JP6925169B2 - 有機酸産出促進剤、有機酸の製造方法及び培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、有機酸産出促進剤、有機酸の製造方法及び培養方法に関する。
生物が生体内で作る有機酸は様々であるが、その中でもコハク酸、乳酸はバイオプラスチックの原料や、食品、医薬品などの幅広い分野において合成原料として用いられている。コハク酸や乳酸は、主に石油を原料として化学的に合成されているが、化石資源の枯渇や地球温暖化の防止といった観点から、生物を利用した有機酸生産が注目を集めている。
また、Ｌ-グルタミン酸や、Ｌ-リジン等のＬ-アミノ酸は、これらのアミノ酸を生産するアミノ酸生産菌を用いて発酵法により工業的に生産されている。発酵法によるＬ-アミノ酸の工業的生産において、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖類が炭素源として用いられている。炭素源としての糖類は、サトウキビなどの植物に由来するものが用いられている。
細菌や藻類などの微生物を利用して、コハク酸、乳酸、アミノ酸などの有機酸を安定的に供給可能な生産系を確立できれば、培養時に二酸化炭素を吸収することで温室効果ガスの削減に寄与できるとともに、石油の消費量や、植物の使用量の削減が期待できる。
一方で、食糧、飼料、燃料等としての利用が有望視されている生物資源として、ユーグレナ（属名：Ｅｕｇｌｅｎａ、和名：ミドリムシ）が注目されている。
ユーグレナは、ビタミン，ミネラル，アミノ酸，不飽和脂肪酸など、人間が生きていくために必要な栄養素の大半に該当する５９種類もの栄養素を備え、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、必要な栄養素を摂取できない貧困地域での食糧供給源としての利用の可能性が提案されている。
ユーグレナは、ビタミン，ミネラル，アミノ酸，不飽和脂肪酸など、人間が生きていくために必要な栄養素の大半に該当する５９種類もの栄養素を備え、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、必要な栄養素を摂取できない貧困地域での食糧供給源としての利用の可能性が提案されている。
ユーグレナは、食物連鎖の第一次生産者に位置し、捕食者により捕食されることや、光、温度条件、撹拌速度などの培養条件が他の微生物に比べて難しいなどの理由から、大量培養が難しいとされてきたが、近年、大量培養技術が確立され、ユーグレナ及びユーグレナから抽出されるパラミロン等、ユーグレナ由来物質の大量供給の途が開かれた。そのため、大量供給可能となったユーグレナ及びユーグレナ由来物質の利用法の開発が望まれている。
ユーグレナを他の微生物と組み合わせて培養する技術の例として、ユーグレナ及びその培養抽出物が乳酸菌の生育を促進すること（特許文献１）や、ユーグレナとコバラミンを生産する乳酸菌の共培養により、両者の増殖が増加すること（非特許文献１）が知られているが、有用物質生産への応用など、様々な観点において検討の余地がある。
向田志保ら,「微細藻類Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓとコバラミンを生産する乳酸菌との共培養」,微細藻類バイオマス利用シンポジウム,Ｐ．２（２０１５年９月３日、中央大学後楽園キャンパス）
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出が促進される培地を用いて、これらの細菌を培養する工程を含む有機酸の製造方法及び細菌の培養方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出が促進される培地を用いて、これらの細菌を培養する工程を含む有機酸の製造方法及び細菌の培養方法を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究した結果、ユーグレナの培養上清又はユーグレナの細胞を含む培地を用いて、コリネ型細菌や藍藻を培養すると、細菌が産出する有機酸の産出が促進されることを見出した。
従って、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの培養上清を有効成分として含有し、グルコース無添加条件下で使用され、コリネ型細菌が産出するグルタミン酸、コハク酸及び乳酸からなる群より選択される一種以上の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの培養上清を有効成分として含有し、グルコース添加条件下で使用され、コリネ型細菌が産出するコハク酸又は乳酸の少なくとも一方の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの細胞を有効成分として含有し、グルコース無添加条件下で使用され、コリネ型細菌が産出するコハク酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの細胞を有効成分として含有し、グルコース添加条件下で使用され、コリネ型細菌が産出するグルタミン酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの培養上清を有効成分として含有し、藍藻が産出する乳酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの細胞を有効成分として含有し、藍藻が産出する乳酸又は酢酸の少なくとも一方の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの細胞を有効成分として含有し、グルコース添加条件下で使用され、コリネ型細菌が産出するグルタミン酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの培養上清を有効成分として含有し、藍藻が産出する乳酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナの細胞を有効成分として含有し、藍藻が産出する乳酸又は酢酸の少なくとも一方の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤により解決される。
本発明によれば、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤を提供することができる。
本発明の有機酸産出促進剤は、ユーグレナの培養上清を有効成分とする場合には、通常であれば廃液として処理されてしまう培養上清の有効利用が可能である。
さらに、本発明の有機酸の製造方法及び細菌の培養方法によれば、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出が促進される培地を用いているため、有機酸を効率よく得ることができる。
本発明の有機酸産出促進剤は、ユーグレナの培養上清を有効成分とする場合には、通常であれば廃液として処理されてしまう培養上清の有効利用が可能である。
さらに、本発明の有機酸の製造方法及び細菌の培養方法によれば、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出が促進される培地を用いているため、有機酸を効率よく得ることができる。
以下、本発明の実施形態について、図１乃至図１１を参照しながら説明する。
本実施形態は、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤、ユーグレナの培養上清又はユーグレナの細胞を含む培地を用いてコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌を培養する工程を行う有機酸の製造方法、及びコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌をユーグレナの培養上清を含む培地を用いて培養する工程を行う培養方法に関するものである。
本実施形態は、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤、ユーグレナの培養上清又はユーグレナの細胞を含む培地を用いてコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌を培養する工程を行う有機酸の製造方法、及びコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌をユーグレナの培養上清を含む培地を用いて培養する工程を行う培養方法に関するものである。
＜ユーグレナ＞
本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Ｅｕｇｌｅｎａｃｅａｅ）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Ｅｕｇｌｅｎａｃｅａｅ）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Ｅｕｇｌｅｎａ ｃｈａｄｅｆａｕｄｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｐｒｏｘｉｍａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｖｉｒｉｄｉｓなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ），特に、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のＥ. ｇｒａｃｉｌｉｓ ｖａｒ. ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Ａｓｔａｓｉａ ｌｏｎｇａ等のその他のユーグレナ類、及びそれらに由来するβ−１，３−グルカナーゼ等の物質であってもよい。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ），特に、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のＥ. ｇｒａｃｉｌｉｓ ｖａｒ. ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Ａｓｔａｓｉａ ｌｏｎｇａ等のその他のユーグレナ類、及びそれらに由来するβ−１，３−グルカナーゼ等の物質であってもよい。
ユーグレナ類は、池や沼などの淡水及び汽水、海水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ類を使用してもよい。
ユーグレナ類は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え，形質導入，形質転換等により得られたものも含有される。
ユーグレナ類は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え，形質導入，形質転換等により得られたものも含有される。
＜細菌＞
本実施形態において、ユーグレナの培養上清又はユーグレナの細胞を含む培地を用いて培養する細菌は、有機酸を産出する細菌、具体的には、コハク酸、乳酸、酢酸、アミノ酸（グルタミン酸、リジンなど）、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸などの有機酸を産出する細菌であり、好ましくはコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌である。
本実施形態において、ユーグレナの培養上清又はユーグレナの細胞を含む培地を用いて培養する細菌は、有機酸を産出する細菌、具体的には、コハク酸、乳酸、酢酸、アミノ酸（グルタミン酸、リジンなど）、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸などの有機酸を産出する細菌であり、好ましくはコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌である。
（コリネ型細菌）
本実施形態において、コリネ型細菌とは、好気性のグラム陽性かん菌であり、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物をいう（Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄ．，ｐｐ．５９９（１９７４））。
また、コリネ型細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、後にコリネバクテリウム属に統合された微生物（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．４１，ｐｐ．２５５（１９９１））が含まれ、コリネバクテリウム属細菌の類縁菌であるブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物も含まれる。
本実施形態において、コリネ型細菌とは、好気性のグラム陽性かん菌であり、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物をいう（Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄ．，ｐｐ．５９９（１９７４））。
また、コリネ型細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、後にコリネバクテリウム属に統合された微生物（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．４１，ｐｐ．２５５（１９９１））が含まれ、コリネバクテリウム属細菌の類縁菌であるブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物も含まれる。
コリネ型細菌として、以下に示す例が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
例えば、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アルバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、ブレビバクテリウム・セリヌム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｒｉｎｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）等が挙げられる。
例えば、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アルバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、ブレビバクテリウム・セリヌム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｒｉｎｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）等が挙げられる。
コリネ型細菌として、以下の菌株が例として挙げられるがこれらに限定されるものではない。
例えば、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０、１３８６９、コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８、ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＪ１２４１８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２０５）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２、ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２及びミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４などの株が挙げられる。
例えば、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０、１３８６９、コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８、ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＪ１２４１８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２０５）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２、ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２及びミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４などの株が挙げられる。
本実施形態におけるコリネ型細菌は、野生のコリネ型細菌を用いることができるが、これに限定されるものではなく、有機酸を効率よく産出するように改変されたコリネ型細菌を用いてもよい。改変は公知の方法で行うことができ、例えば、遺伝子組換えにより改変することができる。そのようなコリネ型細菌として、例えば、有機酸を産出する酵素を過剰発現したものが挙げられる。
（藍藻）
本実施形態において、藍藻とは、藍色細菌（シアノバクテリア）とも呼ばれる真正細菌の１群であり、光合成によって酸素を生み出すという特徴を有する。単細胞で浮遊するもの、少数細胞の集団を作るもの、糸状に細胞が並んだ構造を持つものなどがあり、特に制限されないが、単細胞のものが好ましい。
本実施形態において、藍藻とは、藍色細菌（シアノバクテリア）とも呼ばれる真正細菌の１群であり、光合成によって酸素を生み出すという特徴を有する。単細胞で浮遊するもの、少数細胞の集団を作るもの、糸状に細胞が並んだ構造を持つものなどがあり、特に制限されないが、単細胞のものが好ましい。
藍藻として、以下に示す例が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
例えば、藍藻として、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、ミクロシスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属、シアノテセ（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、グロイオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属、アカリオクロリス（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）属、トリコデスミウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）属、プロクロロン（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ）属、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属等が挙げられる。
例えば、藍藻として、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、ミクロシスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属、シアノテセ（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、グロイオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属、アカリオクロリス（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）属、トリコデスミウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）属、プロクロロン（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ）属、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）属等が挙げられる。
藍藻として、以下の菌株が例として挙げられるがこれらに限定されるものではない。
シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６８０３、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ７５０９、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６７１４、シネココッカス・エスピー ＰＣＣ７９４２、サーモシネココッカス・エロンガタス ＢＰ−１、トリコデスミウム・エリスラエウム ＩＭＳ１０１、アカリオクロリス・マリアナ ＭＢＩＣ１１０１７、クロコスファエラ・ワトソニー ＷＨ８５０１、及びアナベナ・エスピー ＰＣＣ７１２０等などの株が挙げられる。
その中でも、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６８０３、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６７１４、及びシネコシスティス・エスピー ＰＣＣ７５０９を用いることが好ましく、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６８０３を用いることが特に好ましい。
シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６８０３、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ７５０９、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６７１４、シネココッカス・エスピー ＰＣＣ７９４２、サーモシネココッカス・エロンガタス ＢＰ−１、トリコデスミウム・エリスラエウム ＩＭＳ１０１、アカリオクロリス・マリアナ ＭＢＩＣ１１０１７、クロコスファエラ・ワトソニー ＷＨ８５０１、及びアナベナ・エスピー ＰＣＣ７１２０等などの株が挙げられる。
その中でも、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６８０３、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６７１４、及びシネコシスティス・エスピー ＰＣＣ７５０９を用いることが好ましく、シネコシスティス・エスピー ＰＣＣ６８０３を用いることが特に好ましい。
本実施形態における藍藻は、野生の藍藻を用いることができるが、これに限定されるものではなく、有機酸を効率よく産出するように改変された藍藻を用いてもよい。改変は公知の方法で行うことができ、例えば、遺伝子組換えにより改変することができる。そのような藍藻として、例えば、有機酸を産出する酵素を過剰発現したものが挙げられる。
＜ユーグレナの培養上清・ユーグレナ細胞＞
本実施形態では、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌を培養する際に、細菌が産出する有機酸の産出を促進するためにユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を用いる。
ここで、「ユーグレナの培養上清」とは、ユーグレナを培養した後の培養液の上清をいい、遠心分離等の公知の分離手段によってユーグレナ細胞を除去した培養液の上清を意味する。
「ユーグレナ細胞」とは、ユーグレナの細胞をいい、ユーグレナの生細胞及びユーグレナの死細胞の両方が含まれる。なお、「ユーグレナ細胞」には、ユーグレナ細胞の破砕物や、ユーグレナ細胞の抽出物などは含まれない。
本実施形態では、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌を培養する際に、細菌が産出する有機酸の産出を促進するためにユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を用いる。
ここで、「ユーグレナの培養上清」とは、ユーグレナを培養した後の培養液の上清をいい、遠心分離等の公知の分離手段によってユーグレナ細胞を除去した培養液の上清を意味する。
「ユーグレナ細胞」とは、ユーグレナの細胞をいい、ユーグレナの生細胞及びユーグレナの死細胞の両方が含まれる。なお、「ユーグレナ細胞」には、ユーグレナ細胞の破砕物や、ユーグレナ細胞の抽出物などは含まれない。
本実施形態のユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を調製する際のユーグレナの培養は、以下に示す培養条件で行うことが出来るが、以下の条件に限定されるものではない。
・培地の種類
ユーグレナ細胞の培養は、培養液を用いて行うことができる。培養液には栄養源として炭素源が添加されるが、炭素源には無機炭素源（ＣＯ２、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等）と有機炭素源（グルコース等）がある。本実施形態において用いられる培養液としては、栄養源としてグルコースなどの有機炭素源を含まない独立栄養培地を用いることが好ましいがこれに限定されるものではない。例えば、窒素源、リン源、ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地や、改変Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／ｌ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，Ｆｅ２（ＳＯ２）３・７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／ｌ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １．８ｍｇ／ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．５ｍｇ／ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｍｇ／ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１） ０．１ｍｇ／ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、（ＮＨ４）２ＳＯ４やＮＨ３ａｑに変換することも可能である。
ユーグレナ細胞の培養は、培養液を用いて行うことができる。培養液には栄養源として炭素源が添加されるが、炭素源には無機炭素源（ＣＯ２、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等）と有機炭素源（グルコース等）がある。本実施形態において用いられる培養液としては、栄養源としてグルコースなどの有機炭素源を含まない独立栄養培地を用いることが好ましいがこれに限定されるものではない。例えば、窒素源、リン源、ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地や、改変Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／ｌ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，Ｆｅ２（ＳＯ２）３・７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／ｌ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １．８ｍｇ／ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．５ｍｇ／ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｍｇ／ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１） ０．１ｍｇ／ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、（ＮＨ４）２ＳＯ４やＮＨ３ａｑに変換することも可能である。
・培地のｐＨ
培養液のｐＨは好ましくは２以上、また、その上限は、好ましくは６以下、より好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制することができる。
培養中にｐＨ調整を行うことも可能である。ｐＨ調整には、適当な無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を使用することができる。
培養液のｐＨは好ましくは２以上、また、その上限は、好ましくは６以下、より好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制することができる。
培養中にｐＨ調整を行うことも可能である。ｐＨ調整には、適当な無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を使用することができる。
・培養温度
培養温度は、通常１５〜４０℃であり、２０〜３４℃であることが好ましく、特に２３〜２８℃であることが好適である。
培養温度は、通常１５〜４０℃であり、２０〜３４℃であることが好ましく、特に２３〜２８℃であることが好適である。
・培養期間
培養条件にもよるが、ユーグレナは通常、培養開始後２〜１４日で対数増殖期となり、１５〜２１日程度で定常期に到達する。本実施形態において、培養期間は、４〜３０日であることが好ましく、４〜１４日であることがより好ましいが、これに限定されるものではない。
培養条件にもよるが、ユーグレナは通常、培養開始後２〜１４日で対数増殖期となり、１５〜２１日程度で定常期に到達する。本実施形態において、培養期間は、４〜３０日であることが好ましく、４〜１４日であることがより好ましいが、これに限定されるものではない。
・暗・嫌気培養
本実施形態のユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を調製する際には、暗・嫌気条件で培養を行うこと、つまり暗・嫌気培養を行うことが好ましい。
暗条件とは、光照射を行うことなく、光を遮った条件のことをいう。
嫌気培養とは、培養液中の溶存酸素濃度を低くした状態で培養を行うことをいう。嫌気条件とするために、窒素ガス等の不活性ガスを供給して培養を行う、またはＣＯ２などの不活性ガスを通気しながら培養を行う等の方法を用いることができる。なお、嫌気条件とするために用いる窒素ガスは、培養系から酸素を除くために用いられるものであり、ユーグレナや細菌が窒素源として資化するために用いられるものではない。
本実施形態のユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を調製する際には、暗・嫌気条件で培養を行うこと、つまり暗・嫌気培養を行うことが好ましい。
暗条件とは、光照射を行うことなく、光を遮った条件のことをいう。
嫌気培養とは、培養液中の溶存酸素濃度を低くした状態で培養を行うことをいう。嫌気条件とするために、窒素ガス等の不活性ガスを供給して培養を行う、またはＣＯ２などの不活性ガスを通気しながら培養を行う等の方法を用いることができる。なお、嫌気条件とするために用いる窒素ガスは、培養系から酸素を除くために用いられるものであり、ユーグレナや細菌が窒素源として資化するために用いられるものではない。
・ユーグレナの培養上清の回収
上記の培養条件でユーグレナを培養した後、遠心分離等の公知の分離手段を用いて、培養液上清の回収を行うが、ユーグレナの培養上清を適切に回収できる方法であれば特に限定されるものではない。
上記の培養条件でユーグレナを培養した後、遠心分離等の公知の分離手段を用いて、培養液上清の回収を行うが、ユーグレナの培養上清を適切に回収できる方法であれば特に限定されるものではない。
・ユーグレナ細胞の回収
上記の培養条件でユーグレナを培養した後、ユーグレナ細胞の回収を行う。ユーグレナ細胞の回収は、培養後の培養液を含む状態で回収する方法や、公知の分離手段を用いる方法が例として挙げられる。培養後の培養液を含む状態でユーグレナ細胞を生細胞の状態で回収することが好ましいが、これに限定されるものではない。
上記の培養条件でユーグレナを培養した後、ユーグレナ細胞の回収を行う。ユーグレナ細胞の回収は、培養後の培養液を含む状態で回収する方法や、公知の分離手段を用いる方法が例として挙げられる。培養後の培養液を含む状態でユーグレナ細胞を生細胞の状態で回収することが好ましいが、これに限定されるものではない。
＜有機酸産出促進剤＞
本実施形態に係る有機酸産出促進剤は、ユーグレナの培養上清又はユーグレナの細胞を有効成分として含有する。
本実施形態に係る有機酸産出促進剤は、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出を促進するために用いられるものであり、これらの細菌を培養する培地に添加されるものである。
本実施形態に係る有機酸産出促進剤は、ユーグレナの培養上清又はユーグレナの細胞を有効成分として含有する。
本実施形態に係る有機酸産出促進剤は、コリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌が産出する有機酸の産出を促進するために用いられるものであり、これらの細菌を培養する培地に添加されるものである。
ここで、「有機酸の産出を促進する」とは、本実施形態に係る有機酸産出促進剤を用いて前記細菌を培養した場合に細菌が産出する有機酸の量が、本実施形態に係る有機酸産出促進剤を用いずに前記細菌を培養した場合に細菌が産出する有機酸と比較して増えることをいう。
＜有機酸の製造方法＞
本実施形態のユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を用いた有機酸の製造方法は、ユーグレナを培養してユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を得る工程と、前記ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を含む培地を用いてコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌を培養する工程と、前記培地から有機酸を回収する工程と、を行うことを特徴とする有機酸の製造方法である。
以下、各工程について詳細に説明する。
本実施形態のユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を用いた有機酸の製造方法は、ユーグレナを培養してユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を得る工程と、前記ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を含む培地を用いてコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌を培養する工程と、前記培地から有機酸を回収する工程と、を行うことを特徴とする有機酸の製造方法である。
以下、各工程について詳細に説明する。
（ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を得る工程）
ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を得る工程では、上記ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞の調製において示した培養条件でユーグレナを培養する（ステップＳ１）。
ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を得る工程では、上記ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞の調製において示した培養条件でユーグレナを培養する（ステップＳ１）。
（細菌を培養する工程）
細菌を培養する工程では、前記ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を含む培地を用いてコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌を培養する（ステップＳ２）。
ここで、ユーグレナ細胞を含む培地を用いて細菌を培養することを「共培養」という。
細菌を培養する工程は、例えば、以下に示す培養条件で行うことが出来るが、以下の条件に限定されるものではない。
細菌を培養する工程では、前記ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を含む培地を用いてコリネ型細菌及び藍藻を含む群より選択される一種以上の細菌を培養する（ステップＳ２）。
ここで、ユーグレナ細胞を含む培地を用いて細菌を培養することを「共培養」という。
細菌を培養する工程は、例えば、以下に示す培養条件で行うことが出来るが、以下の条件に限定されるものではない。
・培地の種類
有機酸を産出する細菌の培養は、ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を含む培養液を用いて行うことができる。培養液には栄養源として炭素源が添加されるが、炭素源には無機炭素源（ＣＯ２、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等）と有機炭素源（グルコース等）がある。本実施形態において用いられる培養液としては、栄養源としてグルコースなどの有機炭素源を含まない独立栄養培地を用いることが好ましいがこれに限定されるものではない。
コリネ型細菌の培養には、ＬＢ培地を用いて好気培養を行ったのち、ＨＥＰＥＳバッファーにユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を添加した培地を用いて暗・嫌気培養を行うことが好ましく、また、藍藻の培養には、ＢＧ-１１培地を用いて好気培養を行ったのち、ＨＥＰＥＳバッファーにユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を添加した培地を用いて暗・嫌気培養を行うことが好ましいが、用いる培地はこれらの培地に限定されるものではない。また、暗・嫌気培養時の培養は、ＨＥＰＥＳバッファーに限定されるものではない。
有機酸を産出する細菌の培養は、ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を含む培養液を用いて行うことができる。培養液には栄養源として炭素源が添加されるが、炭素源には無機炭素源（ＣＯ２、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等）と有機炭素源（グルコース等）がある。本実施形態において用いられる培養液としては、栄養源としてグルコースなどの有機炭素源を含まない独立栄養培地を用いることが好ましいがこれに限定されるものではない。
コリネ型細菌の培養には、ＬＢ培地を用いて好気培養を行ったのち、ＨＥＰＥＳバッファーにユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を添加した培地を用いて暗・嫌気培養を行うことが好ましく、また、藍藻の培養には、ＢＧ-１１培地を用いて好気培養を行ったのち、ＨＥＰＥＳバッファーにユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を添加した培地を用いて暗・嫌気培養を行うことが好ましいが、用いる培地はこれらの培地に限定されるものではない。また、暗・嫌気培養時の培養は、ＨＥＰＥＳバッファーに限定されるものではない。
・培地のｐＨ
培養液のｐＨは、細菌の増殖及び有機酸の産出に適した任意のｐＨ、例えば、ｐＨ５〜１０であればよく、ｐＨ６〜９であることが好ましく、ｐＨ６〜８であることがより好ましい。ｐＨ調整には、適当な無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を使用することができる。
培養液のｐＨは、細菌の増殖及び有機酸の産出に適した任意のｐＨ、例えば、ｐＨ５〜１０であればよく、ｐＨ６〜９であることが好ましく、ｐＨ６〜８であることがより好ましい。ｐＨ調整には、適当な無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を使用することができる。
・培養温度
培養温度は、細菌の増殖及び有機酸の産出に適した温度、例えば、通常１５〜４０℃であり、２０〜３４℃であることが好ましく、特に２８〜３０℃であることが好適である。
培養温度は、細菌の増殖及び有機酸の産出に適した温度、例えば、通常１５〜４０℃であり、２０〜３４℃であることが好ましく、特に２８〜３０℃であることが好適である。
・培養期間
培養期間は、有機酸が十分に産出される期間であれば特に限定されず、例えば、２〜３０日、好ましくは３〜１４日、特に好ましくは４〜５日であればよい。
培養期間は、有機酸が十分に産出される期間であれば特に限定されず、例えば、２〜３０日、好ましくは３〜１４日、特に好ましくは４〜５日であればよい。
・暗・嫌気培養
細菌の培養を行う際には、暗・嫌気条件で培養を行うこと、つまり暗・嫌気培養を行うことが好ましい。
暗条件とは、光照射を行うことなく、光を遮った条件のことをいう。
嫌気培養とは、培養液中の溶存酸素濃度を低くした状態で培養を行うことをいう。嫌気条件とするために、窒素ガス等の不活性ガスを供給して培養を行う、またはＣＯ２などの不活性ガスを通気しながら培養を行う等の方法を用いることができる。なお、嫌気条件とするために用いる窒素ガスは、培養系から酸素を除くために用いられるものであり、ユーグレナや細菌が窒素源として資化するために用いられるものではない。
細菌の培養を行う際には、暗・嫌気条件で培養を行うこと、つまり暗・嫌気培養を行うことが好ましい。
暗条件とは、光照射を行うことなく、光を遮った条件のことをいう。
嫌気培養とは、培養液中の溶存酸素濃度を低くした状態で培養を行うことをいう。嫌気条件とするために、窒素ガス等の不活性ガスを供給して培養を行う、またはＣＯ２などの不活性ガスを通気しながら培養を行う等の方法を用いることができる。なお、嫌気条件とするために用いる窒素ガスは、培養系から酸素を除くために用いられるものであり、ユーグレナや細菌が窒素源として資化するために用いられるものではない。
・培養方式及び培養装置
細菌の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行ってもよい。
また、細菌の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。
培養は、オープンポンド型、レースウェイ型、チューブ型等の公知の培養装置や、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどの実験用の培養容器を用いて行うことができる。
細菌の培養は、静置培養法、振盪培養法のいずれの方法によって行ってもよい。
各種培養の条件は、培養を通じて一定であってもよいが、有機酸の産出量を向上させるために、培養期間に応じて各種培養条件を変化させることも可能である。
細菌の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行ってもよい。
また、細菌の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。
培養は、オープンポンド型、レースウェイ型、チューブ型等の公知の培養装置や、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどの実験用の培養容器を用いて行うことができる。
細菌の培養は、静置培養法、振盪培養法のいずれの方法によって行ってもよい。
各種培養の条件は、培養を通じて一定であってもよいが、有機酸の産出量を向上させるために、培養期間に応じて各種培養条件を変化させることも可能である。
（有機酸を回収する工程）
有機酸を回収する工程では、前記細菌を培養する工程で得られる培養物（培養系）から有機酸を回収する工程を行う（ステップＳ３）。
ここで、本工程における「培養物（培養系）」は、培地、ユーグレナ細胞、コリネ型細菌の細胞、藍藻の細胞、有機酸等の産出物を含む概念である。従って、「培養物（培養系）から有機酸を回収する」とは、ユーグレナ細胞や細菌細胞を除去した培地から有機酸を回収することや、ユーグレナ細胞や細菌細胞を含む培地から有機酸を回収すること、培養後のユーグレナ細胞や細菌細胞から有機酸を回収することを含む概念である。
回収される有機酸は、乳酸（Ｄ型−乳酸）、コハク酸、及びアミノ酸（グルタミン酸、リジンなど）を含む群より選択される一種以上である。
有機酸を回収する工程では、前記細菌を培養する工程で得られる培養物（培養系）から有機酸を回収する工程を行う（ステップＳ３）。
ここで、本工程における「培養物（培養系）」は、培地、ユーグレナ細胞、コリネ型細菌の細胞、藍藻の細胞、有機酸等の産出物を含む概念である。従って、「培養物（培養系）から有機酸を回収する」とは、ユーグレナ細胞や細菌細胞を除去した培地から有機酸を回収することや、ユーグレナ細胞や細菌細胞を含む培地から有機酸を回収すること、培養後のユーグレナ細胞や細菌細胞から有機酸を回収することを含む概念である。
回収される有機酸は、乳酸（Ｄ型−乳酸）、コハク酸、及びアミノ酸（グルタミン酸、リジンなど）を含む群より選択される一種以上である。
有機酸を回収する工程には、適当な分離方法（例えば、遠心分離や、濾過、有機溶剤による抽出工程、高速液体クロマトグラフィーなどの組み合わせ）により有機酸を分離して得る分離工程や、適切な分離カラムや再結晶によって有機酸を精製する精製工程が含まれる。
予め用意したユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を用いて、細菌の培養を行う場合、ユーグレナの培養上清又はユーグレナ細胞を得る工程を省略することもできる。
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の試験例では、ユーグレナの培養上清（嫌気上清）（実施例１）又はユーグレナ細胞（実施例２）を添加した培地を用いて細菌の培養を行い、細菌の有機酸産出に対する影響の検討を行った。
以下の試験例では、ユーグレナの培養上清（嫌気上清）（実施例１）又はユーグレナ細胞（実施例２）を添加した培地を用いて細菌の培養を行い、細菌の有機酸産出に対する影響の検討を行った。
＜実施例１＞
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリスＺ株（ＮＩＥＳ−４８株）を用い、独立栄養培地である改変ＣＭ培地を使用し、ｐＨを３.５に調整した。具体的には、脱イオン水（ＤＷ）を用いて、表１に示す組成の改変ＣＭ培地を作製し、硫酸を用いてｐＨ３.５に調整してからオートクレーブで滅菌した。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリスＺ株（ＮＩＥＳ−４８株）を用い、独立栄養培地である改変ＣＭ培地を使用し、ｐＨを３.５に調整した。具体的には、脱イオン水（ＤＷ）を用いて、表１に示す組成の改変ＣＭ培地を作製し、硫酸を用いてｐＨ３.５に調整してからオートクレーブで滅菌した。
調製した培地１Ｌを１Ｌ容量のメジューム瓶に入れた後、初期濃度がＯＤ７３０＝０.１になるようにユーグレナ・グラシリスの種藻体を接種し、添加した。
１ｖｏｌ％濃度でＣＯ２を混合した空気を３０〜５０ｍｌ／分の流量で通気し、光源として白色蛍光灯（三菱電機照明株式会社製、ネオルミスーパー、ＦＬＲ４０ＳＷ）を用い、培養液水面に注ぐ光が５０〜８０μＥ／ｍ２・秒の強度となるように調節し、培養を行った。光の照射時間は、屋外の昼夜条件に近づけるため、１２時間点灯後に１２時間消灯する明暗サイクルとした。
培養温度２５℃で１２〜２０日間培養を行った。
培養温度２５℃で１２〜２０日間培養を行った。
培養液からのユーグレナ細胞の回収は、５０ｍＬプラスチックチューブに培養液を加え、５８００×ｇで２分間の遠心を繰り返し、上清を捨てることで行った。その後、嫌気培養を行った。ユーグレナ細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）緩衝液１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で４日間振盪培養した。
＜実施例２＞
ユーグレナの細胞として、ユーグレナ（ユーグレナ・グラシリスＺ株：ＮＩＥＳ−４８株）を用いた。ユーグレナの前培養は、表１に示す組成のＣＭ培地を用い、好気条件、２５℃で７〜２０日間培養した。
ユーグレナの細胞として、ユーグレナ（ユーグレナ・グラシリスＺ株：ＮＩＥＳ−４８株）を用いた。ユーグレナの前培養は、表１に示す組成のＣＭ培地を用い、好気条件、２５℃で７〜２０日間培養した。
＜比較例１＞
比較例１として、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）緩衝液を調製した。ここで、ＨＥＰＥＳは、４-（２-ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄの略称である。
比較例１として、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）緩衝液を調製した。ここで、ＨＥＰＥＳは、４-（２-ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄの略称である。
＜有機酸の定量方法＞
Ｌ−グルタミン酸の定量は、グルタミン酸測定キット（Ｆ−キット、Ｌ−グルタミン酸、Ｒｏｃｈｅ／Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ社製）を用いて行った（ＯＤ４９２を測定）。
コハク酸、乳酸及び酢酸の定量は、培養液を遠心分離にかけることで細胞を分離し、０．４５μｍフィルターで濾過をしながら上清１ｍｌを新しいチューブに移して、凍結乾燥によって内容物を固化させた。これを過塩素酸に懸濁し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、分析した。定量は、ブロモチモールブルーを用いたポストラベル法によって行った。
Ｌ−グルタミン酸の定量は、グルタミン酸測定キット（Ｆ−キット、Ｌ−グルタミン酸、Ｒｏｃｈｅ／Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ社製）を用いて行った（ＯＤ４９２を測定）。
コハク酸、乳酸及び酢酸の定量は、培養液を遠心分離にかけることで細胞を分離し、０．４５μｍフィルターで濾過をしながら上清１ｍｌを新しいチューブに移して、凍結乾燥によって内容物を固化させた。これを過塩素酸に懸濁し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、分析した。定量は、ブロモチモールブルーを用いたポストラベル法によって行った。
＜試験１ ユーグレナの培養上清を用いたコリネバクテリアの培養＞
試験１では、コリネバクテリアとしてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２株（住商インターナショナルより入手）を用い、実施例１のユーグレナの培養上清を添加した培地にて培養を行った。また、比較のために、比較例１の緩衝液を用いてコリネバクテリアの培養を行った。
試験１では、コリネバクテリアとしてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２株（住商インターナショナルより入手）を用い、実施例１のユーグレナの培養上清を添加した培地にて培養を行った。また、比較のために、比較例１の緩衝液を用いてコリネバクテリアの培養を行った。
（コリネバクテリアの前培養）
コリネバクテリアを２５０ｍｌのＬＢ培地を用い、暗・好気条件、３０℃で１日培養した。ＬＢ培地は、表２に示す組成のＬＢ培地を作製し、これを水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７に調整し、加熱滅菌して調製した。
コリネバクテリアを２５０ｍｌのＬＢ培地を用い、暗・好気条件、３０℃で１日培養した。ＬＢ培地は、表２に示す組成のＬＢ培地を作製し、これを水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７に調整し、加熱滅菌して調製した。
（ユーグレナの培養上清を用いたコリネバクテリアの本培養）
前培養したコリネバクテリアを実施例１のユーグレナの培養上清１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で４日間振盪培養した。
前培養したコリネバクテリアを実施例１のユーグレナの培養上清１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で４日間振盪培養した。
（緩衝液を用いたコリネバクテリアの本培養）
前培養したコリネバクテリアを比較例１の緩衝液１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で４日間振盪培養した。
前培養したコリネバクテリアを比較例１の緩衝液１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で４日間振盪培養した。
（試験１の結果）
結果を図１乃至４に示す。
図１乃至４において、「ＮＩＥＳ−４８上清」は実施例１のユーグレナの培養上清であり、「ＡＴＣＣ１３０３２」は比較例１の緩衝液を用いて培養を行った後の培養上清であり、「ＡＴＣＣ１３０３２＋ＮＩＥＳ−４８上清」は実施例１のユーグレナの培養上清を用いて培養を行った後の培養上清である。
結果を図１乃至４に示す。
図１乃至４において、「ＮＩＥＳ−４８上清」は実施例１のユーグレナの培養上清であり、「ＡＴＣＣ１３０３２」は比較例１の緩衝液を用いて培養を行った後の培養上清であり、「ＡＴＣＣ１３０３２＋ＮＩＥＳ−４８上清」は実施例１のユーグレナの培養上清を用いて培養を行った後の培養上清である。
図１に示すように、グルコースを添加しない場合、ユーグレナの培養上清を培養液に用いることによって、緩衝液を培養液に用いた場合と比較して、グルタミン酸が相加的以上に増加することがわかった。一方、図２に示すように、グルコースを添加した場合、ユーグレナの培養上清を培養液に用いても、グルタミン酸が相加的以上に増加することはなかった。
図３及び４に示すように、グルコースを添加した場合、及びグルコースを添加しない場合の両方で、ユーグレナの培養上清を培養液に用いることによって、コハク酸、乳酸が相加的以上に増加することがわかった。なお、図３及び４では、ユーグレナの培養上清に含まれていたコハク酸、乳酸を差し引いた値を示している。
＜試験２ ユーグレナの培養上清を用いた藍藻の培養＞
試験２では、藍藻としてシネコシスティスの野生株（ＧＴ株）を用い、実施例１のユーグレナの培養上清を添加した培地にて培養を行った。また、比較のために、比較例１の緩衝液を用いて藍藻の培養を行った。
試験２では、藍藻としてシネコシスティスの野生株（ＧＴ株）を用い、実施例１のユーグレナの培養上清を添加した培地にて培養を行った。また、比較のために、比較例１の緩衝液を用いて藍藻の培養を行った。
（藍藻の前培養）
藍藻を７０ｍｌのＢＧ−１１培地を用い、明・好気条件、３０℃で３日培養した。ＢＧ−１１培地の組成を表３に示す。
藍藻を７０ｍｌのＢＧ−１１培地を用い、明・好気条件、３０℃で３日培養した。ＢＧ−１１培地の組成を表３に示す。
（ユーグレナの培養上清を用いた藍藻の本培養）
前培養した藍藻を実施例１のユーグレナの培養上清１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で３日間振盪培養した。
前培養した藍藻を実施例１のユーグレナの培養上清１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で３日間振盪培養した。
（緩衝液を用いたコリネバクテリアの本培養）
前培養した藍藻を、ＮａＨＣＯ３を添加した比較例１の緩衝液１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。ＮａＨＣＯ３濃度が１００ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で４日間振盪培養した。
前培養した藍藻を、ＮａＨＣＯ３を添加した比較例１の緩衝液１０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。ＮａＨＣＯ３濃度が１００ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で４日間振盪培養した。
（試験２の結果）
結果を図５に示す。
図５において、「ＧＴ」は比較例１の緩衝液を用いて培養を行った後の培養上清であり、「ＧＴ＋ＮＩＥＳ−４８上清」は実施例１のユーグレナの培養上清を用いて培養を行った後の培養上清である。
結果を図５に示す。
図５において、「ＧＴ」は比較例１の緩衝液を用いて培養を行った後の培養上清であり、「ＧＴ＋ＮＩＥＳ−４８上清」は実施例１のユーグレナの培養上清を用いて培養を行った後の培養上清である。
図５に示すように、ユーグレナの培養上清を培養液に用いることによって、緩衝液を培養液に用いた場合と比較して、乳酸が増加することがわかった。
この結果から、藍藻の乳酸生産も、ユーグレナの培養上清によって促進されることがわかった。なお、図５では、ユーグレナの培養上清に含まれていた乳酸を差し引いた値を示している。
この結果から、藍藻の乳酸生産も、ユーグレナの培養上清によって促進されることがわかった。なお、図５では、ユーグレナの培養上清に含まれていた乳酸を差し引いた値を示している。
＜試験３ コリネバクテリアとユーグレナの共培養＞
試験３では、コリネバクテリアとしてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２株（住商インターナショナルより入手）を用い、実施例２のユーグレナの細胞を添加した培地にて共培養を行った。また、比較のために、比較例１の緩衝液を用いてコリネバクテリア又はユーグレナの培養を行った。
試験３では、コリネバクテリアとしてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２株（住商インターナショナルより入手）を用い、実施例２のユーグレナの細胞を添加した培地にて共培養を行った。また、比較のために、比較例１の緩衝液を用いてコリネバクテリア又はユーグレナの培養を行った。
（コリネバクテリアの前培養）
コリネバクテリアを２５０ｍｌのＬＢ培地を用い、好気条件、３０℃で１日培養した。
コリネバクテリアを２５０ｍｌのＬＢ培地を用い、好気条件、３０℃で１日培養した。
（ユーグレナ細胞を用いたコリネリバクテリアの共培養）
前培養したコリネバクテリア及び実施例２のユーグレナ細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０、ＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で４日間振盪培養した。
前培養したコリネバクテリア及び実施例２のユーグレナ細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０、ＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で４日間振盪培養した。
（緩衝液を用いたコリネバクテリアの単独培養）
前培養したコリネバクテリアを比較例１の緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で４日間振盪培養した。
前培養したコリネバクテリアを比較例１の緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で４日間振盪培養した。
（緩衝液を用いたユーグレナの単独培養）
実施例２のユーグレナ細胞を比較例１の緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で４日間振盪培養した。
実施例２のユーグレナ細胞を比較例１の緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。グルコース添加条件では、グルコース濃度が１０ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で４日間振盪培養した。
（試験３の結果）
結果を図６乃至８に示す。
図６乃至８において、「ＡＴＣＣ１３０３２」は比較例１の緩衝液を用いてコリネバクテリアの単独培養を行った後の培養上清であり、「ＮＩＥＳ−４８」は比較例１の緩衝液を用いてユーグレナの単独培養を行った後の培養上清であり、「共培養」はコリネバクテリアを実施例２のユーグレナと共培養した後の培養上清である。
結果を図６乃至８に示す。
図６乃至８において、「ＡＴＣＣ１３０３２」は比較例１の緩衝液を用いてコリネバクテリアの単独培養を行った後の培養上清であり、「ＮＩＥＳ−４８」は比較例１の緩衝液を用いてユーグレナの単独培養を行った後の培養上清であり、「共培養」はコリネバクテリアを実施例２のユーグレナと共培養した後の培養上清である。
図６に示すように、培養温度３０℃で、グルコースを添加しない場合、コリネバクテリアをユーグレナと共培養することによって、それぞれを単独で培養した場合と比較して、コハク酸が相加的以上に増加することがわかった。一方、図６に示すように、培養温度３０℃で、グルコースを添加した場合、コリネバクテリアをユーグレナと共培養しても、コハク酸が相加的以上に増加することはなかった。この結果は、培養温度が３７℃でも同じであった。
図７に示すように、培養温度３０℃で、グルコースを添加しない場合、コリネバクテリアをユーグレナと共培養しても、それぞれを単独で培養した場合と比較して、乳酸が相加的以上に増加することはなかった。また、図７に示すように、培養温度３０℃で、グルコースを添加した場合にも、コリネバクテリアをユーグレナと共培養しても、乳酸が相加的以上に増加することはなかった。この結果は、培養温度が３７℃でも同じであった。
本データでは、ユーグレナが乳酸を産出していることが示唆されており、ユーグレナが乳酸を産出しない条件（グルコースを添加しない嫌気条件）では、コリネバクテリアをユーグレナと共培養することで、乳酸が相加的以上に増加することがわかった。
本データでは、ユーグレナが乳酸を産出していることが示唆されており、ユーグレナが乳酸を産出しない条件（グルコースを添加しない嫌気条件）では、コリネバクテリアをユーグレナと共培養することで、乳酸が相加的以上に増加することがわかった。
図８に示すように、培養温度３０℃で、グルコースを添加した場合、コリネバクテリアをユーグレナと共培養することによって、それぞれを単独で培養した場合と比較して、グルタミン酸が相加的以上に増加することがわかった。一方、図８に示すように、培養温度３０℃で、グルコースを添加しない場合、コリネバクテリアをユーグレナと共培養しても、グルタミン酸が相加的以上に増加することはなかった。この結果は、培養温度が３７℃でも同じであった。
＜試験４ 藍藻ユーグレナの共培養＞
試験４では、藍藻としてシネコシスティスの野生株（ＧＴ株）を用い、実施例２のユーグレナの細胞を添加した培地にて共培養を行った。また、比較のために、比較例１の緩衝液を用いて藍藻又はユーグレナの培養を行った。
試験４では、藍藻としてシネコシスティスの野生株（ＧＴ株）を用い、実施例２のユーグレナの細胞を添加した培地にて共培養を行った。また、比較のために、比較例１の緩衝液を用いて藍藻又はユーグレナの培養を行った。
（藍藻の前培養）
藍藻を６０ｍｌのＢＧ−１１培地を用い、好気条件、３０℃で４日培養した。１ｖｏｌ％濃度でＣＯ２を混合した空気を３０〜５０ｍｌ／分の流量で通気し、光源として白色蛍光灯（三菱電機照明株式会社製、ネオルミスーパー、ＦＬＲ４０ＳＷ）を用い、培養液水面に注ぐ光が５０〜８０μＥ／ｍ２・秒の強度となるように調節し、培養を行った。光の照射は２４時間連続光で行った。
藍藻を６０ｍｌのＢＧ−１１培地を用い、好気条件、３０℃で４日培養した。１ｖｏｌ％濃度でＣＯ２を混合した空気を３０〜５０ｍｌ／分の流量で通気し、光源として白色蛍光灯（三菱電機照明株式会社製、ネオルミスーパー、ＦＬＲ４０ＳＷ）を用い、培養液水面に注ぐ光が５０〜８０μＥ／ｍ２・秒の強度となるように調節し、培養を行った。光の照射は２４時間連続光で行った。
（ユーグレナ細胞を用いた藍藻の共培養）
前培養した藍藻及び実施例２のユーグレナ細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０、ＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で３日間振盪培養した。
前培養した藍藻及び実施例２のユーグレナ細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０、ＯＤ６００＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で３日間振盪培養した。
（緩衝液を用いた藍藻の単独培養）
前培養した藍藻を、ＮａＨＣＯ３を添加した比較例１の緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。ＮａＨＣＯ３濃度が１００ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で３日間振盪培養した。
前培養した藍藻を、ＮａＨＣＯ３を添加した比較例１の緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。ＮａＨＣＯ３濃度が１００ｍＭとなるように調整した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で３日間振盪培養した。
（緩衝液を用いたユーグレナの単独培養）
実施例２のユーグレナ細胞を比較例１の緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で３日間振盪培養した。
実施例２のユーグレナ細胞を比較例１の緩衝液２０ｍｌに加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃または３７℃で３日間振盪培養した。
（試験４の結果）
結果を図９乃至１１に示す。
図９乃至１１において、「ＧＴ」は比較例１の緩衝液を用いて藍藻の単独培養を行った後の培養上清であり、「ＮＩＥＳ−４８」は比較例１の緩衝液を用いてユーグレナの単独培養を行った後の培養上清であり、「共培養」は藍藻を実施例２のユーグレナと共培養した後の培養上清である。
結果を図９乃至１１に示す。
図９乃至１１において、「ＧＴ」は比較例１の緩衝液を用いて藍藻の単独培養を行った後の培養上清であり、「ＮＩＥＳ−４８」は比較例１の緩衝液を用いてユーグレナの単独培養を行った後の培養上清であり、「共培養」は藍藻を実施例２のユーグレナと共培養した後の培養上清である。
図９に示すように、培養温度３０℃で藍藻をユーグレナと共培養しても、コハク酸が相加的以上に増加することはなかった。この結果は、培養温度が３７℃でも同じであった。
図１０に示すように、培養温度３０℃で藍藻をユーグレナと共培養することによって、それぞれを単独で培養した場合と比較して、乳酸が相加的以上に増加することがわかった。この結果は、培養温度が３７℃でも同じであった。いずれの温度においても、乳酸は全てＤ型−乳酸であり、藍藻が産出する乳酸が促進されたことがわかった。
図１１に示すように、培養温度３０℃で藍藻をユーグレナと共培養することによって、それぞれを単独で培養した場合と比較して、酢酸が相加的以上に増加することがわかった。この結果は、培養温度が３７℃でも同じであった。
Claims (6)
- ユーグレナの培養上清を有効成分として含有し、
グルコース無添加条件下で使用され、
コリネ型細菌が産出するグルタミン酸、コハク酸及び乳酸からなる群より選択される一種以上の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤。 - ユーグレナの培養上清を有効成分として含有し、
グルコース添加条件下で使用され、
コリネ型細菌が産出するコハク酸又は乳酸の少なくとも一方の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤。 - ユーグレナの細胞を有効成分として含有し、
グルコース無添加条件下で使用され、
コリネ型細菌が産出するコハク酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤。 - ユーグレナの細胞を有効成分として含有し、
グルコース添加条件下で使用され、
コリネ型細菌が産出するグルタミン酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤。 - ユーグレナの培養上清を有効成分として含有し、
藍藻が産出する乳酸の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤。 - ユーグレナの細胞を有効成分として含有し、
藍藻が産出する乳酸又は酢酸の少なくとも一方の産出を促進するために用いられる有機酸産出促進剤。
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