JP2992010B2 - 微生物株、遺伝子、プラスミド、及びｌ−システイン、ｌ−シスチン、ｎ−アセチルセリン又はチアゾリジン誘導体の製法ならびに流出遺伝子の使用 - Google Patents
微生物株、遺伝子、プラスミド、及びｌ−システイン、ｌ−シスチン、ｎ−アセチルセリン又はチアゾリジン誘導体の製法ならびに流出遺伝子の使用Info
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物及びＬ−シス
テイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリン又はチアゾ
リジン誘導体の発酵的製法に関する。
テイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリン又はチアゾ
リジン誘導体の発酵的製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸の発酵的製造はこの間、多くの
アミノ酸にとって公知の方法になった。しかしながら、
Ｌ−システインの製造に関して経済的な発酵法は従来存
在しない。
アミノ酸にとって公知の方法になった。しかしながら、
Ｌ−システインの製造に関して経済的な発酵法は従来存
在しない。
【０００３】システインとケトン又はアルデヒドとの縮
合において、一般にチアゾリジン誘導体及び相応するヘ
ミチオケタールが生じる。システインと種々異なるケト
ン又はアルデヒド、特にα−ケト酸との化学的縮合はす
でに長期にわたって公知である。この縮合は、アルデヒ
ド基又はケト基のプラスになった炭素原子への硫黄の遊
離電子対の親核性の攻撃により生じる、中間工程物質と
してのヘミチオケタールを介して行なわれる。水の脱離
下での閉環は次いで相応するチアゾリジン誘導体に導
く。
合において、一般にチアゾリジン誘導体及び相応するヘ
ミチオケタールが生じる。システインと種々異なるケト
ン又はアルデヒド、特にα−ケト酸との化学的縮合はす
でに長期にわたって公知である。この縮合は、アルデヒ
ド基又はケト基のプラスになった炭素原子への硫黄の遊
離電子対の親核性の攻撃により生じる、中間工程物質と
してのヘミチオケタールを介して行なわれる。水の脱離
下での閉環は次いで相応するチアゾリジン誘導体に導
く。
【０００４】次の概略式において、チアゾリジン誘導体
の形成を一般的に示す：
の形成を一般的に示す：
【０００５】
【化５】
【０００６】式中、Ｒ1及びＲ2は任意の有機基である。
【０００７】こうして、出発物質はヘミチオケタールを
介して、チオアゾリジン誘導体と平衡に達する。従っ
て、水溶液中ではチアゾリジン誘導体の他に、一般にヘ
ミチオケタールも存在する。
介して、チオアゾリジン誘導体と平衡に達する。従っ
て、水溶液中ではチアゾリジン誘導体の他に、一般にヘ
ミチオケタールも存在する。
【０００８】本発明の意味において“チアゾリジン誘導
体”とは、この物質のこれに属するヘミチオケタールと
の平衡をも意味する。
体”とは、この物質のこれに属するヘミチオケタールと
の平衡をも意味する。
【０００９】従来、チアゾリジンは細胞からの直接的な
代謝物質として記載されていなかった。細胞によるチア
ゾリジン形成に関する全ての報告は、出発物質の１つ、
多くの場合Ｌ−システインの過剰の外からの添加、次い
でこのＬ−システインの脱スルフヒドリル化及び脱アミ
ノ化によるピルベートへの変換、このピルベートの再び
添加したシステインとの反応、に基づく（Ronald C. Si
mpson等, Biochimicaet Biophusic Acta,496(1977),12-
19）。しかしながら、クレディッヒ（Kredich）等は文
献中で（J. of Biol.Chem.248,17:6187-6196、Ｌ−シス
テインの酵素的脱スルフヒドリル化による２−メチル−
２.４−チアゾリジンジカルボン酸の試験管内形成）、
この物質の生体内形成はほとんど考えられないことであ
る、としている。
代謝物質として記載されていなかった。細胞によるチア
ゾリジン形成に関する全ての報告は、出発物質の１つ、
多くの場合Ｌ−システインの過剰の外からの添加、次い
でこのＬ−システインの脱スルフヒドリル化及び脱アミ
ノ化によるピルベートへの変換、このピルベートの再び
添加したシステインとの反応、に基づく（Ronald C. Si
mpson等, Biochimicaet Biophusic Acta,496(1977),12-
19）。しかしながら、クレディッヒ（Kredich）等は文
献中で（J. of Biol.Chem.248,17:6187-6196、Ｌ−シス
テインの酵素的脱スルフヒドリル化による２−メチル−
２.４−チアゾリジンジカルボン酸の試験管内形成）、
この物質の生体内形成はほとんど考えられないことであ
る、としている。
【００１０】生体内変化によるＬ−システインの製造の
ためのラセミ前駆物質としてチアゾリジンを使用するこ
とは公知である（ＥＰ−Ａ ０１０１０５２、Ok Hee Ry
u 等、Biotechnology Letters 17 No3,275-280(1995,Ma
r.)）。Ｌ−システインの製造のためにラセミ体を使用
する場合、酵素により又は全細胞によりこれをＬ−シス
テインに変換しなければならない。引き続き、残ったジ
アステレオマーを再びラセミ化する必要がある。このよ
うな理由から、この生体内変化は非常に高価である。
ためのラセミ前駆物質としてチアゾリジンを使用するこ
とは公知である（ＥＰ−Ａ ０１０１０５２、Ok Hee Ry
u 等、Biotechnology Letters 17 No3,275-280(1995,Ma
r.)）。Ｌ−システインの製造のためにラセミ体を使用
する場合、酵素により又は全細胞によりこれをＬ−シス
テインに変換しなければならない。引き続き、残ったジ
アステレオマーを再びラセミ化する必要がある。このよ
うな理由から、この生体内変化は非常に高価である。
【００１１】ラセミシステイン及び相応するケトン又は
アルデヒドからのチアゾリジンの化学的合成は４種の異
なるジアステレオマーに導く。エナンチオマー純粋なＬ
−システインからの化学的合成は高価であり、引き続く
Ｌ−システインの獲得の目的のためには無意味である。
従って、Ｃ４−原子でＲ−配置を有するチアゾリジンジ
アステレオマーの製法は出発物質が高価である。
アルデヒドからのチアゾリジンの化学的合成は４種の異
なるジアステレオマーに導く。エナンチオマー純粋なＬ
−システインからの化学的合成は高価であり、引き続く
Ｌ−システインの獲得の目的のためには無意味である。
従って、Ｃ４−原子でＲ−配置を有するチアゾリジンジ
アステレオマーの製法は出発物質が高価である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明はＬ−システイ
ン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリン及び／又はチア
ゾリジン誘導体の発酵的製造に好適である、微生物に関
する。
ン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリン及び／又はチア
ゾリジン誘導体の発酵的製造に好適である、微生物に関
する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明による微生物株
は、抗生物質又は他の有機体に毒性の物質を細胞から直
接放出するために好適である蛋白質をコードする少なく
とも１つの遺伝子を過剰発現することを特徴とする。
は、抗生物質又は他の有機体に毒性の物質を細胞から直
接放出するために好適である蛋白質をコードする少なく
とも１つの遺伝子を過剰発現することを特徴とする。
【００１４】本発明において、有機体に毒性の物質と
は、有機体の成長にマイナスの影響を与える化合物を優
先的に意味する。そのような化合物は、例えば細胞内高
濃度のカルボン酸又はカルボン酸誘導体である。
は、有機体の成長にマイナスの影響を与える化合物を優
先的に意味する。そのような化合物は、例えば細胞内高
濃度のカルボン酸又はカルボン酸誘導体である。
【００１５】抗生物質又は他の毒性の物質を細胞から直
接放出するために好適である蛋白質をコードする遺伝子
を、以降流出遺伝子（Efflux-Gene）と呼ぶ。
接放出するために好適である蛋白質をコードする遺伝子
を、以降流出遺伝子（Efflux-Gene）と呼ぶ。
【００１６】こうして、本発明はアミノ酸又は細胞内で
形成されたアミノ酸誘導体の強化された発現のための流
出遺伝子の、発酵における使用にも関する。
形成されたアミノ酸誘導体の強化された発現のための流
出遺伝子の、発酵における使用にも関する。
【００１７】本発明による微生物において、有利に、流
出遺伝子として、ｍａｒ−座（S.P,Cohen等,Journal of
Bacteriology,Mar.1993,175:5,1484-1492）、ｅｍｒ−
座、ａｃｒ−座、ｃｍｒ−座（P.F.Miller 及びM.C.Sul
avik,Molecular Microbiology(1996)21(3)441-448参
照）、ｍｅｘ−遺伝子（T.Koehler等,Molecular Microb
iology(1997) 23(2),345-354）、ｂｍｒ−遺伝子（A.A
Neyfakh等,Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88:4781-4785(1
991)）、ｑａｃＡ−遺伝子（J.M.Tennent等,J.Gen.Micr
obiol.135:1-10(1989)）の群から選択された少なくとも
１つの遺伝子が過剰発現される。
出遺伝子として、ｍａｒ−座（S.P,Cohen等,Journal of
Bacteriology,Mar.1993,175:5,1484-1492）、ｅｍｒ−
座、ａｃｒ−座、ｃｍｒ−座（P.F.Miller 及びM.C.Sul
avik,Molecular Microbiology(1996)21(3)441-448参
照）、ｍｅｘ−遺伝子（T.Koehler等,Molecular Microb
iology(1997) 23(2),345-354）、ｂｍｒ−遺伝子（A.A
Neyfakh等,Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88:4781-4785(1
991)）、ｑａｃＡ−遺伝子（J.M.Tennent等,J.Gen.Micr
obiol.135:1-10(1989)）の群から選択された少なくとも
１つの遺伝子が過剰発現される。
【００１８】有利には本発明による微生物中で流出遺伝
子としてｍａｒ−座の遺伝子が過剰発現される。
子としてｍａｒ−座の遺伝子が過剰発現される。
【００１９】特に有利であるのは、本発明による微生物
中で、配列：
中で、配列：
【００２０】
【化６】
【００２１】又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に５０％を越え
る配列相同を有する配列を包含する蛋白質をコードする
遺伝子が過剰発現される。
る配列相同を有する配列を包含する蛋白質をコードする
遺伝子が過剰発現される。
【００２２】有利にＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に７５％を越
える、特に有利にＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に９０％を越え
る配列相同である。
える、特に有利にＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に９０％を越え
る配列相同である。
【００２３】こうして、本発明は、配列：
【００２４】
【化７】
【００２５】又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に５０％を越え
る配列相同を有する配列を包含する蛋白質をコードする
遺伝子にも関する。
る配列相同を有する配列を包含する蛋白質をコードする
遺伝子にも関する。
【００２６】更に、本発明は、配列：
【００２７】
【化８】
【００２８】又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に５０％を越え
る配列相同を有する配列を包含する蛋白質にも関する。
る配列相同を有する配列を包含する蛋白質にも関する。
【００２９】有利にはＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に７５％を
越える、特に有利にＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に９０％を越
える配列相同である。
越える、特に有利にＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：１に９０％を越
える配列相同である。
【００３０】例えば、本発明による蛋白質は次の配列を
有していてよい：
有していてよい：
【００３１】
【化９】
【００３２】ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２によるアミノ酸配列
を有する蛋白質をコードするオープンリーディングフレ
ームを以降ＯＲＦ３０６とも呼ぶ。
を有する蛋白質をコードするオープンリーディングフレ
ームを以降ＯＲＦ３０６とも呼ぶ。
【００３３】本発明による蛋白質に関する更なる例は次
の配列を示す。
の配列を示す。
【００３４】
【化１０】
【００３５】本発明による蛋白質はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：
２又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：３によるアミノ酸配列に５０
％を越えるアミノ酸レベルでの配列相同を有するアミノ
酸配列を有する蛋白質でもある。
２又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：３によるアミノ酸配列に５０
％を越えるアミノ酸レベルでの配列相同を有するアミノ
酸配列を有する蛋白質でもある。
【００３６】ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥＱ.ＩＤ.Ｎ
Ｏ：３によるアミノ酸配列に７５％を越える配列相同が
有利であり、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥＱ.ＩＤ.Ｎ
Ｏ：３によるアミノ酸配列に９０％を越える配列相同が
特に有利である。
Ｏ：３によるアミノ酸配列に７５％を越える配列相同が
有利であり、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥＱ.ＩＤ.Ｎ
Ｏ：３によるアミノ酸配列に９０％を越える配列相同が
特に有利である。
【００３７】従って、本発明による遺伝子は、ＳＥＱ.
ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：３によるアミノ
酸配列を有する蛋白質、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥ
Ｑ.ＩＤ.ＮＯ：３によるアミノ酸配列に５０％、有利に
７５％、特に有利に９０％を越えるアミノ酸レベルでの
配列相同を有するアミノ酸配列を有する蛋白質をコード
する遺伝子でもある。
ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：３によるアミノ
酸配列を有する蛋白質、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥ
Ｑ.ＩＤ.ＮＯ：３によるアミノ酸配列に５０％、有利に
７５％、特に有利に９０％を越えるアミノ酸レベルでの
配列相同を有するアミノ酸配列を有する蛋白質をコード
する遺伝子でもある。
【００３８】本発明において、全ての記載した相同値
は、コンピュータプログラム:“Wisconsin Package Ver
sion 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisc
onsin”で得られる結果に関する。相同性決定はアンダ
ープログラム:“fasta”及び予めセットした値（word s
ize 2）でデータバンク中を調査することにより達せら
れる。次いで、類似の配列をアンダープログラム：“ga
p”を用いて類似性に関して調査した。この際予めセッ
トしたパラメータ“gap creation penalty 12”及び“g
ap extension penalty 4”を使用する。
は、コンピュータプログラム:“Wisconsin Package Ver
sion 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisc
onsin”で得られる結果に関する。相同性決定はアンダ
ープログラム:“fasta”及び予めセットした値（word s
ize 2）でデータバンク中を調査することにより達せら
れる。次いで、類似の配列をアンダープログラム：“ga
p”を用いて類似性に関して調査した。この際予めセッ
トしたパラメータ“gap creation penalty 12”及び“g
ap extension penalty 4”を使用する。
【００３９】システイン形成の上昇のための本発明によ
る遺伝子の過剰発現に関する更なる例は５.５ｋｂの長
さのＤＮＡ−フラグメントの過剰発現であり、これは同
様にｍａｒ座をコードする。記号１００−１−１を有す
るこのプラスミドはＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkuluturen GmbH,D-38124Bra
unschweig）においてＥ.コリＫ１２ Ｗ３１１０中、寄
託番号ＤＳＭ１１５４５で寄託されている。図１はこの
プラスミドのプラスミド地図を示す。このプラスミドは
ＰＣＲを用いる、本発明による遺伝子の増殖のために使
用することができる。
る遺伝子の過剰発現に関する更なる例は５.５ｋｂの長
さのＤＮＡ−フラグメントの過剰発現であり、これは同
様にｍａｒ座をコードする。記号１００−１−１を有す
るこのプラスミドはＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkuluturen GmbH,D-38124Bra
unschweig）においてＥ.コリＫ１２ Ｗ３１１０中、寄
託番号ＤＳＭ１１５４５で寄託されている。図１はこの
プラスミドのプラスミド地図を示す。このプラスミドは
ＰＣＲを用いる、本発明による遺伝子の増殖のために使
用することができる。
【００４０】公知方法により、例えば部位突然変異の技
術により、この配列のそれぞれ所望の位置でこの遺伝子
を更に一定の修飾をすることは専門家にとってしばしば
実施されることである。この種の修飾遺伝子を含有する
微生物も、この種の修飾遺伝子がＬ−システイン、Ｌ−
シスチン、Ｎ−アセチルセリン及び／又はチアゾリジン
誘導体の製造のために寄与する限り本発明のものであ
る。
術により、この配列のそれぞれ所望の位置でこの遺伝子
を更に一定の修飾をすることは専門家にとってしばしば
実施されることである。この種の修飾遺伝子を含有する
微生物も、この種の修飾遺伝子がＬ−システイン、Ｌ−
シスチン、Ｎ−アセチルセリン及び／又はチアゾリジン
誘導体の製造のために寄与する限り本発明のものであ
る。
【００４１】本発明において過剰発現とは、蛋白質の発
現が本発明による微生物中で、この蛋白質が由来する野
生型におけるより少なくとも２倍強いことを意味する。
現が本発明による微生物中で、この蛋白質が由来する野
生型におけるより少なくとも２倍強いことを意味する。
【００４２】本発明による微生物中での蛋白質の発現
は、この蛋白質が由来する野生型におけるより少なくと
も５倍強いのが有利であり、少なくとも１０倍強いのが
特に有利である。
は、この蛋白質が由来する野生型におけるより少なくと
も５倍強いのが有利であり、少なくとも１０倍強いのが
特に有利である。
【００４３】例えば別々のプロモーターによる独立した
転写による前記遺伝子の過剰発現なしに、又は例えば多
くのコピーでＭａｒＡをコードする遺伝子のプラスミド
上の存在なしには、出発株に対してＬ−システイン又は
チアゾリジン誘導体の明らかな収率上昇は観察されな
い。
転写による前記遺伝子の過剰発現なしに、又は例えば多
くのコピーでＭａｒＡをコードする遺伝子のプラスミド
上の存在なしには、出発株に対してＬ−システイン又は
チアゾリジン誘導体の明らかな収率上昇は観察されな
い。
【００４４】前記配列の過剰発現による収率上昇は、文
献中に記載されたオープンリーディングフレームＯＲＦ
２６６の遺伝子生成物（その配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２中の４１位のメチオニンからＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に
相当する）が、その過剰発現においてＬ−システインの
収率上昇に導かないことから、更に意外であった。
献中に記載されたオープンリーディングフレームＯＲＦ
２６６の遺伝子生成物（その配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２中の４１位のメチオニンからＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に
相当する）が、その過剰発現においてＬ−システインの
収率上昇に導かないことから、更に意外であった。
【００４５】前記ＯＲＦ３０６から誘導されたアミノ酸
配列中にＯＲＦ２６６の開始メチオニンを太字で記載
し、かつ下線を引く。
配列中にＯＲＦ２６６の開始メチオニンを太字で記載
し、かつ下線を引く。
【００４６】遺伝子の過剰発現を達成するための一連の
方法は専門家にとって公知である。１つの可能性は例え
ば細胞中に高められたコピー数で存在する、プラスミド
上の遺伝子の発現である。そのようなプラスミドは公知
である。例えば、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＡＣＹＣ１８４の誘導体、ｐＢＲ３２２、他のｐ
ＢＲ−誘導体、ｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、
ｐＵＣ１９ならびに他の大腸菌中に慣用のプラスミドを
挙げることができる。
方法は専門家にとって公知である。１つの可能性は例え
ば細胞中に高められたコピー数で存在する、プラスミド
上の遺伝子の発現である。そのようなプラスミドは公知
である。例えば、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＡＣＹＣ１８４の誘導体、ｐＢＲ３２２、他のｐ
ＢＲ−誘導体、ｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、
ｐＵＣ１９ならびに他の大腸菌中に慣用のプラスミドを
挙げることができる。
【００４７】本発明による過剰発現のために有利なプラ
スミドはｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣ
ＹＣ１８４の誘導体、ｐＢＲ３２２、他のｐＢＲ−誘導
体である。
スミドはｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣ
ＹＣ１８４の誘導体、ｐＢＲ３２２、他のｐＢＲ−誘導
体である。
【００４８】特に有利であるのはｐＡＣＹＣ１８４及び
その誘導体、例えばｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨである（Ｄ
ＭＳＺ：Deutschen Sammlung von Mikrooruganismen un
d Zellkulturen GmbH,D-38124 Braunschweig、に寄託番
号ＤＳＭ１０１７２で寄託）。
その誘導体、例えばｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨである（Ｄ
ＭＳＺ：Deutschen Sammlung von Mikrooruganismen un
d Zellkulturen GmbH,D-38124 Braunschweig、に寄託番
号ＤＳＭ１０１７２で寄託）。
【００４９】こうして、本発明は本発明による遺伝子を
含有するプラスミドにも関する。
含有するプラスミドにも関する。
【００５０】発現強化に関する更なる可能性は、染色体
中の遺伝子切片部分の増殖、又は流出遺伝子のより良好
な転写のための強力なプロモータの使用による、流出遺
伝子のコピー数の上昇である。
中の遺伝子切片部分の増殖、又は流出遺伝子のより良好
な転写のための強力なプロモータの使用による、流出遺
伝子のコピー数の上昇である。
【００５１】強力なプロモータとしては例えば、ＧＡＰ
ＤＨ−プロモータ、ｔａｃプロモータ（Ｐtac）、Ｌａ
ｃ−プロモータ（Ｐlac）、ｔｒｐ−プロモータ（Ｐtr
p）、ラムダＰＬ又はラムダＰＲが好適である。
ＤＨ−プロモータ、ｔａｃプロモータ（Ｐtac）、Ｌａ
ｃ−プロモータ（Ｐlac）、ｔｒｐ−プロモータ（Ｐtr
p）、ラムダＰＬ又はラムダＰＲが好適である。
【００５２】ＧＡＰＤＨ−プロモータ又はｔａｃプロモ
ータ（Ｐtac）は有利に好適である。
ータ（Ｐtac）は有利に好適である。
【００５３】ＧＡＰＤＨ−プロモータは特に有利に好適
である。
である。
【００５４】発現強化のための更なる可能性は、流出遺
伝子の発現を抑制する、リプレッサー遺伝子の不活性化
である。ｍａｒ−遺伝子部位に関しては、これは例えば
ｍａｒ Ｒ−遺伝子の不活性化であろう。
伝子の発現を抑制する、リプレッサー遺伝子の不活性化
である。ｍａｒ−遺伝子部位に関しては、これは例えば
ｍａｒ Ｒ−遺伝子の不活性化であろう。
【００５５】翻訳にプラスに影響する要素も流出遺伝子
の過剰発現に寄与する。そのような要素は例えば良好な
リボソーム結合部位（例えば、シャイン−ダルガノ配
列）又は下流ボックスである。
の過剰発現に寄与する。そのような要素は例えば良好な
リボソーム結合部位（例えば、シャイン−ダルガノ配
列）又は下流ボックスである。
【００５６】翻訳にプラスに影響する有利な要素は、Ｇ
ＡＰＤＨ−遺伝子の良好なリボソーム結合部位である。
ＡＰＤＨ−遺伝子の良好なリボソーム結合部位である。
【００５７】流出遺伝子の発現のためにはこれを、Ｌ−
システインを生産する微生物中に形質転換する。
システインを生産する微生物中に形質転換する。
【００５８】流出遺伝子を、バシラス（Bacillus）属、
例えばＢ.ズブチリス（B.subtilis）、コリネバクテリ
ウム（Corynebacterum）属、例えばＣ.グルタミクム
（C.glutamicum）、ストレプトマイセス及びＥ．コリの
群から選択された微生物中に形質転換するのが有利であ
る。
例えばＢ.ズブチリス（B.subtilis）、コリネバクテリ
ウム（Corynebacterum）属、例えばＣ.グルタミクム
（C.glutamicum）、ストレプトマイセス及びＥ．コリの
群から選択された微生物中に形質転換するのが有利であ
る。
【００５９】有利に、そのシステイン物質代謝が、Ｌ−
システインの高められた量の形成及び場合により引き続
くＬ−システインの又はＮ−アセチルセリンのとアゾリ
ジン誘導体の形成に導くように脱制御されている、有機
体中に流出遺伝子を形質転換する。
システインの高められた量の形成及び場合により引き続
くＬ−システインの又はＮ−アセチルセリンのとアゾリ
ジン誘導体の形成に導くように脱制御されている、有機
体中に流出遺伝子を形質転換する。
【００６０】Ｌ−システインを高められた量で生産する
微生物の例は、フィードバック耐性ＣｙｓＥ対立遺伝子
を有する微生物である。
微生物の例は、フィードバック耐性ＣｙｓＥ対立遺伝子
を有する微生物である。
【００６１】更に有利な実施態様においては、細胞内で
Ｌ−システインとケトン又はアルデヒド、特にピルベー
トとの縮合により、チアゾリジン誘導体を形成する微生
物を形質転換する。
Ｌ−システインとケトン又はアルデヒド、特にピルベー
トとの縮合により、チアゾリジン誘導体を形成する微生
物を形質転換する。
【００６２】Ｌ−システインの高められた量を生産する
微生物の例は、特許出願ＤＥ １９５３９９５２中に記
載されている。（DE 19539952 is incorporated by ref
erence）。
微生物の例は、特許出願ＤＥ １９５３９９５２中に記
載されている。（DE 19539952 is incorporated by ref
erence）。
【００６３】微生物の形質転換法は例えば標準的な教科
書から専門家には公知である。全ての公知法を本発明に
よる微生物の製造に適用することができる。
書から専門家には公知である。全ての公知法を本発明に
よる微生物の製造に適用することができる。
【００６４】アミノ酸又は細胞内で生じたアミノ酸誘導
体、例えばＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチ
ルセリン又はこれらからのチアゾリジン誘導体を生産す
る微生物中での流出遺伝子の強化された発現により、意
外にも、細胞からのアミノ酸又は細胞内で生じたアミノ
酸誘導体、例えばＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−
アセチルセリン又はこれらからのチアゾリジン誘導体の
増強された放出が達せられた。これにより発酵における
これらの生成物の明らかに上昇した収率が達せられる。
体、例えばＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチ
ルセリン又はこれらからのチアゾリジン誘導体を生産す
る微生物中での流出遺伝子の強化された発現により、意
外にも、細胞からのアミノ酸又は細胞内で生じたアミノ
酸誘導体、例えばＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−
アセチルセリン又はこれらからのチアゾリジン誘導体の
増強された放出が達せられた。これにより発酵における
これらの生成物の明らかに上昇した収率が達せられる。
【００６５】従って、本発明はＬ−システイン、Ｌ−シ
スチン、Ｎ−アセチルセリン又はこれらからのチアゾリ
ジン誘導体を生産する方法にも関し、この方法では発酵
において公知法で流出遺伝子を過剰発現する微生物を使
用する。
スチン、Ｎ−アセチルセリン又はこれらからのチアゾリ
ジン誘導体を生産する方法にも関し、この方法では発酵
において公知法で流出遺伝子を過剰発現する微生物を使
用する。
【００６６】Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセ
チルセリン又はチアゾリジン誘導体を発酵的に製造する
ための本発明による方法は多くの利点を有する：Ｃ４−
炭素原子でＲ−配置のみを有するチアゾリジンジアステ
レオマーのみが生じる、それというのも細胞の酵素配置
により立体選択的Ｌ−システインが生じ、次いでこれが
その都度供給可能なケトン又はアルデヒドと専ら反応し
て前記チアゾリジンジアステレオマーになることができ
るためである。
チルセリン又はチアゾリジン誘導体を発酵的に製造する
ための本発明による方法は多くの利点を有する：Ｃ４−
炭素原子でＲ−配置のみを有するチアゾリジンジアステ
レオマーのみが生じる、それというのも細胞の酵素配置
により立体選択的Ｌ−システインが生じ、次いでこれが
その都度供給可能なケトン又はアルデヒドと専ら反応し
て前記チアゾリジンジアステレオマーになることができ
るためである。
【００６７】Ｃ４−炭素原子でＲ−配置を有するチアゾ
リジンからは従来の化学的及び生物学的方法及び技術の
使用下に、単に出発物質の方向への平衡移動によっての
みＬ−システインを得ることができる。
リジンからは従来の化学的及び生物学的方法及び技術の
使用下に、単に出発物質の方向への平衡移動によっての
みＬ−システインを得ることができる。
【００６８】意外なことに、更に発酵において細胞内に
生じたチアゾリジン誘導体からＬ−システインを製造す
ることが有利であることが示された。この意外な事実の
詳細な調査は、細胞に対するチアゾリジンの毒性がＬ−
システインの毒性より低いという認識に導いた。
生じたチアゾリジン誘導体からＬ−システインを製造す
ることが有利であることが示された。この意外な事実の
詳細な調査は、細胞に対するチアゾリジンの毒性がＬ−
システインの毒性より低いという認識に導いた。
【００６９】従って、本発明はＬ−システインを製造す
るための方法にも関し、この方法は微生物により細胞内
で形成されたＬ−システインと、該微生物中の細胞内に
存在するケトン又はアルデヒドとを該微生物中で細胞内
で反応させチアゾリジン誘導体とし、このチアゾリジン
誘導体を、抗生物質又は他の微生物に毒性の物質を細胞
から直接放出するために好適である蛋白質を用いて微生
物から放出させ、かつ場合によりチアゾリジン誘導体を
分離した後、Ｌ−システイン及びチアゾリジン誘導体の
間の反応平衡をＬ−システインの方向に平衡移動するこ
とによりＬ−システインを獲得することを特徴とする。
るための方法にも関し、この方法は微生物により細胞内
で形成されたＬ−システインと、該微生物中の細胞内に
存在するケトン又はアルデヒドとを該微生物中で細胞内
で反応させチアゾリジン誘導体とし、このチアゾリジン
誘導体を、抗生物質又は他の微生物に毒性の物質を細胞
から直接放出するために好適である蛋白質を用いて微生
物から放出させ、かつ場合によりチアゾリジン誘導体を
分離した後、Ｌ−システイン及びチアゾリジン誘導体の
間の反応平衡をＬ−システインの方向に平衡移動するこ
とによりＬ−システインを獲得することを特徴とする。
【００７０】チアゾリジン誘導体の細胞内形成のための
可能性はＬ−システインとその都度細胞内に存在するケ
トン又はアルデヒドとの反応である。
可能性はＬ−システインとその都度細胞内に存在するケ
トン又はアルデヒドとの反応である。
【００７１】縮合のために挙げることのできる多くのケ
トン及びアルデヒドは有機体の物質代謝経路において公
知である。バクテリアの物質代謝経路におけるこれらは
特に、例えばピルベート、オキザルアセテート、α−ケ
トグルタレート又はグリオキシレートである。
トン及びアルデヒドは有機体の物質代謝経路において公
知である。バクテリアの物質代謝経路におけるこれらは
特に、例えばピルベート、オキザルアセテート、α−ケ
トグルタレート又はグリオキシレートである。
【００７２】有利にはＬ−システインはピルベート又は
グリオキシレートと反応する。
グリオキシレートと反応する。
【００７３】従って、概略的に示した式Ｉの、発明方法
において生じたチアゾリジン誘導体において、基Ｒ1又
はＲ2の少なくとも１つはカルボキシル基であるのが有
利であり、特に有利であるのはＲ1がＣＯＯＨを表わ
し、Ｒ2がＣＨ3を表わす。
において生じたチアゾリジン誘導体において、基Ｒ1又
はＲ2の少なくとも１つはカルボキシル基であるのが有
利であり、特に有利であるのはＲ1がＣＯＯＨを表わ
し、Ｒ2がＣＨ3を表わす。
【００７４】チアゾリジン誘導体への縮合のための出発
物質は、両者ともに微生物によって生成されたものであ
っても、又は単に１つの出発物質のみが微生物により生
成され、第２の出発物質を発酵の間に添加してもよい。
物質は、両者ともに微生物によって生成されたものであ
っても、又は単に１つの出発物質のみが微生物により生
成され、第２の出発物質を発酵の間に添加してもよい。
【００７５】本発明の有利な実施形においては、チアゾ
リジン誘導体に縮合するための両方の出発物質が微生物
により形成されているのが有利である。
リジン誘導体に縮合するための両方の出発物質が微生物
により形成されているのが有利である。
【００７６】平衡から取り出すことができるように、ピ
ルベートを誘導体化するための誘導体化剤としては特に
ヒドロキシアミン又は２,４−ジニトロフェニルヒドラ
ジンを使用する。
ルベートを誘導体化するための誘導体化剤としては特に
ヒドロキシアミン又は２,４−ジニトロフェニルヒドラ
ジンを使用する。
【００７７】本発明方法において、チアゾリジン誘導体
（及び相応するヘミチオケタール）が簡単でかつ安価な
Ｃ−及びＮ−及びＳ−源から製造されうるのが有利であ
る。
（及び相応するヘミチオケタール）が簡単でかつ安価な
Ｃ−及びＮ−及びＳ−源から製造されうるのが有利であ
る。
【００７８】発酵において常用のＣ−源、例えばグルコ
ース、ラクトース、デンプン等、Ｎ−源、例えばアンモ
ニウム又は蛋白質加水分解物等、及びＳ−源、例えばス
ルフィド、サルファイト、スルフェート、チオスルフェ
ート又はジチオナイトを本発明においては発酵に使用す
ることができる。
ース、ラクトース、デンプン等、Ｎ−源、例えばアンモ
ニウム又は蛋白質加水分解物等、及びＳ−源、例えばス
ルフィド、サルファイト、スルフェート、チオスルフェ
ート又はジチオナイトを本発明においては発酵に使用す
ることができる。
【００７９】発酵により獲得したチアゾリジン誘導体は
システインを獲得するためにのみ使用することができる
のではない。発酵的に製造された、Ｃ４−炭素原子でＲ
−配置を有するチアゾリジン誘導体を更なる合成（buil
ding block）のための出発物質として使用することがで
きる、多くの使用可能性は公知である。
システインを獲得するためにのみ使用することができる
のではない。発酵的に製造された、Ｃ４−炭素原子でＲ
−配置を有するチアゾリジン誘導体を更なる合成（buil
ding block）のための出発物質として使用することがで
きる、多くの使用可能性は公知である。
【００８０】
【実施例】次の実施例は、本発明を更に詳細に説明する
ために使用する。
ために使用する。
【００８１】チアゾリジン誘導体／ヘミチオケタールの
定量的測定は、間接的にのみ可能である。この測定は実
施例においては、ガイトンデ（Gaitonde,M.K.(1967),Bi
ochem.J.104,627-633）によるシステイン測定により実
施した。ニンヒドリンでの強力な酸中でのシステインの
誘導体化により、これを平衡から取り出す。こうしてヘ
ミチオケタール及び引き続きチアゾリジン誘導体も後反
応する。１００℃で約１０分後には、全チアゾリジン誘
導体及びこれに属するヘミチオケタールはシステイン−
ニンヒドリン誘導体に変換し、次いでこれを５６０ｎｍ
で定量測定することができる。遊離のシステインは、こ
の際一緒に把握される。
定量的測定は、間接的にのみ可能である。この測定は実
施例においては、ガイトンデ（Gaitonde,M.K.(1967),Bi
ochem.J.104,627-633）によるシステイン測定により実
施した。ニンヒドリンでの強力な酸中でのシステインの
誘導体化により、これを平衡から取り出す。こうしてヘ
ミチオケタール及び引き続きチアゾリジン誘導体も後反
応する。１００℃で約１０分後には、全チアゾリジン誘
導体及びこれに属するヘミチオケタールはシステイン−
ニンヒドリン誘導体に変換し、次いでこれを５６０ｎｍ
で定量測定することができる。遊離のシステインは、こ
の際一緒に把握される。
【００８２】遊離ＳＨ−基及びこうして遊離のシステイ
ン単独の量はザン・ハン・リー等（Sang-Han Lee、Bioc
hemical and Biophysical Research Communications,Vo
l.213,No.3(1995),p837以降）により記載されたテスト
により５,５′−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（Ｄ
ＴＮＢ）を用いて測定した。
ン単独の量はザン・ハン・リー等（Sang-Han Lee、Bioc
hemical and Biophysical Research Communications,Vo
l.213,No.3(1995),p837以降）により記載されたテスト
により５,５′−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（Ｄ
ＴＮＢ）を用いて測定した。
【００８３】遊離Ｌ−システインの形成の際に、発酵の
間に導入した空気酸素によりこの遊離Ｌ−システインは
Ｌ−シスチンに酸化される。シスチンは水性媒体中に、
ｐＨ７で難溶性であり、白色ペレットとして析出する。
不溶性シスチンペレットの形成の際に、これを半濃縮Ｈ
Ｃｌ中に溶かし、かつ同様に還元性の条件下にジチオト
レイト（ＤＴＴ）で前記テストで測定する。
間に導入した空気酸素によりこの遊離Ｌ−システインは
Ｌ−シスチンに酸化される。シスチンは水性媒体中に、
ｐＨ７で難溶性であり、白色ペレットとして析出する。
不溶性シスチンペレットの形成の際に、これを半濃縮Ｈ
Ｃｌ中に溶かし、かつ同様に還元性の条件下にジチオト
レイト（ＤＴＴ）で前記テストで測定する。
【００８４】実施例３中には発酵結果としてガイトンデ
によるテストで測定した上澄液中の“総システイン”の
量を示している。この際、これは特に２−メチル−チア
ゾリジン−２,４−ジカルボン酸、これに属するヘミチ
オケタール、遊離Ｌ−システイン及び溶解システインで
ある。析出したシステインは別に定量して記載した。
によるテストで測定した上澄液中の“総システイン”の
量を示している。この際、これは特に２−メチル−チア
ゾリジン−２,４−ジカルボン酸、これに属するヘミチ
オケタール、遊離Ｌ−システイン及び溶解システインで
ある。析出したシステインは別に定量して記載した。
【００８５】本発明の実施形において生じる２−メチル
−チアゾリジン−２,４−ジカルボン酸の２価の金属イ
オンによる容易な沈殿性は、この誘導体の生成に関する
検出の際に利用することができる。従来は酢酸亜鉛での
沈殿性のみが記載されている（Schubert等、前記文献位
置を参照）。しかしながら、他の２価の金属イオン、例
えばマグネシウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト
等での沈殿も同様に可能である。生じたチアゾリジン生
成物の沈殿及び引き続く同定は実施例４に記載されてい
る。ここでも、２４時間の発酵時間の後、主生成物は２
−メチル−チアゾリジン−２,４−ジカルボン酸である
ことを示した。容易な沈殿性は発酵生成物の分析におい
て有用であるだけでなく、生成物の精製においても有用
である。
−チアゾリジン−２,４−ジカルボン酸の２価の金属イ
オンによる容易な沈殿性は、この誘導体の生成に関する
検出の際に利用することができる。従来は酢酸亜鉛での
沈殿性のみが記載されている（Schubert等、前記文献位
置を参照）。しかしながら、他の２価の金属イオン、例
えばマグネシウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト
等での沈殿も同様に可能である。生じたチアゾリジン生
成物の沈殿及び引き続く同定は実施例４に記載されてい
る。ここでも、２４時間の発酵時間の後、主生成物は２
−メチル−チアゾリジン−２,４−ジカルボン酸である
ことを示した。容易な沈殿性は発酵生成物の分析におい
て有用であるだけでなく、生成物の精製においても有用
である。
【００８６】実施例１ ＰＣＲによる対立遺伝子の増殖 Ａ. ｃｙｓＥ−対立遺伝子の増殖 次に使用したｃｙｓＥ−対立遺伝子、ｃｙｓＥＩＶ及び
ｃｙｓＥＸはＤＥ １９５３９９５２の実施例２／１０
に記載されている。そこに記載されている突然変異の製
造は部位特異性突然変異誘発物質の使用により可能であ
る。突然誘発を実施するためのキットは例えば、ストラ
タゲン社（Stratagene GmbH,Postfach 105466,D-69044
Heidelberg）から商品名ＥｘＳｉｔｅ又はＣｈａｍｅｌ
ｅｏｎとして市販されている。
ｃｙｓＥＸはＤＥ １９５３９９５２の実施例２／１０
に記載されている。そこに記載されている突然変異の製
造は部位特異性突然変異誘発物質の使用により可能であ
る。突然誘発を実施するためのキットは例えば、ストラ
タゲン社（Stratagene GmbH,Postfach 105466,D-69044
Heidelberg）から商品名ＥｘＳｉｔｅ又はＣｈａｍｅｌ
ｅｏｎとして市販されている。
【００８７】部位特異性突然変異誘発の実施の後、得ら
れた対立遺伝子を複製連鎖反応（ＰＣＲ）により（Saik
i等,1988,Science 239:487-491）それぞれのＤＮＡから
次のプライマーにより増殖した。
れた対立遺伝子を複製連鎖反応（ＰＣＲ）により（Saik
i等,1988,Science 239:487-491）それぞれのＤＮＡから
次のプライマーにより増殖した。
【００８８】
【化１１】
【００８９】ＰＣＲ−実験はデオキシヌクレオチド三リ
ン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２０
０μＭ、相応するオリゴヌクレオチド各１μＭ、それぞ
れのｃｙｓＥ−対立遺伝子を有する鋳型−ＤＮＡ１００
ｎｇ、１／１０ １０倍反応緩衝液（ＫＣｌ １００ｍ
Ｍ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 １００ｍＭ、トリス−ＨＣｌ(ｐＨ
８.８)２００ｍＭ、ＭｇＳＯ4 ２０ｍＭ、トリトン（Tr
iton）Ｘ−１００ １％及びＢＳＡ１０００μｇ／ｍ
ｌ）及び熱安定性、組換えＰｆｕ−ＤＮＡ−ポリメラー
ゼ（Stratagene）２.５単位の存在下に、サーモサイク
ラー（Gene-ATAQ-Controler,Pharmacia）中で次の条件
下に３０サイクル実施した：９４℃で１分間、６０℃で
１分間及び７２℃で３分間。
ン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２０
０μＭ、相応するオリゴヌクレオチド各１μＭ、それぞ
れのｃｙｓＥ−対立遺伝子を有する鋳型−ＤＮＡ１００
ｎｇ、１／１０ １０倍反応緩衝液（ＫＣｌ １００ｍ
Ｍ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 １００ｍＭ、トリス−ＨＣｌ(ｐＨ
８.８)２００ｍＭ、ＭｇＳＯ4 ２０ｍＭ、トリトン（Tr
iton）Ｘ−１００ １％及びＢＳＡ１０００μｇ／ｍ
ｌ）及び熱安定性、組換えＰｆｕ−ＤＮＡ−ポリメラー
ゼ（Stratagene）２.５単位の存在下に、サーモサイク
ラー（Gene-ATAQ-Controler,Pharmacia）中で次の条件
下に３０サイクル実施した：９４℃で１分間、６０℃で
１分間及び７２℃で３分間。
【００９０】増殖生成物をＳａｃＩ及びＮｓｉＩ（両者
とも、Boehringer Mannheim GmbHからのもの）で製造者
が指示した条件下に加水分解し、１％アガロースゲルを
介して分離し、ゲンクリーン法（Geneclean Kit BIO101
P.O.Box 2284 La Jolla,California,92038-2284）を用
いて製造者の指示に従って、アガロースゲルから約１.
０ｋｂの大きさのフラグメントを単離した。次に使用す
るまで、このフラグメントを−２０℃で貯蔵した。
とも、Boehringer Mannheim GmbHからのもの）で製造者
が指示した条件下に加水分解し、１％アガロースゲルを
介して分離し、ゲンクリーン法（Geneclean Kit BIO101
P.O.Box 2284 La Jolla,California,92038-2284）を用
いて製造者の指示に従って、アガロースゲルから約１.
０ｋｂの大きさのフラグメントを単離した。次に使用す
るまで、このフラグメントを−２０℃で貯蔵した。
【００９１】Ｂ. ｍａｒ−座の増殖 大腸菌のｍａｒ−座をＰＣＲにより増殖した。増殖生成
物の獲得法は、実施例１のＡ.項に記載されていると同
様に行なった。鋳型−ＤＮＡとしては大腸菌 Ｗ３１１
０からの染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ２７３２５）を使用
した。鋳型ＤＮＡとしてはプラスミド１００−１−１
（ＤＳＭ １１５４５）も同様に好適である。細胞の溶
菌及び染色体ＤＮＡの精製はアウスベル等により記載さ
れた記録書（Ausubel et al.,1987,2.4.1-2.4.2,Curren
t Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing
Associates and Wiley-Interscience）に従って実施し
た。次のプライマーをｍａｒ−座の増殖に関して使用し
た：
物の獲得法は、実施例１のＡ.項に記載されていると同
様に行なった。鋳型−ＤＮＡとしては大腸菌 Ｗ３１１
０からの染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ２７３２５）を使用
した。鋳型ＤＮＡとしてはプラスミド１００−１−１
（ＤＳＭ １１５４５）も同様に好適である。細胞の溶
菌及び染色体ＤＮＡの精製はアウスベル等により記載さ
れた記録書（Ausubel et al.,1987,2.4.1-2.4.2,Curren
t Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing
Associates and Wiley-Interscience）に従って実施し
た。次のプライマーをｍａｒ−座の増殖に関して使用し
た：
【００９２】
【化１２】
【００９３】ｍａｒ−座の増殖は約３ｋｂの大きさのフ
ラグメントに導いた。このフラグメントを実施例１の
Ａ.項に記載されているように精製した。引き続く制限
消化を酵素ＡｓｃＩ及びＰａｃＩ（両者ともNew Englan
d Biolabs GmbH,Postfach 2750,D-65820 Schwalbach/Ta
unusからのもの）で、製造者の指示及び緩衝剤で実施し
た。アガロースゲル電気泳動によるフラグメントの精製
の後、これを−２０℃で貯蔵した。
ラグメントに導いた。このフラグメントを実施例１の
Ａ.項に記載されているように精製した。引き続く制限
消化を酵素ＡｓｃＩ及びＰａｃＩ（両者ともNew Englan
d Biolabs GmbH,Postfach 2750,D-65820 Schwalbach/Ta
unusからのもの）で、製造者の指示及び緩衝剤で実施し
た。アガロースゲル電気泳動によるフラグメントの精製
の後、これを−２０℃で貯蔵した。
【００９４】Ｃ. ＯＲＦ３０６−ＤＮＡの増殖 ＯＲＦ３０６をコードするＤＮＡを実施例１のＡ.項に
記載されていると同様にして、ＰＣＲを介して増殖し
た。鋳型−ＤＮＡとして、実施例１中のＢ.項で単離し
た大腸菌Ｗ３１１０からの染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ２
７３２５）を使用した。鋳型−ＤＮＡとしてはプラスミ
ド１００−１−１（ＤＳＭ １１５４５）も同様に好適
である。使用したプライマーは次のものを表わす：
記載されていると同様にして、ＰＣＲを介して増殖し
た。鋳型−ＤＮＡとして、実施例１中のＢ.項で単離し
た大腸菌Ｗ３１１０からの染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ２
７３２５）を使用した。鋳型−ＤＮＡとしてはプラスミ
ド１００−１−１（ＤＳＭ １１５４５）も同様に好適
である。使用したプライマーは次のものを表わす：
【００９５】
【化１３】
【００９６】増殖したＤＮＡ−フラグメントは約１.０
５ｋｂの大きさであり、かつ前記のようにアガロースゲ
ル電気泳動により精製した。引き続くＡｓｎＩ（Boehri
ngerMannheim）及びＰａｃＩ（New England Biolabs）
を用いての制限消化は、酵素の除去後、所望のＤＮＡ−
フラグメントに導いた。これを使用まで−２０℃で貯蔵
した。
５ｋｂの大きさであり、かつ前記のようにアガロースゲ
ル電気泳動により精製した。引き続くＡｓｎＩ（Boehri
ngerMannheim）及びＰａｃＩ（New England Biolabs）
を用いての制限消化は、酵素の除去後、所望のＤＮＡ−
フラグメントに導いた。これを使用まで−２０℃で貯蔵
した。
【００９７】Ｄ. ＧＡＰＤＨ−プロモータをコードす
るＤＮＡ−フラグメントの増殖 ＯＲＦ３０６の効果的な転写のために、グリセリンアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモータを使
用した。この所望のＤＮＡ−フラグメントを同様にＰＣ
Ｒで獲得した。
るＤＮＡ−フラグメントの増殖 ＯＲＦ３０６の効果的な転写のために、グリセリンアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモータを使
用した。この所望のＤＮＡ−フラグメントを同様にＰＣ
Ｒで獲得した。
【００９８】鋳型−ＤＮＡとして大腸菌Ｗ３１１０から
の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ２７３２５）を再び使用し
た。鋳型−ＤＮＡとしては同様にプラスミド１００−１
−１が好適である。次のプライマーを使用した：
の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ２７３２５）を再び使用し
た。鋳型−ＤＮＡとしては同様にプラスミド１００−１
−１が好適である。次のプライマーを使用した：
【００９９】
【化１４】
【０１００】得られた約０.３ｋｂを有するＤＮＡフラ
グメントを、実施例１のＡ.項に記載されているように
単離し、かつ精製した。引き続く、酵素ＭｌｕＩ及びＰ
ａｃＩでの制限消化は所望のＤＮＡ−フラグメントに導
いた。制限酵素を除去した後、このＤＮＡを−２０℃で
貯蔵した。
グメントを、実施例１のＡ.項に記載されているように
単離し、かつ精製した。引き続く、酵素ＭｌｕＩ及びＰ
ａｃＩでの制限消化は所望のＤＮＡ−フラグメントに導
いた。制限酵素を除去した後、このＤＮＡを−２０℃で
貯蔵した。
【０１０１】実施例２ 本発明によるプラスミドの構成 本発明によるプラスミドの構成のための基礎プラスミド
としてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を使用した。このプ
ラスミドをＤＥ １９５３９９５２に記載されているよ
うに修飾し、かつプラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨと
して寄託番号ＤＳＭ １０１７２で寄託した（Deutschen
Sammlung fuer Mikroorganismen in Braunschweig）。
としてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を使用した。このプ
ラスミドをＤＥ １９５３９９５２に記載されているよ
うに修飾し、かつプラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨと
して寄託番号ＤＳＭ １０１７２で寄託した（Deutschen
Sammlung fuer Mikroorganismen in Braunschweig）。
【０１０２】プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨの制限
−及び機能地図を図２に示した。プラスミドｐＡＣＹＣ
１８４−ＬＨはポリリンカーを有する。このポリリンカ
ーは次の制限切断位を有する：
−及び機能地図を図２に示した。プラスミドｐＡＣＹＣ
１８４−ＬＨはポリリンカーを有する。このポリリンカ
ーは次の制限切断位を有する：
【０１０３】
【化１５】
【０１０４】このリンカー中に、実施例１中でＰＣＲに
より及び引き続き制限消化により獲得したＤＮＡ−フラ
グメントを連結した。
より及び引き続き制限消化により獲得したＤＮＡ−フラ
グメントを連結した。
【０１０５】Ａ. 制御プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／
ｃｙｓＥＩＶ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸの構成 プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶ及びｐＡＣ
ＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸの製造はＤＥ １９３９９５２
の実施例３中に記載されており、次に簡単に記載する：
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（ＤＳＭ １０１７
２）約１μｇを制限酵素ＳａｃＩ及びＮｓｉＩで製造者
（Boehringer Mannheim）の記載に従って消化した。引
き続き、消化したＤＮＡを酵素の除去のためにアガロー
スゲル電気泳動により、前記のように精製した。実施例
１のＡ.項により得られた、それぞれのｃｙｓＥ−対立
遺伝子をコードするＤＮＡ−フラグメントを、次いでＳ
ａｃＩ及びＮｓｉＩで消化したプラスミドｐＡＣＹＣ１
８４−ＬＨと当モル量で混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
１μｌ及び１０倍リガーゼ緩衝液（両者ともBoehringer
Mannheim）２μｌと混合し、滅菌、二回蒸留Ｈ2Ｏで全
量２０μｌに満たした。この混合物を４℃で一夜インキ
ュベートし、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２
５）の形質転換のために使用した。次に記載した形質転
換法は実施例に記載した形質転換全てにおいて使用し
た。
ｃｙｓＥＩＶ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸの構成 プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶ及びｐＡＣ
ＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸの製造はＤＥ １９３９９５２
の実施例３中に記載されており、次に簡単に記載する：
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（ＤＳＭ １０１７
２）約１μｇを制限酵素ＳａｃＩ及びＮｓｉＩで製造者
（Boehringer Mannheim）の記載に従って消化した。引
き続き、消化したＤＮＡを酵素の除去のためにアガロー
スゲル電気泳動により、前記のように精製した。実施例
１のＡ.項により得られた、それぞれのｃｙｓＥ−対立
遺伝子をコードするＤＮＡ−フラグメントを、次いでＳ
ａｃＩ及びＮｓｉＩで消化したプラスミドｐＡＣＹＣ１
８４−ＬＨと当モル量で混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
１μｌ及び１０倍リガーゼ緩衝液（両者ともBoehringer
Mannheim）２μｌと混合し、滅菌、二回蒸留Ｈ2Ｏで全
量２０μｌに満たした。この混合物を４℃で一夜インキ
ュベートし、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２
５）の形質転換のために使用した。次に記載した形質転
換法は実施例に記載した形質転換全てにおいて使用し
た。
【０１０６】大腸菌Ｗ３１１０の形質転換は、エレクト
ロポレーションにより実施した。このためには１ ｌエ
ルレンマイヤーフラスコ中のＬＢ−培地５００ｍｌ
（トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ ５
ｇ）に同じ培地中の一夜培地１％（ｖ／ｖ）で接種し
た。６００ｎｍで光学密度０.５〜０.６まで３７℃で円
形振盪器中でインキュベーションした後、細胞を滅菌ビ
ーカー中で４℃で遠心分離することにより収穫した。全
てのこれ以降の工程を氷上で、かつ滅菌状態を保持下に
実施した。この細胞ペレットを氷冷、滅菌、二回蒸留Ｈ
2Ｏ５００ｍｌで２回洗浄し、引き続き１０％（ｖ／
ｖ）滅菌グリセリン３０ｍｌ中に再懸濁した。更に遠心
分離した後、細胞ペレットを１０％（ｖ／ｖ）グリセリ
ン５００μｌ中に取り込み、アリコート２００μｌで−
８０℃で貯蔵した。形質転換のためにはこの細胞を氷上
で解凍し、ＤＮＡ約１０〜１００ｎｇと混合し、滅菌エ
レクトロポレーションキュベット（BioRad）中に入れ
た。このキュベットをジーンパルサー（Gene Pulser:Bi
oRad）中に配置し、電圧２５００ボルト、平行抵抗２０
０オーム及びキャパシティー２５μＦでエレクトロポレ
ーションを行なった。引き続きこの細胞をＳＯＣ培地
（カゼインペプトン２０.０ｇ／ｌ、酵母抽出物５.０ｇ
／ｌ、ＮａＣｌ０.５８ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０.１９ｇ／
ｌ、ＭｇＣｌ2 ２.０３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ２.４６ｇ／
ｌ、グルコース３.６０ｇ／ｌ、ｐＨ＝７.０）１ｍｌ中
に再懸濁させ、３７℃で１時間振盪した。その後、この
細胞を相応して希釈し、ＬＢ−寒天培地（トリプトン１
０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、
寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ＝７.２）上に塗布し、個々のコ
ロニーが可視となるまで、３７℃で一夜インキュベート
した。
ロポレーションにより実施した。このためには１ ｌエ
ルレンマイヤーフラスコ中のＬＢ−培地５００ｍｌ
（トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ ５
ｇ）に同じ培地中の一夜培地１％（ｖ／ｖ）で接種し
た。６００ｎｍで光学密度０.５〜０.６まで３７℃で円
形振盪器中でインキュベーションした後、細胞を滅菌ビ
ーカー中で４℃で遠心分離することにより収穫した。全
てのこれ以降の工程を氷上で、かつ滅菌状態を保持下に
実施した。この細胞ペレットを氷冷、滅菌、二回蒸留Ｈ
2Ｏ５００ｍｌで２回洗浄し、引き続き１０％（ｖ／
ｖ）滅菌グリセリン３０ｍｌ中に再懸濁した。更に遠心
分離した後、細胞ペレットを１０％（ｖ／ｖ）グリセリ
ン５００μｌ中に取り込み、アリコート２００μｌで−
８０℃で貯蔵した。形質転換のためにはこの細胞を氷上
で解凍し、ＤＮＡ約１０〜１００ｎｇと混合し、滅菌エ
レクトロポレーションキュベット（BioRad）中に入れ
た。このキュベットをジーンパルサー（Gene Pulser:Bi
oRad）中に配置し、電圧２５００ボルト、平行抵抗２０
０オーム及びキャパシティー２５μＦでエレクトロポレ
ーションを行なった。引き続きこの細胞をＳＯＣ培地
（カゼインペプトン２０.０ｇ／ｌ、酵母抽出物５.０ｇ
／ｌ、ＮａＣｌ０.５８ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０.１９ｇ／
ｌ、ＭｇＣｌ2 ２.０３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ２.４６ｇ／
ｌ、グルコース３.６０ｇ／ｌ、ｐＨ＝７.０）１ｍｌ中
に再懸濁させ、３７℃で１時間振盪した。その後、この
細胞を相応して希釈し、ＬＢ−寒天培地（トリプトン１
０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、
寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ＝７.２）上に塗布し、個々のコ
ロニーが可視となるまで、３７℃で一夜インキュベート
した。
【０１０７】所望の形質転換体はＱＩＡｐｒｅｐ スピ
ン・プラスミド・キッド（Spin Plasmid Kit:Qiagen Gm
bH,Max-Volmer-Strasse 4,D-40724 Hilden）を用いるプ
ラスミド単離の後、制限分析により同定した。これを実
施例３中でコントロールとして発酵中に使用した。
ン・プラスミド・キッド（Spin Plasmid Kit:Qiagen Gm
bH,Max-Volmer-Strasse 4,D-40724 Hilden）を用いるプ
ラスミド単離の後、制限分析により同定した。これを実
施例３中でコントロールとして発酵中に使用した。
【０１０８】プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩ
Ｖ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸを図３中に示し
た。
Ｖ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸを図３中に示し
た。
【０１０９】Ｂ. プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙ
ｓＥＩＶ−ｍａｒ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−
ｍａｒの構成 実施例２のＡ.項中で構成されたプラスミドｐＡＣＹＣ
１８４／ｃｙｓＥＩＶ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥ
Ｘ各１μｇを順次、制限酵素ＭｌｕＩ（Boehringer）及
びＰａｃＩ（New England Biolabs）を用いて製造者の
指示に従って消化した。この制限消化の後、実施例１の
Ａ.項に記載されているように、このＤＮＡをアガロー
スゲル電気泳動で単離し、かつ精製した。ＭｌｕＩ−Ｐ
ａｃＩ消化ベクターｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶも
しくはｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ約２０ｎｇを実施
例１のＡ.項中で製造されたＤＮＡフラグメント２００
ｎｇ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim）１
μｌ及び１０倍リガーゼ緩衝剤（Boehringer Mannhei
m）２μｌ及び必要量の滅菌、二回蒸留Ｈ2Ｏを最終容量
２０μｌとなるように混合した。４℃で一夜インキュベ
ーションした後に、この２つのＤＮＡ−混合物を大腸菌
Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の形質転換に使用
した。ＱＩＡｐｒｅｐ スピン・プラスミド・キッド（S
pin Plasmid Kit:Qiagen GmbH）によるプラスミドの単
離及び制限分析により、所望の形質転換体が単離され、
これを実施例３に記載されているように発酵に使用し
た。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶ−ｍａ
ｒもしくはｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ｍａｒの制
限−及び機能地図は図４中に示されている。
ｓＥＩＶ−ｍａｒ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−
ｍａｒの構成 実施例２のＡ.項中で構成されたプラスミドｐＡＣＹＣ
１８４／ｃｙｓＥＩＶ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥ
Ｘ各１μｇを順次、制限酵素ＭｌｕＩ（Boehringer）及
びＰａｃＩ（New England Biolabs）を用いて製造者の
指示に従って消化した。この制限消化の後、実施例１の
Ａ.項に記載されているように、このＤＮＡをアガロー
スゲル電気泳動で単離し、かつ精製した。ＭｌｕＩ−Ｐ
ａｃＩ消化ベクターｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶも
しくはｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ約２０ｎｇを実施
例１のＡ.項中で製造されたＤＮＡフラグメント２００
ｎｇ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim）１
μｌ及び１０倍リガーゼ緩衝剤（Boehringer Mannhei
m）２μｌ及び必要量の滅菌、二回蒸留Ｈ2Ｏを最終容量
２０μｌとなるように混合した。４℃で一夜インキュベ
ーションした後に、この２つのＤＮＡ−混合物を大腸菌
Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の形質転換に使用
した。ＱＩＡｐｒｅｐ スピン・プラスミド・キッド（S
pin Plasmid Kit:Qiagen GmbH）によるプラスミドの単
離及び制限分析により、所望の形質転換体が単離され、
これを実施例３に記載されているように発酵に使用し
た。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶ−ｍａ
ｒもしくはｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ｍａｒの制
限−及び機能地図は図４中に示されている。
【０１１０】Ｃ. プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙ
ｓＥＩＶ−ＧＡＰＤＨ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥ
Ｘ−ＧＡＰＤＨの構成 実施例２のＡ.項中で構成されたプラスミドｐＡＣＹＣ
１８４／ｃｙｓＥＩＶ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥ
Ｘをそれぞれ制限酵素ＭｌｕＩ（Boehringer Mannhei
m）及びＰａｃＩ（New England Biolabs）を用いて製造
者の指示に従って消化した。
ｓＥＩＶ−ＧＡＰＤＨ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥ
Ｘ−ＧＡＰＤＨの構成 実施例２のＡ.項中で構成されたプラスミドｐＡＣＹＣ
１８４／ｃｙｓＥＩＶ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥ
Ｘをそれぞれ制限酵素ＭｌｕＩ（Boehringer Mannhei
m）及びＰａｃＩ（New England Biolabs）を用いて製造
者の指示に従って消化した。
【０１１１】このように処理したプラスミドの精製の
後、実施例２のＢ.項に記載されているように、それぞ
れ実施例１のＤ.項で製造したＤＮＡフラグメントと２
つの連結を実施した。
後、実施例２のＢ.項に記載されているように、それぞ
れ実施例１のＤ.項で製造したＤＮＡフラグメントと２
つの連結を実施した。
【０１１２】４℃で一夜インキュベーションした後、こ
の連結配合物で大腸菌Ｗ３１１０を形質転換した。正し
い形質転換体はプラスミドＤＮＡの単離の後、好適な制
限酵素による分析により同定した。
の連結配合物で大腸菌Ｗ３１１０を形質転換した。正し
い形質転換体はプラスミドＤＮＡの単離の後、好適な制
限酵素による分析により同定した。
【０１１３】プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩ
Ｖ−ＧＡＰＤＨ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−Ｇ
ＡＰＤＨを出発物質としてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４
／ｃｙｓＥＩＶ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６及びｐＡＣ
ＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６の
構成のために使用した。これに関しては次のＤ.項に記
載されている。
Ｖ−ＧＡＰＤＨ及びｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−Ｇ
ＡＰＤＨを出発物質としてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４
／ｃｙｓＥＩＶ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６及びｐＡＣ
ＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６の
構成のために使用した。これに関しては次のＤ.項に記
載されている。
【０１１４】Ｄ. プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙ
ｓＥＩＶ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６及びｐＡＣＹＣ１
８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６の構成 Ｃ.項中で製造されたプラスミドをＮｄｅＩ（Boehringe
r Mannheim）及びＰａｃＩ（New England Biolabs）を
用いて製造者の指示に従って消化した。プラスミドＤＮ
Ａの精製の後、ＯＲＦをコードする、実施例１のＣ.項
からのＡｓｎＩ−ＰａｃＩで切断したＤＮＡフラグメン
トと２つの連結を実施した。
ｓＥＩＶ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６及びｐＡＣＹＣ１
８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６の構成 Ｃ.項中で製造されたプラスミドをＮｄｅＩ（Boehringe
r Mannheim）及びＰａｃＩ（New England Biolabs）を
用いて製造者の指示に従って消化した。プラスミドＤＮ
Ａの精製の後、ＯＲＦをコードする、実施例１のＣ.項
からのＡｓｎＩ−ＰａｃＩで切断したＤＮＡフラグメン
トと２つの連結を実施した。
【０１１５】４℃で一夜インキュベーションした後、こ
のＤＮＡ混合物をそれぞれ大腸菌Ｗ３１１０中に形質転
換し、ＬＢ−プレート上に塗布した。個々のコロニーが
生じた後に、これをプラスミド単離及び制限消化により
その正確さに関して調べた。
のＤＮＡ混合物をそれぞれ大腸菌Ｗ３１１０中に形質転
換し、ＬＢ−プレート上に塗布した。個々のコロニーが
生じた後に、これをプラスミド単離及び制限消化により
その正確さに関して調べた。
【０１１６】プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩ
Ｖ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６及びｐＡＣＹＣ１８４／
ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６の制限及び機能
地図は５図に示されている。
Ｖ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６及びｐＡＣＹＣ１８４／
ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６の制限及び機能
地図は５図に示されている。
【０１１７】実施例３ 発酵における本発明による構成体及び公知構成体の収率
の比較 発酵において比較する全てのプラスミドを大腸菌Ｗ３１
１０中で発酵した。それぞれ観察された収率上昇は本発
明による遺伝子の使用からのみ生じた。
の比較 発酵において比較する全てのプラスミドを大腸菌Ｗ３１
１０中で発酵した。それぞれ観察された収率上昇は本発
明による遺伝子の使用からのみ生じた。
【０１１８】エルレンマイヤーフラスコ（１００ｍｌ）
中のテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含有するＬＢ−培
地２０ｍｌをそれぞれ大腸菌構成体で接種した。振盪イ
ンキュベーター中で７時間インキュベートした後（１５
０ｒ.ｐ.ｍ、３０℃）、それぞれの予培養をグルコース
５ｇ／ｌ、ビタミンＢ1５ｇ／ｌ及びテトラサイクリン
１５ｍｇ／ｌを補足した、ＳＭ１−培地１００ｍｌ（Ｋ
2ＨＰＯ4 １２ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2
ＳＯ4５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.３ｇ／ｌ、Ｃ
ａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ ０.０１５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4×７Ｈ2
Ｏ ０.００２ｇ／ｌ、Ｎａ3クエン酸塩１ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ ０.１ｇ／ｌ、微量元素溶液（Ｎａ2ＭｏＯ4×２Ｈ
2Ｏ ０.１５ｇ／ｌ、Ｈ3ＢＯ3２.５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ2
×６Ｈ2Ｏ０.７ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ ０.２５ｇ
／ｌ、ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ １.６ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4×
７Ｈ2Ｏ ０.３ｇ／ｌからなる）１ｍｌ／ｌ）中に移入
した。この培養をエルレンマイヤーフラスコ（１ｌ）中
で３０℃、１５０ｒ.ｐ.ｍで１７時間振盪した。このイ
ンキュベーションの後６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ60
0）は３〜５の間であった。
中のテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含有するＬＢ−培
地２０ｍｌをそれぞれ大腸菌構成体で接種した。振盪イ
ンキュベーター中で７時間インキュベートした後（１５
０ｒ.ｐ.ｍ、３０℃）、それぞれの予培養をグルコース
５ｇ／ｌ、ビタミンＢ1５ｇ／ｌ及びテトラサイクリン
１５ｍｇ／ｌを補足した、ＳＭ１−培地１００ｍｌ（Ｋ
2ＨＰＯ4 １２ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2
ＳＯ4５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.３ｇ／ｌ、Ｃ
ａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ ０.０１５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4×７Ｈ2
Ｏ ０.００２ｇ／ｌ、Ｎａ3クエン酸塩１ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ ０.１ｇ／ｌ、微量元素溶液（Ｎａ2ＭｏＯ4×２Ｈ
2Ｏ ０.１５ｇ／ｌ、Ｈ3ＢＯ3２.５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ2
×６Ｈ2Ｏ０.７ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ ０.２５ｇ
／ｌ、ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ １.６ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4×
７Ｈ2Ｏ ０.３ｇ／ｌからなる）１ｍｌ／ｌ）中に移入
した。この培養をエルレンマイヤーフラスコ（１ｌ）中
で３０℃、１５０ｒ.ｐ.ｍで１７時間振盪した。このイ
ンキュベーションの後６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ60
0）は３〜５の間であった。
【０１１９】発酵を発酵器（BIOSTAT M:Firma Braun-Me
lsungen）中で実施した。総容量２ｌの培養容器を使用
した。発酵培地はグルコース１５ｇ／ｌ、トリプトン
（Difco）１０ｇ／ｌ、酵母抽出物（Difco）５.０ｇ／
ｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １.５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ ０.５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.３
ｇ／ｌ、 ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ ０.０１５ｇ／ｌ、Ｆｅ
ＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.０７５ｇ／ｌ、Ｎａ3クエン酸塩×
２Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ 、及び微量元素溶液（前記）１ｍ
ｌ、ビタミンＢ1０.００５ｇ／ｌ及びテトラサイクリン
１５ｍｇ／ｌを含有する。発酵器中のｐＨ値は開始時に
２５％ ＮＨ4ＯＨ−溶液をポンプで供給するすることに
より７.０に調節した。発酵の間、自動調節装置によ
り、２５％ＮＨ4ＯＨ−溶液でｐＨ値７.０に保持した。
接種のために、予培養１００ｍｌを発酵容器中にポンプ
で供給した。開始容量は約１ｌであった。この培養を最
初に２００ｒ.ｐ.ｍで撹拌し、かつ滅菌フィルターを介
して除菌した圧縮空気１.５ｖｖｍで通気した。発酵の
間、空気酸素飽和を５０％に調節した。制御は自動的に
撹拌速度を介して行なった。発酵を温度３０℃で実施し
た。発酵時間２時間後に、３０％Ｎａ−チオスルフェー
ト×５Ｈ2Ｏ−基本溶液からなる飼料供給を１時間あた
り３ｍｌの速度で実施した。ＯＤ600が１０に達した
後、滅菌５６％グルコース基礎溶液を１時間あたり約８
〜１４ｍｌの速度で供給した。グルコース含量の測定を
ＹＳＩ社のグルコース分析装置用いて酵素的に実施し
た。発酵の間グルコース濃度を連続的な飼料供給により
１０〜２０ｇ／ｌの間に調節した。培地のシステインの
総含量は試料の細胞不含上澄みからガイトンデによる比
色定量法により測定した（Gaitonde,M.K. (1967),Bioch
em.J.104,627-633）。この際、発酵の間溶液中に残るシ
ステインは特にチアゾリジン誘導体として存在するが、
それにもかかわらずこのテストにより把握されたという
ことは注目すべきことである。生じたシステインのチア
ゾリジン誘導体への変換のために必要なケトン又はアル
デヒド（この場合はピルベートである）がもはや十分な
量で供給されない場合、遊離Ｌ−システインが生じ、こ
れもテストにおいて同様に一緒に把握される。遊離Ｌ−
システインの形成の際に、これは供給された空気酸素に
より発酵の間にゆっくりとＬ−シスチンに酸化される。
シスチンは水性媒体中にｐＨ７.０で難溶性であり、白
色ペレットとして析出する。不溶性のシスチンペレット
の形成の際に、これを遠心分離により遠心した試料の上
澄みを分離した後、これを半濃縮ＨＣｌ中に溶かし、か
つ同様に還元性条件下に（ＤＤＴ）前記のテストで測定
した。
lsungen）中で実施した。総容量２ｌの培養容器を使用
した。発酵培地はグルコース１５ｇ／ｌ、トリプトン
（Difco）１０ｇ／ｌ、酵母抽出物（Difco）５.０ｇ／
ｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １.５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ ０.５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.３
ｇ／ｌ、 ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ ０.０１５ｇ／ｌ、Ｆｅ
ＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.０７５ｇ／ｌ、Ｎａ3クエン酸塩×
２Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ 、及び微量元素溶液（前記）１ｍ
ｌ、ビタミンＢ1０.００５ｇ／ｌ及びテトラサイクリン
１５ｍｇ／ｌを含有する。発酵器中のｐＨ値は開始時に
２５％ ＮＨ4ＯＨ−溶液をポンプで供給するすることに
より７.０に調節した。発酵の間、自動調節装置によ
り、２５％ＮＨ4ＯＨ−溶液でｐＨ値７.０に保持した。
接種のために、予培養１００ｍｌを発酵容器中にポンプ
で供給した。開始容量は約１ｌであった。この培養を最
初に２００ｒ.ｐ.ｍで撹拌し、かつ滅菌フィルターを介
して除菌した圧縮空気１.５ｖｖｍで通気した。発酵の
間、空気酸素飽和を５０％に調節した。制御は自動的に
撹拌速度を介して行なった。発酵を温度３０℃で実施し
た。発酵時間２時間後に、３０％Ｎａ−チオスルフェー
ト×５Ｈ2Ｏ−基本溶液からなる飼料供給を１時間あた
り３ｍｌの速度で実施した。ＯＤ600が１０に達した
後、滅菌５６％グルコース基礎溶液を１時間あたり約８
〜１４ｍｌの速度で供給した。グルコース含量の測定を
ＹＳＩ社のグルコース分析装置用いて酵素的に実施し
た。発酵の間グルコース濃度を連続的な飼料供給により
１０〜２０ｇ／ｌの間に調節した。培地のシステインの
総含量は試料の細胞不含上澄みからガイトンデによる比
色定量法により測定した（Gaitonde,M.K. (1967),Bioch
em.J.104,627-633）。この際、発酵の間溶液中に残るシ
ステインは特にチアゾリジン誘導体として存在するが、
それにもかかわらずこのテストにより把握されたという
ことは注目すべきことである。生じたシステインのチア
ゾリジン誘導体への変換のために必要なケトン又はアル
デヒド（この場合はピルベートである）がもはや十分な
量で供給されない場合、遊離Ｌ−システインが生じ、こ
れもテストにおいて同様に一緒に把握される。遊離Ｌ−
システインの形成の際に、これは供給された空気酸素に
より発酵の間にゆっくりとＬ−シスチンに酸化される。
シスチンは水性媒体中にｐＨ７.０で難溶性であり、白
色ペレットとして析出する。不溶性のシスチンペレット
の形成の際に、これを遠心分離により遠心した試料の上
澄みを分離した後、これを半濃縮ＨＣｌ中に溶かし、か
つ同様に還元性条件下に（ＤＤＴ）前記のテストで測定
した。
【０１２０】この条件下に、発酵時間２４時間もしくは
４８時間の後、第１表及び第２表中に示した収量が達せ
られた。ここでは、本発明により使用した遺伝子、即ち
大腸菌のｍａｒ−座及び特にＯＲＦ３０６をコードする
部分の遺伝子が、システイン及び／又はチアゾリジン誘
導体（総システイン）の収量を明らかに高めたことが明
らかである。シスチン沈殿が生じた場合、これを表中に
特に記載した。
４８時間の後、第１表及び第２表中に示した収量が達せ
られた。ここでは、本発明により使用した遺伝子、即ち
大腸菌のｍａｒ−座及び特にＯＲＦ３０６をコードする
部分の遺伝子が、システイン及び／又はチアゾリジン誘
導体（総システイン）の収量を明らかに高めたことが明
らかである。シスチン沈殿が生じた場合、これを表中に
特に記載した。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
【表２】
【０１２３】実施例４ ２−メチル−チアゾリジン−２,４−ジカルボン酸の形
成に関する証明 実施例３において記載した発酵の主生成物として、２−
メチル−チアゾリジン−２,４−ジカルボン酸の形成の
証明に関して、構成体大腸菌Ｗ３１１０×ｐＡＣＹＣ１
８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６を実施例
３に記載されているように発酵した。
成に関する証明 実施例３において記載した発酵の主生成物として、２−
メチル−チアゾリジン−２,４−ジカルボン酸の形成の
証明に関して、構成体大腸菌Ｗ３１１０×ｐＡＣＹＣ１
８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６を実施例
３に記載されているように発酵した。
【０１２４】２４時間後に、発酵上澄みを遠心分離によ
り細胞から分離した。記載されたシステイン測定は上澄
み中の総システイン１２.８ｇを示した。次いで、発酵
上澄みにＭｇＳＯ4を最終濃度０.３Ｍで混合した。この
上澄みを４℃で一夜撹拌下にインキュベーションした
後、白色沈殿が生じた。この沈殿は２−メチル−チアゾ
リジン−２,４−ジカルボン酸の難溶性マグネシウム塩
であった。
り細胞から分離した。記載されたシステイン測定は上澄
み中の総システイン１２.８ｇを示した。次いで、発酵
上澄みにＭｇＳＯ4を最終濃度０.３Ｍで混合した。この
上澄みを４℃で一夜撹拌下にインキュベーションした
後、白色沈殿が生じた。この沈殿は２−メチル−チアゾ
リジン−２,４−ジカルボン酸の難溶性マグネシウム塩
であった。
【０１２５】この沈殿を遠心分離により分離した後、上
澄み中に僅かにシステインの残留量２.５ｇ／ｌが測定
された。
澄み中に僅かにシステインの残留量２.５ｇ／ｌが測定
された。
【０１２６】この沈殿を半濃縮ＨＣｌ中に溶かし、かつ
同様にシステインテストを行なった。ここではシステイ
ン９.５ｇ／ｌの濃度が見いだされた。Ｄ2Ｏ＋ＨＣｌ中
に溶かした沈殿の、1Ｈ及び13Ｃ−ＮＭＲ検査により、
このものが参照物質（M.P. Schubert,J.Biol.Chem.121,
539-548(1937)）に対して、２−メチル−チアゾリジン
−２,４−ジカルボン酸であることが同定された。
同様にシステインテストを行なった。ここではシステイ
ン９.５ｇ／ｌの濃度が見いだされた。Ｄ2Ｏ＋ＨＣｌ中
に溶かした沈殿の、1Ｈ及び13Ｃ−ＮＭＲ検査により、
このものが参照物質（M.P. Schubert,J.Biol.Chem.121,
539-548(1937)）に対して、２−メチル−チアゾリジン
−２,４−ジカルボン酸であることが同定された。
【０１２７】実施例５ Ｌ−システイン及び２−メチルチアゾリジン−２,４
（Ｒ）−ジカルボン酸の異なる毒性 この実験に関しては、２−メチル−チアゾリジン−２,
４（Ｒ）−ジカルボン酸をシューベルトの方法により
（M.P. Schubert,J.Biol.Chem.121,539-548(1937)）、
Ｌ−システイン及びピルベートから合成した。ＬＢ−培
地中の大腸菌Ｗ３１１０の一夜培地を、グルコース１０
ｇ／ｌ、ＬＢ−培地１０％、ビタミンＢ１５ｍｇ／ｌ、
テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌ及びそれぞれ相応する量
のＬ−システイン又は２−メチル−チアゾリジン−２,
４（Ｒ）−ジカルボン酸を補充した、ＳＭ１−培地（実
施例３参照）２０ｍｌ中に接種した。３７℃で７時間イ
ンキュベーションした後、Ｌ−システインを加えた培地
中では１ｍＭからもはや全く成長を示さず、一方２−メ
チル−チアゾリジン−２,４（Ｒ）−ジカルボン酸を添
加した培地中では成長は５０ｍＭまで観察された。より
長いインキュベーション時間はシステインの容易な酸化
性により不可能であった。こうして、Ｌ−システインは
２−メチル−チアゾリジン−２,４（Ｒ）−ジカルボン
酸におけるより大腸菌に関して明らかに高い毒性を示
す。
（Ｒ）−ジカルボン酸の異なる毒性 この実験に関しては、２−メチル−チアゾリジン−２,
４（Ｒ）−ジカルボン酸をシューベルトの方法により
（M.P. Schubert,J.Biol.Chem.121,539-548(1937)）、
Ｌ−システイン及びピルベートから合成した。ＬＢ−培
地中の大腸菌Ｗ３１１０の一夜培地を、グルコース１０
ｇ／ｌ、ＬＢ−培地１０％、ビタミンＢ１５ｍｇ／ｌ、
テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌ及びそれぞれ相応する量
のＬ−システイン又は２−メチル−チアゾリジン−２,
４（Ｒ）−ジカルボン酸を補充した、ＳＭ１−培地（実
施例３参照）２０ｍｌ中に接種した。３７℃で７時間イ
ンキュベーションした後、Ｌ−システインを加えた培地
中では１ｍＭからもはや全く成長を示さず、一方２−メ
チル−チアゾリジン−２,４（Ｒ）−ジカルボン酸を添
加した培地中では成長は５０ｍＭまで観察された。より
長いインキュベーション時間はシステインの容易な酸化
性により不可能であった。こうして、Ｌ−システインは
２−メチル−チアゾリジン−２,４（Ｒ）−ジカルボン
酸におけるより大腸菌に関して明らかに高い毒性を示
す。
【０１２８】従って、Ｌ−システインの遊離のための化
学的工程が更に必要であるとしても、２−メチル−チア
ゾリジン−２,４（Ｒ）−ジカルボン酸は発酵的方法に
よりＬ−システインを獲得するためにより好適である。
学的工程が更に必要であるとしても、２−メチル−チア
ゾリジン−２,４（Ｒ）−ジカルボン酸は発酵的方法に
よりＬ−システインを獲得するためにより好適である。
【０１２９】実施例６ Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンの強化された形成 Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンの形成はＯ−アセチル−Ｌ−
セリンから自発的な転移により生じる。このＯ−アセチ
ル−Ｌ−セリンはバクテリアによる生合成経路において
Ｌ−システインの直前の前駆物質である。Ｏ−アセチル
−Ｌ−セリン中への不十分な又は欠けた硫黄組み込みに
おいて、そのような発酵の最終生成物は、こうしてＮ−
アセチル−Ｌ−セリンである。本発明による遺伝子は、
硫黄供給の欠失においてもこの発酵生成物の収量も高め
る。
セリンから自発的な転移により生じる。このＯ−アセチ
ル−Ｌ−セリンはバクテリアによる生合成経路において
Ｌ−システインの直前の前駆物質である。Ｏ−アセチル
−Ｌ−セリン中への不十分な又は欠けた硫黄組み込みに
おいて、そのような発酵の最終生成物は、こうしてＮ−
アセチル−Ｌ−セリンである。本発明による遺伝子は、
硫黄供給の欠失においてもこの発酵生成物の収量も高め
る。
【０１３０】実施例３中に記載した発酵をチオスルフェ
ート供給なしに実施することができた。本発明の遺伝
子、特にＯＲＦの有効性を示すために使用した構成体は
ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ及びｐＡＣＹＣ１８４／
ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６である。
ート供給なしに実施することができた。本発明の遺伝
子、特にＯＲＦの有効性を示すために使用した構成体は
ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ及びｐＡＣＹＣ１８４／
ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６である。
【０１３１】第３表中の結果が示すように、本発明によ
る遺伝子、特にＯＲＦ３０６は、明らかに発酵における
Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンの収量を上昇させた。
る遺伝子、特にＯＲＦ３０６は、明らかに発酵における
Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンの収量を上昇させた。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】より強いフィードバック−耐性ｃｙｓＥ−
対立遺伝子（例えば、ＤＥ １９５３９９５２からのｃ
ｙｓＥＸＩＶ、 ｃｙｓＥＸＩ、ｃｙｓＥＸＸＩＩ）の
使用において、本発明による遺伝子との組合せにおい
て、３０ｇ／ｌを越えるＮ−アセチル−Ｌ−セリンの収
量が達せられる。
対立遺伝子（例えば、ＤＥ １９５３９９５２からのｃ
ｙｓＥＸＩＶ、 ｃｙｓＥＸＩ、ｃｙｓＥＸＸＩＩ）の
使用において、本発明による遺伝子との組合せにおい
て、３０ｇ／ｌを越えるＮ−アセチル−Ｌ−セリンの収
量が達せられる。
【０１３４】配列表に関する一般的情報は以下の通りで
ある： （１） 一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：コンゾルテイウム フユール エレクトロ
ケミツシエ インヅストリー ゲゼルシャフト ミット
ベシュレンクテル ハフツング （Ｂ）町：ツイールシユタツト ストラーセ ２０ （Ｃ）市：ミュンヘン （Ｄ）州：バイエルン （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便コード：８１３７９ （Ｇ）電話：０８９−７４８４４−０ （Ｈ）テレファックス：０８９−７４８４４−３５０ （ｉｉ）発明の名称：微生物株、遺伝子、蛋白質、プラ
スミド、及びＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセ
チルセリン又はチアゾリジン誘導体の製法ならびに流出
遺伝子の使用。
ある： （１） 一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：コンゾルテイウム フユール エレクトロ
ケミツシエ インヅストリー ゲゼルシャフト ミット
ベシュレンクテル ハフツング （Ｂ）町：ツイールシユタツト ストラーセ ２０ （Ｃ）市：ミュンヘン （Ｄ）州：バイエルン （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便コード：８１３７９ （Ｇ）電話：０８９−７４８４４−０ （Ｈ）テレファックス：０８９−７４８４４−３５０ （ｉｉ）発明の名称：微生物株、遺伝子、蛋白質、プラ
スミド、及びＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセ
チルセリン又はチアゾリジン誘導体の製法ならびに流出
遺伝子の使用。
【０１３５】（ｉｉｉ）配列の数：１２ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティング システム：ＰＣ−ＤＯＳ／Ｍ
Ｓ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：パテント イン リリース ♯
１．０，バージョン♯１．３０（ＥＰＡ）。
Ｓ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：パテント イン リリース ♯
１．０，バージョン♯１．３０（ＥＰＡ）。
【０１３６】
（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：４３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名：Ｋ１２ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【０１３７】
【化１６】
【０１３８】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に関する
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３０６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名：Ｋ１２ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３０６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名：Ｋ１２ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【０１３９】
【化１７】
【０１４０】
【化１８】
【０１４１】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に関する
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：２９９アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名：Ｋ１２ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：２９９アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名：Ｋ１２ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
【０１４２】
【化１９】
【０１４３】
【化２０】
【０１４４】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に関する
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：２６６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名：Ｋ１２ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：２６６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白質 （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名：Ｋ１２ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
【０１４５】
【化２１】
【０１４６】
【化２２】
【０１４７】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に関する
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
【０１４８】
【化２３】
【０１４９】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に関する
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
【０１５０】
【化２４】
【０１５１】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に関する
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
【０１５２】
【化２５】
【０１５３】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に関する
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
【０１５４】
【化２６】
【０１５５】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に関する
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
【０１５６】
【化２７】
【０１５７】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に関す
る情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３６塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：
る情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３６塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：
【０１５８】
【化２８】
【０１５９】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に関す
る情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：
る情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：
【０１６０】
【化２９】
【０１６１】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に関す
る情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：４３塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：
る情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：４３塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）記載：/desc=“synthetic” （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：
【０１６２】
【化３０】
【図１】１００−１−１の制限地図を示す。
【図２】ｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨの制限地図を示す。
【図３】ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶ又はｃｙｓＥ
Ｘの制限地図を示す。
Ｘの制限地図を示す。
【図４】ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶ−ｍａｒ又は
ｃｙｓＥＸ−ｍａｒの制限地図を示す。
ｃｙｓＥＸ−ｍａｒの制限地図を示す。
【図５】ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶ−ＧＡＤＰＨ
−ＯＲＦ３０６又はｃｙｓＥＸ−ＧＡＤＰＨ−ＯＲＦ３
０６の制限地図を示す。
−ＯＲＦ３０６又はｃｙｓＥＸ−ＧＡＤＰＨ−ＯＲＦ３
０６の制限地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，175（５) （1993），ｐ．1484−1492 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎｅＳｅｑ
Claims (6)
- 【請求項１】 Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−ア
セチルセリン及び／又はチアゾリジン誘導体の強化され
た発酵的製造のために好適である微生物株において、抗
生物質又は他の微生物に毒性の物質を細胞から直接放出
するために好適である蛋白質をコードする少なくとも１
つの遺伝子を過剰発現すること、その際この遺伝子が配
列：ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２ 【化１】 又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：３ 【化２】 又は前記配列の１つに対して９０％を越える配列相同性
を有する配列を包含するタンパク質をコードする遺伝子
の群から選択されていること、を特徴とする微生物株。 - 【請求項２】 配列：ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥ
Ｑ.ＩＤ.ＮＯ：２に９０％を越える配列相同性を有する
配列を包含する蛋白質をコードする遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２記載の遺伝子を少なくとも１つ
含有するプラスミド。 - 【請求項４】 Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−ア
セチルセリン又はそのチアゾリジン誘導体を発酵的に製
造するために、請求項１記載の微生物株を公知の方法で
発酵に使用することを特徴とするＬ−システイン、Ｌ−
シスチン、Ｎ−アセチルセリン又はそのチアゾリジン誘
導体の発酵的製法。 - 【請求項５】 アミノ酸又は細胞内で形成されたアミノ
酸誘導体の発現を強化するために、配列：ＳＥＱ.ＩＤ.
ＮＯ：２又はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：３又は前記配列の１つ
に対して９０％を越える配列相同性を有する配列を包含
するタンパク質をコードする遺伝子である流出遺伝子の
発酵中への使用。 - 【請求項６】 Ｌ−システインを製造する方法におい
て、微生物により細胞内で形成されたＬ−システイン
と、該微生物中の細胞内に存在するケトン又はアルデヒ
ドとを該微生物中で細胞内で反応させチアゾリジン誘導
体とし、このチアゾリジン誘導体を、抗生物質又は他の
微生物に毒性の物質を細胞から直接放出するために好適
である蛋白質を用いて微生物から放出させ、かつ場合に
よりチアゾリジン誘導体を分離した後、Ｌ−システイン
及びチアゾリジン誘導体の間の反応平衡をＬ−システイ
ンの方向に平衡移動することによりＬ−システインを獲
得すること、その際抗生物質又は他の微生物に毒性の物
質を細胞から直接放出するために好適である蛋白質とし
て、配列：ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２又はＳＥＱ.ＩＤ.Ｎ
Ｏ：３又は前記配列の１つに対して９０％を越える配列
相同性を有する配列を包含するタンパク質が存在するこ
とを特徴とするＬ−システインの製法。
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009104731A1 (ja) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | 味の素株式会社 | Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法 |
| EP2133429A1 (en) | 2008-03-06 | 2009-12-16 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-cysteine-producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| WO2010027045A1 (ja) | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP2230302A1 (en) | 2009-03-12 | 2010-09-22 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-cysteine-producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| WO2011043485A1 (en) | 2009-10-05 | 2011-04-14 | Ajinomoto Co.,Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-CYSTEINE, L-CYSTINE, A DERIVATIVE OR PRECURSOR THEREOF OR A MIXTURE THEREOF USING A BACTERIUM OF Enterobacteriaceae FAMILY |
| WO2011065469A1 (ja) | 2009-11-30 | 2011-06-03 | 味の素株式会社 | Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法 |
| EP2345667A2 (en) | 2010-01-15 | 2011-07-20 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
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| WO2012144472A1 (ja) | 2011-04-18 | 2012-10-26 | 味の素株式会社 | Ｌ－システインの製造法 |
Families Citing this family (95)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19857690A1 (de) * | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von 2-Methyl-thiazolidin-2,4-dicarbonsäure |
| DE19949579C1 (de) * | 1999-10-14 | 2000-11-16 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten |
| DE10046934A1 (de) * | 2000-09-21 | 2002-04-18 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
| BR0200350B1 (pt) * | 2001-02-13 | 2014-10-14 | Ajinomoto Kk | Bactéria transgênica produtora de l-aminoácido pertencente ao gênero escherichia, e, método para produzir l-aminoácido |
| DE10107002A1 (de) * | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von O-Acetyl-L-Serin |
| DE60232120D1 (de) | 2001-06-12 | 2009-06-10 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin unter Verwendung methanolassimilierender Bakterien |
| US7252978B2 (en) | 2001-07-25 | 2007-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-arginine |
| DE60230823D1 (de) * | 2001-09-28 | 2009-02-26 | Ajinomoto Kk | L-cystein herstellendes Bakterium und Verfahren zur Herstellung von L-cystein |
| RU2229513C2 (ru) * | 2001-11-23 | 2004-05-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
| KR101023925B1 (ko) | 2001-11-23 | 2011-03-22 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 에세리키아속 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 제조방법 |
| DE10219851B4 (de) * | 2002-05-03 | 2004-06-24 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Serin |
| DE10232930A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
| US7348037B2 (en) | 2002-08-16 | 2008-03-25 | Evonik Degussa Gmbh | Sulfur-containing animal-feed additives |
| DE10237479A1 (de) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Degussa Ag | Schwefel-haltiges Tierfuttermitteladditiv |
| JP2004166592A (ja) * | 2002-11-20 | 2004-06-17 | Ajinomoto Co Inc | メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP4120364B2 (ja) * | 2002-11-20 | 2008-07-16 | 味の素株式会社 | メタノール資化性菌を用いたｌ−リジンまたはｌ−アルギニンの製造法 |
| DE10305774A1 (de) * | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Methionin |
| EP2348107A3 (fr) | 2003-02-18 | 2012-07-11 | Metabolic Explorer | Procédé de préparation de microorganismes évolués permettant la création ou la modification de voies métaboliques |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| RU2275425C2 (ru) * | 2003-11-03 | 2006-04-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина |
| ATE443757T1 (de) * | 2004-01-30 | 2009-10-15 | Ajinomoto Kk | L-aminosäure produzierender mikroorganismus und verfahren zur l-aminosäureproduktion |
| US20050191684A1 (en) * | 2004-02-25 | 2005-09-01 | Zimenkov Danila V. | Method for producing L-amino acids |
| JP4479283B2 (ja) | 2004-03-04 | 2010-06-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP4604537B2 (ja) * | 2004-03-31 | 2011-01-05 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP2007185184A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2009089603A (ja) | 2006-02-02 | 2009-04-30 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法 |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2186881B1 (en) | 2006-03-23 | 2014-04-23 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA |
| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2008090770A1 (ja) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| DE102007007333A1 (de) | 2007-02-14 | 2008-08-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur Reinigung von L-Cystein |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| DE602009000714D1 (de) * | 2008-03-06 | 2011-03-24 | Ajinomoto Kk | L-Zystein-produzierendes Bakterium und Verfahren zur Herstellung von L-Zystein |
| WO2009135048A2 (en) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Gradalis, Inc. | Highly pure plasmid dna preparations and processes for preparing the same |
| US20120231537A1 (en) * | 2008-04-30 | 2012-09-13 | Gradalis, Inc. | Highly Pure Plasmid DNA Preparations |
| WO2010084995A2 (en) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid |
| US8623619B2 (en) | 2009-02-09 | 2014-01-07 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing L-amino acid |
| JP5521347B2 (ja) * | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP5463528B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| JP2013074795A (ja) | 2010-02-08 | 2013-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法 |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| RU2501858C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-12-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae |
| RU2482188C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |
| KR101381048B1 (ko) | 2010-10-20 | 2014-04-14 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 |
| KR101208267B1 (ko) | 2010-10-20 | 2012-12-04 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 설피드릴라제 변이체 |
| WO2012053794A2 (en) | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| US9234223B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-01-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-cysteine |
| DE102011007790A1 (de) | 2011-04-20 | 2012-10-25 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur Reinigung von L-Cystein |
| DE102011075656A1 (de) | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
| DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| DE102012216527A1 (de) | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| JP6288649B2 (ja) | 2013-03-19 | 2018-03-07 | 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 | Ｌ−システイン生産能が高められた腸内細菌科に属する細菌 |
| RU2013118637A (ru) | 2013-04-23 | 2014-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK |
| KR101493154B1 (ko) | 2013-05-10 | 2015-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법 |
| KR101525663B1 (ko) | 2013-05-10 | 2015-06-04 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린의 생산방법 |
| DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| RU2013140115A (ru) | 2013-08-30 | 2015-03-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB |
| EP3053999B1 (en) | 2013-10-02 | 2019-11-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Ammonia control apparatus and ammonia control method |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
| ES2694011T3 (es) | 2013-10-21 | 2018-12-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para producir L-aminoácido |
| RU2014105547A (ru) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Адзиномото Ко., Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL |
| KR101677328B1 (ko) | 2014-08-12 | 2016-11-18 | 씨제이제일제당 (주) | O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법 |
| RU2015120052A (ru) | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
| KR101694632B1 (ko) | 2015-09-11 | 2017-01-10 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 |
| US11046732B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-06-29 | Wacker Chemie Ag | Microorganism strain and method for antibiotic-free, fermentative preparation of low molecular weight substances and proteins |
| BR112018017227A2 (pt) | 2016-02-25 | 2019-02-05 | Ajinomoto Kk | método para produzir um l-aminoácido |
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| EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN113728105B (zh) | 2018-12-26 | 2024-05-28 | 大象株式会社 | 生产l-氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-氨基酸的生产方法 |
| WO2020171227A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５（５）（１９９３），ｐ．１４８４−１４９２ |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009104731A1 (ja) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | 味の素株式会社 | Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法 |
| US8278075B2 (en) | 2008-02-21 | 2012-10-02 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine-producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| EP2133429A1 (en) | 2008-03-06 | 2009-12-16 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-cysteine-producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| WO2010027045A1 (ja) | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP2230302A1 (en) | 2009-03-12 | 2010-09-22 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-cysteine-producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| WO2011043485A1 (en) | 2009-10-05 | 2011-04-14 | Ajinomoto Co.,Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-CYSTEINE, L-CYSTINE, A DERIVATIVE OR PRECURSOR THEREOF OR A MIXTURE THEREOF USING A BACTERIUM OF Enterobacteriaceae FAMILY |
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