CN105722985A

CN105722985A - 甲烷的微生物转化

Info

Publication number: CN105722985A
Application number: CN201480056376.2A
Authority: CN
Inventors: M·E·利兹多姆; M·G·卡柳兹纳雅; D·W·格里芬; N·布尔达科斯; P·T·平克斯; L·M·L·劳伦斯
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd; Alliance for Sustainable Energy LLC; University of Washington Center for Commercialization
Current assignee: Alliance for Sustainable Energy LLC; University of Washington Center for Commercialization; Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-20
Publication date: 2016-06-29
Also published as: CA2927829A1; WO2015058212A1; EP3058077A1; RU2658440C2; CA2927829C; MY178412A; RU2016116677A; US11220700B2; US20150111265A1; EP3058077A4

Abstract

本发明涉及一种从包含甲烷和氧气的气态底物生产脂质和氨基酸的方法。所述方法使用嗜甲烷微生物于液体营养培养基中的培养物。所述嗜甲烷微生物可为甲基微菌属细菌并且更具体来说是嗜碱甲基微菌(Methylomicrobium buryatense)5GB1。脂质产物可在嗜甲烷菌的细胞膜中并且可在独立提取区中提取。

Description

甲烷的微生物转化

政府权益

美国政府依据在美国能源部与可持续能源联盟有限责任公司(国家再生能源实验室的管理者和操纵者)之间的合同号DE-AC36-08GO28308对本发明具有权益。

本发明是在政府扶持下依据美国能源部援助协议号DE-AR0000350、CFDA号81,135得以完成。政府对本发明有某些权益。

技术领域

本发明涉及一种从含甲烷的原料产生至少一种产物的方法。所述方法包括向包含至少一种嗜甲烷微生物于液体营养培养基中的培养物的生物反应器中提供包含CH₄和O₂的气态底物，以产生至少一种产物，如脂质和氨基酸。

背景技术

全球能源危机已使人们对制造燃料的替代方法的兴趣增大。运输用生物燃料为汽油的有吸引力的替代物并且作为低浓度共混物快速渗透着燃料市场。源于生物质的生物燃料制造已经出现，作为增加替代能源的产量并且减少温室气体排放的主要方法。从生物质制造生物燃料可实现能源独立性，并且已显示会增强农村地区的发展与可持续的经济发展。

传统的液体生物燃料利用碳水化合物原料，如淀粉、蔗糖、玉米、油菜籽、大豆、棕榈和植物油。第一代原料受到许多明显的挑战。这些碳水化合物原料的成本受其作为人的食物或动物饲料的价值的影响，而栽培淀粉或蔗糖生产作物来制造乙醇并非在所有地域都在经济上可持续。持续使用这些原料作为生物燃料的来源将不可避免地对可耕地和水资源造成大的压力。因此，感兴趣的是开发将较低成本和/或较富足的碳资源转化成燃料的技术。

第二代生物燃料为从纤维素和海藻制得的那些。由于快速的生长速率和海藻消耗二氧化碳并产生氧的能力，因此选择海藻来产生脂质。

还已经证明可以通过含一氧化碳的合成气的微生物转化来产生生物燃料。产乙酸细菌，如来自醋杆菌属、穆尔氏菌属、梭菌属、瘤胃球菌属、醋杆菌属、真杆菌属、酪酸杆菌属、产醋杆菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷八叠球菌属和脱硫肠状菌属的那些可以用于通过一氧化碳和/或氢和二氧化碳的厌氧发酵来产生乙酸、乙酸酯和其它产物如乙醇。这些细菌通过Wood-Ljungdahl路径(其中乙酰基辅酶A合成酶为关键酶)将合成气转化成产物。例如，从合成气产生乙酸酯和乙醇的梭状杆菌的各种菌株描述于WO00/68407、EP117309、美国专利5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO98/00558和WO02/08438中。

一个可见活力增强的领域为构成生物燃料制造所需的原料的脂质的微生物合成。大量研究证明了通过对不同底物如工业甘油、乙酸、污水污泥、去蛋白乳清(wheypermeate)、蔗糖蜜和稻秆水解产物使用油脂酵母来积累脂质的能力。而且，这些第二代生物燃料技术已经遇到由高制造成本以及与原料运输和存放相关的成本所造成的问题。

甲烷在美国是由人类活动所排出的第二普遍的温室气体。虽然甲烷的寿命比二氧化碳短得多，但是其在俘获辐射方面比二氧化碳更有效，因此在20年的时期内，甲烷对气候变化的对比影响要比二氧化碳大70倍以上。天然气和石油系统是甲烷的最大工业来源，接着是由农业和填埋废弃物产生的那些。利用甲烷/减少排放的现行策略已经集中于使用天然气中的甲烷，以及从各种工业过程所回收的甲烷，作为可行的燃料来源。

已知各种嗜甲烷细菌遍布自然界，其在好氧条件下能够组合氧与甲烷以通过酶：甲烷单加氧酶和甲醇脱氢酶来形成甲醛。甲醛然后通过RuMP路径(I型嗜甲烷菌)或丝氨酸路径(II型嗜甲烷菌)引入有机化合物中。已经定义了十一种嗜甲烷菌属，也即甲基球菌属、甲基单胞菌属、甲基微菌属、甲基杆菌属、甲基暖菌属、甲基卵菌属(methylovulum)、甲基海洋分枝杆菌属(methylomarinum)、甲基海洋生菌属(methylomarinovum)、甲基热菌属、甲基孢囊菌属和甲基弯曲菌属。

目前，嗜甲烷细菌的商业应用是受限的。Semrau,J.D.(2011)讨论了嗜甲烷菌对于污染地点的生物修复，例如氯化烃类如三氯乙烯的降解的用途。WO09/154683描述了嗜甲烷菌在燃料电池中的用途，其中甲烷被燃料电池内的微生物氧化以产生电子。美国公布2005/0221465和美国专利7,799,550描述了水解的、均化的嗜甲烷细菌生物质作为发酵用营养素原料的用途。EP1641475描述了来自嗜甲烷细菌的脂质用于减少胆固醇的用途。美国公布2003/0138878和EP1320579B1描述了嗜甲烷细菌生物质作为蛋白质来源的用途。美国公布2006/0057726描述了一组通过同源重组对C1代谢细菌中的染色体突变进行阳性选择的基因工具。Kalyuzhnaya等(2011)的综述描述了嗜甲烷细菌的生物技术方面并且概述了将利用甲烷的微生物用于制造依克多因(ectoine)的前景。Shoda等(1975)的研究概述了对于在分批培养物中培育利用甲烷的细菌最优的氧气和甲烷分压。

在本领域中仍需要从包含甲烷的气态底物产生有价值的产物，如生物燃料。本发明的目的在于提供从包含甲烷的气态底物制造适用产物如脂质和氨基酸的新方法，并且向公众提供减少对环境的甲烷排放的新方法，或者至少向公众提供适用的选择。

发明内容

本发明对本领域中的需求作出反应。第一方面，提供一种通过对气态底物进行微生物转化来产生至少一种产物的方法，所述方法包括：

(a)向包含至少一种嗜甲烷微生物于液体营养培养基中的培养物的生物反应器提供包含CH₄和O₂的气态底物；以及

(b)将气态底物在发酵条件下微生物转化成至少一种在细胞生物质中的选自脂质、蛋白质、氨基酸和其混合物以及分泌的脂肪酸的产物。

在第一方面的具体实施方案中，所述方法产生脂质或氨基酸，或者其混合物。在具体的实施方案中，脂质可包括但不限于脂肪酸、糖脂、鞘脂、醣脂、聚酮、固醇脂、藿烷类、磷脂和异戊烯醇脂质或其混合物。在具体的实施方案中，氨基酸可包括但不限于脯氨酸、5-氧脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸盐、谷氨酰胺和谷氨酸盐，或其混合物。

在具体的实施方案中，由所述方法产生的脂质可转化成至少一种化学燃料或燃料组分。例如，脂质可通过本领域熟知的手段转化成选自可再生柴油、生物柴油燃料、柴油燃料、柴油燃料组分、脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)的化合物。

第二方面，提供一种通过对气态底物进行微生物转化来产生至少一种产物的方法，所述方法包括：

(a)向含有液体营养培养基和至少一种嗜甲烷微生物的培养物的生物反应器提供包含CH₄和O₂的气态底物；

(b)微生物转化气态底物以产生至少一种在微生物的细胞生物质中的产物；以及

(c)从微生物的细胞生物质提取至少一种产物。

在具体的实施方案中，将液体营养培养基连续地馈送到生物反应器中。在具体的实施方案中，使液体营养培养基饱和含有O₂，随后馈送到生物反应器中。在具体的实施方案中，对液体营养培养基加压并且使其饱和含有O₂，随后馈送到生物反应器中。

在具体的实施方案中，未转化的气态底物和/或任何由微生物所产生的气体的至少一部分从气体出口离开生物反应器。在具体的实施方案中，排气的至少一部分回收到生物反应器中以进一步转化。在具体的实施方案中，将排气的至少一部分用作燃料。

在具体的实施方案中，将至少一种微生物的培养物悬浮于液体营养培养基中。在具体的实施方案中，将液体营养培养基维持在约6至约11的pH值范围内。在优选的实施方案中，将液体营养培养基维持在约8至约9.5的pH值。在具体的实施方案中，将液体营养培养基的温度维持在约5℃与约60℃之间。在优选的实施方案中，将液体营养培养基维持在约25℃至约35℃的温度下。

在具体的实施方案中，一种或多种微生物为选自以下项的嗜甲烷细菌：甲基球菌属、甲基单胞菌属、甲基微菌属、甲基杆菌属、甲基八叠球菌属、甲基暖菌属、甲基海洋分枝杆菌属、甲基海洋生菌属、甲基热菌属、甲基卵菌属、甲基孢囊菌属和甲基弯曲菌属。在具体的实施方案中，嗜甲烷细菌选自荚膜甲基球菌、甲烷甲基单胞菌、甲基单胞菌属、甲基弯菌、海洋甲基细菌(Methylobactermarinus)、藤黄甲基细菌(Methylobacterluteus)、甲烷氧化菌和嗜碱甲基微菌(Methylomicrobiumburyatense)。在优选的实施方案中，嗜甲烷细菌为嗜碱甲基微菌。

在具体的实施方案中，嗜甲烷细菌为天然存在的菌株。在替代性实施方案中，嗜甲烷细菌为工程化菌株。在具体的实施方案中，嗜甲烷细菌为选择的菌株。在具体的实施方案中，选择的嗜甲烷菌株为甲基微菌属菌株5GB1。

在具体的实施方案中，所述方法包括从至少一种微生物的细胞膜提取至少一种产物的步骤。在具体的实施方案中，提取步骤包括湿法提取程序。在具体的实施方案中，提取步骤在独立反应器中发生，直到转化步骤。在具体的实施方案中，包含至少一种产物和/或至少一种微生物的产物流从反应器来到提取模块。

在具体的实施方案中，提取步骤包括细胞破碎步骤，所述步骤使用高压均化、化学或物理预处理，如(但不限于)酸或碱预处理生物质，以及加热到高于蛋白质变性温度(在约50℃与约200℃之间，优选地在约75℃与约90℃之间)。在具体的实施方案中，提取步骤进一步包括溶剂萃取步骤。在具体的实施方案中，溶剂萃取步骤将产物流分成包含一种或多种产物和溶剂的轻相以及包含废生物质的重相。

在具体的实施方案中，溶剂为非极性烷烃或短链醇或其任何组合。在优选的实施方案中，溶剂为与微生物脂质组合物相容的己烷或替代性短链烷烃(例如戊烷、庚烷)或短链醇，例如丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇或任何其它溶剂(或溶剂系统组合)。可得微生物产物的性质越具极性，应选择越具极性的溶剂体系。

在具体的实施方案中，至少一种所提取的产物进一步来到产物加工模块。在具体的实施方案中，将至少一种所提取的产物升级到可再生柴油、生物柴油燃料、柴油燃料、柴油燃料组分、中链烃和固醇以及类异戊二烯衍生物、脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)。

在具体的实施方案中，将包含来自溶剂萃取步骤的废生物质的重相的至少一部分通到厌氧消化器中，其中重相的至少一部分转化成生物气。由厌氧消化器所产生的生物气的至少一部分可供至生物反应器中。在替代性实施方案中，将由厌氧消化器所产生的生物气的至少一部分供至燃气轮机中来发电。由燃气轮机所发的电可用于为如本文所述的本发明的方法的任何步骤供能。

在具体的实施方案中，细胞生物质的蛋白质部分可分离并且用于制备蛋白质丸粒，所述蛋白质丸粒可用作动物饲料的蛋白质来源。

第三方面，提供一种通过对气态底物进行微生物转化来产生至少一种产物的方法，所述方法包括：

(a)向含有液体营养培养基和至少一种嗜甲烷微生物的培养物的生物反应器提供包含氧气和至少一种选自CH₄、CH₃OH和其混合物的组分的底物；以及

(b)将气态底物微生物转化成至少一种在微生物的细胞生物质中的选自脂质和氨基酸的产物；以及

(c)从微生物的细胞生物质提取至少一种产物。

在第三方面的具体实施方案中，底物包含CH₄、CH₃OH和O₂。在替代性实施方案中，底物大致上包含CH₃OH和O₂。在具体的实施方案中，将包含CH₄的底物与CH₃OH共混，随后供至生物反应器。在替代性实施方案中，将CH₄转化成CH₃OH，随后供至生物反应器。

第四方面，提供一种用于捕获碳的系统，所述系统包括：

(i)反应器，其含有液体营养培养基和至少嗜甲烷微生物的培养物；

(ii)至少一个气体入口，其被构造成引导包含CH₄和O₂的气态底物进入反应器；以及

(iii)至少一个气体出口，其被构造成使气体离开反应器；以及

(iv)至少一个气体出口，其被构造成使气体离开生物反应器。

在第四方面的具体实施方案中，将所述系统用于如在第一、第二和第三方面所述的方法中。在具体的实施方案中，所述系统用于将包含氧和CH₄、CH₃OH中的至少一种的底物微生物转化成至少一种选自脂质、蛋白质、氨基酸和其混合物的产物的方法中。

在具体的实施方案中，将反应器构造成大致上促进一种或多种微生物生长和/或产生一种或多种产物。在替代性实施方案中，系统可以包括第一生长反应器和第二产物合成反应器。

在具体的实施方案中，系统包括使离开生物反应器的气体的至少一部分回到反应器的至少一个气体入口的构件。

在具体的实施方案中，系统进一步包括用于提取一种或多种基于生物质的产物的提取区。在具体的实施方案中，系统包括使包含至少一种产物和/或至少一种微生物的流从反应器通到提取区的构件。

在具体的实施方案中，提取区包括多个提取单元。在具体的实施方案中，提取区包括第一、第二、第三和第四提取单元。在具体的实施方案中，将第一提取单元构造成化学或物理处理湿生物质，例如高压均化、热处理和/或存在酸或碱细胞膜降解。在具体的实施方案中，将第二提取单元构造用于溶剂萃取。在具体的实施方案中，将第三提取单元构造来通过离心来分离产物/溶剂和废生物质。在具体的实施方案中，系统包括使产物、溶剂和/或生物质在提取单元之间通过的构件。

在具体的实施方案中，系统进一步包括产物加工区。在具体的实施方案中，产物加工区包括加氢处理单元。在具体的实施方案中，系统包括使产物流的至少一部分从提取区通到产物加工区的构件。

在具体的实施方案中，系统进一步包括厌氧消化区。在具体的实施方案中，系统包括使废生物质的至少一部分通到厌氧消化区的构件。

本发明还包括在本申请的说明书中个别地或一起(呈两个或更多个所述部分、元件或者特征的任何或所有组合)提及或指示的部分、元件和特征，并且其中在本文中提及特定整体，所述特定整体具有本发明所涉及的领域中的已知等效体，将这些已知的等效体视为并入本文中，如同个别地阐述一样。

附图说明

现在将参考附图来详述本发明，在所述附图中：

图1示出了详述微生物CH₄消耗的可能化学计量的范围的化学计量图。

图2示出了详述当用空气操作时微生物CH₄消耗的可能化学计量的范围的化学计量图。

图3示出了详述当用有限O₂操作时有利于脂质产生的微生物CH₄消耗的可能化学计量的范围的化学计量图。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则如遍及本说明书所用的以下术语定义如下:

术语“反应器”和/或“生物反应器”包括任何由以下组成的微生物转化装置：一个或多个容器和/或塔或管道布置，如固定细胞反应器、气升反应器、泡塔反应器(BCR)、循环环路反应器、膜反应器如空心纤维膜生物反应器(HFMBR)或滴流床反应器(TBR)。

术语“气态底物”包括任何含有被微生物用作微生物转化中的碳源和任选地能源的化合物或元素的气体。气态底物将典型地含有大比例的CH₄和O₂。类似地，术语“底物”包括任何含有被微生物用作微生物转化中的碳源和任选地能源的化合物或元素的气体和/或液体。液体底物的实例包括甲醇。

术语“生物柴油”是指由长链烷基酯组成的源于脂质的柴油燃料。生物柴油典型地通过使脂质与醇进行化学反应以产生脂肪酸酯来制备。

术语“可再生柴油”是指由不含有氧或其它杂原子如氮或硫的长链烷基化合物组成的源于脂质的柴油燃料。典型地如下产生可再生柴油：将脂质催化氢化、脱氧和脱氮，任选地接着进行催化裂化并且使长链烃异构化成链长在8个碳与14个碳之间的烷烃。

术语“排气”包括从一个或多个气体出口离开反应器的任何气体。排气将典型地含有CH₄、O₂和CO₂。

术语“液体营养培养基”和/或“培养基”包括包含适用于使用一种或多种微生物进行微生物转化的营养素的液体培养基。液体营养培养基将含有足以使所用微生物生长的维生素和/或矿物。

如本文所用的术语“传质”是指将气态底物转移到微生物所在的液体培养基中。

术语“湿法提取”一般是指一种提取程序，其中从微生物直接提取产物而无需脱水和干燥。

典型地，湿法提取方法使用具有小于40％固体(优选地在10％与20％之间的固体)的湿生物质浆料，其中仍可能在搅拌的分批反应器中在溶剂存在下进行提取，同时最大化溶剂-生物质质量转移率以提高产物提取效率。已知海藻基于化学细胞破碎的湿生物质分级分离(Czartoski等,WO2010/104922,“AlgaeBiomassFractionation”)。示例性方法包括由Czartoski等所述的那些，其中在脂质提取之前进行酸处理，接着进行非极性溶剂萃取方法。然而，提取方法是针对海藻，尤其是针对非极性脂质特别定制的，并且不包括细菌生物质或嗜甲烷菌生物质或者极性脂质的提取(源自微生物生物质和细菌生物质中的实质性细菌膜部分)。提取程序的现有技术不包括使萃取溶剂的极性适于待提取脂质的组成和极性，其为本发明中所述的提取系统的新颖性。

如本文所用的术语“轻相”意指在提取程序之后所分离物质的一部分，其主要包含所提取的产物和溶剂。

如本文所用的术语“重相”意指在提取程序之后所分离物质的一部分，其主要包含水、废生物质和任何产物/溶剂携带物。

如本文所用的术语“厌氧消化器”是指构造以将有机废料厌氧转化成生物气的反应器。典型地，反应器将含有产酸细菌、产乙酸细菌和/或产甲烷细菌。产酸细菌用于将有机聚合物和氨基酸转化成CO₂、H₂、NH₃和有机酸。产乙酸细菌将所得有机聚合物转化成乙酸以及额外的CO₂、H₂和NH₃。产甲烷细菌将所得乙酸转化成CH₄和CO。适用于厌氧消化的反应器可以包括但不限于有盖厌氧塘消化器、活塞流消化器、完整混合消化器和干燥消化器。

除非上下文另外需要，否则如本文所用的短语“微生物转化”或者“微生物反应”等意图涵盖方法的生长期与产物生物合成期。

嗜甲烷单细胞蛋白(SCP)为动物饲料的蛋白质的公认来源(Anthony,1982)。典型地处理全细胞蛋白以去除核酸和其它磷化合物(如磷脂)。在本文中我们建议在脂质提取之后收集细胞蛋白，并且将其用作动物饲料的氨基酸的来源。

如本文所用的术语“发酵条件”为进行微生物转化所必需的那些条件，并且包括不限于液体营养培养基的温度、液体营养培养基的组成和个别培养基组分的浓度、反应器压力、所用反应器气体共混物的传质系数、共混气体中CH₄和O₂的比率、共混气体的流动速率、接种物的量、生物反应器的搅动以及液体营养培养基的pH值。

如本文所用的术语“湿生物质”是指已经离心以去除至少一些存在于生物质中的水的生物质。湿生物质典型地含有至少约30重量％水。

如本文所用的术语“干燥生物质”是指已经先离心，接着例如由冻干器干燥以去除约100％水的生物质。

从碳源如葡萄糖、木寡糖、乳糖、甘油和乙醇生产脂质的方法是已知的(Chi等,“OleaginousyeastCryptococcuscurvatusculturewithdarkfermentationhydrogenproductioneffluentasfeedstockformicrobiallipidproduction”《国际氢能期刊(InternationalJournalofHydrogenEnergy)》,第36卷,2011,第9542-9550页)。示例性方法包括由Chi等所述的那些。此外，已知许多微藻如小球藻属物种的那些能够使糖微生物转化成脂质。然而，甲烷还没有用作微生物生产脂质的碳源。

本发明的一个方面的方法包括微生物转化馈气生物反应器中的甲烷和氧以产生脂质、蛋白质和氨基酸。在某些实施方案中，方法进一步包括从细菌生物质提取基于脂质的产物。

微生物

本发明的方法的一个必要部分为至少一种能够将CH₄和O₂微生物转化成如脂质和氨基酸的产物的嗜甲烷细菌。任何能够将CH₄和O₂微生物转化成脂质和/或氨基酸的嗜甲烷细菌都可以根据本发明来使用。嗜甲烷细菌选自甲基球菌属、甲基单胞菌属、甲基微菌属、甲基杆菌属、甲基暖菌属、甲基海洋分枝杆菌属、甲基卵菌属、甲基海洋生菌属、甲基热菌属、甲基孢囊菌属、甲基弯曲菌属和其混合物。在具体的实施方案中，嗜甲烷细菌选自荚膜甲基球菌、甲烷甲基单胞菌、甲基单胞菌属、甲基弯菌、瓦迪甲基海洋分枝杆菌(Methylomarinumvadi)、海洋甲基细菌、瓦迪甲基海洋分枝杆菌、甲烷氧化菌和嗜碱甲基微菌。

在其它实施方案中，嗜甲烷细菌选自甲基微菌属。这个属的嗜甲烷细菌为典型的I组嗜甲烷菌，其使用核酮糖单磷酸(RuMP)路径来吸收碳。

在优选的实施方案中，嗜甲烷细菌为嗜碱甲基微菌。这种物种是嗜温的，但是能够在10℃-45℃下生长。在分批培养物中，生长发生在6-11之间的pH值、优选地pH8.0-9.5下，并且有0.1-8％之间的NaCl，优选地0.75％NaCl。这种物种含有微粒甲烷单加氧酶(pMMO)和可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)(Kaluzhnaya等,2001)。

嗜甲烷细菌可为天然存在的细菌或者工程化菌株。例如，嗜甲烷细菌为生长性质比亲本菌株增强的工程化甲基微菌属菌株。在具体的实施方案中，嗜甲烷细菌为选择的甲基微菌属菌株。一种示例性的适用于本发明的所选菌株为嗜碱甲基微菌5GB1，其为野生型的利福霉素抗性变体并且具有rpoS基因(MBURv2_50058)突变，所述突变具有在(野生型的327个aa中的)218个aa之后产生终止密码子的309个碱基对插入。在本公开的某些实施方案中，改善的菌株相对于优化的生长培养基具有约0.24(培养物倍增时间为3小时)的比生长速率(参见实施例1)。

原料

无论什么嗜甲烷细菌用于进行本发明的方法，都需要碳源和氧源以产生脂质和/或氨基酸。碳源包括不限于甲烷、甲醇和其混合物。甲烷可获自选自但不限于以下项的来源：天然气、合成天然气、天然气水合物、闲置天然气、页岩气、火炬气、煤矿甲烷、煤层甲烷、从烯烃或有机物质的催化裂化所产生的甲烷、填埋气体、生物气、相关石油气、农业产生的甲烷，和作为不期望的副产品从CO氢化和氢解反应如费-托法所产生的甲烷。全球CH₄的最大来源是天然气和石油系统。

甲醇可以源自一氧化碳和氢的催化转化。或者，CH₃OH源自CH₄的催化转化。在具体的实施方案中，将包含CH₄的气流催化转化成CH₃OH，随后供至反应器。在一些实施方案中，将本发明的方法与CH₃OH合成方法整合。例如，来自CH₃OH合成工艺如甲醇生产工厂的CH₃OH的至少一部分可以转向反应器以用于本发明的方法中。

在本发明的各个实施方案中，甲醇与甲烷可共混在一起并且馈送到生物反应器。

嗜甲烷细菌生长和产生脂质和/或氨基酸所必要的另一组分是氧或氧源。典型的氧源包括但不限于空气、高氧空气、来自分馏、变压吸附、氧浓缩器、水电解的O₂以及液体O₂。氧与碳源的比率可变化以改善所需产物的生产或最优化微生物反应的效率并且最终改善生产或改善生长。气态底物中O₂与CH₄的比率可在约5:1至约1:1的范围内。在具体的实施方案中，供至生物反应器的气态底物包含比率在约2.5:1至约1:1的范围内的O₂与CH₄。在具体的实施方案中，供至生物反应器的气态底物包含比率在约1.5:1至约1:1的范围内的O₂与CH₄。在CH₄和O₂之间的反应化学计量将根据微生物所用的路径而变化。图1中说明了微生物CH₄消耗的可能化学计量的范围。

如图1中所说明，化学计量可能需要如下操作反应器：将CH₄和O₂的体积设置于可燃范围(1)内。优选如下操作反应器：反应器中存在非可燃条件，因此当在1.8:1的O₂与CH₄进气率下操作时需要96％或更大的CH₄转化率以在反应器中产生非可燃条件。

在具体的实施方案中，方法中所用的气态底物包含空气作为O₂的替代物。当以空气代替O₂进行操作时，反应器中的操作条件可取决于反应器中的CH₄转化率在可燃范围外运行。图2中说明了用空气进行操作的化学计量的范围，其中(1)表示可燃区域、(2)表示化学计量范围、(3)表示进气组成并且(4)表示空气线。在某些实施方案中，利用1.8:1的O₂与CH₄进气比，高于40％的CH₄转化率将在反应器内产生非可燃条件。这就点火源减少来说简化了反应器设计。

当碳源是甲醇时，生长培养基中的CH₃OH浓度可在约1％(v/v)至约5％(v/v)内变化。在具体的实施方案中，所述比率可为1:1.2至约1:1.5。为了最优地利用甲醇，菌株应在完全好氧条件下生长。在具体的实施方案中，在工艺初期将包含CH₃OH的底物供至反应器以最优化微生物生长。一旦确定一种或多种微生物的最优生长速率，底物便可以改成包含CH₄和O₂的底物。

可将碳源和氧源作为一股流或作为独立流馈送到生物反应器。例如天然气流可与含氧流例如空气共混以提供所需的O₂:CH₄。

在另一实施方案中，可将包含甲烷和甲醇的底物馈入反应器中并且可将含氧流单独馈入反应器中。甲醇液流可从甲烷气态流单独馈入。

共混气流也可以具有其它优势，尤其是在包含CH₄或者CH₄和O₂的气流在本质上间歇的情况下。例如，包含CH₄或者CH₄和O₂的间歇气流可以与包含CH₄或者CH₄和O₂的大致连续流共混并且供至反应器中。在具体的实施方案中，大致连续流的组成和流动速率可以根据间歇流而变以维持向发酵器提供大致连续组成和流动速率的底物流。

不论馈送到反应器的氧源:碳源的比率如何，重要的是，足够的氧溶解于液体营养培养基中以有助于细菌吸收。通常，在大气压下溶解氧应在约0.1％至约100％空气饱和度的范围内。在一些实施方案中，在大气压下溶解氧在约0.1％至约40％空气饱和度的范围内。通常需要溶解氧小于约1mM/LO₂。

本发明的方法可以与涉及从气态底物合成产物的其它方法整合。这些方法的实例包括通过包含CO、CO₂和/或H₂的气态底物的厌氧发酵来生产醇和/或酸。示例性方法包括例如WO2007/117157和WO2008/115080以及美国专利6,340,581、6,136,577、5,593,886、5,807,722和5,821,111中所述的方法，所述专利以引用的方式并入本文中。在这些实施方案中，包含CH₄以及CO、CO₂和/或H₂的气流，例如天然气或填埋气体可经历任何在本领域中已知的气体分离方法以分离气体的组分或元素。分离的CH₄然后可用于本发明的方法中，而CO、CO₂和/或H₂可以用于厌氧发酵过程。

反应器

微生物培养和甲烷微生物转化成一种或多种产物可以在任何合适的生物反应器如固定的细胞反应器、气升反应器、泡塔反应器(BCR)、循环环路反应器、膜反应器如空心纤维膜生物反应器(HFMBR)或滴流床反应器(TBR)中进行。而且，在本发明的一些实施方案中，生物反应器可以包括培养微生物的第一生长反应器，和第二产物合成反应器，来自生长反应器的发酵液可以馈送到所述第二产物合成反应器中并且其中可以产生各种产物(例如酸)。

生物反应器包含液体营养培养基，所述液体营养培养基含有所需细菌并且其中将馈入包含CH₄和O₂的气态底物。在具体的实施方案中，将液体营养培养基连续地馈送到反应器中。在具体的实施方案中，使液体营养培养基饱和含有O₂，随后馈送到反应器中。在具体的实施方案中，对液体营养培养基加压并且使其饱和含有O₂，随后馈送到反应器中。

液体营养培养基将含有适于使用所需细菌进行微生物转化的营养素，并且将进一步含有足以使所用微生物生长的维生素和/或矿物。本领域已知适于培养甲烷消耗型细菌的培养基。例如，Kaluzhnaya等,2001和Ojala等,2011中描述了合适的培养基。在具体的实施方案中，培养基为盐的最小混合物。组成在盐含量方面可以变化。表1中阐述了典型的营养培养基组成。

表1.培养嗜甲烷培养物的营养培养基组成

在本发明的一些实施方案中，用于使嗜碱甲基微菌5GB1生长的培养基包含NMS培养基。在本发明的其它实施方案中，用于使嗜碱甲基微菌5GB1生长的培养基包含在约0.04g/L至约1g/L范围内的MgSO₄*7H₂O、在约0.007g/L至约0.2g/L范围内的CaCl₂*6H₂O、NaCl、KH₂PO₄、Na₂CO₃、Na₂-EDTA、FeSO₄*7H₂O、ZnSO₄*7H₂O、MnCl₂*4H₂O、在约0.02g/L至约0.03g/L范围内的H₃BO₃、在约0.02g/L至约0.2g/L范围内的CoCl₂*6H₂O、CuCl₂*2H₂O、NiCl₂*6H₂O和在约0.003g/L至约0.05g/L范围内的Na₂MoO₄*2H₂O。

在本发明的一些实施方案中，用于使嗜碱甲基微菌5GB1生长的培养基包含至少一种氮源，如KNO₃、NaNO₃、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、尿素或其混合物。在本发明的其它实施方案中，用于使嗜碱甲基微菌5GB1生长的培养基包含至少一种氮源，所述氮源包括KNO₃、NaNO₃或其混合物。

已经发现一些所添加的营养素会影响由特定细菌所产生的脂质的生长速率和量。具体地，需要有至少7.5μmol/gDCW的Cu⁺⁺吸收率。因为所述量的铜最终可变成细菌的毒物，所以需要Cu⁺⁺浓度在约7μM至约20μM的范围内。类似地，需要Fe⁺⁺浓度在约5μM至约15μM的范围内(表2)。类似地，NO₃ ^-吸收率应在约5mmol/gDCW至约8mmol/gDCW内变化。另外，PO₄ ^-3应在约1.4mmol/gDCW至约2mmol/gDCW的范围内。

将生物反应器构造成提供足够传质以允许微生物接近CH₄(和或CH₃OH)和O₂。长的气体停留时间使微生物吸收较多气体。在具体的实施方案中，反应器为包括上升段和下降段的循环环路反应器，气态底物和液体培养基会在所述上升段和下降段中循环。反应器可以另外包括许多合适的气体/液体接触模块，其可提供改善微生物转化效率所必需的气态底物的有效传质。接触模块提供允许气体与液体沿着设定流径充分混合的独特几何环境，从而使夹带气更均匀地溶解于液体中。例如，这些接触模块包括但不限于结构化波纹金属填料、散堆填料、筛板和静态混合器的基质，这些都具有一定范围的熟知类型和密度并且可广泛地商购获得。

根据具体实施方案，可控制气态底物向微生物培养物的传质率以在最优供应率下或向着最优供应率向微生物培养物供应底物。在反应器中，可通过控制气体底物的分压和/或通过控制液体流动速率或气体滞留来控制传质率。在具体的实施方案中，通过控制进入反应器的气态底物的分压来控制传质。

在具体的实施方案中，将培养基的pH值维持在约6至约11。更具体地，pH值在约8.0至约9.5内变化。可以通过向培养基按需添加碳酸盐或碳酸氢盐或添加酸和碱来控制pH值。在具体的实施方案中，将液体营养培养基的温度维持在约5℃至约65℃、优选地约20℃至约40℃并且最优选约25℃至约35℃。

产物的生产

本发明的方法通过在生物反应器中嗜甲烷微生物对CH₄的微生物转化来产生基于脂质的产物。在各个实施方案中，脂质含于细菌生物质的膜部分中。整个生物质体积的脂质分数将由反应器中的生长条件决定。在具体的实施方案中，细菌生物质的膜部分中所含的脂质占细菌干重的约至少5％。在具体的实施方案中，细菌生物质的膜部分中所含的脂质占细菌干重的至少约20％或至少约40％。作为微生物转化的部分所产生的废气中的一种为CO₂。CO₂可与气相中任何未反应的气体一起离开，或者其中一些可以含于液体发酵液中。相对于液体发酵液，气相中离开的量将取决于发酵液pH值，较高pH值有利于液体发酵液中的CO₂。

在具体的实施方案中，对反应器有限的O₂供应将有利于微生物产生脂质。充足的CH₄供应与有限的O₂供应可使生长速率较快并且使培养物的脂质形成增强。因此，在具体的实施方案中，将包含过量CH₄的气态底物供至反应器中以使培养物产生脂质产物。在具体的实施方案中，向反应器有限的CH₄供应将有利于微生物产生脂质。充足的O₂供应与有限的CH₄供应可使生长速率较快并且使培养物的脂质形成增强。因此，在具体的实施方案中，将包含过量O₂的气态底物供至反应器中以使培养物产生脂质产物。在有利于脂质产生的具体实施方案中，气态底物的细菌的吸收率处于在约1:1至约2.5:1O₂:CH₄范围内的比率。在有利于脂质产生的优选实施方案中，O₂与CH₄的吸收率以在约1.3:1至约1:1范围内的比率变化。期望细菌生长速率为至少0.08hr^-1或至少0.12hr^-1，或至少0.2hr^-1或至少0.4hr^-1。图3中说明用有限的O₂操作并且有利于脂质产生的化学计量的范围，其中(1)表示可燃区域。

在具体的实施方案中，所述方法产生脂质，包括脂肪酸、糖脂、鞘脂、醣脂、聚酮、固醇脂、藿烷类、磷脂和异戊烯醇脂质与链长为约12个至20个碳的脂肪酸(以及所得烃)。脂质的特定实例包括但不限于月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、异油酸、磷脂酰胆碱、三酸甘油酯、甘油和其混合物。特定脂肪酸含量示于实施例1、表3中。

除产生脂质以外，本发明的方法还可产生氨基酸。在具体的实施方案中，由微生物所产生的氨基酸包括但不限于依克多因、脯氨酸、5-氧脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸盐、谷氨酰胺和谷氨酸盐。表3中示出生产氨基酸的一个实例，其呈现于实施例3中。微生物产生氨基酸可以由在高盐度(3-8％NaCl)下培养所引起。

反应器应理想地在适于将气体微生物转化成所需产物的条件下操作。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流动速率、液体流动速率、培养基pH值、培养基氧化还原电位、搅动速率(若使用连续搅拌釜反应器的话)、接种物水平、最大底物浓度以确保液相中的CH₄、CH₃OH或O₂不会变得具有限制性的，以及避免产物抑制的最大产物浓度。

在本发明的某些实施方案中，可能对在高分压下的方法有利。反应器中的较高压力可影响脂质形成和微生物生长。在具体的实施方案中，将反应器维持在约大气压至约3,000kPag的压力下。在其它实施方案中，压力可为约20kPag至约2,000kPag。

在某些实施方案中，培养基的钠浓度可对嗜甲烷微生物的生长和生产率有影响。在具体的实施方案中，使用盐优选NaCl将培养基的钠浓度调节到所需水平。在这些情况下，使用不含有钠的酸和碱来控制培养基的pH值。在优选的实施方案中，将钠浓度维持在约120mM与约210mM之间(作为阳离子)。

在各个实施方案中，使用气相色谱法通过进气和出气的常规t取样来测定方法的气体组成。这允许监测气体中的CH₄、CO₂、O₂和惰性物质如氮，以及由细菌代谢所产生的氢。在具体的实施方案中，通过使用测量反应器发酵液中的O₂浓度的溶解氧探针来进一步监测反应器中的O₂水平。在具体的实施方案中，使用由氧探针收集的测量值以控制入口O₂或空气馈送率。

在具体的实施方案中，未利用的气体和/或任何由微生物所产生的气体的至少一部分从气体出口离开反应器。这种排气典型地包含未消耗的CH₄和O₂，以及由微生物所产生的CO₂。在具体的实施方案中，排气的至少一部分回收到生物反应器中以进一步转化。在这些实施方案中，排气可先经历本领域中已知的任何气体分离方法以去除排气流的一种或多种不合需要的组分，如CO₂。或者，可以将排气的至少一部分用作燃料。

提取

在各个实施方案中，脂质产物含于细胞或细胞膜中。在这些情况下，需要从细菌生物质中提取脂质产物。因此，在反应器中的微生物转化过程之后，将生物质馈送到提取区。

提取区可以包括用于提取过程的不同阶段的多个提取单元。作为第一段，可以将生物质供至固体浓度适于泵送生物质(小于40％固体并且优选在1％与10％固体之间)以便在脂质提取之前进行预处理的细胞破碎单元。预处理步骤可以由细胞生物质的化学或物理处理，优选高压均化、高温孵育(在约50℃与约200℃之间，优选地在约75℃与约90℃之间)或者酸或碱预处理(优选浓度在约1％与约10％H₂SO₄或NaOH之间、优选地在约2％与约4％H₂SO₄或NaOH之间)或者上述处理的任何组合组成。

在本发明的其它实施方案中，破碎的细胞可以先经历脱水步骤以去除一些在发酵液中所含的水，随后导入溶剂萃取过程。脱水可以包括例如但并不限于离心、过滤、蒸发或其组合。脱水可以得到含有破碎细胞并且水含量小于起始发酵液的水含量的生物质部分。在本发明的一些实施方案中，含有破碎细胞和脂质的脱水生物质的水含量可以在约10重量％水至约60重量％水的范围内。

破碎的细胞然后可以经历溶剂萃取过程，其比率在约100:1与约1:100的湿生物质:溶剂之间，或者比率在约10:1与约1:10之间，或者比率为约5:1至约约1:5或比率为约2:1至约1:2。用于本段的优选溶剂为极性与脂质部分的极性相容并且具有足以使溶剂易于去除的低沸点的溶剂，优选的溶剂为用于嗜甲烷生物质中的高度极性脂质部分的短链醇溶剂，例如用于微生物非极性脂质的丁醇或戊醇或短链烷烃溶剂，例如己烷或庚烷或者极性与非极性溶剂的组合。可用于本发明的方法中的溶剂的其它实例选自甲醇、乙醇、1-丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、1-戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、1-壬醇、1-癸醇、色醇、异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、环己醇、叔丁醇、叔戊醇、2-甲基-2-戊醇、2-甲基己-2-醇、2-甲基庚-2-醇、3-甲基-3-戊醇、3-甲基辛-3-醇、环戊烷、环己烷、苯、甲苯、乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜和其混合物。在具体的实施方案中，将来自提取过程的产物进一步分离成主要包含所提取的脂质和溶剂的轻相，以及主要包含水、废生物质和脂质/溶剂携带物的重相。在本发明的一些实施方案中，轻相与重相的分离可以通过重量法(包括但不限于离心和分相器)来实现。在具体的实施方案中，在分离段采用盘叠式离心机。

在本发明的一些实施方案中，溶剂萃取步骤可以在约0℃至约100℃范围内的温度下完成。在本发明的一些实施方案中，溶剂萃取步骤可以在约20℃至约50℃范围内的温度下完成。在本发明的还有其它的实施方案中，溶剂萃取步骤可以在约0℃、约10℃、约20℃、约30℃、约40℃、约50℃、约60℃、约70℃、约80℃、约90℃或约100℃的温度下完成。

在本发明的一些实施方案中，溶剂萃取步骤可以在35kPa(5psia)至约13790kPa(2000psia)，或约690kPa(100psia)至约6,900kPa(1000psia)，或约6,900kPa(1000psia)至约13,790kPa(2,000psia)，或97kPa(14psia)至约172kPa(25psia)的范围内的压力下进行。

在本发明的一些实施方案中，溶剂萃取步骤可以在约1分钟至约24小时范围内的时期内完成。在本发明的一些其它实施方案中，溶剂萃取步骤可以在约1分钟至约60分钟的范围内的时期内完成。在本发明的一些其它实施方案中，溶剂萃取步骤可以在约1分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟的时期内完成。在本发明的一些其它实施方案中，溶剂萃取步骤可以在约1小时至约24小时的范围内的时期内完成。在本发明的一些其它实施方案中，溶剂萃取步骤可以在约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时的时期内完成。

在分离之后，可以使用蒸馏从脂质产物中洗提溶剂，并且将其回收到提取区，留下大致上纯的脂质流。在具体的实施方案中，将含有废生物质的重相送到厌氧消化模块。或者，废生物质可用于产生单细胞蛋白。

在具体的实施方案中，可以进一步加工从生物质所提取的脂质以提供燃料或其它化学物质。例如，脂质产物流的至少一部分可以通到加氢处理单元，其中脂质可转化成柴油燃料或柴油燃料组分。

在另一实施方案中，脂质可通过本领域熟知的手段转化成至少一种选自以下项的化学物质、燃料或燃料组分：可再生柴油、生物柴油、烃、脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)。各种衍生化学品如清洁产品和个人护理产品使用诸如表面活性剂、脂肪醇和脂肪酸的组分，可以提供脂质或脂质衍生物作为所有这些组分的替代物。此外，可从脂质产生各种油脂化学物质。

在具体的实施方案中，将包含来自溶剂萃取步骤的废生物质的重相的至少一部分通到厌氧消化器单元中。在厌氧消化器单元内，重相的组分通过厌氧消化转化成生物气。厌氧消化器单元可以含有产酸细菌、产乙酸细菌和/或产甲烷细菌。在典型的厌氧消化过程中，产酸细菌首先将有机聚合物和氨基酸转化成CO₂、H₂、NH₃和有机酸。产乙酸细菌然后将所得有机聚合物转化成乙酸以及额外的CO₂、H₂和NH₃。最后，产甲烷细菌将所得乙酸转化成CH₄和CO₂。

在具体的实施方案中，将由厌氧消化器所产生的生物气的至少一部分供至生物反应器中，其中将甲烷用于由嗜甲烷细菌进一步微生物转化成一种或多种产物。在替代性实施方案中，将由厌氧消化器所产生的生物气的至少一部分供至燃气轮机中以发电。由燃气轮机所发的电然后可用于为如本文所述的本发明的方法的任何步骤供能。

实施例

实施例1

本实施例呈现用于进行以下实验的通用程序。通过将以下试剂溶解于1000mL去离子水中在生物反应器中制备液体培养基。

0.2gMgSO₄x7H₂O

0.02gCaCl₂x6H₂O

1.00gKNO₃

7.5gNaCl

接着将生物反应器在121℃下高压处理20分钟，然后冷却至30℃。生物反应器配备溶解氧(DO)探针和pH值探针，并且所有都与控制器连接。接着将空气以100sccm/m的速率喷射通过培养基持续12小时。添加痕量元素、碳酸盐缓冲剂和磷酸盐(分别2mL、25mL和20mL)。

痕量元素配方：

1.0gNa₂-EDTA

2.0gFeSO₄x7H₂O

0.8gZnSO₄x7H₂O

0.03gMnCl₂x4H₂O

0.03gH₃BO₃

0.2gCoCl₂x6H₂O

0.6gCuCl₂x2H₂O

0.02gNiCl₂x6H₂O

0.05gNa₂MoOx2H₂O

填充至1000mL

磷酸盐溶液：

5.44gKH₂PO₄

10.73gNa₂HPO₄

填充至1000mL

碳酸盐溶液：

1MNaHCO₃700mL

1MNa₂CO₃300mL

连接碱对照物(3MNaOH)并且将其设为维持在pH8.8。

用正在测试的特定气体代替空气流，并且取样以在运行期间每45分钟使用自取样来进行气相色谱。

最后，添加50mL接种物。

实施例2.

嗜甲烷细菌需要铁来生长、甲醇氧化以及呼吸。已经显示嗜甲烷菌可产生Fe螯合化合物(Yoon等,2010；Matsen等,2013)，因此可在极低的金属水平下生长。我们发现5GB1菌株的生长速率取决于铁的可用性。最大生长发生在高的铁水平(14.4μM)下。使嗜碱甲基微菌菌株5GB1培养物在250ml密闭小瓶中的、补充有50ml甲烷和不同浓度的Fe⁺⁺(以FeSO₄添加)的50ml矿物培养基中生长。

表2.嗜碱甲基微菌菌株5GB1在不同浓度FeSO₄下的生长参数

*T_d，倍增时间。

实施例3

使用不同生长条件使细胞在分批培养物中生长。收集物1来自在非有限的CH₄和O₂下生长的细胞；收集物2来自在有限的O₂下生长的细胞；并且收集物3来自在有限的CH₄下生长的细胞。使用全细胞酯基转移来定量作为脂肪酸甲酯(总FAME)的脂肪酸并且鉴别细胞脂质的脂肪酸概况。细胞脂质含量和脂肪酸概况随生长条件而变。

表3：嗜碱甲基微菌5GB1的脂质部分的脂肪酸含量和概况

实施例4

使嗜碱甲基微菌5GB1培养物在1L瓶中的补充有750ml甲烷的250ml上述矿物培养基中生长。将细胞离心收集、冻干并且提交AminoAcids(https://www.aminoacids.com)供氨基酸分析以进行总氨基酸剖析。表4中示出基于甲基微菌属的蛋白质的氨基酸组成。5GB1细胞蛋白显示类似于异亮氨酸和蛋氨酸的鱼粉含量，并且这些氨基酸的量高于BP蛋白。此外，与构成15％核酸的荚膜甲基球菌生物质相反，来自嗜碱甲基微菌5GB1的生物质具有仅3-5％的核酸。

表4.嗜碱甲基微菌菌株5GB1细胞蛋白的氨基酸含量

*必需氨基酸；BP，BioProtein(基于荚膜甲基球菌细胞蛋白)；¹，来自http://www.vkm.no/dav/a0782dea9c.pdf的数据

实施例5

本实施例描述在分批馈料和连续培养期间所产生的发酵参数中的一些。在分批馈料操作中，操作如实施例1中所示的初始培养基和反应器装备直到生长达到静止阶段并且气体吸收下降为止。每小时测量在反应器入口和出口处的气体以测定气体吸收率，并且还频繁测量培养物光学密度以测定生长条件。

对于甲醇分批馈料操作，使用与实施例1类似的程序以用甲醇代替甲烷作为碳源来进行实验。除标准NMS2培养基以外，在接种之前还添加0.5％v/v的甲醇。代替预混合的气体共混物，将空气以100sccm喷射通过培养基。pH值对照物和气相色谱仪取样不变。

特定CH₄和O₂吸收率在最高的生长速率下达到峰值，并且概括于下文表5中。

表5.甲醇分批馈料、甲烷分批馈料、O₂有限和CH₄有限操作的Fame干重％、特定O₂吸收率和特定CH₄吸收率

在类似的实验中，将馈料分批培养物转换为培养基的连续馈料，将培养基组分分离到不同溶液中。使这个系统达到稳态。培养基组分流入反应器的速率会变化，直到发现一种具有限制性为止。基于由限制性营养素流量支撑的稳态生物质浓度来确定对生物质的特定NO₃和PO₄要求。

表6：特定CH₄吸收率、特定O₂吸收率、特定NO₃吸收率、特定PO₄吸收率和特定Cu吸收率的关键过程参数的范围和典型值。

实施例6

熟知铜在好氧型嗜甲烷细菌的生理学和活性方面起到重要作用。仅具有微粒甲烷单加氧酶的菌株的生长强烈地依赖于金属的可用性。含可溶性MMO的培养物可在没有铜补充下生长，但会显示生长速率降低。菌株5GB1能够在铜限制时转换成sMMO并且在宽的铜范围(0-20μM)内生长。菌株在没有铜下的生长速率为0.115h^-1(相对于在最优铜水平下的0.24h^-1)。发现最优的铜浓度为12μM(作为CuSO₄添加)。在高于24μM的铜浓度下没有观测到菌株生长。脂质的积累量高于有铜的情况下生长的培养物，如下表中所示。

表7：Cu浓度对CDW的FAME％的影响

实施例7

本实施例描述在0.5L生物反应器中的分批培养中的我们的微生物的高细胞密度培养物。将用于本培养物的培养基改性为如实施例1中所述的液体培养基中的8X氮源、2X磷酸盐溶液和4X微量元素溶液。共混气体中的CH₄与O₂的比率为1:0.8。控制生物反应器中的培养物pH值并且将其维持在pH8.8。在这个48小时的培养中达到最大细胞密度22g/L并且列于如下。

实施例8

本实施例呈现在5L生物反应器中进行的分批培养。将与实施例7中所应用相同的培养基、共混气体并且培养物pH值用于本培养物中。从这个72小时的培养物获得10g/LDCW，其为在实施例7中达到的最大DCW的仅一半。这可能是由于由这个生物反应器所约束的较低搅动速率。然而，在这整个培养中，FAME含量为约10％。

实施例8：溶剂与脂质类型的相容性

对纯组分显示极性与非极性完整脂质在极性和非极性溶剂中的选择性分配。选用丁醇作为与含水细胞混悬液形成轻相的代表性低沸点短链醇溶剂，并且将其与作为基于三酸甘油酯的脂质的传统脂质萃取溶剂的己烷相比。使用磷脂酰胆碱作为代表性极性脂质并且使用纯菜籽油作为非极性三酸甘油酯脂质的代表，在将脂质溶解于水中并随后用己烷或丁醇(比率1:1)萃取之后萃取效率的比较显示，在己烷中萃取了2.7％极性脂质，有明显的抑制萃取所必需的相分离的乳液形成，而观测到丁醇中有70％回收率，用两种溶剂类型获得在61-72％之间的中性类脂回收率。丁醇分离对于极性脂质萃取来说是清洁并且有效的。

对干燥生物质上脂质的萃取的完备性(测量为燃料相关脂肪酸)的证明显示，1-丁醇和更具毒性的用于通用分析萃取并且公认为完备的极性溶剂体系氯仿:甲醇(2:1)一样好。将加速溶剂萃取器(ASE,Dionex)用于使用以下参数对干燥生物质进行加压萃取：75mg干燥生物质，在50℃、1500psi下萃取，连续萃取三次。将含所萃取脂质的溶剂在氮气流下在40℃下蒸干。氯仿:甲醇一致地萃取100％脂质，丁醇萃取70％脂质。脂肪酸概况保持一致，代表性脂肪酸存在于由丁醇萃取的脂质中并且示于下文。

实施例9：证明对细胞混悬液进行热处理会提高提取效率

将在1-10％之间的细胞混悬液的孵育物在85℃下加热15分钟，接着在室温下萃取1小时，当使用己烷时，应用于生物质得到4％与28％之间的脂肪酸可萃取性，而用丁醇得到70％的萃取完备性。发现热处理为有效使细胞破裂从而允许萃取和分离极性与非极性脂质的方式。热可帮助细胞破裂诱导的潜在机制包括蛋白质变性和细胞的蛋白聚糖层的破坏，从而制备更可进行溶剂萃取的脂质。

举例来描述本发明的实施方案。然而，应了解，在一个实施方案中所必需的具体步骤或阶段在另一实施方案中可能不是必需的。相反地，具体实施方案的描述中所包括的步骤或阶段可任选地有利地用于其所未特别提及的实施方案中。

虽然参考任何类型的可以通过任何已知转移手段穿过或围绕系统移动的流来广泛描述了本发明，但是在某些实施方案中，底物和/或废流为气态。本领域技术人员将了解，具体阶段可以通过合适的管道构件等来耦合，可配置成遍及系统来接收或流通各流。可以提供泵或压缩机以帮助向具体阶段递送所述流。此外，压缩机可用于提高供至一段或多段(例如生物反应器)的气体的压力。如上文所讨论，生物反应器内气体的压力可影响其中进行的发酵反应的效率。因此，可调节压力以提高发酵效率。本领域中已知适用于常见反应的压力。

另外，本发明的系统或方法可以任选地包括用于调控和/或控制其它参数以提高方法总效率的构件。可以将一个或多个处理器引入系统中以调控和/或控制方法的具体参数。例如，具体实施方案可以包括监测底物和/或废流的组成的测定构件。另外，如果所述测定构件测得所述流具有适于具体段的组成，那么具体实施方案可以包括用于控制底物流向具体系统内的具体段或元件的递送的构件。例如，在气态底物流含有可能不利于微生物反应的低水平O₂或高水平CH₄的情况下，底物流可以转为远离生物反应器。在本发明的具体实施方案中，系统包括用于监测和控制底物流的目的地和/或流动速率的构件，以使含所需或合适组成的流可递送到具体段。

另外，可能有必要在所述方法的一段或多段之前或期间加热或冷却具体的系统组分或底物流。在这些情况下，可以使用已知的加热或冷却手段。例如，可以采用热交换器以加热或冷却底物流。

此外，系统可以包括一个或多个预处理/后处理步骤以改善具体段的操作或效率。例如，预处理步骤可以包括从气态底物流去除微粒物质和/或长链烃或焦油的构件。其它可以进行的预操作或后操作包括从具体段如生物反应器生产段分离所需产物。

已经在本文中参考某些优选的实施方案描述了本发明以使读者能够在无不当实验的情况下实践本发明。本领域技术人员将了解，本发明可在许多变化和修改(除特别描述的那些以外)下实践。应了解，本发明包括所有这些变化和修改。此外，题目、标题等是提供来帮助读者理解本文献，并且不应被视作限制本发明的范围。

更具体地，本领域人士应了解，本发明的实施方案的实施可以包括一个或多个额外要素。具体实施例或说明书中可能仅已示出理解本发明各个方面所必需的那些要素。然而，本发明的范围不限于所述的实施方案，并且包括：包括一个或多个额外步骤和/或一个或多个替代步骤的系统和/或方法，和/或省去一个或多个步骤的系统和/或方法。

在本说明书中提及任何现有技术并不并且不应被视为承认或以任何形式表明现有技术形成任何国家所付出努力范围内的公知常识的一部分。

遍及本说明书和任何上述权利要求，除非上下文另外要求，否则措词“包含”等应被视为具有包括性含义，如与排外性含义相反，也就是说，其意思是“包括但不限于”。

Claims

1.一种通过对气态底物进行微生物转化来产生至少一种产物的方法，所述方法包括：

(a)向包含至少一种嗜甲烷微生物于液体营养培养基中的培养物的生物反应器中提供包含CH₄和O₂的气态底物；以及

(b)将所述气态底物在发酵条件下微生物转化成至少一种在细胞生物质中的选自脂质、蛋白质、氨基酸和其混合物以及所分泌的脂肪酸的产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述脂质选自脂肪酸、糖脂、鞘脂、醣脂、聚酮、固醇脂、藿烷类、磷脂和异戊烯醇脂质或其混合物。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述脂质进一步转化成选自可再生柴油、生物柴油、柴油、柴油组分脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯的化合物。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物包含比率在约5:1至约0.9:1O₂:CH₄范围内的O₂与CH₄。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述气态底物包含比率在约1.3:1至约0.9:1O₂:CH₄范围内的O₂与CH₄。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物吸收比率为约1:1至约2.5:1O₂:CH₄的CH₄与O₂。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物以至少约0.08hr^-1的速率生长。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述营养培养基包含Cu⁺⁺并且所述微生物以约7μM/gDCW至约20μM/gDCW的速率吸收所述Cu⁺⁺。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述营养培养基包含NO₃ ^-并且所述微生物以约5mmol/gDCW至约8mmol/gDCW的速率吸收所述NO₃ ^-。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述营养培养基包含PO₄ ^-3并且所述微生物以约1.4mmol/gDCW至约2mmol/gDCW的速率吸收所述PO₄ ^-3。

11.如权利要求1所述的方法，其中至少一种嗜甲烷微生物的所述培养物选自甲基球菌属、甲基单胞菌属、甲基微菌属、甲基杆菌属、甲基暖菌属、甲基球形菌属、甲基孢囊菌属和甲基弯曲菌属，或者其混合物。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述培养物包含嗜碱甲基微菌(Methylomicrobiumburyatense)。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物的至少一部分未反应从气体出口离开所述生物反应器，并且回收到所述生物反应器中以进一步转化。

14.如权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述液体营养培养基的pH值维持在约6至约11的范围内。

15.如权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述液体营养培养基的温度维持在约5℃至约50℃的范围内。

16.一种通过对气态底物进行微生物转化来产生至少一种产物的方法，所述方法包括：

(a)向含有液体营养培养基和至少一种嗜甲烷微生物的培养物的生物反应器中提供包含氧气和至少一种选自CH₄、CH₃OH和其混合物的组分的底物；

(b)微生物转化所述底物以产生至少一种在所述微生物的细胞生物质中的选自脂质和氨基酸的产物；以及

(c)从所述微生物的细胞生物质中提取所述至少一种产物。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述脂质选自脂肪酸、糖脂、鞘脂、醣脂、聚酮、固醇脂、藿烷类、磷脂和异戊烯醇脂质，以及其混合物。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述气态底物包含比率在约5:1至0.5:1O₂:CH₄范围内的O₂与CH₄。

19.如权利要求16所述的方法，其中所述微生物吸收比率为约1:1至约2.5:1O₂:CH₄的CH₄与O₂。

20.如权利要求16所述的方法，其进一步包括将所述CH₄与所述CH₃OH共混，随后供至所述生物反应器中。

21.如权利要求16所述的方法，其中至少一种嗜甲烷微生物的所述培养物选自由以下组成的属类：甲基球菌属、甲基单胞菌属、甲基微菌属、甲基杆菌属、甲基暖菌属/甲基热菌属、甲基海洋分枝杆菌属、甲基海洋生菌属、甲基孢囊菌属和甲基弯曲菌属，或者其混合物。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述培养物包含嗜碱甲基微菌。

23.如权利要求16所述的方法，其中所述提取步骤包括细胞破碎步骤和溶剂萃取步骤。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述溶剂萃取步骤产生包含至少一种产物的轻相以及包含废生物质的重相。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述废生物质的至少部分用于制备单细胞蛋白。

26.如权利要求24所述的方法，其进一步包括使所述重相的至少一部分通到厌氧消化器中，其中所述重相的至少一部分转化成生物气。

27.如权利要求26所述的方法，其中将所述产生的生物气的至少一部分供至所述生物反应器中。

28.如权利要求16所述的方法，其进一步包括将所述萃取的产物的至少一部分转化成至少一种选自可再生柴油、生物柴油、柴油、柴油衍生物、脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯的化合物。

29.一种用于微生物转化甲烷的系统，包括：

(i)生物反应器，其含有液体营养培养基和至少一种嗜甲烷微生物的培养物；

(ii)至少一个气体入口，其被构造成引导包含氧气以及CH₄和CH₃OH中的至少一种的气态底物进入所述生物反应器中；

(iii)至少一个液体出口，其使至少一种产物离开所述生物反应器；以及

(iv)至少一个气体出口，其被构造成使气体离开所述生物反应器。

30.如权利要求29所述的系统，其中所述系统包括使离开所述生物反应器的所述气体的至少一部分回到所述反应器的所述至少一个气体入口的构件。

31.如权利要求29所述的系统，其进一步包括用于从所述微生物提取至少一种产物的提取区。

32.如权利要求31所述的系统，其中所述提取区包括：

(i)高压均化单元；

(ii)溶剂萃取单元；

(iii)分离单元；以及

(iv)蒸馏单元。

33.如权利要求29所述的系统，其中所述系统进一步包括产物加工区。

34.如权利要求33所述的系统，其中所述产物加工区包括加氢处理单元。

35.如权利要求29所述的系统，其中所述系统进一步包括厌氧消化器。