CN112312771A - 使用化能自养的微生物生产富细胞培养基的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了从初始的基本培养基生产富含营养物的培养基，该富培养基适合于培养异养的细胞。这些方法在化能自养的条件下利用光能自养的和/或化能自养的微生物的气体发酵，使用常见工业废气中的碳，来喂养生长的生物质。所述微生物还将一些碳转化为有机营养物，所述有机营养物释放到所述基本培养基中，由此富集所述基本培养基。在进一步的方法中，然后将所述富含营养物的培养基用于培养异养的细胞。

Description

使用化能自养的微生物生产富细胞培养基的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月17日提交的美国专利申请16/443,658(要求2018年6月18日提交的美国临时专利申请号62/686,508的权益)的权益，并且是2017年7月3日提交的美国专利申请号15/641,114的部分连续案，三者的全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明总体涉及微生物发酵和工业生物技术领域，并且更具体地，涉及产生用于异养生物培养的富含营养物的生长培养基。
背景技术
细胞培养是在液体中或在固体或半固体基质(例如琼脂)上生长、繁殖和维持细胞的实践。在细胞培养的实践中，将在其上培养细胞的液体或材料称为培养基。所有异养的细胞，即除自养的细胞以外的所有细胞，都需要包含某种形式的化学能和碳的培养基，这些可以由小分子(例如甲酸盐、乙酸盐和甲醇)或更复杂和更大的分子(例如糖和淀粉)提供，并且在某些情况下还可以由非常复杂和大型的化学物质(例如蛋白质)提供。
细胞培养基可以具有许多不同的组成，其包含一系列的组分，所述组分包含矿物质盐、糖、氨基酸、肽、蛋白质、多糖、激素、生长因子和复杂成分(例如牛血清、胰蛋白胨和酵母提取物)。仅包含水和无机盐的培养基组合物被称为“基本培养基”。因为缺乏某种形式的化学能和碳，所以基本培养基天生就不足以用于异养的细胞。基本培养基不包含有机化合物。包含有机化合物(例如糖、酵母提取物、酶消化的蛋白质和其他能量源)和复杂化合物的培养基被称为“富培养基”或“复杂培养基”。复杂培养基或富培养基是那些基本上包含微生物生长所需的所有能量、碳和其他因子的培养基。在培养多细胞生物(例如脊椎动物、软体动物和节肢动物)的细胞系时，蛋白质特别重要。
以下进一步的定义适用于本文中：
“异养的”被定义为“需要氮和碳的复杂有机化合物(例如从酵母、植物或动物物质获得的)进行代谢合成。”
“自养的”被定义为“仅需要二氧化碳或碳酸盐(C1化合物)作为碳源并需要简单的无机氮化合物用于有机分子(例如葡萄糖)的代谢合成”。
“化能自养的”被定义为“是自养的并且氧化无机化合物作为能量源”。在氢氧化细菌的情况下，作为能量来源的无机化合物可以包括H2，其可以消耗CO2、H2和O2的组合。实例包括为碳和H2而消耗CO2获得能量的厌氧产乙酸菌。化能自养生物的其他无机能量源可以包括还原的小分子，例如H2S、铵或亚铁。在某些情况下，化能自养生物的碳和能量输入可以合并为单个的C1分子。例如，一氧化碳营养菌(carboxydotrophs)和食一氧化碳菌(carboxydovores)为碳和能量两者而消耗CO(一氧化碳)，而嗜甲烷菌(methanotrophs)和O2(分子氧)或其他供氧化合物一起消耗CH4(甲烷)。化能自养的代谢在细菌和古细菌中是已知的，并且在某些其他生物中也可作为未发现的特征或通过遗传修饰赋予的能力存在。在许多细菌属(例如贪铜菌属(Cupriavidu)、红细菌属(Rhodobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、亚硝基单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝基球菌属(Nitrosococcus)、硝化细菌属(Nitrobacter)、硝化球菌属(Nitrococcus)、副球菌属(Paracoccus)、产氢嗜热菌属(Hydrogenothermus)、氢弧菌(Hydrogenovibrio)、梭菌属(Clostridium)、红球菌属(Rhodococcus)、红螺菌属(Rhodospirillum)、产碱杆菌属(Alcaligines)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)和硫杆菌属(Thiobacillus))中以及许多古细菌(包括产甲烷菌)的属中发现了化能自养生物的实例。化能自养生物的具体实例包括钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、巴塞尔贪铜菌(Cupriavidus basilensis)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)、发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、海产氢嗜热菌(Hydrogenothermus marinus)、深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustrus)、产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)。
“发酵”被定义为“通过酶的作用在有机基质中产生化学变化的代谢过程”。在生物化学中，其被狭义地定义为在没有氧气的情况下从碳水化合物中提取能量。在食品生产的背景下，它可能更广泛地指任何过程，其中微生物的活动会导致食品或饮料发生理想的变化。甚至更广泛地，并且为了本发明的目的，“发酵”是在受控的工艺条件下在专用容器(由玻璃、金属或塑料制成并被称为发酵器或生物反应器)中培养细胞以优化它们的生长和最大化效率的过程。受控的工艺条件包括无菌性、温度、搅拌速率、pH、输入气体的组成和流速、营养成分、细胞密度、溶解气体的浓度、生物质去除率(用于连续或半连续的去除)等。在后一种情况下，发酵可以是有氧的或无氧的。
“气体发酵”是指在生物反应器中的发酵，其中化能自养的细胞的代谢过程从供应给它们的气体输入中提取能量和碳。气体发酵可以指在气体上进行微生物培养的无氧或有氧的过程。通过将这些气体输入与培养基中的简单无机盐结合，化能自养的细胞将这些基本输入转化为更复杂的生物质和其他细胞产物。气体发酵可以是有氧的也可以是无氧的，这取决于所使用的生物和可用于发酵的原料气体。气体发酵是化能自养的发酵的一种特别有利的形式，因为关键的输入是由广泛可用且低成本的气体提供的。
“培养”被定义为“在制备的营养培养基中培养生命的物质(例如细菌或病毒)的行为或过程”。“营养物”被定义为“促进生长、提供能量和维持生命的物质或成分”。“培养基”被定义为“用于人工培养细胞或生物体，尤其是细菌的营养系统”。培养基可以是液体、半固体或固体(例如琼脂、珠子或其他支架)。固体或半固体培养基可以为细胞提供生长支持。
应注意的是，在典型的异养发酵中，细胞在包含复杂有机分子(例如糖、氨基酸、肽、有机酸等)的培养基中生长。异养的细胞通常从培养基中提取大部分的“高能”形式的碳以增加细胞生物质，以二氧化碳、乙酸盐或其他简单的低价值废产物的形式释放分解代谢的碳。因此，在异养发酵过程之后，从生物反应器中收获得到的生物质后残留的培养基通常被称为“废弃培养基”，因为它通常具有非常低的用于进一步培养异养生物的营养价值。即使选择了异养生物或将异养生物设计成将高价值产物排泄至培养基中，也必须在成本相当高的培养基(包含例如糖或蛋白质等的复杂分子)上培养它们，从而限制了生产过程的利润率。
在化能自养的发酵期间，细胞类似地生长并产生生物质。然而，化能自养生物的高度合成代谢产生过量的在营养上有价值的产物，其中一些部分泄漏或排泄至培养基中。
“较高生命形式”或“较高生物”是指真核生物，例如酵母、真菌、微藻、植物和动物。
在细胞的商业培养和维持中，特别是在从例如植物、鱼类、软体动物和节肢动物等多细胞生物中分离的细胞的培养中，相当大的花费是生长培养基的成本。除水和各种无机盐外，此类培养基经常还包含许多不同的肽生长因子、氨基酸、糖，酵母提取物、动物或植物来源的蛋白质消化物、动物来源的血清、蛋白(例如胰蛋白胨和蛋白胨)或白蛋白(例如牛血清白蛋白))和其他对细胞生长至关重要的代谢物。这些培养基的高生产成本的很大一部分是使用由动物材料(例如血液和其他流体和组织)加工而成的材料。
例如，基础培养基Eagle(BME)是广泛使用的合成基础培养基，其用于支持许多不同的哺乳动物细胞的生长。BME包含8种B-维生素和10种必需氨基酸，加上胱氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺。
附图说明
图1是根据本发明的各种实施方式所述的系统的示例性实施方式的示意图。
图2是根据本发明的各种实施方式所述的示例性生物反应器的示意图。
图3是根据本发明的各种实施方式所述的方法的流程图。
图4是实验结果的图，其显示了在根据本发明的示例性方法生产的培养基中的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的培养。
发明内容
本发明描述了从废气中生产适于培养异养的细胞的富含营养物的培养基。本文中所述的方法使用工业废料中的碳作为食物链的底部，所述食物链由在化能自养的条件下，在该碳上以及最初没有有机营养的培养基中气体发酵光能自养或化能自养的微生物开始。微生物繁殖以将该碳转化为更大的生物质，并且在适当的条件下还可以将某些碳转化为有机养分作为废弃副产物，所述废弃副产物可以使培养基富集，从而使其适合培养在食物链的更上部分的异养细胞。
本发明的示例性方法包括向生物反应器提供基本培养基，用包含化能自养的和/或光能自养的细胞的接种物接种所述生物反应器中的所述基本培养基，和通过向所述生物反应器中提供气体输入，化能自养地培养所述接种物以在所述生物反应器中生长生物质直到所述培养基中的所述生物质的细胞密度达到阈值，从而在所述培养过程中将所述基本培养基富集成为富集培养基。在各种实施方式中，所述方法进一步包括在用所述接种物接种所述基本培养基之前制备所述接种物。各种方法可以进一步包括制备所述基本培养基。进一步的实施方式包括在用所述接种物接种所述基本培养基之前对所述基本培养基和所述生物反应器进行灭菌。在更进一步的实施方式中，所述基本培养基包含凝胶。在各种实施方式中，将所述基本培养基与所述细胞的生长支持物一起加至所述生物反应器。
在各种实施方式中，所述化能自养的细胞或光能自养的细胞产生生长因子、激素、抗生素、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、着色剂、类胡萝卜素、脂肪酸或油。在各种实施方式中，所述接种物还包含异养的细胞。所述接种物还可以包含光能自养的细胞，并且在这些实施方式中，所述培养是在所述生物反应器中不存在光的情况下进行的。
在各种实施方式中，培养所述接种物包括将有益分子加至所述富集培养基中，并且在这些实施方式的一些中，所述有益分子包含葡萄糖。在一些实施方式中，培养所述接种物包括调节所述富集培养基的pH。在某些情况下，所述接种物包括化能自养的细胞，并且所述气体输入包含CH4和O2。在这些实施方式的一些中，所述化能自养的细胞包含荚膜甲基球菌的细胞。在各种实施方式中，所述气体输入包含CO，或所述气体输入包含CO2和H2S，或所述气体输入包含CO2、H2和O2。仍在其他实施方式中，所述接种物包含钩虫贪铜菌的细胞、荚膜红细菌的细胞或两者的细胞。在各种实施方式中，所述接种物可包含一氧化碳营养菌(carboxydotroph)的细胞或混浊红球菌(Rhodococcus opacus)的细胞。
本发明的各种实施方式进一步包括破坏所述富集培养基中的细胞以将其内容物释放至所述富集培养基中。在某些情况下，破坏细胞可以包括裂解所述细胞。在各种实施方式中，所述富集培养基包括生长因子、激素、抗生素、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、着色剂、类胡萝卜素、脂肪酸或油中的一种或多种。
在各种实施方式中，所述方法进一步包括例如通过离心、过滤或基于重力的分离从所述富集培养基中分离不溶性生物质。在这些实施方式的一些中，所述富集培养基在分离后包含每升至少1克D-葡萄糖。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在分离后，将一种或多种无机盐加至所述富集培养基，调节所述富集培养基的pH，过滤所述富集培养基，向所述富集培养基提供酶处理，对所述富集培养基进行色谱分离，或从所述富集培养基上进行选择性沉淀。在从所述富集培养基中分离不溶性生物质的方法中，一些方法进一步包括从所述富集培养基中去除铵离子。
在各种实施方式中，所述方法进一步包括在从所述生物质中分离的所述富集培养基中培养异养生物的细胞，从而耗尽所述富集培养基。在这些方法中的一些中，所述异养生物包括酵母、真菌、藻类、古细菌、细菌或哺乳动物。在进一步的实施方式中，所述异养生物的细胞源自多细胞水生生物的细胞系。
此外，本发明涉及通过本文描述的方法而产生的各种富集培养基。
具体实施方式
本发明描述了从废气中生产适于培养异养的细胞的富含营养物的培养基。此类培养基的生产包括至少在最初基本培养基中通过气体发酵化学自养地培养化学自养的和/或光学自养的细胞，然后在充分培养后收获该富集培养基。然后可以将所述富集培养基用于培养异养生物(例如酵母、真菌、微藻、植物和动物)。在生物反应器中培养的细胞可以包括化能自养的微生物或光能自养的微生物的单一物种或单一菌株，或者它们可以包括多种菌株或物种。另外，这些细胞可以与多种选择的异养的微生物的一种或多种物种或菌株共培养，其目的是向培养基提供其他所需营养成分(益生菌等)，所述其他所需营养成分不是由化能自养的或光能自养的细胞单独产生的。可以设计与异养的细胞的共培养或联合，以使异养的细胞为最终产品提供比其消耗更多的附加值。在一些实施方式中，可以将所得生物质的细胞内内容物加至富集培养基。
如本文中所用，“第一培养基”是用于为第一轮发酵提供基本营养物的初始培养基。如本文中所用，“第二培养基”是由所述第一培养基的富集产生的上清液富集的培养基，其在与所有或大部分生物质分离后仍保留。因此，所述第二培养基是富培养基。在化能自养的发酵过程中，细胞生长并增加生物质，但是它们的高度合成代谢也产生了过量的在营养上有价值的产物，其中一部分泄漏或排泄至所述生长培养基中。从化能自养的发酵的富集后剩余的培养基被称为“第二培养基”，以区别于异养发酵产生的营养不良的“废弃培养基”。在生物质已被大部分或全部去除后，所述第二培养基包含许多适合支持异养的细胞生长的复杂物质。因此，可以在发酵期间或之后收集该第二培养基，对其进行处理以去除任何残留的细胞或细胞碎片(如果需要的话)，并将其再次用作营养上有利的生长培养基或用于培养异养的细胞的添加剂。本文中还使用的“富集培养基”是指气体发酵开始后的第一培养基，并广泛涵盖培养期间的培养基以及分离过程之后的第二培养基。
在工业废气上培养的化能自养的和光能自养的微生物可以是特别丰富和有益的营养来源，因为这些微生物必须从头开始从简单且通常廉价的输入(例如氢气、二氧化碳、氧气、水和无机盐)开始生产其所有细胞组分(包括糖、脂肪酸、类胡萝卜素、辅因子、维生素、肽和蛋白质)。这种化能自养的生产模式还具有例如可以以与通过在糖上发酵异养的微生物相比更低的成本合成维生素和蛋白质的优点。
与现有技术的富培养基相比，根据本发明生产的第二培养基可以包含相似或相同的组分，并且可以提供等同的营养价值，因此可以补充或完全替代动物来源的和其他昂贵的成分以用于各种细胞培养应用。在某些情况下，这不仅可以降低生产成本，还可以提供不需要杀死或伤害动物的培养基。在其他情况下，培养基中提供的组分可以提供已知的富培养基中没有的益处，因此该过程的产物本身相对于现有技术具有新颖性。培养基可以完全由液体组成，也可以被配制成凝胶(例如使用琼脂)，或包含用作细胞生长支持物的固体或半固体物质(例如珠子)。
重要的是要注意，典型的用于异样生物的现有技术生长培养基具有被设计为在培养生长细胞时被耗尽的初始组成。根据本发明，化能自养的细胞的发酵在基本培养基中开始。原料气体的输入与以无机盐和原料气体为食的细胞的化能自养的生长的结合，以及可以作为联合中的一部分被包含其中并以化能自养的生长的产物为食的任何其他异养的细胞的生长，实际上会随着培养的进行而增强富集培养基的营养品质。
图1显示了本发明的示例性系统100的示意图。所述系统100包括生物反应器110，所述生物反应器110包含光能自养的和/或化能自养的细胞120。所述系统100还包括碳源130，例如产生包含一种或多种碳氧化物、一氧化碳和二氧化碳的废弃流140的工业源。碳源130的实例包括水泥制造设施，燃烧化石燃料的发电厂，黑色金属产品制造(例如铸造和锻造)，有色金属产品制造，食品制造，生产乙醇或其他生物产品的制造的发酵工厂，生物质的气化，煤炭的气化以及石油炼制、炭黑生产、氨气生产、甲醇生产和焦炭生产等的化学生产。
系统100进一步包括任选的分子氢源150，例如氢存储罐、氢管线、蒸汽甲烷重整器、气化器或电解系统。氢源150产生氢流160，氢流160包含分子氢作为光能自养地(即在无光下)生长的化能自养的或光能自养的细胞的能量源。在本发明的各种实施方式中，化能自养地生长于生物反应器中的细胞从一种废物流140(例如甲烷或一氧化碳)中获得碳和能量，并且在那些实施方式中，分子氢源150不是必需的。在进一步的实施方式中，废物流130包含碳源，还包含氢源(例如可由气化器产生的)。图1还示意性地说明了系统100的两个输出流，在从生物反应器110移出并分离之后，是累积的生物质170和富集或“第二”培养基180。在一些实施方式中，生物质170被气化(未示出)，并且该输出被用作第二碳源130。
图2显示了作为用于本发明方法的合适生物反应器的一个实例的生物反应器200的示意图。生物反应器200可以包括用于产生细胞以接种第一培养基并与单独的生长容器结合使用以在富集培养基中产生生物质的合成容器，或者生物反应器200可以包括适用于合成和成长阶段两者的容器。在图2中，生物反应器200包括容器205，所述容器205在操作中容纳一定量的液体培养基210，所述液体培养基210包含培养物中的化能自养的或光能养自养的细胞和任选的其他异养的细胞。生物反应器200还包括输入口215(可通过所述输入口215将气体220引入容器205中，以将其引入培养基210中)；培养基进口225(可通过所述培养基进口225将新鲜培养基230引入容器205中)，和培养基出口235(可通过所述培养基出口235去除培养基210，例如将富集培养基与不溶性生物质分离)。生物反应器200还可以包括顶部空间240和气体释放阀245，以从顶部空间240排出气体。在一些实施方式中，气体释放阀245附接至再循环系统以将排出的气体返回到输入口215，并且可以包括歧管(未示出)，通过所述歧管进行添加以优化气体组成。
在各种实施方式中，生物反应器200可以是连续搅拌的釜式反应器，回路生物反应器或适合于气体发酵的任何其他设计。生物反应器200可以进一步包括用于混合的受控搅拌，用于测量pH、溶解气体和培养物密度的各种探针，以及用于气体的控制，温度调节等。也可以将用于控制发泡的试剂加至生物反应器200。
图3说明了本发明的示例性方法300。尽管某些步骤被标记为任选，但未标记为任选的步骤不一定是必需的。方法300包括制备接种物的任选步骤305和制备基本培养基的任选步骤310。然后，方法300包括将基本培养基加至生物反应器的步骤315和对基本培养基和生物反应器进行灭菌的任选步骤320。方法300然后包括用接种物接种无菌基本培养基的步骤325，通过将气体供入生物反应器中来发酵直到细胞密度达到阈值的步骤330。方法300然后包括将细胞的内容物释放至富集培养基中的任选步骤335，然后包括从第二培养基中分离生物质的任选步骤340。在任选步骤345中，用第二培养基被设计以支持的异养细胞的类型接种第二培养基。
在步骤305中，制备足以接种生物反应器(例如生物反应器200)的接种物。该步骤是任选的，只要方法300的某些实施方式可以从预制接种物开始。接种物包括至少一个物种的光能自养的微生物或化能自养的微生物的细胞，并且可以使用富培养基或基本培养基与气体原料一起制备。选择用于接种物的一个或多个特定微生物物种和包括于其中的任何其他异养的微生物，以产生合适的第二培养基，所述第二培养基经定制以利于稍后在第二培养基中培养某些特定的高级生物，例如细菌、古细菌、微藻、真菌、霉菌或酵母。接种物的制备可以包括在相同培养基中或在单独培养基中的一种或多种菌株中共同培养化能自养的、光能自养的和/或异养的细胞。在后一种情况下，制备接种物可包括在不同时间制备一定数量的化能自养的细胞、光能自养的细胞和/或异养的细胞，并储存这些量直到全部准备使用为止。
在一些实施方式中，化能自养的微生物包含单个化能自养的细胞株，例如钩虫贪铜菌或荚膜甲基球菌，或荚膜红细菌或混浊红球菌，或已被遗传修饰以产生有益异源产物的化能自养生物。化能自养的菌株可以是天然的，可以包含突变，可以被基因修饰，也可以包含一个或多个通过CRISPR编辑的基因，以产生有价值的小分子、生长因子、激素、抗生素、氨基酸、肽、糖、多糖、蛋白质、维生素、着色剂、类胡萝卜素、脂肪酸、有机酸、核酸、油、乙醇酸、碳氢化合物、聚羟基脂肪酸酯、凝血素、基因转移剂(GTA)或然后可被非自养的微生物和其他异养的细胞利用作为生长基质和生长调节剂的其他生物分子。可以以这种方式使用的光能自养的微生物的实例包括：深红红螺菌、沼泽红假单胞菌、产玉米素副球菌、类球红细菌、荚膜红细菌、蓝藻(例如螺旋藻和鱼腥藻)。
生物材料的保藏
下列微生物已保藏于美国模式菌种收集中心(American Type CultureCollection)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA(ATCC)：
表1
Figure BDA0002842351060000121
该保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》及其下的条例(布达佩斯条约)的规定进行的。这样可确保自保藏之日起30年内保持活的培养物。ATCC将根据《布达佩斯条约》的条款提供生物体，并须遵守Oakbio，Inc.与ATCC之间的协议，该协议可确保在相关美国专利的授权后或在任何美国或外国专利申请向公众公布后(以先到者为准)向公众永久且不受限制地提供该培养物的后代，并确保后代可提供给美国专利商标局根据35USC§122和其相关规定(包括37CFR§1.12，特别是参考886OG638)确定的有权享有者。
本申请的受让人已经同意，如果在适当条件下培养时，保藏的培养物死亡或丢失或被破坏，则将在通知后立即用相同培养物的活的标本代替。保藏的菌株的可获得性不应被理解为违反任何政府根据其专利法在其授权下授予的权利来实施本发明的许可。
在步骤310中，制备在水中包含矿物质盐的基本培养基。该步骤也是任选的，只要方法300的某些实施方式可以以预制的基本培养基开始。化能自养生物的基本培养基的实例包括嗜氢菌的Repaske氏培养基和嗜甲烷菌的NMS培养基。这些示例性的基本培养基的配方是公开可得的，例如通过美国模式菌种收集中心(ATCC)。
在步骤315中，将基本培养基加至生物反应器，并且在步骤320中，对基本培养基和生物反应器进行灭菌。可以例如通过加热、辐射或通过使基本培养基通过无菌过滤器(例如0.2μm过滤器)来对基本培养基进行灭菌。在步骤315中，基本培养基可以包含凝胶。同样在步骤315中，基本培养基可以与生长支持物(例如珠子)一起加至生物反应器。
在步骤325中，用诸如步骤305中制备的接种物接种生物反应器中的无菌培养基。在一些实施方式中，用接种物接种生物反应器包括依次引入分开制备的不同细胞的数量。
在步骤330中，通过将包含CO2、CO、CH4、H2、H2S、O2、N2或NH3中的一种或多种的气体原料进料至生物反应器中来发酵接种物以将其培养成生物质。当原料中包含一种以上的气体时，则根据培养的细胞种类以适当的组合和比例提供几种气体。具体的实例包括CO2、H2和O2的混合物，CH4和O2的混合物以及CO2和H2S的混合物。维持发酵直到生物质的细胞达到阈值密度，通常大于0.5克细胞干重/升(CDW/L)，但优选大于约2克CDW/L。在步骤330期间，有益分子被生长的生物质的细胞分泌至基本培养基中以产生富集培养基。在进一步的实施方式中，在步骤330期间，可以将其他有益分子加至富集培养基以进一步提高其营养品质。例如，为了产生适合哺乳动物细胞的培养基，可以添加葡萄糖以将葡萄糖的浓度增加至用于快速生长的可接受的水平。在其他情况下，可能需要添加铁或其他矿物质。同样地，可以通过添加酸或碱来调节pH，并且可以包含其他无机盐、酵母提取物、胰蛋白胨、酚红或其他组分。
在任选步骤335中，可以将培养基灭菌或处理，以杀死、裂解或以释放其内容物的方式灭活或破坏富集培养基中的细胞，从而使得富集培养基进一步包含细胞内氨基酸、蛋白质、核酸、聚羟基脂肪酸酯、有机酸和其他因子，使培养基对于培养高等生物的细胞更为有用。
在步骤340中，收集第二培养基。在一些实施方式中，这是通过例如用于去除生物质的分离过程(例如离心、过滤或基于重力的分离)来实现的。在一些实施方式中，这个过程可包括通过0.2μm滤膜的无菌过滤，使得所得液体不包含任何微生物细胞。在一些实施方式中，可以通过无机盐的添加、pH的调节、过滤、酶处理、色谱分离、选择性沉淀和/或其他操作来修饰步骤340中收集的第二培养基，以使第二培养基对培养高等生物的细胞更有用。例如，如果异养发酵将被高浓度的铵离子抑制，则例如通过洗涤步骤从第二培养基中选择性地去除铵离子可能是有利的。乳酸也是如此。在一些实施方式中，第二培养基包含来自原始接种物的化能自养生物的细胞或其他。
从完全不包含葡萄糖、维生素、氨基酸或蛋白质的第一培养基开始，通过本文中所述的化能自养的方法生产的第二培养基包含每升超过1克的D-葡萄糖，以及大量的维生素B2、维生素B3、维生素B12、生物素、泛酸、谷氨酸、蛋氨酸和肽。异养的细菌、酵母(巴西仙草(Phaffia)、酵母属(Saccharomyces))，真菌(曲霉属)和细菌(乳杆菌属、杆菌属、双歧杆菌属、短波单胞菌属、埃希菌属)可以在未经修饰的第二培养基中培养，该培养基是通过培养化能自养的细菌而产生的。本发明的第二培养基也可以用作高等生物的更复杂的培养基制剂的基础或补充。
在任选步骤345中，第二培养基被接种具有更高生命形式的细胞。在第二培养基中培养细胞，直到收获细胞，或直至收获整个培养物，或直至从所得培养基中分离出其某些组分(例如重组蛋白)为止。这些微生物可以包括细菌、古细菌、微藻、真菌、霉菌、酵母或其他。此类微生物的实例包括：
子囊菌(Ascomycota)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillusoryzae)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroidesamylophilus)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、栖瘤胃拟杆菌(Bacteroidesruminocola)、猪拟杆菌(Bacteroides suis)、担子菌(Basidiomycota)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、短双歧杆菌(Bifidobacterum breve)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbruekii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、类谷糠乳杆菌(Lactobacillus parafarraginis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗特氏乳杆菌(Lactobacillus reuterii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、芽孢乳酸杆菌(Lactobacillus sporogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、薛氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、双乙酰乳酸链球菌(Streptococcus diacetylactis)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)。
实施例1：使用化能自养的细菌的气体发酵生产第二培养基
在该第一实施例中，使用经改良用于气体发酵的New Brunswick BioFlo 450030L连续搅拌罐生物反应器进行气体发酵。制备化能自养的和异养的菌种的接种物，使用钩虫贪铜菌、荚膜红细菌、深红红螺菌、类球红细菌、沼泽红假单胞菌作为化能自养的菌种，以及巨大芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的亚种casei作为异养的(益生菌)菌种。
为了制备接种物，从接种至15ml无菌Luria Bertani肉汤中的冷冻储备液培养细菌培养物，并在200rpm下摇动的温度控制的培养箱中于30℃下生长过夜，或直到培养物在620nm处达到0.6吸光度单位(au)的吸光度为止。将它们在化能自养的生长培养基中进一步培养，所述化能自养的生长培养基每升包含以下物质：
来自10x溶液的磷酸盐(PO4) 100ml
来自10x溶液的氯化铵(NH4Cl) 200ml
来自20g/200mL溶液的碳酸氢钠(NaHCO3) 2ml
来自100mM(NH4)2Ni(SO4)2.6H2O溶液4的镍 0.166ml
蒸馏水(diH2O) 674ml
将培养基灭菌后，添加以下无菌无机盐：
来自Schlegel方案‘E’的痕量元素 2mL
来自200g/L溶液5的CaCl2·2H2O 0.1ml
来自100x溶液6的MgSO4·7H2O 10ml
来自0.1g/100mL溶液的FeSO4·7H2O 12ml
许多上述成分是从浓度高得多的储备溶液中添加的。磷酸盐10x储备液是由40g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)和66.7g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)混合在1L diH2O中制备而成的。由18g NH4Cl混合在1L diH2O中制备氯化铵10x储备液。碳酸氢钠储备液是由20g NaHCO3混合在200mL diH2O中制备而成的。或者，可以通过100μL的100mM NiCl2提供镍。氯化钙可以由200g CaCl2·H2O在1L diH2O中提供；10,000x的浓缩储备液。最后，可以通过加入合适的来自含有113.05g MgSO4·7H2O的溶液的量的来制备硫酸镁；100x的浓缩储备液。
用～20L的培养基填满生物反应器，然后使用生物反应器的机载灭菌周期对培养基进行30分钟的灭菌，冷却至室温，然后添加剩余的无机盐。然后通过无菌端口添加联合接种物(consortial inocula)的各种组分。
氢气通过供应有超纯水的9kW Proton S40电解槽供应至生物反应器。O2和CO2由装有气体调节器的压缩气瓶提供，以将压力降至约20psi。通过一组三个质量流量控制器根据比例80:10:10(H2：CO2：O2)来控制气体混合。随着发酵的进行，进入生物反应器的气体流速从1-8SLPM增加。生物反应器内的气头压力为10psi。维持温度为30℃，pH为6.8，和叶轮搅拌速率为300rpm。
生物反应器在半连续收获模式下运行32天。每24小时，通过无菌端口去除10L的反应器内容物，并将相同体积的无菌新鲜培养基加回到生物反应器中。通过离心从富集培养基中分离出细菌生物质，然后冻干以备后用。剩余的上清液的等分试样通过无菌的一次性0.2μm过滤器过滤灭菌，并在-20℃下冷冻，从而得到“第二培养基”。
对来自发酵的第11天和第23天的第二培养基的冷冻样品进行废弃培养基分析，结果如下：
表2.来自化能自养的H2：CO2：O2气体发酵的第二培养基的分析
Figure BDA0002842351060000171
Figure BDA0002842351060000181
ND＝低于测定限
未列出的氨基酸低于测定限。
BCA蛋白测定法(Pierce)表明，第11天的样品还包含0.83g/L蛋白。用考马斯蓝染色法(Invitrogen)通过SDS-PAGE对蛋白质的分子量进行的分析表明，大多数蛋白质由小于约10kD的小分子量肽组成(未显示)。
通过离心将来自每个样品的细菌生物质从第二培养基分离并冻干以备后用(每收获一升约8g CDW)。收集现在无细胞的第二培养基并保存于4℃下。
实施例2：从气体发酵的第11天起在第二培养基上的短乳杆菌的异养培养
从实施例1中所述的发酵的第11天起，将异养生物短乳杆菌的冷冻储备液的细胞以1:50的比例接种至30ml的无菌第二培养基中。将这种接种物在250ml带挡板的培养瓶中，在28℃的温度控制的恒温箱中，在旋转振荡器上以100rpm的频率振荡。一个烧瓶不添加任何物质(“无葡萄糖”)，另外两个烧瓶包含与第一个烧瓶相同的第二培养基，但是分别另外含有0.5％(w/v)的葡萄糖和1.0％(w/v)的葡萄糖(高于第二培养基中已经存在的0.14％的水平)。在不同时间取出样品，并在酶标仪中测量200μL等分试样在620nm(A620)处的光密度。生长曲线在图4中示出。
图4的结果显示，在没有任何葡萄糖补充的情况下，异养的细菌在第二培养基上的密度增加了两倍以上。另外的葡萄糖刺激其生长超过该水平，特别是在0.5％添加的后期，尽管随着培养物变老，1％葡萄糖的有效性可能降低。这表明第二培养基可用于培养异养的细胞作为完全培养基或重要的培养基成分。该方法还可以有效地在气体上间接培养异养的细胞，从而利用它们在代谢上不适合的原料和培养条件。还可以从气体发酵产物中提取超过或高于原始提取的生物质的附加价值。
在前述说明书中，参考本发明的特定实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员将认识到本发明不限于此。上述发明的各种特征和方面可以单独或共同使用。此外，在不脱离本说明书的更广泛的精神和范围的情况下，本发明可以在本文所述之外的任何数量的环境和应用中使用。因此，说明书和附图被认为是说明性的而不是限制性的。将会认识到的是，本文所使用的术语“包含(comprising)”、“包括(including)”和“具有(having)”特别地旨在被解读为开放式的术语。

Claims (32)

1.一种方法，其包括：
向生物反应器提供基本培养基；
用包含化能自养的和/或光能自养的细胞的接种物接种所述生物反应器中的所述基本培养基；和
通过向所述生物反应器中提供气体输入化能自养地培养所述接种物以在所述生物反应器中生长生物质直到所述培养基中的所述生物质的细胞密度达到阈值，从而在所述培养期间将所述基本培养基富集成为富集培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述化能自养的细胞或光能自养的细胞产生生长因子、激素、抗生素、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、着色剂、类胡萝卜素、脂肪酸或油。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述接种物还包含异养的细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述接种物包含光能自养的细胞，并且所述培养是在所述生物反应器内不存在光的情况下进行的。
5.根据权利要求1-3或4所述的方法，其中培养所述接种物包括将有益分子加至所述富集培养基中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述有益分子包含葡萄糖。
7.根据权利要求1-5或6所述的方法，其中培养所述接种物包括调节所述富集培养基的pH。
8.根据权利要求1-6或7所述的方法，其中所述接种物包含化能自养的细胞，并且所述气体输入包含CH4和O2。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述化能自养的细胞包含荚膜甲基球菌的细胞。
10.根据权利要求1-6或7所述的方法，其中所述气体输入包含CO。
11.根据权利要求1-6或7所述的方法，其中所述气体输入包含CO2和H2S。
12.根据权利要求1-6或7所述的方法，其中所述气体输入包含CO2、H2和O2。
13.根据权利要求1-11或12所述的方法，其中所述接种物包含钩虫贪铜菌的细胞、荚膜红细菌的细胞或两者的细胞。
14.根据权利要求1-11或12所述的方法，其中所述接种物包含一氧化碳营养菌的细胞。
15.根据权利要求1-11或12所述的方法，其中所述接种物包含混浊红球菌的细胞。
16.根据权利要求1-14或15所述的方法，其进一步包括在用所述接种物接种所述基本培养基之前制备所述接种物。
17.根据权利要求1-15或16所述的方法，其进一步包括制备所述基本培养基。
18.根据权利要求1-16或17所述的方法，其进一步包括在用所述接种物接种所述基本培养基之前对所述基本培养基和所述生物反应器进行灭菌。
19.根据权利要求1-17或18所述的方法，其进一步包括破坏所述富集培养基中的细胞以将其内容物释放至所述富集培养基中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中破坏细胞包括裂解所述细胞。
21.根据权利要求1-19或20所述的方法，其中所述富集培养基包含生长因子、激素、抗生素、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、着色剂、类胡萝卜素、脂肪酸或油。
22.根据权利要求1-20或21所述的方法，其进一步包括从所述富集培养基中分离不溶性生物质。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述富集培养基在分离后包含每升至少1克的D-葡萄糖。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其进一步包括在分离后将一种或多种无机盐加至所述富集培养基中，调节所述富集培养基的pH，过滤所述富集培养基，向所述富集培养基提供酶处理，对所述富集培养基进行色谱分离，或从所述富集培养基进行选择性沉淀。
25.根据权利要求22、23或24所述的方法，其中从所述富集培养基中分离所述生物质包括离心、过滤或基于重力的分离。
26.根据权利要求22-24或25所述的方法，其进一步包括从所述富集培养基中去除铵离子。
27.根据权利要求22-25或26所述的方法，其进一步包括在从所述生物质分离的所述富集培养基中培养异养生物的细胞，从而耗尽所述富集培养基。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述异养生物包括酵母、真菌、藻类、古细菌、细菌或哺乳动物。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述异养生物的细胞源自多细胞水生生物的细胞系。
30.根据权利要求1-28或29所述的方法，其中所述基本培养基包含凝胶。
31.根据权利要求1-29或30所述的方法，其中将所述基本培养基与所述细胞的生长支持物一起添加至所述生物反应器。
32.一种富集培养基，其通过根据权利要求1-31中任一项所述的方法而产生。
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