CN114045235A - 一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法。本发明提供了一种嗜甲烷菌培养方法：采用生物反应器培养嗜甲烷菌；培养过程中，持续进行通气，通气气体中包括甲烷；培养过程中，根据培养体系溶氧调节生物反应器转速；培养过程中具有补料阶段。本发明还保护所述方法在制备单细胞蛋白中的应用。本发明还保护所述方法在制备动物饲料和/或可发酵糖中的应用。本发明为商业化生产嗜甲烷菌单细胞蛋白提供借鉴。

Description

一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法。
背景技术
随着我国作出“碳达峰”、“碳中和”等承诺，后续各项政策规划的出台及落地将加快推动实现绿色低碳制造。相比于二氧化碳，甲烷(CH4)温室效应可高出80余倍，是不容忽视的温室气体主要来源之一。
随着全球人口增长以及人们对营养的需求提升，使得肉蛋奶的需求逐年增长，进而加剧了饲料供需紧张。目前，畜禽及水产养殖的饲料来源主要为豆粕和鱼粉，饲用豆粕需求增长将占据更多耕地，而鱼粉产量远低于饲料需求。
单细胞蛋白(SCP)，也叫微生物蛋白，是人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸、非蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等组成的细胞质团。嗜甲烷菌以甲烷为唯一碳源和能源进行生长，其代谢过程中流向生物质的碳可高达70％。其中，部分嗜甲烷菌蛋白含量可介于60-70％。利用嗜甲烷菌以甲烷为碳源生产单细胞蛋白，不仅有助于温室气体减排，还可填补全球饲料缺口。
限制嗜甲烷菌单细胞蛋白商业化生产的最主要因素为细胞密度及蛋白含量，其受气体底物供应和营养盐添加的影响较大。目前CN105722985-A公布的数据显示在0.5L和5L搅拌式发酵罐中嗜甲烷菌干重分别达到22和10g/L，与大肠杆菌(200-400g/L)及酵母菌(100-200g/L)相比仍有明显差距。此外，根据该工艺添加的氮源量计算，在0.5L罐达到的最高细胞密度(22g/L)下，干生物质总凯氏氮含量仅5％，表明其蛋白含量远低于正常值。因此，需要对现有嗜甲烷菌高密度发酵工艺进行改进和优化，在确保菌体高蛋白含量的同时达到更高细胞密度，进而保证产品经济价值，并减小生产成本。
此外，嗜甲烷菌胞内可积累相当部分的糖原，经提纯和水解等预处理后能够作为可发酵糖，用于生产生物燃料等高值化学品。其可作为副产品，以改善单细胞蛋白生产成本普遍较高的现状，使得后者更具市场竞争力。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法。
本发明提供了一种嗜甲烷菌培养方法，包括如下步骤：
采用生物反应器培养嗜甲烷菌；
培养过程中，持续进行通气，通气气体中包括甲烷；
培养过程中，根据培养体系溶氧调节生物反应器转速；
培养过程中具有补料阶段。
根据培养体系溶氧调节生物反应器转速的方法为：初始转速设置为50-500rpm，每当溶氧低于5-40％时转速提高10-400rpm，至达到生物反应器所允许的最高转速。
具体的，所述最高转速可为600-1200rpm，例如800rpm。
具体的，根据培养体系溶氧调节生物反应器转速的方法为：初始转速设置为50-150rpm，当溶氧第一次低于35％时转速改为100-200rpm，当溶氧第二次低于35％时转速改为350-450rpm，当溶氧第三次低于35％时转速改为750-850rpm。
具体的，根据培养体系溶氧调节生物反应器转速的方法为：初始转速设置为100rpm，当溶氧第一次低于35％时转速改为150rpm，当溶氧第二次低于35％时转速改为400rpm，当溶氧第三次低于35％时转速改为最高转速。
具体的，补料的方法为：将转速设为最高转速时开始向生物反应器中加入浓缩培养基，初始补料速率为1-10ml/h并以该速率持续补料1-10小时，然后将补料速率提高0.5-6ml/h并以该速率持续补料1-8小时，以此方式递增至达到预设的最高补料速率，以最高补料速率继续补料3-20小时，然后停止补料。
具体的，补料的方法为：将转速设为最高转速时开始向生物反应器中加入浓缩培养基，初始补料速率为1-3ml/h并以该速率持续补料1-3小时，然后将补料速率更改为4-6ml/h并以该速率持续补料1-3小时，然后将补料速率更改为9-11ml/h并以该速率持续补料7-9小时，然后停止补料。
具体的，补料的方法为：将转速设为最高转速时开始向生物反应器中加入浓缩培养基，初始补料速率为2ml/h并以该速率持续补料2小时，然后将补料速率更改为5ml/h并以该速率持续补料2小时，然后将补料速率更改为10ml/h并以该速率持续补料8小时，然后停止补料。
具体的，通气气体的通气量为0.5-3.0vvm。
具体的，通气气体的通气量为0.5-1.5vvm。
具体的，通气气体的通气量为1.3vvm。
具体的，通气气体由CH4和空气组成。
CH4和空气的体积配比可为1:1-10。
CH4和空气的体积配比可为1:3-5。
CH4和空气的体积配比可为1:3.5-4.5。
CH4和空气的体积配比可为1:4。
具体的：通气气体由CH4和空气组成，通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为520sccm，空气的流量为2080sccm。
具体的，补料的方法为：将转速设为最高转速时开始向生物反应器中加入浓缩培养基，初始补料速率为3-5ml/h并以该速率持续补料2-4小时，然后将补料速率更改为8-10ml/h并以该速率持续补料6-8小时，然后将补料速率更改为12-14ml/h并以该速率持续补料11-13小时，然后停止补料。
具体的，补料的方法为：将转速设为最高转速时开始向生物反应器中加入浓缩培养基，初始补料速率为4ml/h并以该速率持续补料3小时，然后将补料速率更改为9ml/h并以该速率持续补料7小时，然后将补料速率更改为13ml/h并以该速率持续补料12小时，然后停止补料。
具体的，通气气体的通气量为0.5-3.0vvm。
具体的，通气气体的通气量为0.5-1.5vvm。
具体的，通气气体的通气量为1.3vvm。
通气分为两个阶段；
第一个阶段的通气气体由CH4和空气组成，CH4和空气的体积配比为1:1-5；
将转速设为最高转速且溶氧低于5-40％时开始第二个阶段；
第二个阶段的通气气体由CH4、空气和富氧空气组成，CH4、空气和富氧空气的体积配比为0.6-1:1.1-4.0:1.0-3.9。
CH4和空气的体积配比可为1:3-5。
CH4和空气的体积配比可为1:3.5-4.5。
CH4和空气的体积配比可为1:4。
具体的，第一个阶段的通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为520sccm，空气的流量为2080sccm。
CH4、空气和富氧空气的体积配比可为1:2.6-2.8:1.2-1.4。
CH4、空气和富氧空气的体积配比可为1:1.1-1.2:2.8-2.9。
具体的，通气分为两个阶段：第一个阶段的通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为520sccm，空气的流量为2080sccm；当转速已设为最高转速且溶氧低于35％时开始第二个阶段，第二个阶段的通气气体由CH4、空气和富氧空气组成，起初CH4的流量为520sccm、空气的流量为1400sccm、富氧空气的流量为680sccm，溶氧再次低于35％时CH4的流量为520sccm、空气的流量为600sccm、富氧空气的流量为1480sccm。
所述富氧空气由O2和N2组成，O2和N2的体积配比为30-50:50-70。
所述富氧空气由O2和N2组成，O2和N2的体积配比为35-45:55-65。
所述富氧空气由O2和N2组成，O2和N2的体积配比为40:60。
具体的，培养过程中补料的同时排出发酵液。
具体的，培养过程为：当发酵体系的光密度值(OD600nm)达到10-60时(具体可为15-40，更具体可为20)，向生物反应器中加入补料培养基，同时从生物反应器出料口排出发酵液，补料速率等于排出速率；当完成3-8个工作体积(具体可为6个工作体积)的发酵体系置换时，开始连续收获出料口排出的发酵液。
具体的，稀释率可为0.04h-1至0.12h-1。
具体的，稀释率可为0.05h-1至0.10h-1。
具体的，稀释率可为0.05h-1或0.10h-1。
稀释率D(h-1)＝发酵液排出速率/工作体积。
具体的，排出速率可为50-250ml/h。
具体的，排出速率可为50-100ml/h。
具体的，排出速率可为150-250ml/h。
具体的，培养过程为：当发酵体系的OD600nm值达到15-40时(具体可为20)，以200ml/h的补料速率向生物反应器中持续加入补料培养基，同时从生物反应器出料口以200ml/h的速率排出发酵液。当完成3-8个工作体积(具体可为6个工作体积)的发酵体系置换时，开始连续收获出料口排出的发酵液。
具体的，培养过程为：当发酵体系的OD600nm值达到15-40时(具体可为20)，以100ml/h的补料速率向生物反应器中持续加入补料培养基，同时从生物反应器出料口以100ml/h的速率排出发酵液。当完成3-8个工作体积(具体可为6个工作体积)的发酵体系置换时，开始连续收获出料口排出的发酵液。
具体的，通气气体的通气量为0.5-3.0vvm。
具体的，通气气体的通气量为1.5-2.5vvm。
具体的，通气气体的通气量为2.0vvm。
具体的，通气气体由CH4和空气组成。
CH4和空气的体积配比可为1:3-5。
CH4和空气的体积配比可为1:3.5-4.5。
CH4和空气的体积配比可为1:4。
具体的：通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为800sccm，空气的流量为3200sccm。
以上任一所述培养过程中，温度控制为25-35℃，pH控制为8-10。
以上任一所述培养过程中，温度控制为30℃，pH控制为8.5-8.8。
以上任一所述所述方法中，将种子液接种至装有发酵培养基的生物反应器中，然后开始培养。
种子液与发酵培养基的体积配比可为1:8-11。
种子液与发酵培养基的体积配比可为1:9。
具体的，将200mL种子液接种至装有1.80L发酵培养基的3L生物反应器中。
所述种子液，是将嗜甲烷菌接种至种子培养基，然后进行培养得到的。
所述种子液的OD600nm值为2.0-3.0。
所述种子液的制备方法具体可为：用接种环取一环嗜甲烷菌，接种至装有种子培养基的生物反应器中，置于磁力搅拌器上，30℃培养48h，得到种子液。培养过程中持续通气，通气量为0.8vvm，通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为48sccm，空气的流量为192sccm。
所述种子液的制备方法具体可为：用接种环取一环嗜甲烷菌，接种至装有种子培养基的生物反应器(反应容器为500mL规格，装液量为300mL)中，置于磁力搅拌器上(磁力搅拌子转速为400rpm)，30℃培养48h，得到种子液。培养过程中持续通气，通气量为0.8vvm，通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为48sccm，空气的流量为192sccm。
以上任一所述生物反应器可为发酵罐或洗气瓶等。
具体的，所述嗜甲烷菌为某1种嗜甲烷菌或2种以上嗜甲烷菌的混合。
每L发酵培养基包括：0.30-0.50g MgSO4·7H2O、0.008-0.012g CaCl2·6H2O、0.80-1.20g KNO3、8.00-12.00g NaCl、0.30-0.50g KH2PO4、0.80-1.20g Na2CO3和2-4ml微量元素溶液。
每L发酵培养基的组成：0.30-0.50g MgSO4·7H2O、0.008-0.012g CaCl2·6H2O、0.80-1.20g KNO3、8.00-12.00g NaCl、0.30-0.50g KH2PO4、0.80-1.20g Na2CO3和2-4ml微量元素溶液，余量为水。
每L发酵培养基包括：0.40g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·6H2O、1.00g KNO3、10.00gNaCl、0.40g KH2PO4、1.00g Na2CO3和3ml微量元素溶液。
每L发酵培养基的组成：0.40g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·6H2O、1.00g KNO3、10.00g NaCl、0.40g KH2PO4、1.00g Na2CO3和3ml微量元素溶液，余量为水。
每L发酵培养基包括：0.10-0.30g MgSO4·7H2O、0.01-0.03g CaCl2·6H2O、6.00-8.00g KNO3、8.00-12.00g NaCl、1.00-1.40g KH2PO4、0.80-1.20g Na2CO3、10-14ml微量元素溶液。
每L发酵培养基的组成：0.10-0.30g MgSO4·7H2O、0.01-0.03g CaCl2·6H2O、6.00-8.00g KNO3、8.00-12.00g NaCl、1.00-1.40g KH2PO4、0.80-1.20g Na2CO3、10-14ml微量元素溶液，余量为水。
每L发酵培养基包括：0.20g MgSO4·7H2O、0.02g CaCl2·6H2O、7.00g KNO3、10.00gNaCl、1.20g KH2PO4、1.00g Na2CO3、12ml微量元素溶液。
每L发酵培养基的组成：0.20g MgSO4·7H2O、0.02g CaCl2·6H2O、7.00g KNO3、10.00g NaCl、1.20g KH2PO4、1.00g Na2CO3、12ml微量元素溶液，余量为水。
每L浓缩培养基包括：26.00-30.00g MgSO4·7H2O、2.40-2.80g CaCl2·6H2O、200.0-210.0g KNO3、12.00-15.00g NaCl、16.00-19.00g Na2HPO4、250-350ml微量元素溶液。
每L浓缩培养基的组成：26.00-30.00g MgSO4·7H2O、2.40-2.80g CaCl2·6H2O、200.0-210.0g KNO3、12.00-15.00g NaCl、16.00-19.00g Na2HPO4、250-350ml微量元素溶液，余量为水。
每L浓缩培养基包括：28.00g MgSO4·7H2O、2.60g CaCl2·6H2O、205.2g KNO3、13.50g NaCl、17.40g Na2HPO4、300ml微量元素溶液。
每L浓缩培养基的组成：28.00g MgSO4·7H2O、2.60g CaCl2·6H2O、205.2g KNO3、13.50g NaCl、17.40g Na2HPO4、300ml微量元素溶液，余量为水。
每L补料培养基包括：0.20-0.40g MgSO4·7H2O、0.01-0.03g CaCl2·6H2O、8.00-12.00g KNO3、10.00-14.00g NaCl、1.00-1.40g KH2PO4、0.80-1.20g Na2CO3、14-18ml微量元素溶液。
每L补料培养基的组成：0.20-0.40g MgSO4·7H2O、0.01-0.03g CaCl2·6H2O、8.00-12.00g KNO3、10.00-14.00g NaCl、1.00-1.40g KH2PO4、0.80-1.20g Na2CO3、14-18ml微量元素溶液，余量为水。
每L补料培养基包括：0.30g MgSO4·7H2O、0.02g CaCl2·6H2O、10.00g KNO3、12.00g NaCl、1.20g KH2PO4、1.00g Na2CO3、16ml微量元素溶液。
每L补料培养基的组成：0.30g MgSO4·7H2O、0.02g CaCl2·6H2O、10.00g KNO3、12.00g NaCl、1.20g KH2PO4、1.00g Na2CO3、16ml微量元素溶液，余量为水。
每L种子培养基包括：0.10-0.30g MgSO4·7H2O、0.008-0.012g CaCl2·6H2O、0.70-0.80g KNO3、8.00-12.00g NaCl、0.20-0.40g KH2PO4、0.80-1.20g Na2CO3和2-4ml微量元素溶液。
每L种子培养基的组成：0.10-0.30g MgSO4·7H2O、0.008-0.012g CaCl2·6H2O、0.70-0.80g KNO3、8.00-12.00g NaCl、0.20-0.40g KH2PO4、0.80-1.20g Na2CO3和2-4ml微量元素溶液，余量为水。
每L种子培养基包括：0.20g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·6H2O、0.75g KNO3、10.00gNaCl、0.30g KH2PO4、1.00g Na2CO3和3ml微量元素溶液。
每L种子培养基的组成：0.20g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·6H2O、0.75g KNO3、10.00g NaCl、0.30g KH2PO4、1.00g Na2CO3和3ml微量元素溶液，余量为水。
每L微量元素溶液包括：0.08-0.12g Na2-EDTA、0.40-0.60g FeSO4·7H2O、0.70-0.90g ZnSO4·7H2O、0.02-0.04g MnCl2·4H2O、0.08-0.12g H3BO3、0.08-0.12g CoCl2·6H2O、0.80-1.20g CuCl2·2H2O、0.008-0.012g NiCl2·6H2O和0.02-0.04g Na2MoO·2H2O。
每L微量元素溶液的组成：0.08-0.12g Na2-EDTA、0.40-0.60g FeSO4·7H2O、0.70-0.90g ZnSO4·7H2O、0.02-0.04g MnCl2·4H2O、0.08-0.12g H3BO3、0.08-0.12g CoCl2·6H2O、0.80-1.20g CuCl2·2H2O、0.008-0.012g NiCl2·6H2O和0.02-0.04g Na2MoO·2H2O，余量为水。
每L微量元素溶液包括：0.10g Na2-EDTA、0.50g FeSO4·7H2O、0.80g ZnSO4·7H2O、0.03g MnCl2·4H2O、0.10g H3BO3、0.10g CoCl2·6H2O、1.00g CuCl2·2H2O、0.01g NiCl2·6H2O和0.03g Na2MoO·2H2O。
每L微量元素溶液的组成：0.10g Na2-EDTA、0.50g FeSO4·7H2O、0.80g ZnSO4·7H2O、0.03g MnCl2·4H2O、0.10g H3BO3、0.10g CoCl2·6H2O、1.00g CuCl2·2H2O、0.01gNiCl2·6H2O和0.03g Na2MoO·2H2O，余量为水。
本发明还保护一种制备单细胞蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)按照以上任一所述方法培养嗜甲烷菌；
(2)完成步骤(1)后，取发酵液，离心收获菌体沉淀并进行干燥，得到单细胞蛋白。
所述单细胞蛋白的凯氏氮含量不低于10％。
所述单细胞蛋白的干生物质中，糖原所占的质量百分含量为5-20％。
所述单细胞蛋白中包括如下氨基酸：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸。
所述单细胞蛋白的干生物质的每100g蛋白中，天冬氨酸含量为3.0g以上，谷氨酸含量为4.5g以上，亮氨酸含量为2.6g以上，丙氨酸含量为2.2g以上，赖氨酸含量为2.0g以上，蛋氨酸含量为0.8g以上。
本发明还保护以上任一所述方法在制备动物饲料和/或可发酵糖中的应用。
所述应用中，所述可发酵糖作为单细胞蛋白的副产物。
所述嗜甲烷菌为某1种嗜甲烷菌或2种以上嗜甲烷菌的混合。
所述嗜甲烷菌可为甲基微菌。
示例性的，所述嗜甲烷菌为Methylotuvimicrobium buryatense或Methylotuvimicrobium alcaliphilum。
示例性的，所述嗜甲烷菌为Methylotuvimicrobium buryatense和Methylotuvimicrobium alcaliphilum。Methylotuvimicrobium buryatense和Methylotuvimicrobium alcaliphilum的配比为1：1-3，具体为1:2。
所述配比具体为菌量配比。
所述菌量配比具体通过光密度值(OD600nm)体现。
Methylotuvimicrobium buryatense具体可为Methylotuvimicrobiumburyatense5GB1。
Methylotuvimicrobium alcaliphilum具体可为Methylotuvimicrobiumalcaliphilum 20Z。
本发明公开了一种单细胞蛋白和可发酵糖的生产工艺，属于发酵工程技术领域。以一种或多种嗜甲烷菌为生产菌株，进行高密度发酵。所开发的分批补料发酵工艺在获得更高细胞密度的同时仍能维持较高的生物质蛋白含量，连续发酵工艺则得到更高生产速率，混菌发酵工艺有效改善蛋白品质。联产单细胞蛋白和可发酵糖以弥补前者生产成本较高的缺陷，为商业化生产嗜甲烷菌单细胞蛋白提供借鉴。
附图说明
图1为实施例1的结果。
图2为实施例2的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。实施例中的富氧空气由O2和N2组成，O2和N2的体积配比为40:60。实施例中所用的洗气瓶为成都玻仪生产的500ml规格的玻璃容器，https://m.tb.cn/h.fYCtewR？sm＝4ad123。实施例中的发酵液指的是菌种接种于培养基并培养一段时间后的整个液相体系。
每L固体培养基的组成：0.20g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·6H2O、0.50g KNO3、12.50g NaCl、0.20g KH2PO4、1.00g Na2CO3、1ml甲醇、2ml微量元素溶液和20g琼脂粉，余量为水。
每L种子培养基的组成：0.20g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·6H2O、0.75g KNO3、10.00g NaCl、0.30g KH2PO4、1.00g Na2CO3和3ml微量元素溶液，余量为水。
每L微量元素溶液的组成：0.10g Na2-EDTA、0.50g FeSO4·7H2O、0.80g ZnSO4·7H2O、0.03g MnCl2·4H2O、0.10g H3BO3、0.10g CoCl2·6H2O、1.00g CuCl2·2H2O、0.01gNiCl2·6H2O和0.03g Na2MoO·2H2O，余量为水。
Methylotuvimicrobium buryatense 5GB1为现有技术中的甲基微菌，也称为“Methylomicrobium buryatense 5GB1”，记载于如下文献：Molecular MechanismAssociated With the Impact of Methane/Oxygen Gas Supply Ratios on Cell Growthof Methylomicrobium buryatense 5GB1 Through RNA-Seq；frontiers inBioengineering and Biotechnology，April 2020。Methylotuvimicrobium alcaliphilum20Z为现有技术中的甲基微菌，也称为“Methylomicrobium alcaliphilum 20Z”，记载于如下文献：Molecular Mechanism Associated With the Impact of Methane/Oxygen GasSupply Ratios on Cell Growth of Methylomicrobium buryatense 5GB1 Through RNA-Seq；frontiers in Bioengineering and Biotechnology,April 2020。
实施例1、
一、制备种子液
1、取Methylotuvimicrobium buryatense 5GB1，接种至固体培养基平板，30℃静置培养至菌落布满平板(通常为4-5天)。
2、完成步骤1后，用接种环取一环菌，接种至装有种子培养基的洗气瓶(装液量为300mL)中，置于磁力搅拌器上(磁力搅拌子转速为400rpm)，30℃培养48h，得到种子液。培养过程中持续通气，通气量为0.8vvm，通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为48sccm，空气的流量为192sccm。
3、经检测，步骤2得到的种子液的OD600nm值为2.0-3.0。
二、采用本发明的工艺(又称为改进工艺)发酵
每L发酵培养基的组成：0.40g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·6H2O、1.00g KNO3、10.00g NaCl、0.40g KH2PO4、1.00g Na2CO3和3ml微量元素溶液，余量为水。
每L浓缩培养基的组成：28.00g MgSO4·7H2O、2.60g CaCl2·6H2O、205.2g KNO3、13.50g NaCl、17.40g Na2HPO4、300ml微量元素溶液，余量为水。
将200mL步骤一制备的种子液接种至装有1.80L发酵培养基的3L发酵罐中。
发酵过程中，温度控制为30℃，pH控制为8.7±0.1。
发酵过程中，持续向发酵罐中通气，通气量为1.3vvm；通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为520sccm，空气的流量为2080sccm。
发酵过程中，根据溶氧调节发酵罐转速，程序依次如下：初始转速设置为100rpm，当溶氧第一次低于35％时(通常为发酵2-3小时后)转速改为150rpm，当溶氧第二次低于35％时(通常为发酵4-6小时后)转速改为400rpm，当溶氧第三次低于35％时(通常为发酵8-12小时后)转速改为800rpm。
发酵过程中，将转速改为800rpm时开始向发酵罐中加入浓缩培养基，初始补料速率为2ml/h并以该速率持续补料2小时，然后将补料速率更改为5ml/h并以该速率持续补料2小时，然后将补料速率更改为10ml/h并以该速率持续补料8小时，然后停止补料。
三、按照原始工艺发酵
每L发酵培养基的组成：0.20g MgSO4·7H2O、0.02g CaCl2·6H2O、7.00g KNO3、10.00g NaCl、1.20g KH2PO4、1.00g Na2CO3、12ml微量元素溶液，余量为水。
将200mL步骤一制备的种子液接种至装有1.80L发酵培养基的3L发酵罐中。
发酵过程中，温度控制为30℃，pH控制为8.7±0.1。
发酵过程中，持续向发酵罐中通气，通气量为1.3vvm；通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为520sccm，空气的流量为2080sccm。
发酵过程中，根据溶氧调节发酵罐转速，程序依次如下：初始转速设置为100rpm，当溶氧第一次低于35％时(通常为发酵2-3小时后)转速改为150rpm，当溶氧第二次低于35％时(通常为发酵4-6小时后)转速改为400rpm，当溶氧第三次低于35％时(通常为发酵8-12小时后)转速改为800rpm。
四、检测干重、糖原含量和凯氏氮含量
1、每隔12小时取样0.01L，离心收集菌体沉淀，进行冷冻干燥，得到的干物质即为干生物质，称重为m(g)。菌体干重(g/L)＝m/0.01。
2、每隔12小时取样0.02L，按照步骤1制备干生物质。采用糖原含量试剂盒(TY-2-Y，苏州科铭生物技术有限公司)检测糖原含量。糖原含量即糖原质量(g)/干生物质质量(g)。糖原浓度(g/L)＝菌体干重(g/L)×糖原含量(g/g)。
3、每隔12小时取样0.04L，按照步骤1制备干生物质。检测凯氏氮含量，即凯氏氮占干生物质的质量百分含量(％)。凯氏氮检测方法参照：GB/T 6432-2018饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法。
菌体干重、糖原浓度和凯氏氮含量的检测结果见图1。发酵至36小时以后，获得与原始工艺相近细胞密度的同时，采用本发明的工艺发酵的生物质凯氏氮含量仍保持在10％以上。结果表明，采用本发明提供的发酵工艺，可以在获得高细胞密度的同时维持较高的菌体蛋白含量。
实施例2、
一、种子液的制备
同实施例1的步骤一。
二、采用本发明的工艺(又称为改进工艺)发酵
发酵培养基的组成同实施例1的步骤二。
浓缩培养基的组成同实施例1的步骤二。
将200mL步骤一制备的种子液接种至装有1.80L发酵培养基的3L发酵罐中。
发酵过程中，温度控制为30℃，pH控制为8.7±0.1。
发酵过程中，根据溶氧调节发酵罐转速，程序依次如下：初始转速设置为100rpm，当溶氧第一次低于35％时(通常为发酵2-3小时后)转速改为150rpm，当溶氧第二次低于35％时(通常为发酵4-6小时后)转速改为400rpm，当溶氧第三次低于35％时(通常为发酵8-12小时后)转速改为800rpm。
发酵过程中，持续通气，通气量为1.3vvm；通气分为两个阶段：第一个阶段的通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为520sccm，空气的流量为2080sccm；当转速已设置为800rpm且溶氧低于35％时开始第二个阶段，第二个阶段的通气气体由CH4、空气和富氧空气组成，起初CH4的流量为520sccm、空气的流量为1400sccm、富氧空气的流量为680sccm，溶氧再次低于35％时CH4的流量为520sccm、空气的流量为600sccm、富氧空气的流量为1480sccm。
发酵过程中，将转速改为800rpm时开始向发酵罐中加入浓缩培养基，初始补料速率为4ml/h并以该速率持续补料3小时，然后将补料速率更改为9ml/h并以该速率持续补料7小时，然后将补料速率更改为13ml/h并以该速率持续补料12小时，然后停止补料。
三、按照原始工艺发酵
同实施例1的步骤三。
四、检测干重、糖原含量和凯氏氮含量
同实施例1的步骤四。
菌体干重、糖原浓度和凯氏氮含量的检测结果见图2。发酵至36h以后，采用本发明的工艺发酵能够在保持较高生物质凯氏氮含量的基础上提高细胞密度。结果表明，采用本发明提供的发酵工艺，可以在维持较高菌体蛋白含量的同时进一步提高细胞密度。
五、检测氨基酸含量
发酵60小时后取样50ml发酵液，离心收集菌体沉淀，进行冷冻干燥，得到的干物质即为干生物质。取干生物质，检测氨基酸含量。检测氨基酸含量的方法参照：GB/T18246-2019饲料中氨基酸的测定。各氨基酸含量相加，作为表1中的蛋白总量。
各氨基酸含量检测结果见表1。
表1
氨基酸种类 干生物质的氨基酸含量(g/100g蛋白)
L-天冬氨酸 10.4
L-苏氨酸* 4.9
L-丝氨酸 2.8
L-谷氨酸 15.4
L-甘氨酸 5.1
L-丙氨酸 7.9
L-半胱氨酸 0.0
L-缬氨酸* 6.6
L-蛋氨酸* 2.2
L-异亮氨酸* 5.6
L-亮氨酸* 9.5
L-酪氨酸 4.4
L-苯丙氨酸* 5.1
L-赖氨酸* 5.0
L-组氨酸* 4.4
L-精氨酸* 6.3
L-脯氨酸 4.6
注：*为必需氨基酸。
实施例3、
每L发酵培养基的组成为：0.20g MgSO4·7H2O、0.02g CaCl2·6H2O、7.00g KNO3、10.00g NaCl、1.20g KH2PO4、1.00g Na2CO3、12ml微量元素溶液，余量为水。
每L补料培养基的组成为：0.30g MgSO4·7H2O、0.02g CaCl2·6H2O、10.00g KNO3、12.00g NaCl、1.20g KH2PO4、1.00g Na2CO3、16ml微量元素溶液，余量为水。
一、种子液的制备
同实施例1的步骤一。
二、采用本发明的工艺(改进工艺)发酵
将200mL步骤一制备的种子液接种至装有1.80L发酵培养基的3L发酵罐中。即，工作体积为2L。
发酵过程中，温度控制为30℃，pH控制为8.6±0.1。
发酵过程中，持续向发酵罐中通气，通气量为2.0vvm；通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为800sccm，空气的流量为3200sccm。
发酵过程中，根据溶氧调节发酵罐转速，程序依次如下：初始转速设置为100rpm，当溶氧第一次低于35％时(通常为发酵2-3小时后)转速改为150rpm，当溶氧第二次低于35％时(通常为发酵4-6小时后)转速改为400rpm，当溶氧第三次低于35％时(通常为发酵8-12小时后)转速改为800rpm。
设置两组稀释率进行发酵。稀释率D(h-1)＝发酵液排出速率/工作体积。
稀释率为0.10h-1的发酵过程中，当发酵体系的OD600nm值达到20时(实际应用中15-40均可)，以200ml/h的补料速率向发酵罐中持续加入补料培养基，同时从发酵罐出料口以200ml/h的速率排出发酵液。当完成6个工作体积的发酵体系置换时，计为收料0时刻，开始连续收获出料口排出的发酵液。
稀释率为0.05h-1的发酵过程中，当发酵体系的OD600nm值达到20时(实际应用中15-40均可)，以100ml/h的补料速率向发酵罐中持续加入补料培养基，同时从发酵罐出料口以100ml/h的速率排出发酵液。当完成6个工作体积的发酵体系置换时，计为收料0时刻，开始连续收获出料口排出的发酵液。
三、按照原始工艺发酵
同实施例1的步骤三。
四、检测干重、糖原含量和凯氏氮含量
检测对象：从收料0时刻开始计，6小时后、12小时后、18小时后和24小时后从出料口收集的发酵液。
检测方法同实施例1的步骤四。
生物质生产速率(g/L/h)＝稀释率(h-1)×干重(g/L)。
结果见表2。结果为各个时间点发酵液的检测结果的均值。与采用原始工艺相比，采用本发明提供的改进工艺发酵，生物质生产速率和凯氏氮含量都显著提高。
表2
原始工艺 改进工艺(D＝0.05h<sup>-1</sup>) 改进工艺(D＝0.10h<sup>-1</sup>)
生物质生产速率(g/L/h) 0.31 0.36 0.56
凯氏氮含量(％) 7.1 10.5 11.3
糖原含量(％) 45.0 18.3 19.3
实施例4、
每L发酵培养基的组成：0.20g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·6H2O、0.90g KNO3、10.00g NaCl、0.25g KH2PO4、1.00g Na2CO3和2ml微量元素溶液，余量为水。
一、制备M.alcaliphilum 20Z种子液
1、取Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z，接种至固体培养基平板，30℃静置培养至菌落布满平板(通常为5-6天)。
2、完成步骤1后，用接种环取一环菌，接种至装有种子培养基的洗气瓶(装液量为300mL)中，置于磁力搅拌器上(磁力搅拌子转速为400rpm)，30℃培养72h，得到种子液，又称为M.alcaliphilum种子液。培养过程中持续通气，通气量为0.8vvm，通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为48sccm，空气的流量为192sccm。
3、经检测，步骤2得到的种子液的OD600nm值为1.5-2.5。
二、混菌发酵
将20mL M.alcaliphilum 20Z种子液和10mL M.buryatense 5GB1种子液(即实施例1的步骤一制备的种子液)接种至装有发酵培养基的洗气瓶(装液量为300mL)中，置于磁力搅拌器上(磁力搅拌子转速为300rpm)，30℃培养72h。培养过程中持续通气，通气量为1.5vvm，通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为90sccm，空气的流量为360sccm。
三、单菌发酵
将30mL M.buryatense 5GB1种子液(即实施例1的步骤一制备的种子液)接种至装有发酵培养基的洗气瓶(装液量为300mL)中，置于磁力搅拌器上(磁力搅拌子转速为300rpm)，30℃培养72h。培养过程中持续通气，通气量为1.5vvm，通气气体由CH4和空气组成，CH4的流量为90sccm，空气的流量为360sccm。
四、检测氨基酸组成和含量
1、完成步骤二(或步骤三)后，取发酵液0.05L，离心收集菌体沉淀，进行冷冻干燥，得到干生物质。
2、取步骤1得到的干生物质，检测氨基酸含量。
检测氨基酸含量的方法参照：GB/T 18246-2019饲料中氨基酸的测定。
各氨基酸含量相加，作为表3中的蛋白总量。
各氨基酸含量检测结果见表3。相比于单菌发酵，混菌发酵得到的生物质蛋白中半胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸等氨基酸含量明显改善。
表3
Figure BDA0003337446870000141
Figure BDA0003337446870000151
注：*为必需氨基酸。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种嗜甲烷菌培养方法，包括如下步骤：
采用生物反应器培养嗜甲烷菌；
培养过程中，持续进行通气，通气气体中包括甲烷；
培养过程中，根据培养体系溶氧调节生物反应器转速；
培养过程中具有补料阶段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
根据培养体系溶氧调节生物反应器转速的方法为：初始转速设置为50-500rpm，每当溶氧低于5-40％时转速提高10-400rpm，至达到生物反应器所允许的最高转速。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
将转速设为最高转速时开始向生物反应器中加入浓缩培养基，初始补料速率为1-10ml/h并以该速率持续补料1-10小时，然后将补料速率提高0.5-6ml/h并以该速率持续补料1-8小时，以此方式递增至达到预设的最高补料速率，以最高补料速率继续补料3-20小时，然后停止补料。
4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：
通气气体由CH4和空气组成，CH4和空气的体积配比为1:1-10。
5.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：
通气分为两个阶段；
第一个阶段的通气气体由CH4和空气组成，CH4和空气的体积配比为1:1-5；
将转速设为最高转速且溶氧低于5-40％时开始第二个阶段；
第二个阶段的通气气体由CH4、空气和富氧空气组成，CH4、空气和富氧空气的体积配比为0.6-1:1.1-4.0:1.0-3.9。
6.如权利要求1或2或4所述的方法，其特征在于：
当发酵体系的光密度值达到10-60时，向生物反应器中加入补料培养基，同时从生物反应器出料口排出发酵液，补料速率等于排出速率；当完成3-8个工作体积的发酵体系置换时，开始连续收获出料口排出的发酵液。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述嗜甲烷菌为某1种嗜甲烷菌或2种以上嗜甲烷菌的混合。
8.一种制备单细胞蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1至7中任一所述方法培养嗜甲烷菌；
(2)完成步骤(1)后，取发酵液，离心收获菌体沉淀并进行干燥，得到单细胞蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述单细胞蛋白的凯氏氮含量不低于10％；
所述单细胞蛋白中包括如下氨基酸：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸；
所述单细胞蛋白的干生物质中，糖原所占的质量百分含量为5-20％。
10.权利要求1至9中任一所述方法在制备动物饲料和/或可发酵糖中的应用。
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