CN111979129A - 一种利用混合微生物体系将沼气转化为单细胞蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用混合微生物体系将沼气转化为单细胞蛋白的方法，属于沼气利用技术领域。本发明方法通过对沼液进行固液分离的预处理，使得其能够用于小球藻和甲烷氧化菌的混合培养，小球藻利用沼气中的CH4和CO2生长，甲烷氧化菌可以利用沼气中的CH4与小球藻光合作用产生的O2进行生长。在无害化、资源化利用的同时，能得到高蛋白的小球藻和甲烷氧化菌，是环境友好型产品。本发明所提出的一种无害化、资源化利用沼气的方法，操作简单，可行性高，并且具有处理量大，处理周期短的特点，具有很好的经济价值和环境效益。

Description

一种利用混合微生物体系将沼气转化为单细胞蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种利用混合微生物体系将沼气转化为单细胞蛋白的方法，属于沼气利用技术领域。
背景技术
由于资源的有限性，世界上仍存在因人口快速增长而造成的营养不良的问题，所以，急需一种生产高质量蛋白替代食物和动物饲料的方法来缓解食物短缺问题。我国固体废弃物产生量逐渐增长，尤其是农业固体废弃物以及污水处理厂产生的污泥占据了一定的比例。厌氧发酵是满足我国固废管理所提出的“三化”原则的一种处理固废的方法，能够减量化、资源化、无害化处理固体废弃物。有机物经过微生物厌氧发酵之后，产生了一种可燃性混合气体——沼气，它的主要组成成分是甲烷(60％-70％)和二氧化碳(30％-40％)。但由于沼气中二氧化碳的含量较高，目前沼气的主要利用方式局限于供热和发电。沼气提纯作为生物天然气使用大幅提高了沼气的应用范围及价值，但是提纯过程中高的经济投入限制了其大规模使用。此外，厌氧发酵产生的副产物沼液常用作有机肥，但由于沼液的产生以及有机肥的使用存在不同步现象，所产生的沼液等废弃物往往需要长时间存储，在此过程中会释放出甲烷等温室气体对环境产生一定的不利影响，并且沼液作为肥料使用过程中，作物对其营养元素使用率很低。因此，急需一种有效且合理的方式对沼气和沼液进行资源化、无害化利用。
微藻通过光合作用将二氧化碳转化为有机物以供自身的生长，微藻中含有丰富的核酸、脂质、矿物质、叶绿素、维生素等。尤其，微藻的蛋白质含量很高，具有极高的营养价值，目前应用在鱼食饵料中，其中的脂质还可以作为生物能源。甲烷氧化菌是一种将甲烷作为唯一碳源的微生物，它能产生可用作动物饲料的单细胞蛋白，生物聚合物，纳米技术应用组分的表面层，可溶性代谢物(甲醇、甲醛、有机酸)、可用作生物柴油和保健品的脂质，生长介质和维生素B12。利用微藻及甲烷氧化菌混合体系可以实现沼气向蛋白的转化，并且在此过程中沼液可以作为营养源为微藻以及甲烷氧化菌的生长提供营养元素，从而实现沼气以及沼液的资源化、高值化利用。
发明内容
[技术问题]
由于沼气中二氧化碳的含量较高，目前沼气的主要利用方式局限于供热和发电。沼气提纯作为生物天然气使用大幅提高了沼气的应用范围及价值，但是提纯过程中高的经济投入限制了其大规模使用。此外，厌氧发酵产生的副产物沼液常用作有机肥，但由于沼液的产生以及有机肥的使用存在不同步现象，所产生的沼液等废弃物往往需要长时间存储，在此过程中会释放出甲烷等温室气体对环境产生一定的不利影响，并且沼液作为肥料使用过程中，作物对其营养元素使用率很低。同时，由于资源的有限性，世界上仍存在因人口快速增长而造成的营养不良的问题，所以，急需一种生产高质量蛋白替代食物和动物饲料的方法来缓解食物短缺问题。
[技术方案]
针对上述问题，本发明提供了一种利用混合微生物体系将沼气转化为单细胞蛋白的方法，微生物混合体系是指微藻和甲烷氧化菌混合的微生物体系，本发明以厌氧发酵产生的沼液与培养液混合用于培养微藻与甲烷氧化菌，能够充分利用沼液资源。反应过程中，微藻吸收沼气中的CO2进行光合作用完成自身成长，同时产生O2以供甲烷氧化菌的生长；而甲烷氧化菌吸收沼气中的CH4和微藻产生的O2，同时产生单细胞蛋白。
本发明提供了一种利用混合微生物体系将沼气转化为单细胞蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将沼液与培养液混合，向混合后的培养液中接种微藻和甲烷氧化菌，得到微生物混合体系；
(2)将沼气与氧气进行混合，混合气体通入活性炭吸收装置吸收气体中的硫化氢再通入微生物混合体系中供微藻和甲烷氧化菌生长；
(3)离心或过滤收集步骤(2)中生长得到的生长得到的微藻和甲烷氧化菌。
在一种实施方式中，步骤(1)中所述沼液为厌氧发酵后产生的沼液，并且需要将沼液进行固液分离，取分离后液态的沼液与培养液混合。
在一种实施方式中，步骤(1)中的培养液为BG11培养液，具体组成为：NaNO3：1500mg/L，К2НРО4·3Н2O：40mg/L，MgSO4·7H2O：75mg/L，Na2CO3：20mg/L，CaCl2：27mg/L，一水柠檬酸：6mg/L，柠檬酸铁铵：6mg/L，Na2EDTA：1mg/L，НзВОз：2.86mg/L，MnCl2·4H2O：1.81mg/L，ZnSO4·7H2O：0.222mg/L，CuSO4·5H2O：0.079mg/L，CoCl2·6H2O：0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O：0.39mg/L。
在一种实施方式中，步骤(1)中沼液体积占沼液和培养液总体积的5％～40％。
在一种实施方式中，步骤(1)中最优沼液体积占沼液和培养液总体积的10％。
在一种实施方式中，步骤(1)中的微藻为绿藻门小球藻属，包括小球藻、螺旋藻、轮藻中的任意一种。
在一种实施方式中，步骤(1)中按体积计，所述微藻的接种量占培养液的1％～10％。
在一种实施方式中，步骤(1)中按体积计，所述甲烷氧化菌的接种量占培养液的1％～10％。
在一种实施方式中，步骤(1)中所述微藻和甲烷氧化菌的接种量比为(1∶1)～(2∶3)。
在一种实施方式中，步骤(1)中按体积计，所述微藻的最优接种量占培养液的1.2％，所述甲烷氧化菌的最优接种量占培养液的1.8％。
在一种实施方式中，步骤(2)中所述沼气与氧气混合的比例按体积计为(1：0)～(3：4)。
在一种实施方式中，步骤(2)中所述沼气与氧气混合的最优比例按体积计为3：4。
在一种实施方式中，步骤(2)中所述微藻和甲烷氧化菌生长的条件为：在120rpm，25℃摇床中进行光照培养，24h内连续光照14h，停止光照10h，光照强度3800lux。
在一种实施方式中，从步骤(3)得到的微藻和甲烷氧化菌中提取蛋白质。
本发明提供了上述方法在处理沼液和沼气中的应用。
[有益效果]
本发明所提出的一种混合微生物体系将沼气转化为单细胞蛋白的方法，主要应用于沼气能源利用领域。具有操作简单，可实施性高，处理沼气量大，周期短的特点。本发明在将沼气、沼液无害化、资源化充分利用的同时，产生高质量的单细胞蛋白，具有较高的经济价值。本发明所具有的优点，具体如下：
(1)本发明操作简单，可实施性高，反应条件易于控制；
(2)本发明所提出的资源化利用沼气的量大，处理周期短：仅需5-10天；
(3)本发明通过微生物利用沼气，并以沼液替代部分培养基，实现了沼气、沼液的高值化利用；
(4)本发明具有甲烷利用率高的优点，在整个过程中甲烷的理论利用率可达100％；
(5)本发明可以协同得到优质蛋白，经济效益明显。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明利用气相色谱仪测量CH4原始量和剩余量。
CH4利用率计算方法：[(原始CH4量-剩余CH4量)/原始CH4量]×100％
培养液具体成分：BG11培养液：NaNO3：1500mg/L，К2НРО4·ЗН2O：40mg/L，MgSO4·7H2O：75mg/L，Na2CO3：20mg/L，CaCl2：27mg/L，一水柠檬酸：6mg/L，柠檬酸铁铵：6mg/L，Na2EDTA：1mg/L，НзВОз：2.86mg/L，MnCl2·4H2O：1.81mg/L，ZnSO4·7H2O：0.222mg/L，CuSO4·5H2O：0.079mg/L，CoCl2·6H2O：0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O：0.39mg/L。
利用分光光度计测定混合微生物的吸光度观察微生物的增长趋势；
利用BCA法蛋白含量测定试剂盒测定蛋白质含量。
沼气成分：约为60％CH4，40％CO2以及1000ppm的H2S。
【实施例1】
(1)将取自厌氧发酵罐的沼液以400r/min的转速进行离心，然后利用砂芯漏斗过滤，再放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min备用；
(2)按照沼液占培养液总体积的10％的比例，将处理后的沼液与培养液混合均匀，向混合液体中接种1.5％(体积比)小球藻富集藻液(4×106CFU/mL)，向混合液体中接种1.5％(体积比)甲烷氧化菌富集菌液(9×109CFU/mL)；
(3)将沼气经过活性炭吸附装置进行吸附，吸附其中的硫化氢后再通入小球藻和甲烷氧化菌的混合体系中，将混合体系于室温下(25℃)120r/min摇床中进行5天的光照培养(24h内连续光照时长为14h，黑暗时长10h)，光照强度3800lux；
(4)反应结束后，将反应体系通过4000rpm的转速洗涤离心，取沉淀物收集小球藻与甲烷氧化菌，即获得富含蛋白的小球藻及甲烷氧化菌。
利用气相色谱仪测试CH4利用率，通过计算可知，在5天的处理过程中，CH4的利用率为47.13％，取141ml藻液用冷冻干燥机冻干后，称重，得出混合微生物的生物量为0.87g干重/L，混合蛋白含量为51.97g/100g干重。
【实施例2】
(1)将取自厌氧发酵罐的沼液以400r/min的转速进行离心，然后利用砂芯漏斗过滤，再放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min备用；
(2)按照沼液占培养液总体积的10％的比例，将处理后的沼液与培养液混合均匀，向混合液体中接种1.2％(体积比)小球藻富集藻液(4×106CFU/mL)，向混合液体中接种1.8％(体积比)甲烷氧化菌富集菌液(9×109CFU/mL)；
(3)将沼气经过活性炭吸附装置进行吸附，吸附其中的硫化氢后再通入小球藻和甲烷氧化菌的混合体系中，将混合体系于室温下(25℃)120r/min摇床中进行5天的光照培养(24h内连续光照时长为14h，黑暗时长10h)，光照强度3800lux；
(4)反应结束后将反应体系通过4000rpm的转速洗涤离心，取沉淀物收集小球藻与甲烷氧化菌，即获得富含蛋白的小球藻及甲烷氧化菌。
利用气相色谱仪测试CH4利用率，通过计算可知，在5天的处理过程中，CH4的利用率为61.39％，取141ml藻液用冷冻干燥机冻干后，称重，得出混合微生物的生物量为1.06g干重/L，混合蛋白含量为52.74g/100g干重。
通过实施例1与实施例2对比可知，在不通氧气(仅通入沼气)的情况下，小球藻与甲烷氧化菌接种比为2∶3时，更适宜于小球藻与甲烷氧化菌的生长，混合微生物能更充分利用培养液的营养成分(根据干重即生物量以及蛋白含量观察得出)
【实施例3】
(1)将取自厌氧发酵罐的沼液以400r/min的转速进行离心，然后利砂芯漏斗过滤，再放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min备用；
(2)按照沼液占培养液总体积的10％的比例，将处理后的沼液与培养液混合均匀，向混合液体中接种1.2％(体积比)小球藻富集藻液(4×106CFU/mL)，向混合液体中接种1.8％(体积比)甲烷氧化菌富集菌液(9×109CFU/mL)；
(3)将沼气经过活性炭吸附装置进行吸附，吸附其中的硫化氢，再按照沼气和氧气的体积比为3:4与氧气混合，后再通入小球藻和甲烷氧化菌的混合体系中，将混合体系于室温下(25℃)120r/min摇床中进行5天的光照培养(24h内连续光照时长为14h，黑暗时长10h)，光照强度3800lux；
(4)反应结束后，将反应体系通过4000rpm的转速洗涤离心，取沉淀物收集小球藻与甲烷氧化菌，即获得富含蛋白的小球藻及甲烷氧化菌。
利用气相色谱仪测试CH4利用率，通过计算可知，在5天的处理过程中，CH4的利用率为81.72％，取141ml藻液用冷冻干燥机冻干后，称重，得出混合微生物的生物量为1.28g干重/L，混合蛋白含量为56.53g/100g干重。
实施例2与实施例3对比，在小球藻与甲烷氧化菌接种比为2∶3的情况下，通入氧气，有利于微生物的生长(根据干重即生物量观察得出)，由于氧气的通入，在反应的开启阶段，促进了小球藻的生长，同时氧气充足的情况也促进了甲烷氧化菌的生长。
【实施例4】
(1)将取自厌氧发酵罐的沼液以400r/min的转速进行离心，然后利用砂芯漏斗过滤，再放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min备用；
(2)按照沼液占培养液总体积的40％的比例，将处理后的沼液与培养液混合均匀，向混合液体中接种1.2％(体积比)小球藻富集藻液(4×106CFU/mL)，向混合液体中接种1.8％(体积比)甲烷氧化菌富集菌液(9×109CFU/mL)；
(3)将沼气经过活性炭吸附装置进行吸附，吸附其中的硫化氢，再按照沼气和氧气的体积比为3:4与氧气混合，后再通入小球藻和甲烷氧化菌的混合体系中，将混合体系于室温下(25℃)120r/min摇床中进行5天的光照培养(24h内连续光照时长为14h，黑暗时长10h)，光照强度3800lux；
(4)反应结束后，将反应体系通过4000rpm的转速洗涤离心，取沉淀物收集小球藻与甲烷氧化菌，即获得富含蛋白的小球藻及甲烷氧化菌。
利用气相色谱仪测试CH4利用率，通过计算可知，在5天的处理过程中，CH4的利用率为37.56％，取141ml藻液用冷冻干燥机冻干后，称重，得出混合微生物的生物量为0.59g干重/L，混合蛋白含量为46.82g/100g干重。
【对比例1】
(1)将取自厌氧发酵罐的沼液以400r/min的转速进行离心，然后利用砂芯漏斗过滤，再放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min备用；
(2)按照沼液占总液体体积的80％将处理后的沼液与培养液混合均匀，向混合液体中接种1.2％(体积比)小球藻富集藻液(4×106CFU/mL)，向混合液体中接种1.8％(体积比)甲烷氧化菌富集菌液(9×109CFU/mL)；
(3)将沼气经过活性炭吸附装置进行吸附，吸附其中的硫化氢，再按照沼气和氧气的体积比为3:4与氧气混合，后再通入小球藻和甲烷氧化菌的混合体系中，将混合体系于室温下(25℃)120r/min摇床中进行5天的光照培养(24h内连续光照时长为14h，黑暗时长10h)，光照强度3800lux；
(4)反应结束后，将反应体系通过4000rpm的转速洗涤离心，取沉淀物收集小球藻与甲烷氧化菌，即获得富含蛋白的小球藻及甲烷氧化菌。
利用气相色谱仪测试CH4利用率，通过计算可知，在5天的处理过程中，CH4的利用率为22.04％，取141ml藻液用冷冻干燥机冻干后，称重，得出混合微生物的生物量为0.48g干重/L，混合蛋白含量为44.70g/100g干重。
通过实施例4、对比例1与实施例3对比，在小球藻与甲烷氧化菌接种比为2∶3且通入氧气的情况下，沼液浓度为10％(v/v)时，微生物的生长的最好(根据干重即生物量观察得出)，尤其是甲烷氧化菌的生长(根据甲烷利用率观察得出)，可能是由于沼液浓度上升，溶液颜色较深影响了小球藻光合作用产氧气，从而影响甲烷氧化菌的生长。
【对比例2】
(1)将取自厌氧发酵罐的沼液以400r/min的转速进行离心，然后利用砂芯漏斗过滤，再放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min备用；
(2)按照沼液占培养液总体积的10％的比例，将处理后的沼液与培养液混合均匀，向混合液体中接种3％(体积比)小球藻富集藻液(4×106CFU)；
(3)将沼气经过活性炭吸附装置进行吸附，吸附其中的硫化氢，再按照沼气和氧气的体积比为3:4与氧气混合，后再通入小球藻和甲烷氧化菌的混合体系中，将混合体系于室温下(25℃)120r/min摇床中进行5天的光照培养(24h内连续光照时长为14h，黑暗时长10h)，光照强度3800lux；
(4)反应结束后，将反应体系通过4000rpm的转速洗涤离心，取沉淀物收集小球藻，即获得富含蛋白的小球藻。
利用气相色谱仪测试CH4利用率，通过计算可知，在5天的处理过程中，CH4的利用率为6.67％，取141ml藻液用冷冻干燥机冻干后，称重，得出小球藻的生物量为1.13g干重/L，小球藻蛋白含量为49.03g/100g干重。
【对比例3】
(1)将取自厌氧发酵罐的沼液以400r/min的转速进行离心，然后利用砂芯漏斗过滤，再放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min备用；
(2)按照沼液占培养液总体积的10％的比例，将处理后的沼液与培养液混合均匀，向混合液体中接种1.2％(体积比)小球藻富集藻液(4×106CFU)，向混合液体中接种1.8％(体积比)甲烷氧化菌富集菌液(9×109CFU)；
(3)未经过活性炭吸附硫化氢之后的沼气(含有硫化氢)，按照沼液占培养液总体积的10％的比例，将处理后的沼液与培养液混合均匀，将混合体系于室温下(25℃)120r/min摇床中进行5天的光照培养(24h内连续光照时长为14h，黑暗时长10h)，光照强度3800lux；
(4)反应结束后，将反应体系通过4000rpm的转速洗涤离心，取沉淀物收集小球藻与甲烷氧化菌，即获得富含蛋白的小球藻及甲烷氧化菌。
利用气相色谱仪测试CH4利用率，通过计算可知，在5天的处理过程中，CH4的利用率为13.02％，取141ml藻液用冷冻干燥机冻干后，称重，得出混合微生物的生物量为0.67g干重/L，混合蛋白含量为43.51g/100g干重。
通过对比例与实施例3对比，认为硫化氢的存在会抑制甲烷氧化菌的生长，因此在反应装置前安装活性炭吸附装置是有必要的。
为了便于对比，以下表1中详细列出了以上实施例和对比例中的各项数据。
表1
Figure BDA0002659541530000071
Figure BDA0002659541530000081
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种利用混合微生物体系将沼气转化为单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将沼液与培养液混合，向混合后的培养液中接种微藻和甲烷氧化菌，得到微生物混合体系；
(2)取沼气、或沼气与氧气的混合气，气体通入活性炭吸收装置吸收气体中的硫化氢再通入微生物混合体系中供微藻和甲烷氧化菌生长；
(3)离心或过滤收集步骤(2)中生长得到的微藻和甲烷氧化菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中沼液体积占沼液和培养液总体积的5％～40％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中沼液体积占沼液和培养液总体积的10％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的微藻为绿藻门小球藻属，包括小球藻、螺旋藻、轮藻中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中按体积计，所述微藻的接种量占培养液的1％～10％；所述甲烷氧化菌的接种量占培养液的1％～10％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述微藻和甲烷氧化菌的接种量比为(1∶1)～(2∶3)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述沼气与氧气混合的比例按体积计为(1∶0)～(3∶4)，且氧气含量不为0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述沼气与氧气最优混合的比例按体积计为3∶4。
9.权利要求1～8任一项所述方法，其特征在于，从步骤(3)得到的微藻和甲烷氧化菌中提取蛋白质。
10.权利要求1～8任一项所述方法在处理沼液和沼气中的应用。
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