CN105907692A - 一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法 - Google Patents

一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产L‑赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法。该方法将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF同时失活后构建获得，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种高产L‑赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株的构建方法，构建的菌株由于内源基因brnE和brnF的失活引起甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸胞外分泌量明显降低，与野生型相比，该菌株有利于生产高浓度的L‑赖氨酸，并能有效降低发酵液副产物的含量，作为L‑赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产和纯化成本。

Description

一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法，属于生物技术技术领域。
背景技术
L-赖氨酸属于天冬氨酸族氨基酸，是人体八大必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。L-赖氨酸目前已被广泛用于动物饲料添加剂、食品加工、药物合成等方面。
L-赖氨酸的生产方法主要包括:微生物发酵法(一步发酵法、两步发酵法)、酶法、蛋白水解法等。目前工业上生产L-赖氨酸最常用的方法是微生物发酵法，是借助微生物具有生物合成自身所必需氨基酸的能力，利用微生物的代谢作用，通过对菌株进行改造，选育出各种氨基酸营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株，从而解除生物合成途径中的反馈阻遏和抑制作用，达到过量积累代谢途径中L-赖氨酸的目的。
研究发现可用于L-赖氨酸生产的微生物主要为细菌，包括棒状杆菌、短杆菌、念球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等。目前，国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、黄色短杆菌(B.flavum)、乳酸发酵短杆菌(B.lactofermentus)和大肠杆菌(E.coli)菌株，但由于野生型菌株产L-赖氨酸能力差、副产物多，因此需要进行相应的改造，国内外对L-赖氨酸生产菌种的选育主要通过诱变育种技术和代谢工程育种技术。代谢工程育种是从分子水平上通过最小限度的、最明确的基因改造来优化选育菌株。然而，与野生型菌株相比较，这些菌株存在很大的缺陷，如生长速度缓慢，糖耗速率低，对外界不良环境耐受力差等。随着生物技术的发展及谷氨酸棒状杆菌基因组的解析，传统诱变育种获得L-赖氨酸高产菌方法逐渐被代谢工程育种方法所取代。同时大量研究表明，通过基因工程技术获得的基因工程菌，除保留了野生型菌株的一些优点外，还能很大程度上提高L-赖氨酸产量。如中国发明专利CN1539015公开了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在内的多个可用于赖氨酸产量提高的基因改进位点。中国专利文献CN101600796(申请号200780048626.8)、CN1974760(申请号200610163142.5)、CN103243042(申请号201310092638.8)分别对基因NCg22534、NCgl1835、NCg21090进行失活获得一系列L-赖氨酸产率提高的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法。本发明通过改造菌株谷氨酸棒状杆菌获得，具体策略为失活谷氨酸棒状杆菌BrnFE操纵子中brnE或brnF基因，或者对两基因同时进行失活，减少L-赖氨酸发酵时发酵液中副产物氨基酸的含量，使更多的碳流量流向L-赖氨酸合成方向，提高L-赖氨酸发酵底物利用率，便于纯化。
术语说明
本发明中，“失活”可以通过本领域已知的任何失活方法来诱导。“失活”产生的效果是指内源基因brnE和brnF的表达分别或同时被降低到很低的水平，或者产生不表达基因以及尽管被表达但表达不具有活性或活性降低的产物。
本发明中，“失活”可以通过基因工程手段在BrnFE操纵子中插入一个或多个碱基对，或者缺失该内源基因brnE和brnF中的一个或多个碱基对，或者由基因内部序列转换或颠换获得。
本发明技术方案如下：
一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，是将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的内源基因brnE和brnF同时失活后构建获得，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明优选的，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。
根据本发明优选的，上述高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，步骤如下：
(1)在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF内各设计一条引物，通过PCR扩增内源基因brnE和brnF基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源臂序列，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；
(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；
(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，即得。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增同源臂序列NCg3，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
F1:CGGGATCCTTGCCCGTTTCTATTCGGTT；
R1:AAGGCCAGCAAAA TCTTCAGATCTATCGCATTGCT；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿梭质粒pHT01(购自杭州宝赛生物科技有限公司)的DNA；PCR扩增抗性标签基因片段Cmr，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
F2:GATCTGAAGA TTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；
R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的第一阶段扩增体系如下，总体系为25μl：
重叠PCR的第一阶段扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2min，5个循环；72℃延伸10min；
重叠PCR的第二阶段扩增体系为在第一阶段扩增后的产物基础上加入如下成分，总体系为50μl：
重叠PCR的第二阶段扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(4)的具体步骤如下：
(i)挑取谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)单菌落，在种子培养基中培养至菌体浓度OD600为0.7～0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得感受态细胞；
(ii)对步骤(3)制得的融合基因进行单酶切，28～32℃酶切2～5h，高压电击转化至步骤(i)制得的感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28～32℃培养0.5～2h后，筛选，即得。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(ii)中单酶切体系如下，总体系为40μl：
根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中，种子培养基，每升组分如下：
蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96g。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中，电转缓冲液，每升组分如下：
山梨醇85～96g、甘露醇85～96g、甘油95～105mL。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中，高压电击转化的条件为：2100V电击5ms。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(ii)中液体复苏培养基，每升组分如下：
蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96g、甘露醇65～73g。
上述构建方法制得的高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌在生产L-赖氨酸中的应用。
构建原理
由于氨基酸的自身特性导致进出生物体细胞膜需要相应转运蛋白的辅助；基因BrnFE为谷氨酸棒状杆菌中存在的包含两种蛋白组分的操纵子，能够介导甲硫氨酸和分支氨基酸(包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的胞外转运，而胞外甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的积累不仅会影响L-赖氨酸的产量，还会增加L-赖氨酸分离提取难度。发明人通过研究发现，通过失活内源基因brnE和brnF，可以导致甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸胞外分泌量明显降低，从而促进L-赖氨酸的合成并有效降低胞外发酵液副产物的含量。
有益效果
本发明提供一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株的构建方法，构建的菌株由于内源基因brnE和brnF的失活引起甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸胞外分泌量明显降低，与野生型相比，该菌株有利于生产高浓度的L-赖氨酸，并能有效降低发酵液副产物的含量，作为L-赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产和纯化成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)23604来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604；
穿梭质粒pHT01购自杭州宝赛生物科技有限公司。
实施例1：基因敲除片段构建
1)(i)提取谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)23604基因组DNA，以该基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂NCg3；
所述的PCR引物序列如下：
F1:CGGGATCCTTGCCCGTTTCTATTCGGTT
R1:AAGGCCAGCAAAA TCTTCAGATCTATCGCATTGCT
所述的PCR扩增体系为：
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸60sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为608bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
(ii)提取穿梭质粒pHT01(购自杭州宝赛生物科技有限公司)的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cmr片段；
所述的PCR引物序列如下:
F2:GATCTGAAGA TTTTGCTGGCCTTTTGCTCA
R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT
所述的PCR扩增体系为：
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为1264bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
(iii)将步骤(i)制得的NCg3片段与步骤(ii)制得的Cmr片段进行重叠PCR，制得NCg3-Cmr片段；
所述的重叠PCR的扩增体系为：
所述的重叠PCR的第一阶段扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2min，5个循环；72℃延伸10min；
所述的重叠PCR的第二阶段扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为1777bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
实施例2：制备地衣芽孢杆菌感受态
(i)挑取谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)23604单菌落，接种于10mL种子培养基中，37℃、220r/min，过夜培养；
种子培养基，组分如下：
蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇91g。
(ii)取1mL上述菌液转接到100mL种子培养基中，37℃、220r/min培养至OD600＝0.9；
(iii)将菌液转移至100mL离心管，冰浴15-20min，使菌体停止生长；
(iv)冰浴后4℃、5000g、5min离心，收集菌体；
(v)离心后的菌体用预冷的电转缓冲液(ETM)洗涤3次；
电转缓冲液，每升组分如下：
山梨醇91g、甘露醇91g、甘油100mL。
(vi)洗涤结束后，使用1000μL电转缓冲液重悬菌体；
(vii)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。
实施例3：NCg3-Cmr片段电转化谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)23604
(i)将NCg3-Cmr片段用限制性内切酶BamH I，30℃酶切3h；；
酶切体系(40uL)如下：
(ii)浓缩纯化酶切产物
(1)加入1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃冰箱20min；
(2)12000r/min，离心5min得沉淀；
(3)300μL体积百分比为75％的乙醇重悬沉淀；
(4)12000r/min，离心5min，除去乙醇，37℃风干30min，
(5)加入15-18μL ddH2O重悬DNA，并置于-20℃保存。
(iii)电转化
首先利用核酸超微量分光光度计测定NCg3-Cmr片段浓度，达到300μg/mL浓度后2100V电击5ms，进行电转化，得到的细胞使用复苏培养基30℃复苏培养1h后，取100μL涂布在含氯霉素的LB固体培养基上，在37℃培养2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子。
液体复苏培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇91g、甘露醇69.4g。
实施例4：阳性重组菌的培养及鉴定
挑取上述阳性重组菌落，接种到含200μg/mL氯霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA，并以获得的基因组为模板，F1和R2为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；
所述的PCR引物序列如下:
F1:CGGGATCC TTGCCCGTTTCTATTCGGTT
R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT
其中，下划线标识的为酶切位点
所述的PCR扩增体系为20μl：
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，使用引物F1和R2能够扩增出一条特异性基因条带，大小约为1800b，与理论值1849bp接近，表明目的基因已成功整合到谷氨酸棒状杆菌基因组上，制得高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌。
实施例4：L-赖氨酸发酵测试
将制备的高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌接种至100mL LBG培养基(葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中220rpm 30℃下进行种子培养20h，其后按体积百分比2％接种量接种至100mL发酵培养基(葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，玉米浆30mL，尿素5g/L，(NH4)2SO4 25g/L，L-亮氨酸0.34g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，生物素0.001g/L)发酵培养36h，并通过日立L-8900型高速氨基酸自动分析仪测定发酵液中氨基酸的含量。
结果显示与原始菌相比。高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌发酵液中缬氨酸的含量由2.8g/L降低至仪器未检出水平，甲硫氨酸的含量由1.5g/L降低至仪器未检出水平，且亮氨酸和异亮氨酸均未检出，赖氨酸的产量由40.0g/L提升至43.8g/L。

Claims (10)

1.一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF同时失活后构建获得，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。
3.权利要求1或2所述重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的内源基因brnE和brnF内各设计一条引物，通过PCR扩增内源基因brnE和brnF基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源臂序列，内源基因brnE和brnF基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)通过PCR扩增抗性标签基因片段；
(3)将步骤(1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠PCR进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；
(4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，即得。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增同源臂序列NCg3，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
F1:CGGGATCC TTGCCCGTTTCTATTCGGTT；
R1:AAGGCCAGCAAAA TCTTCAGATCTATCGCATTGCT；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿梭质粒pHT01的DNA；PCR扩增抗性标签基因片段Cmr，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
F2:GATCTGAAGA TTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；
R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
6.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，重叠PCR的第一阶段扩增体系如下，总体系为25μl：
重叠PCR的第一阶段扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2min，5个循环；72℃延伸10min；
重叠PCR的第二阶段扩增体系为在第一阶段扩增后的产物基础上加入如下成分，总体系为50μl：
重叠PCR的第二阶段扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
7.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体步骤如下：
(i)挑取谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)单菌落，在种子培养基中培养至菌体浓度OD600为0.7～0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得感受态细胞；
(ii)对步骤(3)制得的融合基因进行单酶切，28～32℃酶切2～5h，高压电击转化至步骤(i)制得的感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28～32℃培养0.5～2h后，筛选，即得。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(ii)中单酶切体系如下，总体系为40μl：
9.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(i)中，种子培养基，每升组分如下：
蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96g；
优选的，所述步骤(i)中，电转缓冲液，每升组分如下：
山梨醇85～96g、甘露醇85～96g、甘油95～105mL；
优选的，所述步骤(i)中，高压电击转化的条件为：2100V电击5ms；
优选的，所述步骤(ii)中液体复苏培养基，每升组分如下：
蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96g、甘露醇65～73g。
10.权利要求1所述构建方法制得的高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌在生产L-赖氨酸中的应用。
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