KR101752819B1

KR101752819B1 - L-시스테인 및 아미노산의 유도체의 발효에 의한 생산 방법

Info

Publication number: KR101752819B1
Application number: KR1020157006616A
Authority: KR
Inventors: 토비아스 데슬러; 알프레드 라인펠데르; 귄테르 비치
Original assignee: 와커 헤미 아게
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2017-07-11
Also published as: US9347078B2; EP2895597B1; WO2014040955A1; CN104640978A; EP2895597A1; DE102012216527A1; KR20150041150A; JP2015528301A; JP6258329B2; US20150232897A1

Abstract

본 발명은 발효 배지 내에서 시스테인-생산 미생물 균주를 발효시킴에 의하여 L-시스테인 및 그의 유도체 L-시스틴 및 티아졸리딘을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 L-메티오닌, L-이소류신 또는 L-트레오닌이 각각 0.1 내지 10 g/L 범위의 농도로 본배양에서 상기 발효 배지에 첨가됨을 특징으로 한다.

Description

L-시스테인 및 아미노산의 유도체의 발효에 의한 생산 방법{METHOD FOR THE FERMENTATIVE PRODUCTION OF L-CYSTEINE AND DERIVATIVES OF SAID AMINO ACID}

본 발명은 L-시스테인 및 아미노산의 유도체 L-시스틴 및 2-메틸티아졸리딘-2,4-디카르복시산의 발효 생산 방법에 관한 것이다.

L-시스테인은 두 개의 L-시스테인 분자들의 산화에 의하여 형성되는 디설파이드이다. 이러한 반응은 가역적이며, 이는 L-시스틴이 환원에 의하여 L-시스테인으로 다시 전환될 수 있음을 의미한다.

2-메틸티아졸리딘-2,4-디카르복시산 (티아졸리딘)은 전적으로 화학적 반응으로 형성되는 L-시스테인 및 피루베이트의 축합 생성물이다 (US 5972663A). 이러한 반응은 마찬가지로 가역적이다. 따라서, 티아졸리딘은 예를 들어 승온에서 산 내에서 그의 출발 성분으로 다시 분해될 수 있다.

상기 아미노산 L-시스테인은 경제적으로 중요하다. 예를 들어, 이는 식품 첨가물로서 (특히 베이킹제 산업에서), 화장품 원료로서, 및 약학적 활성 성분의 생산을 위한 원료로서 (특히 N-아세틸시스테인 및 S-카르복시메틸시스테인) 사용된다.

L-시스테인은 모든 생물체에서 황 대사에 있어서 핵심적인 위치에 있으며, 단백질, 글루타티온, 비오틴, 리포산, 메티오닌 및 기타 황-함유 대사산물들의 합성에 사용된다. 또한, L-시스테인은 보조효소 A의 생합성을 위한 전구체로 작용한다. L-시스테인의 생합성은 세균, 특히 장내세균(enterobacteria) 내에서 상세히 연구되어 오고 있으며, Kredich (1996, Biosynthesis of cysteine, p. 514-527. In F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C.　C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C)에 광범위하게 기재되어 있다.

L-시스테인 생합성에서 중심적인 대사로부터의 중요한 전구체는 해당작용의 중간체인 3-포스포글리세레이트이다. 따라서, L-시스테인은 L-세린 및 글리신과 함께 포스포글리세레이트족의 일부로 간주된다. 이와 대조적으로 단백질 생산 아미노산 L-메티오닌, L-이소류신 및 L-트레오닌은 중심 대사로부터 공유된 전구체가 시트르산 사이클 중간체 옥살로아세테이트이므로 옥살로아세테이트족에 속한다. 예를 들어 글루코스와 같은 탄소 공급원으로부터 시작하여, 상기 물질 흐름은 대체로 서로 무관하게 이러한 두 개의 상이한 동화적 아미노산 대사를 통하여 진행된다. 그러나, 상기 포스포글리세레이트족의 중간체 또는 최종 생성물의 상기 옥살로아세테이트족의 개별적 생합성 단계와 몇몇 상호 작용이 공지되어 있다. 예를 들어, L-아스파테이트 세미알데히드의 L-호모세린으로의 환원을 촉매하는 thrA 유전자 생성물인 호모세린 디하이드로게나아제 I가 L-세린뿐 아니라 L-시스테인에 의해서도 저해될 수 있는 것으로 기재되어 있다 (Hama et al., 1991, J. Biochem. 109, 604-8; Datta, 1967, Biochemistry 58, 635-41). 나아가, 동화적 트레오닌 디아미나아제 IlvA가 L-시스테인에 의하여 저해되는 것으로 공지되어 있다 (Harris, 1981, J. Bacteriol. 145, 1031-35). 또한, L-세린은 L-트레오닌과 유사하게 IlvA 유전자 생성물의 기질로서 작용할 수 있다 (Rasko et al., 1971, Eur. J. Biochem. 21, 424-27).

L-이소류신이 포스포글리세레이트족의 아미노산의 발효 생산에서 배양 배지에 첨가될 수 있는 것으로 다양한 특허에 기재되어 있으나 (EP1233067, EP1382684), L-이소류신은 단지 다양한 가능한 첨가 중 하나로서 인용되어 있다. 그러나, L-이소류신이 아미노산 생산에 이로운 영향을 미친다는 사실은 어디에도 시사되어 있거나 명백하게 되어 있지 않다.

Dassler et al. (2000, Mol. Microbiol. 36: 1101-1112)에, 포스포글리세레이트족 아미노산의 발효 생산에서 전배양(preculture)의 배지에 아미노산 L-메티오닌, L-이소류신 및 L-류신의 첨가가 기재되어 있다 (각각의 경우 0.3 g/l). 그러나, 이들 아미노산은 상기 발효조 내에 본배양(main culture)의 배지에 첨가되지 않았다. 또한, 전배양 배지의 아미노산 보충이 시스테인 또는 아세틸세린 생산에 이로운 영향을 미칠 수 있음이 시사되어 있지 않다.

머리털, 강모, 뿔, 발굽, 깃털과 같은 케라틴성 물질로부터 추출에 의한, 또는 전구체의 효소 전환에 의한 생물변환에 의한 L-시스테인의 전통적인 생산 외에, 몇 년 전에, L-시스테인의 발효 생산 방법이 또한 개발되었다. 미생물에 의한 L-시스테인의 발효 생산에 대한 종래 기술은 예를 들어 US6218168B1, US5972663A, US20040038352A1, CA2386539A1, US20090053778A1 및 US20090226984A1에 기재되어 있다. 여기서 사용되는 세균 숙주 유기체는 무엇보다 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 균주 및 예를 들어 대장균(Escherichia coli) 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)와 같은 장내세균(Enterobacteriaceae)과의 대표적인 것들이다.

돌연변이 및 선택에 의하여 개선된 L-시스테인 생산자에 도달하기 위한 전통적인 절차 외에, 효과적인 L-시스테인 과잉생산을 달성하기 위하여 표적화된 방식으로 균주에 유전자 변형이 또한 수행되었다.

따라서, L-시스테인에 의하여 감소된 피드백 저해를 가지는 세린-O-아세틸 트랜스퍼라아제를 암호화하는 cysE 대립유전자의 도입은 시스테인 생산 증가를 가져왔다 (US6218168B1; Nakamori et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611). L-시스테인의 직접적인 전구체인 O-아세틸-L-세린의 형성은 피드백-내성 CysE 효소에 의하여 세포의 L-시스테인 수준으로부터 실질적으로 분리된다.

O-아세틸-L-세린은 L-세린 및 아세틸-CoA로부터 형성된다. 따라서, L-세린을 L-시스테인 생산에 충분한 양으로 공급하는 것이 매우 중요하다. 이는 L-세린에 의한 감소된 피드백 저해를 가지는 3-포스포글리세레이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 serA 대립 유전자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 그 결과, L-세린의 전구체인 3-히드록시피루베이트의 형성이 세포의 L-세린 수준으로부터 실질적으로 분리된다. 그러한 SerA 효소의 예는 EP0620853 및 US2005009162A2에 기재되어 있다.

또한, 발효조 내에 L-시스테인 수율은 예를 들어 트립토파나아제 TnaA 또는 시스타티오닌-β-리아제 MalY 또는 MetC와 같은 L-시스테인-분해 효소를 암호화하는 유전자를 약화시키거나 파괴시킴으로써 증가될 수 있는 것으로 알려져 있다 (EP1571223).

세포의 L-시스테인의 운반을 증가시키는 것은 배지 내 생산 수율을 증가시키기 위한 추가적인 가능성이다. 이는 유출 유전자(efflux genes)로 명명되는 것들의 과발현에 의하여 달성될 수 있다. 이러한 유전자는 세포 밖으로 L-시스테인의 방출을 중재하는 막-결합 단백질을 암호화한다. 다양한 유출 유전자들이 L-시스테인 방출에 대하여 기재되어 있다 (US5972663A, US20040038352A1).

L-시스테인의 세포 밖으로 발효 배지 내로의 방출은 많은 이점들을 가진다:

1) L-시스테인이 세포내 반응 평형으로부터 빼내어져 세포 내 상기 아미노산의 수준이 낮게 유지되며, 따라서 L-시스테인으로 인한 민감성 효소의 피드백 저해가 없다: (1) L-시스테인 (세포내) ⇔ L-시스테인 (배지)

2) 배지 내로 분비되는 L-시스테인이 배양 중 배지 내로 도입되는 산소의 존재 하에 디설파이드 L-시스틴으로 산화된다 (US5972663A):

(2) 2 L-시스테인 + 1/2 O₂ ⇔ L-시스틴 + H₂O

특히 L-시스테인과 비교하여, 중성 pH에서 수용액 내 L-시스틴의 용해도는 매우 낮기 때문에, 상기 디설파이드는 낮은 농도에서도 침전되고, 백색 침전물(precipitate)을 형성한다:

(3) L-시스틴 (용해된) ⇔ L-시스틴 (침전물)

L-시스틴의 침전으로 인하여, 배지 내 용해된 생성물의 수준이 감소되고, 그 결과, 각각의 경우에도 (1) 및 (2)의 반응 평형이 생성물 쪽으로 이동된다.

3) 상기 아미노산을 발효 배지로부터 직접 얻을 수 있을 때, 상기 생성물이 세포내 축적되고 세포 소화가 먼저 진행되어야 할 때보다, 생성물 정제를 위한 기술적 비용이 현저히 낮아진다.

본 발명의 문맥 상 표현 "전체 시스테인"은 L-시스테인, 및 발효 동안 형성되고 배양 상청액(supernatant) 내 및 침전물 내에 축적되는, 이로부터 형성되는 L-시스틴 및 티아졸리딘 화합물을 포함한다.

L-시스테인 생산 균주의 유전적 변형 외에도, 발효 방법, 즉 세포 배양 유형 및 방식의 최적화 또한 효율적인 생산 공정의 개발에 있어서 중요한 역할을 한다.

이러한 경우, 예를 들어, 탄소 및 에너지 공급원의 유형 및 투여량, 온도, 산소 공급 (DE102011075656A1), pH 및 배양 배지의 조성과 같은 다양한 배양 패러미터들이 L-시스테인의 발효 생산에서 생산 수율 및/또는 생산 스펙트럼에 영향을 미칠 수 있다.

계속하여 증가하는 원료 및 에너지 비용으로 인하여, 이러한 방식으로 공정의 경제 효율성을 개선시키기 위하여 L-시스테인 생산 수율 증가에 대한 끊임없는 요구가 있다.

본 발명의 목적은 발효조 내 전배양 및 본배양에서 발효 배지 내 시스테인-생산 미생물 균주의 발효에 의하여 L-시스테인 및 그 유도체 L-시스틴 및 티아졸리딘의 생산을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적은 본배양에서 발효 배지에 L-메티오닌, L-이소류신 또는 L-트레오닌이 각각 0.1 내지 10 g/l의 농도 범위로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법에 의하여 달성된다.

생산 공정에 대한 영향과 관련하여 다양한 화학적 물질을 스크리닝하여, 본배양에서 발효 배지에 아미노산 L-메티오닌, L-이소류신 또는 L-트레오닌을 보충함으로써 총 시스테인 수율이 증가될 수 있음이 놀랍게도 발견되었다. 이는 시스테인 발효 생산 공정에 통상적으로 사용된 세균 균주는 상기 아미노산에 대하여 자가영양균이므로 더욱 놀랍다.

본배양에서 L-시스테인 및 이의 상기한 유도체들의 발효 생산에 대한 L-메티오닌, L-이소류신 또는 L-트레오닌의 보충의 유리한 효과는 현재까지 기재되거나 명백히 되지 않았다. 이들 아미노산의 첨가에 의하여 시스테인 발효 생산 공정 수율이 증가될 수 있다는 사실은 이들 아미노산들 중 어떠한 것도 시스테인 생합성에서 대사 전구체가 아니기 때문에 놀랍다.

L-메티오닌, L-이소류신 또는 L-트레오닌은 본배양에서 발효 배지에 각각 바람직하게 0.5-5 g/l, 특히 바람직하게 0.5-3 g/l의 농도 범위로 첨가된다.

이러한 경우, 메티오닌/이소류신 및 메티오닌/트레오닌의 조합들이 하나의 단일 아미노산만의 보충에 비하여 바람직하다. 메티오닌/이소류신의 조합에 특히 바람직하다. 아미노산 조합이 첨가될 때, 개별 아미노산에 대하여 인용된 것과 동일한 농도 범위가 바람직하다.

상응하는 아미노산으로 배지의 보충은 본배양을 개시할 때에도 배치 첨가로서 진행될 수 있다. 대안적으로, 상기 아미노산들은 발효 동안 처음 연속적으로 배지에 첨가될 수 있다.

본배양(생산 배양)에서 시스테인 생산은 원칙적으로 당업자에게 공지된 발효 방법에 따라, 5 m³이상, 바람직하게 20 m³이상, 특히 바람직하게 50 m³이상의 용량을 가지는 생반응기, 바람직하게 교반-탱크 발효조 내에서 진행된다. 시스테인-생산 세포 배양은 전형적으로 복수 단계로 수행된다. 보존 배양(stock culture)으로부터 진행하여, 본배양이 마지막 전배양으로 접종되기 전에, 세포는 하나 이상의 전배양에서 먼저 성장한다. 이러한 경우, 일반적으로, 연속적 규모 확대가 진탕 플라스크로부터 실험실 규모의 발효조를 경유하여 산업적 규모의 생반응기로 진행된다.

본 발명에 따른 방법을 위한 미생물로서, 종래 기술에 기재된 모든 시스테인-생산 균주가 사용될 수 있다. 그러한 균주들은 예를 들어, US6218168B1, US5972663A, US20040038352A1, CA2386539A1, US20090053778 또는 EP2138585에 개시된다.

미생물 균주로서, 장내세균과의 대표적인 것들이 바람직하고, 대장균속 및 판토에아속의 대표적인 것들이 특히 바람직하고, E. coli 및 P.ananatis 종의 균주가 매우 특히 바람직하다.

이들 미생물 균주들 중에서, 상응하는 야생형 효소와 비교하여 2배 이상 감소된 L-시스테인으로 인한 피드백 저해를 가지거나, 유출 유전자의 과발현에 의하여 야생형 세포와 비교하여 2배 이상 증가된 세포 밖으로의 시스테인 방출을 가지는 변형된 세린-O-아세틸 트랜스퍼라아제를 가지는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 미생물 균주들은 상응하는 야생형 효소와 비교하여 2배 이상 감소된 L-시스테인으로 인한 피드백 저해를 가지고, 또한 유출 유전자의 과발현에 의하여 야생형 세포와 비교하여 2배 이상 증가된 세포 밖으로의 시스테인 방출을 가지는 세린-O-아세틸 트랜스퍼라아제를 가진다.그러한 균주들은 예를 들어, US6218168B1 및 US5972663A에 공지되어 있다. 매우 특히 바람직한 균주들은 상응하는 야생형 효소와 비교하여 2배 이상 감소된 L-세린으로 인한 피드백 저해를 가지고, 하나 이상의 L-시스테인-분해 효소가 약화되어 야생형 세포와 비교하여 세포 내에 상기 효소 활성의 최대 50%만이 존재하는 변형된 3-포스포글리세레이트 디하이드로게나아제를 추가로 가진다.

바람직한 세린-O-아세틸 트랜스퍼라아제의 변이체들은 상응하는 야생형 효소와 비교하여 5배 이상, 특히 바람직하게 10배 이상, 매우 특히 바람직하게 50배 이상 감소된 L-시스테인으로 인한 피드백 저해를 가진다.

상기 유출 유전자는 바람직하게 E.coli의 ydeD (US5972663A 참조), yfiK (US20040038352A1 참조), cydDC (WO2004113373 참조), bcr (US2005221453 참조) 및 emrAB (US2005221453 참조) 또는 다른 미생물로부터의 상응하는 상동유전자로 이루어지는 군으로부터 유래된다. 상동 유전자는 상기 유전자 서열이 상응하는 E.coli 유전자의 DNA 서열과 80% 이상 일치함을 의미한다.

유출 유전자의 과발현은 야생형 세포와 비교하여 바람직하게 5배 이상, 특히 바람직하게 10배 이상, 매우 특히 바람직하게 20배 이상 증가되는 세포 밖으로 시스테인 방출을 가져온다.

3-포스포글리세레이트 디하이드로게나아제의 바람직한 변이체는 상응하는 야생형 효소와 비교하여 5배 이상, 특히 바람직하게 10배 이상, 매우 특히 바람직하게 50배 이상 감소되는 L-세린으로 인한 피드백 저해를 가진다.

상기 L-시스테인-분해 효소는 바람직하게 트립토파나아제(TnaA) 및 시스타티오닌-β-리아제 (MalY, MetC)의 군으로부터 유래된다.

이들 효소들 중 하나 이상이 야생형 균주와 비교하여 그 효소 활성의 최대 10%만이 세포 내에 존재하도록 약화된 미생물 균주인 것이 특히 바람직하다. 이들 효소들 중 하나 이상이 완전히 불활성화된 균주인 것이 매우 특히 바람직하다.

상기 세포들은 L-시스테인 생산의 경우 호기성 성장 조건 하에 배양되며, 여기서 본배양에서 발효 동안 산소 농도는 최대 50% 포화로 설정된다. 배양에서 산소 포화도는 이러한 경우 기체 공급 및 교반 속도를 통하여 자동적으로 조절된다.

탄소 공급원으로서, 바람직하게 당, 당 알콜, 유기산 또는 당-함유 식물 가수분해물이 사용된다. 특히 바람직하게, 탄소 공급원으로서, 글루코오스, 프럭토오스, 락토오스, 글리세롤 또는 이들 화합물들 중 두 개 이상을 포함하는 혼합물이 본 발명에 따른 방법에서 사용된다.

본 발명에 따른 발효 방법의 생산 단계는 L-시스테인, L-시스틴 또는 티아졸리딘이 본배양의 배양액 내에서 최초로 검출될 수 있는 시점에서 시작하여, 배양 완료시까지 지속된다. 전형적으로 이러한 단계는 생산 발효조의 접종 후 대략 8-10 시간 후에 시작한다.

바람직하게, 상기 탄소 공급원은 발효조 내 상기 탄소 공급원의 함량이 생산 단계 동안 10 g/를 초과하지 않는 방식으로 본배양에 첨가된다. 2 g/l의 최대 농도가 바람직하고, 0.5 g/l가 특히 바람직하고, 0.1 g/l가 매우 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 방법에서 N 공급원으로서, 바람직하게 암모니아, 암모늄 염 또는 단백질 가수분해물이 사용된다. 암모니아가 pH-상태에 대한 보정 배지로서 사용될 때, 이러한 N 공급원은 발효 동안 정기적으로 보충된다.

추가적인 배지 첨가물로서, 원소 인, 염소, 나트륨, 마그네슘, 질소, 칼륨, 칼슘, 철의 염, 및 원소 몰리브덴, 붕소, 코발트, 망간, 아연 및 니켈의 미량의 (즉, μM 농도) 염을 첨가할 수 있다.

또한, 유기산 (예를 들어, 아세테이트, 시트레이트) 및 비타민 (예를 들어, B1, B6)을 배지에 첨가할 수 있다.

복합 영양소 공급원으로서, 예를 들어 효모 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 또는 맥아 추출물을 사용할 수 있다.

예를 들어, E.coli 또는 P.ananatis와 같은 중온성 미생물의 배양 온도는 바람직하게 15-45℃, 특히 바람직하게 30-37 ℃이다

발효 배지의 pH는 바람직하게 발효 동안 5.5 내지 7.5 범위, 특히 바람직하게 6.5-7.5 범위, 매우 특히 바람직하게 7.0이다.

L-시스테인 및 L-시스테인 유도체의 생산을 위하여, 발효 동안 황 공급원이 공급되어야 한다. 바람직하게, 설페이트 또는 티오설페이트가 사용된다.

본원에 기재되는 방법에 따라 발효되는 미생물들은, 최초 성장 단계 후, 8 내지 150 시간의 기간으로, L-시스테인 및 그로부터 유도되는 화합물들을 발효 배지 내로 배치 공정 또는 유가 공정(fed-batch process)으로 고효율로 분비한다.

상기 발효 후, 침전물로 존재하는 L-시스틴은 배양액의 잔류 성분들로부터 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어 디캔터를 사용하여 분리될 수 있다.

조 생성물의 추가적인 정제를 위하여, 다음 단계들을 수행할 수 있다:

- 조 생성물을 무기산(mineral acid)으로 용해

- 조 생성물 용액을 원심분리 또는 여과에 의하여 정화

- 상기 용액을 탈색

- 침전 결정화.

L-시스틴의 L-시스테인으로의 환원은 예를 들어 EP0235908에 기재된 바와 같은 전기화학적 공정을 통하여 진행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본배양에서 발효 배지에 아미노산 L-메티오닌, L-이소류신 또는 L-트레오닌을 보충함으로써 총 시스테인 수율이 증가될 수 있다.

이하 실시예들은 본 발명을 추가로 예시하기 위한 것이다.

실시예 1: 시스테인 생산 균주의 생산

야생형 균주 E. coli W3110 (ATCC 27325) 및 P. ananatis (ATCC 11530)을 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 (US5972663A의 실시예 2에 개시됨)을 사용하여 US5972663A에 기재된 바와 같은 전기천공법에 의하여 각각 형질전환시켰다. 상기 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306는 복제 기점 및 테트라사이클린 내성 유전자 외에, L-시스테인으로 인한 감소된 피드백 저해를 가지는 세린-O-아세틸 트랜스퍼라아제를 암호화하는 cysEX 대립유전자, 및 그 발현이 구성적 GAPDH 프로모터에 의하여 조절되는 유출 유전자 ydeD (ORF306)을 추가로 함유한다.

플라스미드-베어링 세포들을 15 mg/l 테트라사이클린을 함유한 LB 한천 평판 상에서 선별하였다.

QIAprep Spin Plasmid Kit (Qiagen GmbH)에 의한 반복된 플라스미드 분리 및 제한 분석 후, 원하는 형질전환체, 즉 상기 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306를 테이크업한 세포들을 분리하고 실시예 2 및 3에 기재되는 배양에 사용하였다.

실시예 2: 다양한 아미노산을 보충한 시스테인 생산

전배양 1:

15 mg/l의 테타라사이클린을 함유하는 LB 배지 20 ml를 삼각 플라스크(100 ml) 내에서 각각의 균주 (E. coli W3110 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 or P. ananatis pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306)로 접종하고, 진탕기 상에서 7 시간 동안 배양하였다 (150 rpm, 30℃)

전배양 2:

다음, 전배양 1을 5 g/l의 글루코오스, 5 mg/l의 비타민 B1 및 15 mg/l의 테트라사이클린이 보충된 SM1 배지(12　g/l K₂HPO₄, 3　g/l KH₂PO₄, 5　g/l (NH₄)₂SO₄, 0.3　g/l MgSO₄·7 H₂O, 0.015 g/l CaCl₂·2 H₂O, 0.002 g/l FeSO₄·7 H₂O, 1　g/l Na₃시트레이트·2 H₂O, 0.1　g/l NaCl, 1 ml/l의 0.15　g/l Na₂MoO₄·2H₂O, 2.5 g/l H₃BO₃, 0.7 g/l CoCl₂·6　H₂O, 0.25 g/l CuSO₄·5　H₂O, 1.6　g/l MnCl₂·4 H₂O, 0.3 g/l ZnSO₄·7　H₂O로 구성되는 미량 원소 용액) 100 ml로 완전히 옮겼다. 상기 배양을 30℃에서 17 시간 동안 150 rpm에서 삼각 플라스크 (1 l) 내에서 진탕하였다. 상기 배양 후, 600 nm에서 광학 밀도(OD₆₀₀)는 3 내지 5였다.

본배양:

Sartorius Stedim으로부터의 BIOSTAT B 타입의 발효조 내에서 발효를 수행하였다. 2 l의 총 용량을 가지는 배양 용기를 사용하였다. 발효 배지 (900ml)는 15 g/l의 글루코오스, 10 g/의 트립톤 (Difco), 5 g/l의 효모 추출액 (Difco), 5 g/l (NH₄)₂SO₄, 1.5　g/l KH₂PO₄, 0.5 g/l NaCl, 0.3　g/l MgSO₄·7　H₂O, 0.015　g/l CaCl₂·2　H₂O, 0.075　g/l FeSO₄·7　H₂O, 1　g/l Na₃시트레이트·2　H₂O, 및 1　ml 의 미량 원소 용액(상기 참조), 0.005 g/l의 비타민 B1 및 15 mg/l의 테트라사이클린을 함유한다. 다양한 실험 셋업에서, 아미노산 L-메티오닌, L-이소류신 또는 L-트레오닌을 상기 배지에 개별적으로 또는 다양한 농도로 조합하여 첨가하였다 (표 1 참조).

상기 발효조의 pH를 25% NH₄OH 용액 내에서 펌핑함으로써 처음에 7.0으로 설정하였다. 발효 동안, 25% NH₄OH를 사용하여 자동 보정함으로써 pH를 7.0으로 유지하였다. 접종을 위하여, 100 ml의 상기 전배양 2를 발효조 용기 내로 펌핑하였다. 초기 용량은 따라서 약 1 l였다. 배양을 처음에 400 rpm에서 교반하고, 살균 필터를 통하여 살균된 2 vvm의 압축 공기로 통기시켰다. 이러한 초기 조건 하에, 접종 전에 산소 프로브를 100% 포화로 교정하였다. 발효 동안 O₂ 포화에 대한 목표 값을 50%로 설정하였다. O₂ 포화가 목표 값 이하로 떨어진 후, O₂ 포화를 목표 값으로 되돌리기 위하여 조절 캐스케이드를 시작하였다. 이 경우, 먼저 기체 공급을 연속적으로 증가시킨 다음 (최대 5 vvm), 교반기 속도를 연속적으로 증가시켰다 (최대 1500 rpm). 발효를 30℃ 온도에서 수행하였다. 2 시간의 발효 시간 후, 살균 60% 소듐 티오설페이트·5H₂O 저장 용액 형태의 황 공급원을 시간 당 1.5 ml 속도로 공급하였다. 발효조 내 글루코오스 함량이 초기 15 g/l로부터 대략 2 g/l로 떨어지자마자, 56% 글루코오스 용액을 연속적으로 첨가하였다. 상기 공급 속도를 발효조 내 글루코오스 농도가 2 g/l를 더 이상 초과하지 않는 방식으로 설정하였다. YSI (Yellow Sprgins, Ohio, USA)로부터의 글루코오스 분석 장치를 이용하여 글루코오스를 측정하였다.

발효 기간은 48 시간이었다. 그 후, 샘플을 꺼내고, L-시스테인 및 이로부터 유도되는 유도체들의 함량을 각각의 경우 배양 상청액 내 (주로 L-시스테인 및 티아졸리딘) 및 침전물 (L-시스틴) 내에서 서로 별도로 측정하였다 (표 1 참조). 이를 위하여, 각각의 경우 Gaitonde의 비색 시험을 이용하였다 (Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633). 여기서, 상기 시험은 EP0885962 A1에 기재된 바와 같이 강산 반응 조건 하에 L-시스테인 및 L-시스테인과 피루베이트의 축합 생성물인 2-메틸-티아졸리딘-2,4-디카르복시산 (티아졸리딘)을 구별하지 않는다는 사실을 고려할 필요가 있다. 두 개의 L-시스테인 분자의 산화에 의하여 형성되는 L-시스틴은 마찬가지로 pH 8.0에서 묽은 용액 내에서 디티오트레이톨로 환원에 의하여 상기 시험에서 L-시스테인으로 검출된다. 침전물 내 L-시스틴은 먼저 8% 염산 내에 용해되어야 동일한 방식으로 정량될 수 있다.

48 시간 후 배양액 내 L-시스테인 및 L-시스테인 유도체의 함량

아미노산 첨가 [g/l]	48 시간 후 시스테인 함량 [g/l]
	*E. coli*			*P. ananatis*
	상청액¹	침전물²	총 시스테인³	상청액¹	침전물²	총 시스테인³
-	6.1	10.8	16.9	3.4	7.6	11.0
Met 1.5	6.2	11.3	17.5	3.5	8.4	11.9
Ile 1.5	6.5	11.3	17.8	3.7	8.0	11.7
Thr 1.5	6.3	11.0	17.3	3.5	8.3	11.8
Met/Ile 0.1/0.1	6.8	13.1	19.9	4.0	9.2	13.2
Met/Ile 0.5/0.5	7.1	14.4	21.5	4.2	10.5	14.7
Met/Ile 3/3	7.3	16.3	23.6	4.1	11.2	15.3
Met/Ile 10/10	7.5	16.0	23.5	4.3	11.0	15.3
Met/Thr 0.1/0.1	6.8	12.2	19.0	3.9	9.0	12.9
Met/Thr 0.5/0.5	7.2	13.6	20.8	4.2	9.8	14.0
Met/Thr 3/3	7.2	14.9	22.1	4.0	11.0	15.0
Met/Thr 10/10	7.4	14.6	22.0	4.6	10.3	14.9

¹: 상청액 내 용해된 L-시스테인, L-시스틴 및 티아졸리딘의 합

²: 침전물 내 L-시스틴

³: 총 시스테인 (상청액 및 침전물의 합)

Claims

발효조 내 전배양(preculture) 및 본배양(main culture)에서, 발효 배지 내 시스테인-생산 미생물 균주의 발효에 의하여, L-시스테인 및 그의 유도체 L-시스틴 및 티아졸리딘을 생산하는 방법으로서, 상기 본배양에서 상기 발효 배지에 메티오닌 및 이소류신 또는 메티오닌 및 트레오닌이 각각 0.5 내지 5 g/l의 농도 범위로 첨가되며,
상기 미생물 균주는, 상응하는 야생형 효소와 비교하여 2배 이상 감소된, L-시스테인으로 인한 피드백 저해를 가지는 변형된 세린-O-아세틸 트랜스퍼라아제를 함유하고, 및 유출 유전자가 과발현되어 야생형 세포와 비교하여 세포 밖으로의 시스테인 방출이 2배 이상 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서,
메티오닌 및 이소류신이 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,
미생물 균주로서, 장내세균과(Enterobacteriaceae family) 미생물이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 미생물 균주는, 추가적으로, 상응하는 야생형 효소와 비교하여 2배 이상 감소된, L-세린으로 인한 피드백 저해를 가지는 변형된 3-포스포글리세레이트 디하이드로게나아제를 함유하고, 및 하나 이상의 L-시스테인-분해 효소가 약화되어 야생형 세포와 비교하여 세포 내에 그 효소 활성이 50% 이하로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 미생물 균주는 L-시스테인 생산의 경우 호기 성장 조건 하에 배양되고, 발효 동안 산소 함량은 최대 50% 포화로 설정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,
탄소 공급원이 상기 발효 배지 내 그 함량이 생산 단계 동안 10 g/l 이하를 유지하는 방식으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제