WO2012036151A1 - 含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法 - Google Patents

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    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing a sulfur-containing amino acid such as L-cysteine or a related substance, and more specifically, a bacterium suitable for producing a sulfur-containing amino acid or a related substance, and a sulfur-containing amino acid or a related substance using the same. It relates to the manufacturing method. Sulfur-containing amino acids and related substances are used in the fields of pharmaceuticals, cosmetics and foods.
  • L-cysteine has been obtained by extraction from keratin-containing substances such as hair, horns and feathers, or by microbial enzyme conversion using DL-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid as a precursor.
  • mass production of L-cysteine by an immobilized enzyme method using a novel enzyme is also planned.
  • production of L-cysteine by fermentation using microorganisms has also been attempted.
  • Patent Document 1 a coryneform bacterium having an increased intracellular serine acetyltransferase activity (Patent Document 1) is known.
  • Patent Document 2 a technique for enhancing L-cysteine production ability by retaining a mutant serine acetyltransferase in which feedback inhibition by L-cysteine is reduced is known (Patent Documents 2 to 4).
  • Microorganisms whose L-cysteine production ability is enhanced by suppressing the L-cysteine decomposition system include cystathionine- ⁇ -lyase (Patent Document 2), tryptophanase (Patent Document 5), O-acetylserine sulfate. Coryneform bacteria or Escherichia bacteria in which the activity of hydrhydrase B (Patent Document 6) is reduced or deleted are known.
  • Non-patent Document 1 a mar gene locus, emr gene locus, acr gene locus, cmr gene locus, mex gene, bmr gene, or qacA gene, which is a gene encoding a protein suitable for excretion of a substance toxic to cells (Patent Document 7) ), Or emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, or cusA gene (Patent Document 8) to increase the expression of L-cysteine.
  • Escherichia coli in which the activity of a positive transcriptional regulator of the cysteine regulon encoded by the cysB gene is known as an L-cysteine-producing bacterium.
  • methionine is industrially produced as a DL form mainly by chemical synthesis.
  • the L form is required, it can be produced by acetylating the DL form to N-acetyl-DL-methionine and enzymatically deacetylating only the L form.
  • production of L-methionine by fermentation using microorganisms has also been attempted.
  • the L-methionine-producing bacterium the L-methionine biosynthetic repressor is deleted, the intracellular homoserine transsuccinylase activity is enhanced, and the intracellular S-adenosylmethionine synthetase activity is weakened.
  • Patent Document 12 shows L-threonine requirement and has enhanced intracellular cystathionine ⁇ -synthase activity and aspartokinase-homoserine dehydrogenase II activity.
  • the yeeE gene is registered in the database EcoCyc (Non-patent Document 2) as a gene encoding a protein (putative transport system permease protein) presumed to be involved in membrane permeation. Moreover, when analyzed using the membrane protein prediction program SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html), YeeE is predicted to be a 9-transmembrane membrane protein. Is done. Therefore, although it is presumed to be some kind of transporter, the actual function is unknown, and its relation to sulfur-containing amino acid production is not known.
  • the yeeE gene is cadmium (Non-patent Document 3), zinc (Non-patent Document 4), and CORM-2, which is a CO-releasing agent (Non-patent Document 5). It has been reported that it is up-regulated by Patent Document 6) and a temperature condition of 37 ° C., which is the human body temperature (Non-Patent Document 7). Further, it is reported that it is down-regulated by acetic acid (Non-patent Document 8), by ursolic acid (Non-patent Document 9), and in the IHF ( ⁇ ) strain (Non-patent Document 10). However, all of them are only listed as one of many genes whose expression has changed in microarray experiments, and no association with sulfur-containing amino acid production has been suggested.
  • JP 2002-233384 A Japanese Patent Laid-Open No. 11-155571 US Patent Application Publication No. 20050112731 US Pat. No. 6,218,168 JP 2003-169668 A JP-A-2005-245311 US Pat. No. 5,972,663 JP 2005-287333 A International pamphlet No. 01/27307 US Pat. No. 5,856,148 US Patent Application Publication No. 20050009162 US Patent No. 7611873
  • the present invention develops a novel technology for improving the ability of bacteria to produce sulfur-containing amino acids, and provides a method for producing sulfur-containing amino acid-producing bacteria and sulfur-containing amino acids or related substances using the bacteria, or a mixture thereof.
  • the issue is to provide.
  • the present inventor can improve the ability to produce sulfur-containing amino acids by modifying bacteria so that the activity of the protein encoded by the yeeE gene is increased.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows. (1) Bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae, which have the ability to produce sulfur-containing amino acids and have been modified so that the activity of the protein encoded by the yeeE gene is increased. (2) The bacterium in which the activity of the protein is increased by increasing the expression amount of the yeeE gene or increasing the translation amount of the yeeE gene.
  • the bacterium, wherein the protein is the protein described in (A) or (B) below.
  • A) A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 has an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids, and contains sulfur when the intracellular activity is increased. A protein that improves amino acid production.
  • the bacterium, wherein the yeeE gene is the DNA described in the following (a) or (b).
  • (B) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13; or (b) a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 or a probe which can be prepared from the base sequence. And a DNA encoding a protein whose ability to produce sulfur-containing amino acids is improved when the intracellular activity is increased.
  • the bacterium having at least one of the following properties. i) Modified to increase serine acetyltransferase activity. ii) It has been modified to increase the expression of the ydeD gene. iii) modified to increase 3-phosphoglycerate dehydrogenase activity.
  • the bacterium as described above, wherein the bacterium is an Escherichia bacterium.
  • the bacterium as described above, wherein the bacterium is Escherichia coli.
  • the bacterium as described above, wherein the bacterium is a Pantoea bacterium.
  • the bacterium as described above, wherein the bacterium is Pantoea ananatis.
  • the bacterium is cultured in a medium, and a sulfur-containing amino acid or a related substance thereof, or a mixture thereof is collected from the medium, or a sulfur-containing amino acid or a related substance thereof, or a mixture thereof Manufacturing method.
  • the method as described above, wherein the sulfur-containing amino acid is L-cysteine.
  • the method as described above, wherein the sulfur-containing amino acid is L-cysteine and the related substance is cystine or a thiazolidine derivative.
  • the ability of bacteria to produce sulfur-containing amino acids can be improved.
  • a sulfur-containing amino acid or those related substances, or these mixtures can be manufactured efficiently.
  • the bacterium of the present invention is a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae which has a sulfur-containing amino acid-producing ability and has been modified so that the activity of a protein encoded by the yeeE gene is increased. .
  • sulfur-containing amino acids examples include L-cysteine and L-methionine, with L-cysteine being preferred.
  • the bacterium of the present invention may be capable of producing both L-cysteine and L-methionine.
  • the sulfur-containing amino acid may be a free sulfur-containing amino acid or a salt thereof, or a mixture thereof.
  • the salt include sulfate, hydrochloride, carbonate, ammonium salt, sodium salt, and potassium salt.
  • the sulfur-containing amino acid-producing ability means that, when the bacterium of the present invention is cultured in a medium, a sulfur-containing amino acid or a related substance thereof, or a mixture thereof is produced in the medium or in the cells, and the medium or The ability to accumulate to the extent that it can be recovered from the cells.
  • the bacterium having sulfur-containing amino acid-producing ability means a bacterium that can produce and accumulate in a culture medium a sulfur-containing amino acid or a related substance in a larger amount than a wild strain or a parent strain, or a mixture thereof.
  • L-cysteine produced by bacteria may be partially converted to L-cystine by a disulfide bond in the medium.
  • S-sulfocysteine may be produced by the reaction of L-cysteine and thiosulfuric acid contained in the medium (Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)).
  • L-cysteine produced in bacterial cells may be condensed with ketones or aldehydes present in the cells, such as pyruvic acid, to produce thiazolidine derivatives using hemithioketals as intermediates (see Patent No. 2992010). .
  • L-cysteine is used as a starting material for biosynthesis of ⁇ -glutamylcysteine, glutathione, cystathionine, homocysteine and the like. Therefore, these compounds can be produced by using bacteria having the ability to produce these compounds in addition to the ability to produce L-cysteine.
  • the ability to produce L-cysteine is not limited to the ability to accumulate only L-cysteine in the medium or in the cells, but includes L-cysteine, L-cystine, derivatives of L-cysteine as described above (for example, S -Sulfocysteine, thiazolidine derivatives, hemithioketals) or other compounds produced via L-cysteine as described above (eg ⁇ -glutamylcysteine, glutathione, cystathionine, homocysteine), or mixtures thereof in the medium Including the ability to accumulate in In the present invention, L-cystine, derivatives of L-cysteine as described above, and other compounds produced via L-cysteine as described above are collectively referred to as L-cysteine related substances.
  • L-methionine is a sulfur-containing amino acid that is biosynthesized using L-cysteine as one of the starting materials.
  • L-methionine is used as a starting material for biosynthesis such as S-adenosylmethionine. Therefore, when the sulfur-containing amino acid is L-methionine, S-adenosylmethionine and the like are produced by using bacteria having the ability to produce S-adenosylmethionine and the like in addition to the ability to produce L-methionine. can do.
  • the ability to produce L-methionine is not limited to the ability to accumulate only L-methionine in the medium or in the cells, but L-methionine or other compounds produced via L-methionine (for example, S-adenosylmethionine), or a mixture thereof, shall be included in the medium.
  • L-methionine-related substances other compounds produced via L-methionine as described above are referred to as L-methionine-related substances.
  • the ability to produce sulfur-containing amino acids refers to the ability to accumulate L-cysteine, an L-cysteine related substance, L-methionine, an L-methionine related substance, or a mixture thereof in a medium.
  • L-cysteine-related substances and L-methionine-related substances are also collectively referred to as sulfur-containing amino acid-related substances.
  • Bacteria having sulfur-containing amino acid-producing ability may be inherently those having sulfur-containing amino acid-producing ability. It may be modified so as to have an amino acid-producing ability.
  • the bacterium used in the present invention includes Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella
  • the parent strain of the family Enterobacteriaceae used for modification it is desirable to use, in particular, Escherichia bacteria, Enterobacter bacteria, Pantoea bacteria, Erwinia bacteria, Enterobacter bacteria, or Klebsiella bacteria.
  • the Escherichia bacterium is not particularly limited, but specifically, Neidhardt et al. (Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1 In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology / Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, DC). Among them, for example, Escherichia coli is mentioned. Specific examples of Escherichia coli include Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) derived from the prototype wild-type K12 strain, Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), and the like.
  • strains can be purchased from, for example, the American Type Culture Collection (address: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States States of America). That is, a registration number corresponding to each strain is given, and it is possible to receive a sale using this registration number (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.
  • Enterobacter bacteria examples include Enterobacter agglomerans and Enterobacter aerogenes.
  • a representative strain of the genus Enterobacter is Enterobacter agglomerans ATCC 12287. Specifically, the strains exemplified in European Patent Application Publication No. 952221 can be used.
  • Pantoea bacteria examples include Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, and Pantoea citrea.
  • Pantoea Ananatis include Pantoea Ananatis AJ13355 and SC17.
  • the SC17 strain was selected as a mucus low production mutant from AJ13355 strain (FERM BP-6614), which was isolated as a strain capable of growing on a medium containing L-glutamic acid and a carbon source at low pH from soil in Iwata City, Shizuoka Prefecture. (US Pat. No. 6,596,517).
  • Pantoea Ananatis AJ13355 was established at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (current name: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, zip code 305-8565, East of Tsukuba City, Ibaraki Prefecture. 1-chome, 1-address, 1-center, 6), deposited under the deposit number FERM P-16644, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on January 11, 1999 and given the deposit number FERM BP-6614 .
  • Pantoea Ananatis SC17 was deposited on February 4, 2009 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biology Center (address zip code 305-8656, 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki). The accession number FERM BP-11091 is assigned.
  • the Pantoea ananatis AJ13355 strain was identified as Enterobacter agglomerans at the time of isolation and deposited as the Enterobacter agromerans AJ13355 strain. Has been.
  • Examples of bacteria belonging to the genus Erwinia include Erwinia amylovora and Erwinia carotovora, and examples of the genus Klebsiella include Klebsiella plantacola.
  • Pantoea bacteria, Erbinia bacteria, Enterobacter bacteria are bacteria classified as ⁇ -proteobacteria, and are taxonomically closely related (J Gen Appl Microbiol 1997 Dec; 43 ( 6) 355-361, International Journal Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067). Therefore, some bacteria belonging to the genus Enterobacter have been reclassified as Pantoea agglomerans or Pantoea dispersa by DNA-DNA hybridization experiments, etc. (International Journal Systematic Bacteriology, July 1989) ; 39 (3) .p.337-345).
  • Enterobacter agglomerans have been reclassified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, or Pantoea stealty by 16S rRNA sequence analysis.
  • bacteria belonging to the genus Ervinia include those that have been reclassified as Pantoea ananas and Pantoea Stuarti (International Journal Systematic Bacteriology, Jan 1993; 43 (1), p.162- 173).
  • it may belong to any of the genus Enterobacter, Pantoea, Erwinia and the like.
  • An auxotrophic mutant strain capable of producing a sulfur-containing amino acid, an analog resistant strain of a sulfur-containing amino acid, or a metabolically controlled mutant strain is obtained by subjecting a parent strain or a wild strain to normal mutation treatment, that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or N-methyl -N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or treatment with a mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS), etc., among the obtained mutant strains, auxotrophy, analog resistance, or metabolism It can be obtained by selecting those exhibiting a controlled mutation and having the ability to produce sulfur-containing amino acids.
  • normal mutation treatment that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or N-methyl -N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or treatment with a mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS), etc.
  • L-cysteine-producing ability is imparted or enhanced, and L-cysteine-producing bacteria
  • L-cysteine-producing bacteria L-cysteine producing ability of bacteria is the production of compounds that are substrates of the pathway, such as enzymes of the L-cysteine biosynthetic pathway or L-serine. It can be improved by enhancing the activity of the enzyme involved, such as 3-phosphoglycerate dehydrogenase or serine acetyltransferase. 3-Phosphoglycerate dehydrogenase is subject to feedback inhibition by serine, but by allowing the bacteria to retain a mutant serA gene encoding a mutant 3-phosphoglycerate dehydrogenase in which this feedback inhibition is reduced or eliminated, The activity can be enhanced.
  • Serine acetyltransferase is also subject to feedback inhibition by L-cysteine. Therefore, the enzyme activity can be enhanced by allowing a bacterium to retain a mutant cysE gene encoding serine acetyltransferase in which this feedback inhibition is reduced or eliminated.
  • ydeD gene encodes a ydeD gene encoding YdeD protein (Dabler et al., Mol. Microbiol.
  • the ability to produce L-cysteine can also be increased by enhancing the expression of the yeastS gene (European Patent Application Publication No. 1016710).
  • the L-cysteine-producing bacterium preferably has at least one of the following properties. i) Modified to increase serine acetyltransferase activity. ii) It has been modified to increase the expression of the ydeD gene. iii) modified to increase 3-phosphoglycerate dehydrogenase activity.
  • L-cysteine production ability can be improved by enhancing the activity of the sulfate / thiosulfate transport system.
  • the sulfate / thiosulfate transport system protein group is encoded by the cysPTWAM gene cluster (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-137369, EP1528108).
  • Escherichia coli JM15 strain (US Pat. No. 6,218,168) transformed with a plurality of cysE alleles encoding a feedback inhibition resistant serine acetyltransferase (SAT). No.
  • Escherichia coli W3110 strain (US Pat. No.
  • pACYC-DES is a plasmid obtained by inserting the three genes into pACYC184, and each gene is controlled by the PompA promoter.
  • cystathionine- ⁇ -lyase (metC product, JP-A-11-155571, Chandra55et. Al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)
  • Tryptophanase (tnaA product, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-169668, (Austin Newton et. Al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218)
  • O-acetylserine sulfhydrylase B (cysM gene product) JP, 2005-245311), and malY gene product (JP 2005-245311) are known.
  • cystathionine- ⁇ -lyase (metC product, JP-A-11-155571, Chandra55et. Al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)
  • Tryptophanase (tnaA product, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-169668, (Austin Newton et. Al., J. Bio
  • the L-cysteine-producing bacterium preferably retains a mutant SAT that is resistant to feedback inhibition.
  • a mutant SAT having resistance to feedback inhibition derived from Escherichia coli a mutant SAT in which the methionine residue at position 256 is substituted with a glutamic acid residue (Japanese Patent Laid-Open No. 11-155571), the methionine residue at position 256 Mutant SAT (Denk, D. and Boeck, A., J.
  • the SAT gene is not limited to the Escherichia coli gene, and any gene that encodes a protein having SAT activity can be used.
  • an SAT isozyme derived from Arabidopsis that is not subject to feedback inhibition by L-cysteine is known, and a gene encoding this can also be used (FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459).
  • the ability to produce L-cysteine can be imparted or enhanced by introducing and expressing a gene encoding SAT, particularly a gene encoding a mutant SAT resistant to feedback inhibition.
  • the activity of these proteins can be increased by increasing the copy number of genes encoding proteins such as SAT.
  • the ability to produce compounds such as ⁇ -glutamylcysteine, glutathione, cystathionine, and homocysteine biosynthesized using L-cysteine as a starting material also enhances the enzyme activity in the biosynthetic pathway of the target compound or its biosynthesis It can be imparted or enhanced by reducing the activity of the enzyme of the pathway branched from the pathway or the enzyme that degrades the target compound.
  • the ability to produce ⁇ -glutamylcysteine can be enhanced by enhancing ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity and / or decreasing glutathione synthetase activity.
  • the ability to produce glutathione can be imparted or enhanced by enhancing ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity and / or glutathione synthetase activity.
  • the ability to produce ⁇ -glutamylcysteine or glutathione can also be enhanced by using a mutant ⁇ -glutamylcysteine synthetase that is resistant to feedback inhibition by glutathione.
  • the production of glutathione is described in detail in a review by Li et al. (Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 233-242).
  • cystathionine and homocysteine are intermediates in the L-methionine biosynthetic pathway, in order to enhance the production ability of these substances, it is effective to use a part of the method for enhancing the production ability of L-methionine described later. It is.
  • Specific methods for enhancing cystathionine-producing ability include a method using a methionine-requiring mutant (Japanese Patent Application No. 2003-010654), cysteine (or a biosynthetic raw material thereof) and / or homoserine (or a biosynthetic raw material) in a fermentation medium. Is known (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-168422). Since homocysteine uses cystathionine as a precursor, the above method for enhancing cystathionine production ability is also effective for enhancing homocysteine production ability.
  • L-methionine-producing ability can be imparted or enhanced by imparting L-threonine requirement or norleucine resistance to bacteria (Japanese Patent Laid-Open No. 2000). -139471).
  • the gene for an enzyme involved in the biosynthesis of L-threonine exists as the threonine operon (thrABC).
  • thrABC threonine operon
  • the ability to biosynthesize after L-homoserine has been lost by deleting the thrBC moiety.
  • L-threonine-requiring strains can be obtained.
  • S-adenosylmethionine synthetase activity is weakened and L-methionine producing ability is imparted or enhanced.
  • S-adenosylmethionine synthetase is encoded by the metK gene.
  • L-methionine production ability is enhanced by the activities of enzymes involved in L-methionine biosynthesis such as methionine repressor deficiency, homoserine transsuccinylase, cystathionine ⁇ -synthase, and aspartokinase-homoserine dehydrogenase II.
  • the methionine repressor is encoded by the metJ gene
  • the homoserine transsuccinylase is encoded by the metA gene
  • the cystathionine ⁇ -synthase is encoded by the metB gene
  • the aspartokinase-homoserine dehydrogenase II is encoded by the metL gene.
  • the ability to produce L-methionine can also be imparted or enhanced by using a mutant homoserine transsuccinylase resistant to feedback inhibition by methionine (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-139471, US20090029424).
  • L-methionine is biosynthesized using L-cysteine as an intermediate, L-methionine production ability is improved by improving L-cysteine production ability (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-139471, US20080311632). Therefore, in order to impart or enhance L-methionine production ability, the above method for imparting or enhancing L-cysteine production ability is also effective.
  • L-methionine-producing bacteria and parent strains used to construct them include AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ11542 (NRRL B-12402) (British Patent No. 2075055), L-methionine analog 218 strains (VKPM B-8125) (Russian Patent No. 2209248) having resistance to norleucine and 73 strains (VKPM (B-8126) (( Russian) Patent No. 2215782), etc.
  • L-methionine-producing bacteria and parent strains used to construct them include AJ13425 (FERM P-16808) derived from E. coli W3110 (special No.
  • AJ13425 lacks a methionine repressor, weakens intracellular S-adenosylmethionine synthetase activity, and intracellular homoserine transsuccinylase activity, Cystathionine ⁇ -synthase activity and aspar L-threonine-requiring strain with enhanced tokinase-homoserine dehydrogenase II activity AJ13425 was launched on May 14, 1998 from the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. The depository number is FERM P-16808, which is deposited at the Institute for Patent Biological Depository, Address Postal Code 305-8566 (1st, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture).
  • the ability to produce compounds such as S-adenosylmethionine biosynthesized using L-methionine as a starting material also enhances the enzyme activity of the biosynthetic pathway of the target compound or branches off from the biosynthetic pathway. It can be imparted or enhanced by reducing the activity of the enzyme of the pathway or the enzyme that degrades the target compound.
  • the ability to produce S-adenosylmethionine can be imparted or enhanced by enhancing methionine adenosyltransferase (EP0647712, EP1457569) or enhancing excretion factor MdfA (US7410789).
  • the bacterium of the present invention is a protein belonging to the family Enterobacteriaceae having the ability to produce sulfur-containing amino acids as described above (hereinafter referred to as “YeeE”). Or may be described as “YeeE protein”) to increase activity.
  • YeeE sulfur-containing amino acids as described above
  • the sulfur-containing amino acid-producing ability may be imparted or enhanced after modification so that the activity of the YeeE protein is increased.
  • the activity of the protein encoded by the yeeE gene is increased means that the activity of the YeeE protein encoded by the yeeE gene is increased relative to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • the activity of the protein is not particularly limited as long as it is increased compared to the non-modified strain, but is preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more compared to the non-modified strain. To increase.
  • the activity of the protein encoded by the yeeE gene is increased means not only an increase in the activity of the YeeE protein in a strain that originally has the activity of the YeeE protein, but also a strain that originally does not have the activity of the YeeE protein. Conferring the activity of the YeeE protein. That is, for example, Pantoea ananatis does not have the yeeE gene, but includes imparting the activity of the YeeE protein to Pantoea ananatis.
  • Modifications that increase the activity of the YeeE protein are achieved, for example, by enhancing the expression of the yeeE gene.
  • the modification for enhancing the expression of the yeeE gene can be performed, for example, by increasing the copy number of the gene in the cell using a gene recombination technique.
  • a DNA fragment containing the yeeE gene may be ligated with a vector that functions in a host bacterium, preferably a multicopy vector, to produce a recombinant DNA, which is introduced into the bacterium and transformed.
  • the vector include a vector capable of autonomous replication in a host bacterial cell.
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, are introduced into the DNA-receptor cells in a protoplast or spheroplast state that readily incorporates recombinant DNA.
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast.
  • increasing the number of copies of the yeeE gene can also be achieved by making multiple copies of the above-described yeeE gene on the bacterial genomic DNA.
  • homologous recombination is performed using a sequence present in multiple copies on the genomic DNA as a target.
  • a sequence present in multiple copies on genomic DNA a repetitive DNA sequence (inverted repeat) present at the end of a transposable element can be used. Further, it may be linked in tandem beside the yeeE gene present on the genome, or may be redundantly incorporated on an unnecessary gene on the genome.
  • the expression of the yeeE gene is regulated by the method described in International Publication No. 00/18935 pamphlet and the expression regulation of each promoter of the yeeE gene on genomic DNA or plasmid Replace the sequence with a strong one, bring the -35 and -10 regions of each gene closer to the consensus sequence, amplify a regulator that increases the expression of the yeeE gene, or decrease the expression of the yeeE gene It can also be achieved by deleting or weakening such regulators.
  • a strong promoter for example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, araBA promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, T7 promoter, ⁇ 10 promoter and the like are known.
  • the promoter of the threonine operon of Escherichia coli can also be used. It is also possible to introduce a base substitution or the like into the promoter region or SD region of the yeeE gene and modify it to a stronger one.
  • the SD region sequence can be directly replaced with the SD region sequence downstream of the ⁇ 10 promoter.
  • the expression regulatory region such as the promoter of the yeeE gene can also be determined using a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX. These promoter substitutions or modifications enhance the expression of the yeeE gene. For example, a method using a temperature sensitive plasmid or a Red driven integration method (WO2005 / 010175) can be used for the replacement of the expression regulatory sequence.
  • Modifications that increase the expression level of the yeeE gene can be achieved, for example, by modulating a regulator that positively regulates the expression of the yeeE gene or a regulator that negatively regulates the expression of the yeeE gene.
  • a regulator that positively regulates the expression of the yeeE gene or a regulator that negatively regulates the expression of the yeeE gene.
  • those belonging to the LysR family and the like are listed as control factors, and can be found using a database EcoCyc (http://ecocyc.org/) or the like.
  • An increase in the transcription amount of the yeeE gene or an increase in the amount of YeeE protein may be observed by modulating the regulatory factor.
  • the increase in expression of the yeeE gene can be confirmed by confirming that the amount of transcription of the yeeE gene has increased, or by confirming that the amount of YeeE protein has increased.
  • Confirmation that the transcription amount of the yeeE gene has increased can be performed by comparing the amount of mRNA transcribed from the same gene with a wild strain or an unmodified strain.
  • methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, and the like (Molecular cloning (Cold spring Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). It is preferable that the amount of mRNA increases, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more as compared with the unmodified strain.
  • the amount of the protein is preferably increased by 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more, for example, compared to the unmodified strain.
  • recombinant DNA can be introduced into bacteria by the same method, and the copy number of the gene can be increased.
  • the yeeE gene of Escherichia coli K12 MG1655 strain corresponds to the complementary sequence of sequences 2082491 to 2083549 in the genome sequence registered as GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI: 49175990) in the NCBI database.
  • the yeeE gene of Escherichia coli K12 MG1655 strain is synonymous with ECK2007 and JW1995.
  • the nucleotide sequence of the EE1 gene of the MG1655 strain and the amino acid sequence encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively.
  • the yeeE gene that has been modified to increase the activity of the YeeE protein has the base sequence shown in SEQ ID NO: 13. It may be a variant.
  • a variant of the yeeE gene can be searched by BLAST or the like with reference to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 (http://blast.genome.jp/).
  • the variant of a yeeE gene contains the homologue of the same gene.
  • the homologue of the gene can be amplified by PCR using, for example, a synthetic oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, using a chromosome of a microorganism such as Enterobacteriaceae or coryneform bacteria as a template. Gene.
  • Examples of yeeE gene homologues of bacteria other than Escherichia coli include the following bacterial yeeE genes (Table 1).
  • identity indicates the identity by BLAST of the YeeE protein (SEQ ID NO: 14) of Escherichia coli K12 strain and the homologue of each bacterium.
  • accession number indicates the accession number of the NCBI database.
  • the yeeE gene encodes a protein that enhances the ability to produce sulfur-containing amino acids when the intracellular activity is increased, 1 is present at one or several positions in the amino acid sequence of the YeeE protein as described above.
  • it may be a gene encoding a protein having a sequence including substitution, deletion, insertion or addition of several amino acids.
  • the “one or several” differs depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, More preferably, it means 1 to 5.
  • One or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions described above are conservative mutations in which the function of the protein is maintained normally.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is, for example, when the substitution site is an aromatic amino acid, between Phe, Trp, and Tyr, and when the substitution site is a hydrophobic amino acid, between Leu, Ile, and Val, a polar amino acid Is an amino acid having a hydroxyl group between Lys, Arg and His when it is a basic amino acid, and between Asp and Glu when it is an acidic amino acid.
  • it is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, Met to Ile, L u, Val or Phe substitution, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu substitution, Ser to Thr or Ala substitution, Thr to Ser or Ala substitution, Trp to Phe or Tyr substitution , Sub
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences or species differences of microorganisms from which genes are derived. Also included by mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences or species differences of microorganisms from which genes are derived. Also included by mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences or species differences of microorganisms from which genes are derived. Also included by
  • the gene having a conservative mutation as described above is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97%, based on the entire amino acid sequence of the YeeE protein as described above. As described above, it may be a gene encoding a protein having a homology of 99% or more and improving the ability to produce sulfur-containing amino acids when the intracellular activity is increased.
  • “homology” may refer to “identity”.
  • the yeeE gene hybridizes under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, the complementary sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13, and encodes a protein having a function equivalent to that of the YeeE protein. It may be DNA.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, highly homologous DNAs, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more DNAs having homology.
  • the probe may be a part of a gene complementary sequence.
  • a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • gene and protein variants can be applied mutatis mutandis to enzymes such as serine acetyltransferase and 3-phosphoglycerate dehydrogenase, or YdeD proteins, and genes encoding them.
  • the yeeD gene exists downstream of the yeeE gene, and both genes are considered to form an operon (database “EcoCys”; http://ecocyc.org/, database “ RegulonDB "; http://regulondb.ccg.unam.mx/).
  • the gene group forming the operon often has a common function or a related function. Therefore, when a modification that increases the activity of the YeeE protein exerts some effect, the modification that increases the activity of the YeeD protein may exhibit the same effect.
  • a modification that increases the activity of the YeeD protein may be performed together with a modification that increases the activity of the YeeE protein.
  • bacterium of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, and the sulfur-containing amino acid or the compounds thereof are cultured from the medium. These compounds can be produced by collecting the related substances or a mixture thereof.
  • the sulfur-containing amino acid is L-cysteine
  • examples of L-cysteine-related substances include S-sulfocysteine, thiazolidine derivatives, hemithioketals corresponding to the thiazolidine derivatives described above.
  • sulfur-containing amino acid is L-methionine
  • examples of the related substance of L-methionine include the aforementioned S-adenosylmethionine.
  • Examples of the medium to be used include a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic ions, and other organic components as required.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysate, and organic acids such as fumaric acid, citric acid, and succinic acid.
  • the nitrogen source examples include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
  • sulfur source examples include inorganic sulfur compounds such as sulfate, sulfite, sulfide, hyposulfite, and thiosulfate.
  • an organic trace nutrient source it is desirable to contain an appropriate amount of a required substance such as vitamin B1 or a yeast extract.
  • a required substance such as vitamin B1 or a yeast extract.
  • potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added in small amounts as necessary.
  • Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions for 30 to 90 hours, and the culture temperature is preferably controlled at 25 ° C. to 37 ° C. and the pH during culture is preferably controlled at 5 to 8.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment.
  • the collection of sulfur-containing amino acids from the culture can be carried out by combining ordinary ion exchange resin methods, precipitation methods and other known methods.
  • L-cysteine obtained as described above can be used for the production of L-cysteine derivatives.
  • L-cysteine derivatives include methylcysteine, ethylcysteine, carbocysteine, sulfocysteine, acetylcysteine and the like.
  • the thiazolidine derivative of L-cysteine when the thiazolidine derivative of L-cysteine accumulates in the medium, the thiazolidine derivative is collected from the medium, and the reaction equilibrium between the thiazolidine derivative and L-cysteine is shifted to the L-cysteine side. Can be manufactured. Further, when S-sulfocysteine accumulates in the medium, it can be converted to L-cysteine by reduction using a reducing agent such as dithiothreitol.
  • L-cysteine producing bacteria Mutant cysE (US20050112731 (A1)) encoding mutant serine acetyltransferase with reduced feedback inhibition by L-cysteine, ydeD gene (US5972663A) encoding L-cysteine excretion factor ), And pACYC-DES having a mutant serA gene (US6180373) encoding 3-phosphoglycerate dehydrogenase with reduced feedback inhibition by L-serine on one plasmid, Escherichia coli MG1655 strain and Pantoea ananatis It was introduced into the SC17 strain, and L-cysteine producing bacteria MG1655 / pACYC-DES and SC17 / pACYC-DES were constructed.
  • the threonine residue at position 167 is substituted with an alanine residue.
  • the 3-phosphoglycerate dehydrogenase lacks the tyrosine residue at position 410.
  • the construction of pACYC-DES is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-137369 (US20050124049 (A1), EP1528108 (A1)).
  • the PCR cycle is as follows. 95 ° C 3 minutes, 95 ° C 60 seconds, 50 ° C 30 seconds, 72 ° C 40 seconds 2 cycles, 94 ° C 20 seconds, 55 ° C 20 seconds, 72 ° C 15 seconds 25 cycles, finally 72 ° C 5 minutes.
  • the obtained fragment was digested with SalI and PaeI and inserted into the SalI-PaeI site of pMIV-5JS (JP 2008-99668) to obtain plasmid pMIV-Pnlp0.
  • the base sequence of the PaeI-SalI fragment of the Pnlp0 promoter inserted into this pMIV-Pnlp0 plasmid is as shown in SEQ ID NO: 3.
  • a DNA fragment containing about 300 bp of the terminator region of the rrnB gene is obtained by PCR using primer P3 (agctgatctagaaaacagaatttgcctggcggc: SEQ ID NO: 4) and primer P4 (agctgaggatccaggaagagtttgtagaaacgc: SEQ ID NO: 5). did. Restriction enzymes XbaI and BamHI sites are designed at the 5 ′ ends of these primers, respectively.
  • the PCR cycle is as follows.
  • the obtained fragment was digested with XbaI and BamHI and inserted into the XbaI-BamHI site of pMIV-Pnlp0 to obtain plasmid pMIV-Pnlp0-ter.
  • a DNA fragment of about 700 bp containing the yeastS gene was obtained by PCR using primer P5 (agctgagtcgacgtgttcgctgaatacggggt: SEQ ID NO: 6) and primer P6 (agctgatctagagaaagcatcaggattgcagc: SEQ ID NO: 7). Restriction enzymes SalI and XbaI sites are designed at the 5 ′ ends of these primers, respectively.
  • the PCR cycle is as follows.
  • the obtained fragment was digested with SalI and XbaI and inserted into the SalI-XbaI site of pMIV-Pnlp0-ter to obtain plasmid pMIV-Pnlp0-YeaS3.
  • an expression unit of yeastS was constructed in which the nlpD promoter, the yeastS gene, and the rrnB terminator were connected in this order on the pMIV-5JS vector.
  • the nlpD promoter region (FIG. 1) has two regions that are presumed to function as promoters.
  • the -10 region and the -35 region are represented by P1 (-10) and P1 (-35), and P2 ( ⁇ 10) and P2 ( ⁇ 35).
  • the -10 region (P1 (-10)) contained in the 3 'end of the nlpD promoter is randomized by PCR using the primer P1 and the primer P7 (atcgtgaagatcttttccagtgttnannagggtgccttgcacggtnatnangtcactgg: SEQ ID NO: 8).
  • the obtained DNA fragment was obtained.
  • the PCR cycle is as follows. 95 ° C 3 minutes, 95 ° C 60 seconds, 50 ° C 30 seconds, 72 ° C 40 seconds 2 cycles, 94 ° C 20 seconds, 60 ° C 20 seconds, 72 ° C 15 seconds 25 cycles, finally 72 ° C 5 minutes.
  • the PCR cycle is as follows. 95 ° C 3 minutes, 95 ° C 60 seconds, 50 ° C 30 seconds, 72 ° C 40 seconds 2 cycles, 94 ° C 20 seconds, 60 ° C 20 seconds, 72 ° C 15 seconds 25 cycles, and finally 72 ° C 5 minutes.
  • the obtained 3′-end and 5′-end fragments can be joined together by the BglII sites designed for the primers P7 and P8 to construct a full length nlpD promoter in which two ⁇ 10 regions are randomized. be able to.
  • a DNA fragment of the modified nlpD promoter full length was obtained by PCR using P1 and P2 as primers.
  • the PCR cycle is as follows. 95 ° C 3 minutes, 95 ° C 60 seconds, 50 ° C 30 seconds, 72 ° C 40 seconds 2 cycles, 94 ° C 20 seconds, 60 ° C 20 seconds, 72 ° C 15 seconds 12 cycles, and finally 72 ° C 5 minutes.
  • the amplified fragment is digested with the restriction enzymes SalI and PaeI designed at the 5 ′ end of the primer, and inserted into the plasmid pMIV-Pnlp0-YeaS3, which is also digested with SalI and PaeI, so that the wild-type nlpD promoter site on the plasmid (Pnlp0) was replaced with mutant Pnlp.
  • the one having the promoter sequence (Pnlp8) shown in SEQ ID NO: 10 was selected and named pMIV-Pnlp8-YeaS7.
  • the base sequence of the PaeI-SalI fragment of the Pnlp8 promoter inserted into this plasmid is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the Pnlp8 promoter is a stronger promoter than the Pnlp0 promoter.
  • Amplification of the Escherichia coli yeeE gene was carried out using the MG1655 strain genomic DNA as a template, yeeE (Ec) SalI-F (acgcgtcgacatgttttcaatgatattaagcgggc: SEQ ID NO: 11), yeeE (Ec) XbaI-R (ctagtctagattaatttgccgcagt
  • the PCR cycle (94 ° C., 5 minutes, 98 ° C., 5 seconds, 55 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 90 seconds, 30 cycles, finally 4 ° C. incubation) was used. SalI and XbaI sites are designed at both ends of the primer.
  • the amplified fragment was digested with SalI and XbaI and inserted into pMIV-Pnlp8-YeaS7, which was also digested with SalI and XbaI, to prepare pMIV-Pnlp8-eeE (Ec). Also, pMIV-5JS (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-99668) was used as the corresponding empty vector (for control).
  • the DNA sequence of the yeeE gene is shown in SEQ ID NO: 13, and the predicted amino acid sequence of the yeeE gene product is shown in SEQ ID NO: 14.
  • L-cysteine production culture Escherichia coli
  • Escherichia coli MG1655 / pACYC-DES was transformed into the yE overexpression plasmid pMIV-Pnlp8-yeE.
  • Ec and the strain introduced with the empty vector pMIV-5JS for control were subjected to fermentation production culture, and the production amounts of L-cysteine and L-cysteine related compounds were compared.
  • an L-cysteine production medium having the following composition was used.
  • Sterilization was performed by autoclaving at 110 ° C. for 30 minutes (components 1 and 2), dry heat sterilization (component 5) at 180 ° C. for 5 hours or more, and filter sterilization (components 3 and 4).
  • L-cysteine production culture was performed according to the following procedure. Each L-cysteine-producing bacterium is spread on LB agar medium, pre-cultured overnight at 37 ° C., and then about 7 cm of cells on a plate with a 10 microliter inoculation loop (NUNC Blue Loop) 3 times (3 loops), inoculated into the above L-cysteine production medium with 2 ml in a large test tube (inner diameter 23 mm, length 20 cm), and the amount of cells at the start of culture is almost the same. It was prepared so that it might become. Shaking culture was performed at 32 ° C., and the culture was terminated after 30 hours.
  • NUNC Blue Loop 10 microliter inoculation loop
  • L-cysteine including some L-cysteine-related substances such as cystine
  • the quantification of L-cysteine (including some L-cysteine-related substances such as cystine) produced in the medium was determined by Gaiton, M. et al. K. (Biochem J. 1967 Aug; 104 (2): 627-33.). Each strain was tested in quadruplicate, and L-cysteine yield (average value), standard deviation, and L-cysteine yield relative to glucose consumed are shown in Table 2. Overexpression of the yeeE gene increased the accumulated concentration of L-cysteine. Thus, it was revealed that L-cysteine production can be improved by increasing the activity of the YeeE protein.
  • L-cysteine production culture (Panteoanaanatis)
  • the above-described L-cysteine producing bacterium Pantoea ananatis SC17 / pACYC-DES was transformed into the yE overexpression plasmid pMIV-Pnlp8-yeE ( Ec) and a strain introduced with the control empty vector pMIV-5JS were subjected to fermentation production culture, and the production amounts of L-cysteine and L-cysteine related compounds were compared.
  • L-cysteine production culture and the L-cysteine quantification method are almost the same as those in the above-mentioned Example of Escherichia coli. However, the amount of inoculation was 1 loop and the culture time was 22 hours. Each strain was tested in quadruplicate, and L-cysteine yield (average value), standard deviation, and L-cysteine yield relative to glucose consumed are shown in Table 3. Overexpression of the yeeE gene increased the accumulated concentration of L-cysteine. Thus, it was revealed that L-cysteine production can be improved by increasing the activity of the YeeE protein.
  • the ability of bacteria to produce sulfur-containing amino acids can be improved, and sulfur-containing amino acids or their related substances, or mixtures thereof can be efficiently produced.

Abstract

　細菌の含硫アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、含硫アミノ酸生産菌、及び同細菌を用いた含硫アミノ酸等の化合物の製造法を提供する。含硫アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質、例えば下記の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地中で培養し、該培地から含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を採取することによって、これらの化合物を製造する。 （Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。 （Ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列からなる、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質。

Description

含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法
　本発明は、Ｌ－システイン等の含硫アミノ酸又はその関連物質の製造法に関し、詳しくは含硫アミノ酸又はその関連物質の製造に好適な細菌、及びそれを用いた含硫アミノ酸又はその関連物質の製造法に関する。含硫アミノ酸及びその関連物質は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。
　従来、Ｌ－システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ－２－アミノチアゾリン－４－カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ－システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ－システインの生産も試みられている。
　Ｌ－システイン生産能を有する微生物としては、例えば、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ－システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ－システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２～４）。
　また、Ｌ－システイン分解系を抑制することによってＬ－システイン生産能が高められた微生物としては、シスタチオニン－β－リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献５）、Ｏ－アセチルセリンスルフヒドリラーゼＢ（特許文献６）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。
　さらに、ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている（非特許文献１）。また、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ遺伝子座、ｅｍｒ遺伝子座、ａｃｒ遺伝子座、ｃｍｒ遺伝子座、ｍｅｘ遺伝子、ｂｍｒ遺伝子、若しくはｑａｃＡ遺伝子（特許文献７）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ若しくはｃｕｓＡ遺伝子（特許文献８）の発現を上昇させることによりＬ－システイン生産能を高める技術が知られている。
　また、Ｌ－システイン生産菌として、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ（特許文献９）が知られている。
　さらに、セリンによるフィードバック阻害が低減された３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡが知られており、エシェリヒア・コリのＬ－システイン生産に利用することが示唆されている（特許文献１０、１１）。
　また、メチオニンは、工業的には主に化学合成によりＤＬ体として製造される。Ｌ体が必要な場合は、ＤＬ体をアセチル化してＮ－アセチル－ＤＬ－メチオニンとし、酵素的にＬ体だけを脱アセチル化することによって製造できる。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ－メチオニンの生産も試みられている。Ｌ－メチオニン生産菌としては、Ｌ－メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、さらに細胞内のＳ－アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、Ｌ－スレオニン要求性を示し、細胞内のシスタチオニンγ－シンターゼ活性及びアスパルトキナーゼ－ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたエシェリヒア・コリ（特許文献１２）等が知られている。
　ｙｅｅＥ遺伝子は、膜透過に関わると推定されるタンパク質（putative transport system permease protein）をコードする遺伝子としてデータベースＥｃｏＣｙｃ（非特許文献２）に登録されている。また、膜タンパク質予測プログラムＳＯＳＵＩ(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)を用いて解析すると、ＹｅｅＥは９回膜貫通型の膜タンパク質であると予想される。よって、何らかのトランスポータであると推定されるが、実際の機能は不明であり、含硫アミノ酸生産との関連は知られていない。
　また、ｙｅｅＥ遺伝子は、カドミウムにより（非特許文献３）、亜鉛により（非特許文献４）、ＣＯ放出剤であるＣＯＲＭ－２により（非特許文献５）、ＲｐｏＥ依存で定常期の初期に（非特許文献６）、及び、ヒトの体温である３７℃の温度条件により（非特許文献７）アップレギュレートされることが報告されている。また、酢酸により（非特許文献８）、ウルソール酸により（非特許文献９）、及び、ＩＨＦ（－）株において（非特許文献１０）ダウンレギュレートされることが報告されている。しかしながら、いずれもマイクロアレイ実験において発現変動のあった多くの遺伝子の一つとして挙げられているのみであり、含硫アミノ酸生産との関連は示唆されていない。
特開２００２－２３３３８４号公報 特開平１１－１５５５７１号公報 米国特許出願公開第２００５０１１２７３１号 米国特許第６２１８１６８号 特開２００３－１６９６６８号公報 特開２００５－２４５３１１号公報 米国特許第５９７２６６３号 特開２００５－２８７３３３号公報 国際公開パンフレット第０１／２７３０７号 米国特許第５８５６１４８号 米国特許出願公開第２００５０００９１６２号 米国特許第７６１１８７３号
Dassler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000) BioCyc Home Page, Escherichia coli K-12 substr. MG1655 Gene: ｙｅｅＥ [平成２２年７月１３日検索]、インターネット< http://biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE?type=GENE&object=EG11895> Kerstin et al., J. Bacteriol., Aug 2008; 190: 5439 - 5454 Kaneyoshi et al., J. Bacteriol., Sep 2005; 187: 6333 - 6340 Ligia S. Nobre et al., Microbiology, Mar 2009; 155: 813 - 824 Md. Shahinur Kabir et al., Microbiology, Aug 2005; 151: 2721 - 2735. Christine A. et al., J. Bacteriol., Aug 2007; 189: 5429 - 5440 Carrie N. Arnold et al., J. Bacteriol., Apr 2001; 183: 2178 - 2186. Dacheng Ren et al., Appl. Envir. Microbiol., Jul 2005; 71: 4022 - 4034. Stuart M. Arfin et al., J. Biol. Chem., Sep 2000; 275: 29672
　本発明は、細菌の含硫アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、含硫アミノ酸生産菌、及び同細菌を用いた含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように細菌を改変することによって含硫アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）含硫アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
（２）ｙｅｅＥ遺伝子の発現量を増大させること、又は、ｙｅｅＥ遺伝子の翻訳量を増大させることにより、前記タンパク質の活性が増大した、前記細菌。
（３）ｙｅｅＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ｙｅｅＥ遺伝子の発現量が増大した、前記細菌。
（４）前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である前記細菌。
　（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
　（Ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質。
（５）前記ｙｅｅＥ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記細菌。
　（ａ）配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、または
　（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）さらに、下記の性質の少なくともいずれかを有する前記細菌。
ｉ）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
ｉｉ）ｙｄｅＤ遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
ｉｉｉ）３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
（７）前記細菌がエシェリヒア属細菌である、前記細菌。
（８）前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記細菌。
（９）前記細菌がパントエア属細菌である、前記細菌。
（１０）前記細菌がパントエア・アナナティスである、前記細菌。
（１１）前記細菌を培地中で培養し、該培地から含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
（１２）前記含硫アミノ酸がＬ－システインである、前記方法。
（１３）前記含硫アミノ酸がＬ－システインであり、前記関連物質がシスチン又はチアゾリジン誘導体である、前記方法。
　本発明により、細菌の含硫アミノ酸生産能を向上させることができる。また、本発明によれば、含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。
野生型ｎｌｐＤプロモーター（Ｐｎｌｐ：配列番号１５）、及び、変異型ｎｌｐＤプロモーター（Ｐｎｌｐ８：配列番号１６）と、ｙｅａＳ遺伝子との連結部位の配列を示す図。
＜１＞本発明の細菌
　本発明の細菌は、含硫アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。
　含硫アミノ酸としては、Ｌ－システイン及びＬ－メチオニンが挙げられ、Ｌ－システインが好ましい。また、本発明の細菌は、Ｌ－システイン及びＬ－メチオニンの両方の生産能を有するものであってもよい。
　また、本発明において含硫アミノ酸とは、フリー体の含硫アミノ酸もしくはその塩、又はそれらの混合物であってもよい。塩としては、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
　ここで、含硫アミノ酸生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内に含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。また、含硫アミノ酸生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量の含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味し、好ましくは、０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上の量の含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味する。
　含硫アミノ酸がＬ－システインである場合には、細菌が産生したＬ－システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ－シスチンに変換することがある。また、Ｌ－システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ－スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ－システインは、細胞中に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第２９９２０１０号参照）。これらのチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。また、Ｌ－システインは、γ－グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン等の生合成の出発物質として用いられる。したがって、Ｌ－システイン生産能に加えて、これらの化合物を産生する能力を有する細菌を用いることによって、これらの化合物を製造することができる。本発明において、Ｌ－システイン生産能とは、Ｌ－システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、前記のようなＬ－システインの誘導体（例えばＳ－スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、ヘミチオケタール）、もしくは前記のようなＬ－システインを経由して生産される他の化合物（例えばγ－グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン）、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力を含むものとする。また、本発明において、Ｌ－シスチン、前記のようなＬ－システインの誘導体、及び前記のようなＬ－システインを経由して生産される他の化合物をまとめてＬ－システインの関連物質という。
　Ｌ－メチオニンはＬ－システインを出発物質の一つとして生合成される含硫アミノ酸である。また、Ｌ－メチオニンは、Ｓ－アデノシルメチオニン等の生合成の出発物質として用いられる。したがって、含硫アミノ酸がＬ－メチオニンである場合には、Ｌ－メチオニン生産能に加えて、Ｓ－アデノシルメチオニン等を生産する能力を有する細菌を用いることによって、Ｓ－アデノシルメチオニン等を製造することができる。本発明において、Ｌ－メチオニン生産能とは、Ｌ－メチオニンのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ－メチオニン、もしくはＬ－メチオニンを経由して生産される他の化合物（例えばＳ－アデノシルメチオニン）、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力を含むものとする。本発明において、前記のようなＬ－メチオニンを経由して生産される他の化合物をＬ－メチオニンの関連物質という。
　本発明において、含硫アミノ酸生産能とは、Ｌ－システイン、Ｌ－システインの関連物質、Ｌ－メチオニン、もしくはＬ－メチオニンの関連物質、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力をいう。また、本発明において、Ｌ－システインの関連物質とＬ－メチオニンの関連物質を総称して含硫アミノ酸の関連物質ともいう。
　含硫アミノ酸生産能を有する細菌としては、本来的に含硫アミノ酸生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えＤＮＡ技術を利用して、含硫アミノ酸生産能を有するように改変したものであってもよい。
　本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)属など、腸内細菌科に属する細菌であって、Ｌ－アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌、又はクレブシエラ属細菌を用いることが望ましい。
　エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはＮｅｉｄｈａｒｄｔらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ　２７３２５）、エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ　４７０７６）等が挙げられる。
　これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
　エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。エンテロバクター属の代表的な株としては、エンテロバクター・アグロメランス　ＡＴＣＣ　１２２８７株が挙げられる。また、具体的には、欧州特許出願公開９５２２２１号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
　パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ　ｃｉｔｒｅａ）が挙げられる。
　パントエア・アナナティスとしては、具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株、ＳＣ１７株が挙げられる。ＳＣ１７株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ－グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離されたＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１４）から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第６，５９６，５１７号）。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所　郵便番号３０５－８５６６　茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１４が付与されている。また、パントエア・アナナティスＳＣ１７株は、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所　郵便番号３０５－８５６６　　茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０９１が付与されている。尚、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５株として寄託されたが、近年１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
　エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）が挙げられる。
　なお、特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ－プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067）。よって、エンテロバクター属に属する細菌には、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション実験等により、パントエア・アグロメランス又はパントエア・ディスパーサ（Ｐａｎｔｏｅａ　ｄｉｓｐｅｒｓａ）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスには、１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、又はパントエア・スチューアルティに再分類されているものがある。また、エルビニア属に属する細菌には、パントエア・アナナス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｓ）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173  参照）。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属、パントエア属、及びエルビニア属等のいずれに属するものであってもよい。
　以下、腸内細菌科に属する細菌に含硫アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの細菌の含硫アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
　細菌に含硫アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、含硫アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、１９８６年５月３０日初版発行、第７７－１００頁参照）。ここで、含硫アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強される含硫アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
　含硫アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、含硫アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ含硫アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
　以下、腸内細菌科に属する細菌に含硫アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの細菌の含硫アミノ酸生産能を増強する方法、及び含硫アミノ酸生産能を有する細菌について具体的に例示する。
Ｌ－システイン生産能の付与又は増強、及びＬ－システイン生産菌
　細菌のＬ－システイン生産能は、Ｌ－システイン生合成経路の酵素、又はＬ－セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素、例えば、３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ、又はセリンアセチルトランスフェラーゼ等の活性を増強することにより、向上させることができる。３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、セリンによるフィードバック阻害を受けるが、このフィードバック阻害が低減又は解除された変異型３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。また、セリンアセチルトランスフェラーゼは、Ｌ－システインによるフィードバック阻害を受ける。したがって、このフィードバック阻害が低減又は解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｃｙｓＥ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。
　また、ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子（Dabler et al., Mol. Microbiol.36. 1101-1112 (2000)）、ＹｆｉＫタンパク質をコードするｙｆｉＫ遺伝子（特開２００４－４９２３７）、又はＹｅａＳタンパク質をコードするｙｅａＳ遺伝子（欧州特許出願公開第１０１６７１０号明細書）の発現を強化することによっても、Ｌ－システイン生産能を高めることができる。
　Ｌ－システイン生産菌は、下記の性質の少なくともいずれかを有するのが好ましい。
ｉ）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
ｉｉ）ｙｄｅＤ遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
ｉｉｉ）３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
　また、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系の活性を増強することによっても、Ｌ－システイン生産能を向上させることができる。硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群は、ｃｙｓＰＴＷＡＭ遺伝子クラスターによってコードされている（特開２００５－１３７３６９号公報、ＥＰ１５２８１０８号明細書）。
　Ｌ－システイン生産菌としては、具体的には、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコードする複数種のｃｙｓＥアレルで形質転換されたエシェリヒア・コリ　ＪＭ１５株（米国特許第６，２１８，１６８号）、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するエシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０株（米国特許第５，９７２，６６３号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ（特開平１１－１５５５７１号公報）、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０株（ＷＯ０１／２７３０７）などのエシェリヒア属に属する株、ｙｄｅＤ遺伝子、変異型ｃｙｓＥ遺伝子および変異型ｓｅｒＡ５遺伝子を保持するプラスミドｐＡＣＹＣ－ＤＥＳ（特開２００５－１３７３６９（ＵＳ２００５０１２４０４９（Ａ１）、ＥＰ１５２８１０８（Ａ１）））を持つエシェリヒア・コリ等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＡＣＹＣ－ＤＥＳは、前記３遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４に挿入することによって得られたプラスミドであり、各遺伝子はＰｏｍｐＡプロモーターにより制御される。
　エシェリヒア・コリでは、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質として、シスタチオニン－β－リアーゼ（ｍｅｔＣ産物、特開平１１－１５５５７１号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)）、トリプトファナーゼ（ｔｎａＡ産物、特開２００３－１６９６６８、（Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218)）、Ｏ－アセチルセリン　スルフヒドリラーゼＢ（ｃｙｓＭ遺伝子産物、特開２００５－２４５３１１）、及び、ｍａｌＹ遺伝子産物（特開２００５－２４５３１１）が知られている。これらのタンパク質の活性を低下させることにより、Ｌ－システイン生産能が向上する。
　本発明においては、Ｌ－システイン生産菌は、フィードバック阻害耐性の変異型ＳＡＴを保持していることが好ましい。エシェリヒア・コリに由来する、フィードバック阻害耐性の変異型ＳＡＴとして具体的には、２５６位のメチオニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型ＳＡＴ（特開平１１－１５５５７１）、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型ＳＡＴ（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する変異型ＳＡＴ（ＷＯ９７／１５６７３号国際公開パンフレット、米国特許第６２１８１６８号）、野生型ＳＡＴの８９～９６位に相当するアミノ酸配列が１又は複数の変異を含み、かつ、Ｌ－システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型ＳＡＴ（米国特許公開第２００５０１１２７３１（Ａ１））、９５位及び９６位のＶａｌ残基及びＡｓｐ残基が、各々Ａｒｇ残基及びＰｒｏ残基に置換された変異型ＳＡＴ（変異型遺伝子名ｃｙｓＥ５、ＷＯ２００５００７８４１）、及び、１６７位のスレオニン残基がアラニン残基に置換される変異（米国特許第６２１８１６８号、米国特許公開第２００５０１１２７３１（Ａ１））等が知られている。
　ＳＡＴ遺伝子は、エシェリヒア・コリの遺伝子に限られず、ＳＡＴ活性を有するタンパク質をコードするものであれば、使用することができる。例えば、Ｌ－システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のＳＡＴアイソザイムが知られており、これをコードする遺伝子を用いることもできる（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）。
　細菌にＳＡＴをコードする遺伝子、特にフィードバック阻害耐性の変異型ＳＡＴをコードする遺伝子を導入し発現させることで、Ｌ－システイン生産能を付与又は増強することができる。
　また、ＳＡＴ等のタンパク質をコードする遺伝子のコピー数を高めることによっても、それらのタンパク質の活性を上昇させることができる。
　Ｌ－システインを出発物質として生合成されるγ－グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、及びホモシステイン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。
　例えば、γ－グルタミルシステイン生産能は、γ－グルタミルシステイン合成酵素活性の増強及び／又はグルタチオン合成酵素活性の低下によって、増強することができる。また、グルタチオン生産能はγ－グルタミルシステイン合成酵素活性及び／又はグルタチオン合成酵素活性の増強によって、付与又は増強することができる。また、グルタチオンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型γ－グルタミルシステイン合成酵素を用いることでもγ－グルタミルシステインやグルタチオンの生産能を増強させることができる。グルタチオンの生産についてはＬｉらの総説（Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 233-242）に詳しく記載されている。
　シスタチオニン、ホモシステインはＬ－メチオニン生合成経路の中間体であるため、これら物質の生産能を増強するためには、後述するＬ－メチオニンの生産能を増強させる方法を一部利用することが有効である。シスタチオニン生産能を増強させる具体的方法として、メチオニン要求性変異株を用いる方法（特願２００３－０１０６５４）や、発酵培地にシステイン（またはその生合成原料）及び／又はホモセリン（またはその生合成原料）を添加する方法（特開２００５－１６８４２２）が知られている。ホモシステインはシスタチオニンを前駆体とするため、ホモシステイン生産能を増強するためには、シスタチオニン生産能を増強させる上記方法も有効である。
Ｌ－メチオニン生産能の付与又は増強、及びＬ－メチオニン生産菌
　Ｌ－メチオニン生産能は、Ｌ－スレオニン要求性あるいはノルロイシン耐性を細菌に付与することによって、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、Ｌ－スレオニンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペロン（thrABC）として存在し、例えば、thrBC部分を欠失させることによってＬ－ホモセリン以降の生合成能を失ったＬ－スレオニン要求株を取得することができる。ノルロイシン耐性株では、Ｓ－アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化され、Ｌ－メチオニン生産能が付与又は増強される。E. coliにおいては、Ｓ－アデノシルメチオニンシンセターゼはmetK遺伝子にコードされている。また、Ｌ－メチオニン生産能は、メチオニンリプレッサーの欠損、ホモセリントランスサクシニラーゼ、及びシスタチオニンγ－シンテース、及びアスパルトキナーゼ－ホモセリンデヒドロゲナーゼII等のＬ－メチオニン生合成に関与する酵素の活性の増強によっても、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、メチオニンリプレッサーはmetJ遺伝子に、ホモセリントランスサクシニラーゼはmetA遺伝子に、シスタチオニンγ－シンテースはmetB遺伝子に、アスパルトキナーゼ－ホモセリンデヒドロゲナーゼIIはmetL遺伝子にそれぞれコードされている。また、メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを用いることでもＬ－メチオニンの生産能を付与又は増強することができる（特開2000-139471号、US20090029424）。なお、Ｌ－メチオニンはＬ－システインを中間体として生合成されるため、Ｌ－システインの生産能の向上によりＬ－メチオニンの生産能も向上する（特開2000-139471号、US20080311632）。よって、Ｌ－メチオニン生産能を付与又は増強するためには、Ｌ－システイン生産能を付与又は増強させる上記方法も有効である。
　Ｌ－メチオニン生産菌やそれを構築するために用いられる親株としては、具体的には、AJ11539 (NRRL B-12399)、AJ11540 (NRRL B-12400)、AJ11541 (NRRL B-12401)、AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、Ｌ－メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有する218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) ((ロシア特許第2215782号)等のE. coli株が挙げられる。また、Ｌ－メチオニン生産菌やそれを構築するために用いられる親株としては、E. coli W3110由来のAJ13425 (FERM P-16808)（特開2000-139471号（US7611873））を用いることができる。AJ13425は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のＳ－アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ－シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ－ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたＬ－スレオニン要求株である。AJ13425は、平成１０年５月１４日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566　茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号FERM P-16808が付与されている。
　また、Ｌ－メチオニンを出発物質として生合成されるＳ－アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン生産能は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼを強化することや（ＥＰ０６４７７１２、ＥＰ１４５７５６９）、排出因子ＭｄｆＡを強化すること（ＵＳ７４１０７８９）で付与又は増強することができる。
ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性の増大
　本発明の細菌は、上述したような含硫アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質（以下、「ＹｅｅＥ」又は「ＹｅｅＥタンパク質」と記載することがある）の活性が増大するように改変することによって得ることができる。ただし、ＹｅｅＥタンパク質の活性が増大するように改変を行った後に、含硫アミノ酸生産能を付与又は増強してもよい。
　「ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大する」とは、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるＹｅｅＥタンパク質の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に増大する。また、「ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大する」とは、もともとＹｅｅＥタンパク質の活性を有する菌株においてＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともとＹｅｅＥタンパク質の活性が存在しない菌株にＹｅｅＥタンパク質の活性を付与することを含む。すなわち、例えば、パントエア・アナナティスはｙｅｅＥ遺伝子を有さないが、パントエア・アナナティスにＹｅｅＥタンパク質の活性を付与することも含む。
　ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させるような改変は、例えば、ｙｅｅＥ遺伝子の発現を増強させることによって達成される。
　ｙｅｅＥ遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、ｙｅｅＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを細菌に導入して形質転換すればよい。前記ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４（ｐＨＳＧ、ｐＡＣＹＣは宝バイオ社より入手可）、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１９（ｐＭＷ２１９はニッポンジーン社より入手可）、ｐＳＴＶ２９（宝バイオ社より入手可）等が挙げられる。
　組換えＤＮＡを細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ　Ｋ－１２株について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C. H.,Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)）も応用できる。
　一方、ｙｅｅＥ遺伝子のコピー数を高めることは、上述のようなｙｅｅＥ遺伝子を細菌のゲノムＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌のゲノムＤＮＡ上にｙｅｅＥ遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。ゲノムＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、反復ＤＮＡ配列（repetitive DNA）、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、ゲノム上に存在するｙｅｅＥ遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはインテグレーションベクターを用いて達成することが出来る。
　あるいは、特開平２－１０９９８５号公報に開示されているように、ｙｅｅＥ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。ゲノム上に遺伝子が転移したことの確認は、ｙｅｅＥ遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
　さらに、ｙｅｅＥ遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開００／１８９３５号パンフレットに記載した方法で、ゲノムＤＮＡ上またはプラスミド上のｙｅｅＥ遺伝子の各々のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、各遺伝子の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけること、ｙｅｅＥ遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、ｙｅｅＥ遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。強力なプロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ａｒａＢＡプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、Ｔ７プロモーター、φ１０プロモーター等が知られている。また、エシェリヒア・コリのスレオニンオペロンのプロモーターを使用することもできる。また、ｙｅｅＥ遺伝子のプロモーター領域、ＳＤ領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。例えば、ＳＤ領域の配列をφ１０プロモーター下流のＳＤ領域の配列にそのまま置き換えることもできる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することにより翻訳効率を向上させることも可能である。ｙｅｅＥ遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりｙｅｅＥ遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（ＷＯ２００５／０１０１７５）を使用することが出来る。
　ｙｅｅＥ遺伝子の発現量を増大させるような改変は、例えば、ｙｅｅＥ遺伝子の発現を正に調節する制御因子や負に制御する制御因子をモジュレートすることによっても達成される。例えばＬｙｓＲファミリーなどに属するものが制御因子として挙げられ、データベースＥｃｏＣｙｃ（http://ecocyc.org/）等を利用して見つけ出すことができる。制御因子のモジュレートによりｙｅｅＥ遺伝子の転写量の増大やＹｅｅＥタンパク質の量の増大が見られればよい。
　ｙｅｅＥ遺伝子の発現が増大したことは、ｙｅｅＥ遺伝子の転写量が増大したことを確認することや、ＹｅｅＥタンパク質の量が増大したことを確認することにより確認できる。
　ｙｅｅＥ遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。
　ＹｅｅＥタンパク質の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。
　なお、上述したＳＡＴ等をコードする遺伝子についても、同様の方法で細菌に組換えＤＮＡを導入することができ、また、遺伝子のコピー数を高めることができる。
　エシェリヒア・コリ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５株のｙｅｅＥ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、２０８２４９１～２０８３５４９位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５株のｙｅｅＥ遺伝子は、ＥＣＫ２００７、ＪＷ１９９５と同義である。また、エシェリヒア・コリ　Ｋ１２　ＭＧ１６５５株のＹｅｅＥタンパク質は、GenBank accession NP_416517(version NP_416517.1 GI:16129954、locus_tag=“b2013”)として登録されている。前記ＭＧ１６５５株のｙｅｅＥ遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３及び１４に示す。
　細菌が属する属、種、又は菌株によって、ｙｅｅＥ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させるような改変を受けるｙｅｅＥ遺伝子は、配列番号１３に示す塩基配列のバリアントであってもよい。ｙｅｅＥ遺伝子のバリアントは、配列番号１３の塩基配列を参考にして、ＢＬＡＳＴ等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、ｙｅｅＥ遺伝子のバリアントは、同遺伝子のホモログを含む。同遺伝子のホモログとしては、例えば腸内細菌科やコリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、例えば配列番号１３の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増幅可能な遺伝子が挙げられる。
　エシェリヒア・コリ以外の細菌のｙｅｅＥ遺伝子ホモログの例として、以下の細菌のｙｅｅＥ遺伝子が挙げられる（表１）。表１中、同一性（％）は、エシェリヒア・コリＫ１２株のＹｅｅＥタンパク質（配列番号１４）と、各細菌のホモログとの、ＢＬＡＳＴによる同一性を示す。アクセション番号は、ＮＣＢＩデータベースのアクセション番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、ｙｅｅＥ遺伝子は、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードする限り、上記のようなＹｅｅＥタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
　さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記のようなＹｅｅＥタンパク質のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、「同一性」（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を指すことがある。
　また、ｙｅｅＥ遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば配列番号１３に示す塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＹｅｅＥタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２～３回洗浄する条件が挙げられる。
　プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳが挙げられる。
　上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼ、３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ等の酵素、又はＹｄｅＤタンパク質や、それらをコードする遺伝子にも準用できる。
　なお、エシェリヒア・コリ染色体上ではｙｅｅＥ遺伝子の下流にｙｅｅＤ遺伝子が存在し、両遺伝子はオペロンを形成していると考えられている（データベース「ＥｃｏＣｙｓ」; http://ecocyc.org/、データベース「ＲｅｇｕｌｏｎＤＢ」; http://regulondb.ccg.unam.mx/）。通常、オペロンを形成している遺伝子群は共通の機能や関連する機能を担っている場合が多い。したがって、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させるような改変が何らかの効果を発揮する場合には、ＹｅｅＤタンパク質の活性を増大させるような改変も同様の効果を発揮する可能性がある。本発明においては、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させるような改変と共に、ＹｅｅＤタンパク質の活性を増大させるような改変を行ってもよい。
＜２＞本発明の含硫アミノ酸、もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物の製造法
　上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地から含硫アミノ酸、もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。含硫アミノ酸がＬ－システインである場合は、Ｌ－システインの関連物質としては、先述したＳ－スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に対応するヘミチオケタール等が挙げられる。含硫アミノ酸がＬ－メチオニンである場合は、Ｌ－メチオニンの関連物質としては、先述したＳ－アデノシルメチオニン等が挙げられる。
　使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
　炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
　イオウ源としては、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。
　有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
　培養は好気的条件下で３０～９０時間実施するのがよく、培養温度は２５℃～３７℃に、培養中ｐＨは５～８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からの含硫アミノ酸の採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
　上記のようにして得られるＬ－システインは、Ｌ－システイン誘導体の製造に用いることができる。Ｌ－システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が挙げられる。
　また、Ｌ－システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ－システインとの間の反応平衡をＬ－システイン側に移動させることによって、Ｌ－システインを製造することができる。また、培地にＳ－スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスレイトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ－システインに変換することができる。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
（１）Ｌ－システイン生産菌の構築
　Ｌ－システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｃｙｓＥ（ＵＳ２００５０１１２７３１（Ａ１））、Ｌ－システイン排出因子をコードするｙｄｅＤ遺伝子（ＵＳ５９７２６６３Ａ）、及びＬ－セリンによるフィードバック阻害が低減された３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡ遺伝子（ＵＳ６１８０３７３）が１つのプラスミドに載ったｐＡＣＹＣ－ＤＥＳを、エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株及びパントエア・アナナティス　ＳＣ１７株に導入し、Ｌ－システイン生産菌ＭＧ１６５５／ｐＡＣＹＣ－ＤＥＳ、及びＳＣ１７／ｐＡＣＹＣ－ＤＥＳを構築した。前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、１６７位のスレオニン残基がアラニン残基に置換されている。また、前記３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、４１０位のチロシン残基を欠失している。ｐＡＣＹＣ－ＤＥＳの構築は、特開２００５－１３７３６９（ＵＳ２００５０１２４０４９（Ａ１）、ＥＰ１５２８１０８（Ａ１））に記載されている。
（２）ｙｅｅＥ遺伝子発現用プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ｙｅｅＥ（Ｅｃ）の構築
　ＹｅｅＥタンパク質の活性を増強するために用いられる、ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現用プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ｙｅｅＥ（Ｅｃ）を以下の手順で構築した。
（２－１）プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ＹｅａＳ３の構築
　エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ　４７０７６）の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ１（agctgagtcgacccccaggaaaaattggttaataac：配列番号１）、及びプライマーＰ２（agctgagcatgcttccaactgcgctaatgacgc：配列番号２）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター領域（Ｐｎｌｐ０）約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。これらのプライマーの５'末端には制限酵素ＳａｌＩ及びＰａｅＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃　３分の後、９５℃　６０秒、５０℃　３０秒、７２℃　４０秒を２サイクル、９４℃　２０秒、５５℃　２０秒、７２℃　１５秒を２５サイクル、最後に７２℃　５分。得られた断片をＳａｌＩ及びＰａｅＩで消化し、ｐＭＩＶ－５ＪＳ（特開２００８－９９６６８）のＳａｌＩ－ＰａｅＩサイトに挿入しプラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０を取得した。このｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０プラスミドに挿入されたＰｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ－ＳａｌＩ断片の塩基配列は配列番号３に示したとおりである。
　次にＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ３（agctgatctagaaaacagaatttgcctggcggc：配列番号４）、及びプライマーＰ４（agctgaggatccaggaagagtttgtagaaacgc：配列番号５）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。これらプライマーの５'末端には制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃　３分の後、９５℃　６０秒、５０℃　３０秒、７２℃　４０秒を２サイクル、９４℃　２０秒、５９℃　２０秒、７２℃　１５秒を２５サイクル、最後に７２℃　５分。得られた断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０のＸｂａＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入しプラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ｔｅｒを取得した。
　続いてＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ５（agctgagtcgacgtgttcgctgaatacggggt：配列番号６）、及びプライマーＰ６（agctgatctagagaaagcatcaggattgcagc：配列番号７）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｙｅａＳ遺伝子を含む約７００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。これらプライマーの５'末端には制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃　３分の後、９５℃　６０秒、５０℃　３０秒、７２℃　４０秒を２サイクル、９４℃　２０秒、５５℃　２０秒、７２℃　１５秒を２５サイクル、最後に７２℃　５分。得られた断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ｔｅｒのＳａｌＩ－ＸｂａＩサイトに挿入しプラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ＹｅａＳ３を取得した。こうして、ｐＭＩＶ－５ＪＳベクター上にｎｌｐＤプロモーター、ｙｅａＳ遺伝子、及びｒｒｎＢターミネーターが、この順に繋がったｙｅａＳの発現ユニットが構築された。
（２－２）プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ＹｅａＳ３の構築
　ｎｌｐＤプロモーターの－１０領域を改変することでより強力なプロモーターとするため、以下の手法で－１０領域のランダム化を行った。ｎｌｐＤプロモーター領域（図１）には、プロモーターとして機能すると推定される領域が２箇所存在し、それぞれの－１０領域及び－３５領域を、Ｐ１（－１０）及びＰ１（－３５）、並びにＰ２（－１０）及びＰ２（－３５）と示す。プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０をテンプレートとして、プライマーＰ１及びプライマーＰ７（atcgtgaagatcttttccagtgttnannagggtgccttgcacggtnatnangtcactgg：配列番号８）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｎｌｐＤプロモーターの３'末端側に含まれる－１０領域（Ｐ１（－１０））をランダム化したＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃　３分の後、９５℃　６０秒、５０℃　３０秒、７２℃　４０秒を２サイクル、９４℃　２０秒、６０℃　２０秒、７２℃　１５秒を２５サイクル、最後に７２℃　５分。
　一方、同様にプラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０をテンプレートとして、プライマーＰ２及びプライマーＰ８（tggaaaagatcttcannnnncgctgacctgcg：配列番号９）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｎｌｐＤプロモーターの５'末端側に含まれる－１０領域（Ｐ２（－１０））をランダム化したＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃　３分の後、９５℃　６０秒、５０℃　３０秒、７２℃　４０秒を２サイクル、９４℃　２０秒、６０℃　２０秒、７２℃　１５秒を２５サイクル、最後に７２℃　５分。
　得られた３'末端側と５'末端側の断片は、プライマーＰ７とＰ８にデザインされたＢｇｌＩＩサイトによってつなぎ合わせることができ、２箇所の－１０領域がランダム化されたｎｌｐＤプロモーター全長を構築することができる。この断片をテンプレートとして、Ｐ１及びＰ２をプライマーとして用いたＰＣＲによって改変型ｎｌｐＤプロモーター全長のＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃　３分の後、９５℃　６０秒、５０℃　３０秒、７２℃　４０秒を２サイクル、９４℃　２０秒、６０℃　２０秒、７２℃　１５秒を１２サイクル、最後に７２℃　５分。
　増幅断片を、プライマーの５'末端にデザインされている制限酵素ＳａｌＩ及びＰａｅＩで消化し、同じくＳａｌＩ及びＰａｅＩで消化したプラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ＹｅａＳ３に挿入することで、プラスミド上の野生型ｎｌｐＤプロモーター部位（Ｐｎｌｐ０）を変異型Ｐｎｌｐと置き換えた。その中から配列番号１０に示すプロモーター配列（Ｐｎｌｐ８）を持つものを選び、ｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ＹｅａＳ７と命名した。このプラスミドに挿入されたＰｎｌｐ８プロモーターのＰａｅＩ－ＳａｌＩ断片の塩基配列が配列番号１０に示されている。Ｐｎｌｐ８プロモーターはＰｎｌｐ０プロモーターに比べて、強力なプロモーターである。
（２－３）ｙｅｅＥ遺伝子発現用プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ｙｅｅＥ（Ｅｃ）の構築
　先述の発現プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ＹｅａＳ７に組み込まれているｙｅａＳ遺伝子をｙｅｅＥ遺伝子に置き換えることで、ｐＭＩＶ－５ＪＳベクター上にＰｎｌｐ８プロモーター、ｙｅｅＥ遺伝子、及びｒｒｎＢターミネーターの順に繋がったｙｅｅＥの発現ユニットが搭載されたプラスミドを構築した。ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現用プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ｙｅｅＥ（Ｅｃ）の構築方法を以下に示す。
　エシェリヒア・コリのｙｅｅＥ遺伝子の増幅は、ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ｙｅｅＥ（Ｅｃ）ＳａｌＩ－Ｆ（acgcgtcgacatgttttcaatgatattaagcgggc：配列番号１１）、ｙｅｅＥ（Ｅｃ）ＸｂａＩ－Ｒ（ctagtctagattaatttgccgcagcagttgcc：配列番号１２）をプライマーとして用い、ＰＣＲサイクル（９４℃　５分の後、９８℃　５秒、５５℃　５秒、７２℃　９０秒を３０サイクル、最後に４℃保温）で行った。プライマーの両端にはＳａｌＩとＸｂａＩサイトがそれぞれデザインされている。増幅断片をＳａｌＩとＸｂａＩで切断し、同じくＳａｌＩとＸｂａＩで切断したｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ＹｅａＳ７に挿入しｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ｙｅｅＥ（Ｅｃ）を作製した。また、対応する空のベクター（対照用）としてｐＭＩＶ－５ＪＳ（特開２００８－９９６６８）を使用した。なお、ｙｅｅＥ遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１３、ｙｅｅＥ遺伝子産物の予想アミノ酸配列を配列番号１４に示した。
（３）Ｌ－システイン生産培養（エシェリヒア・コリ）
　ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現がＬ－システイン及びＬ－システイン関連化合物の発酵生産に及ぼす効果を調べるため、先述のＬ－システイン生産菌　エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５／ｐＡＣＹＣ－ＤＥＳにｙｅｅＥ過剰発現プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ｙｅｅＥ（Ｅｃ）及びその対照用の空ベクターｐＭＩＶ－５ＪＳを導入した株の発酵生産培養を行い、Ｌ－システイン及びＬ－システイン関連化合物の生産量を比較した。培養には下記組成のＬ－システイン生産培地を使用した。

〔Ｌ－システイン生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
　（ＮＨ4）2ＳＯ4　　　　　　　　　　　１５ｇ／Ｌ
　ＫＨ2ＰＯ4　　　　　　　　　　　　 １．５ｇ／Ｌ
　ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ　　　　　　　　 　　１ｇ／Ｌ
　トリプトン　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ／Ｌ
　イーストエクストラクト　　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
　ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ／Ｌ
　Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物　　　　１３５ｍｇ／Ｌ
　Ｌ－メチオニン　　　　　　　　　　　３００ｍｇ／Ｌ
成分２：
　グルコース　　　　　　　　　　　　　　４０ｇ／Ｌ
成分３：
　チオ硫酸ナトリウム　　　　　　　　　　　７ｇ／Ｌ
成分４：
　ピリドキシン塩酸塩　　　　　　　　　　　２ｍｇ／Ｌ
成分５：
　炭酸カルシウム　　　　　　　　　　　　２０ｇ／Ｌ

　各成分について、各々１００／４７．５倍（成分１）、１００／４７．５倍（成分２）、５０倍（成分３）、１０００倍（成分４）のストック溶液を作製しておき、使用時に混合し滅菌水で規定の量までメスアップして最終濃度となるように調製した。殺菌は、１１０℃、３０分のオートクレーブ（成分１、２）、１８０℃、５時間以上の乾熱滅菌（成分５）、フィルター滅菌（成分３、４）により行った。
　Ｌ－システイン生産培養は以下の手順で行った。各Ｌ－システイン生産菌をＬＢ寒天培地に塗り広げ、３７℃で一晩前培養を行った後、１０マイクロリッターサイズの植菌用ループ（ＮＵＮＣ社ブルーループ）でプレート上約７ｃｍ分の菌体を３回掻き取り（３ループ）、大試験管（内径２３ｍｍ、長さ２０ｃｍ）に２ｍｌ張りこんだ上記Ｌ－システイン生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製した。３２℃にて振盪培養を行い、３０時間後に培養を終了した。培地中に生産されたＬ－システイン（シスチン等の一部のＬ－システイン関連物質を含む）の定量はＧａｉｔｏｎｄｅ，　Ｍ．Ｋ．（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。各株とも４連で実験を行い、そのときのＬ－システイン生産量（平均値）と標準偏差、消費グルコースに対するＬ－システイン収率を表２に示した。ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現によりＬ－システインの蓄積濃度が増大した。よって、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させることにより、Ｌ－システインの生産を向上させることができると明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（４）Ｌ－システイン生産培養（パントエア・アナナティス）
　ｙｅｅＥ遺伝子過剰発現がＬ－システイン及びＬ－システイン関連化合物の発酵生産に及ぼす効果を調べるため、先述のＬ－システイン生産菌　パントエア・アナナティス　ＳＣ１７／ｐＡＣＹＣ－ＤＥＳにｙｅｅＥ過剰発現プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ８－ｙｅｅＥ（Ｅｃ）及びその対照用の空ベクターｐＭＩＶ－５ＪＳを導入した株の発酵生産培養を行い、Ｌ－システイン及びＬ－システイン関連化合物の生産量を比較した。Ｌ－システイン生産培養及びＬ－システインの定量方法は先述のエシェリヒア・コリでの実施例と概ね同じである。ただし、植菌量を１ループ、培養時間を２２時間とした。各株とも４連で実験を行い、そのときのＬ－システイン生産量（平均値）と標準偏差、消費グルコースに対するＬ－システイン収率を表３に示した。ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現によりＬ－システインの蓄積濃度が増大した。よって、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させることにより、Ｌ－システインの生産を向上させることができると明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明により、細菌の含硫アミノ酸生産能を向上させることができ、含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。
配列表の説明
配列番号１：Pnlp0増幅用プライマー
配列番号２：Pnlp0増幅用プライマー
配列番号３：Pnlp0の塩基配列
配列番号４：rrnB遺伝子のターミネーター領域増幅用プライマー
配列番号５：rrnB遺伝子のターミネーター領域増幅用プライマー
配列番号６：yeaS遺伝子増幅用プライマー
配列番号７：yeaS遺伝子増幅用プライマー
配列番号８：Pnlp0の－１０領域（３’側）ランダム化プライマー
配列番号９：Pnlp0の－１０領域（５’側）ランダム化プライマー
配列番号10：Pnlp8の塩基配列
配列番号11：yeeE遺伝子増幅用プライマー
配列番号12：yeeE遺伝子増幅用プライマー
配列番号13：エシェリヒア・コリ野生型yeeE遺伝子の塩基配列
配列番号14：エシェリヒア・コリ野生型YeeEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号15：yeaS遺伝子との連結部位を含むPnlp0の塩基配列
配列番号16：yeaS遺伝子との連結部位を含むPnlp8の塩基配列

Claims (13)

  1. 　含硫アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
  2. 　ｙｅｅＥ遺伝子の発現量を増大させること、又は、ｙｅｅＥ遺伝子の翻訳量を増大させることにより、前記タンパク質の活性が増大した、請求項１に記載の細菌。
  3. 　ｙｅｅＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ｙｅｅＥ遺伝子の発現量が増大した、請求項２に記載の細菌。
  4. 　前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌。
    　（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
    　（Ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質。
  5. 　前記ｙｅｅＥ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１～４のいずれか１項に記載の細菌。
    　（ａ）配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
    　（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  6. 　さらに、下記の性質の少なくともいずれかを有する請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌。
    ｉ）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
    ｉｉ）ｙｄｅＤ遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
    ｉｉｉ）３－ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
  7. 　前記細菌がエシェリヒア属細菌である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細菌。
  8. 　前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項７に記載の細菌。
  9. 　前記細菌がパントエア属細菌である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細菌。
  10. 　前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項９記載の細菌。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の細菌を培地中で培養し、該培地から含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
  12. 　前記含硫アミノ酸がＬ－システインである、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記含硫アミノ酸がＬ－システインであり、前記関連物質がシスチン又はチアゾリジン誘導体である、請求項１１に記載の方法。
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