度为30~50℃，pH值为4.0-6.0；
B、第二阶段：调控第一阶段所得发酵液中电子供体与电子受体的比例，将所述发酵液中电子供体和电子受体的摩尔比控制在(1-6):1；
所述电子供体为乳酸，所述电子受体为短链脂肪酸；其中，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸；
C、第三阶段：向第二阶段的发酵液中接种反刍动物瘤胃液，进行厌氧发酵，发酵温度为30-40℃，pH值为5.5-7.5；
步骤B中调控电子供体、电子受体比例的方法为外加乙酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述发酵底物的碳氮比为(30-40):1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述乳酸菌包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A中发酵浓度为2%VS-15%VS；菌液接种量为5%-10% v/v，菌液中的活菌数为106-109CFU/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中所述反刍动物瘤胃液为牛或羊瘤胃液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤C中发酵浓度为2%VS-15%VS；反刍动物瘤胃液的接种量为5%-10% v/v。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中电子供体和电子受体的摩尔比控制在1:1、2:1、3:1或4:1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中采用批式发酵工艺，每批发酵天数为6-10d；
步骤C中厌氧发酵天数为15~25d。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤C中通过加碱调控pH值为5.5-7.5；
其中，所述碱为20%~30%氢氧化钠溶液。
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