WO2004053111A1 - 外来遺伝子高発現大腸菌株の選択方法、その方法により選択される大腸菌変異株及びそれを用いる酵素及び化合物の製造方法 - Google Patents

外来遺伝子高発現大腸菌株の選択方法、その方法により選択される大腸菌変異株及びそれを用いる酵素及び化合物の製造方法 Download PDF

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escherichia coli
strain
coli strain
foreign gene
highly expressing
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Kazufumi Yazaki
Hirobumi Aoki
Harumi Kamachi
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Showa Denko K.K.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting an Escherichia coli strain that highly expresses a foreign gene, Escherichia coli selected by the method, and methods for producing enzymes and compounds using the strain. More specifically, a method for selecting a mutant strain that stably expresses the gene from a group of transformants into which an enzyme gene whose expression in Escherichia coli is unstable has been introduced, and a method for highly expressing a foreign gene selected by this method The present invention relates to a sex mutant, and a method for producing an enzyme and a compound, particularly an ammonia lyase and a diamino acid using the strain. Background art
  • Escherichia coli is an area in which a great deal of research and development of practical technologies have been performed, and is one of the most advanced fields in molecular biology and genetic engineering. At present, it is very important as a manufacturing means in industry, and many biopharmaceuticals are manufactured industrially by a method using Escherichia coli.
  • the most frequently used strain of E. coli in molecular biology research is a strain derived from the K12 strain (Swartz, 1996, In Escherichia coli and Salmonella-Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press Washington , pp1693-1711).
  • the expression system simultaneously expresses the promoter and its regulator, a ribosome fixing site and a restriction site into which a useful gene can be inserted downstream, a structure that can function as a transcription terminator, and the quality of a superexpressed useful protein.
  • the expression system is composed of genes arbitrarily present to be improved, and one or more vectors into which a combination of these genes can be introduced into the host.
  • the exogenous gene to be expressed is compatible with the Escherichia coli and its gene expression system, and is generally selected by trial and error.
  • the situation where the target protein cannot be obtained in a sufficient amount may be a case where the produced protein does not have the normal structure inherent to the protein, resulting in a precipitate (inclusion 'body), or a case where the produced protein is immediately separated after production.
  • many means for solving such various problems have been introduced in the literature (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 10-313863 and 8-140671, Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-). 538; Current Opinions in Biotechnology, 1996, 7).
  • An object of the present invention is to provide a mutant strain of Escherichia coli useful for obtaining a sufficient protein from an expression-unstable foreign gene whose expression level tends to decrease due to passage or storage, and to use such a strain. It is to provide a method for producing industrially important chemical substances.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a substance.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, selected an Escherichia coli strain based on hydrogen peroxide decomposability, a kind of stress-tolerance that is not directly related to protein production. If it is carried out, it has been found that a mutant strain in which gene expression does not decrease even after subculture can be obtained, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a mutant strain of Escherichia coli which is useful for obtaining a sufficient protein from an expressionally unstable foreign gene whose expression level tends to decrease due to passage or storage, and which is industrially important using such a strain. It provides a way to produce a variety of chemicals.
  • the present invention provides the following Escherichia coli strain selection method, the selected Escherichia coli strain, a method for producing an enzyme using the same, and a method for producing a useful compound using the enzyme.
  • a strain of Escherichia coli with high expression of a foreign gene selected using the strength of stress response as an index.
  • E. coli strain highly expressing a foreign gene according to [14], wherein the E. coli strain is an induced strain obtained by clonal selection or genetic manipulation from the Escherichia coli SD840 strain.
  • Escherichia coli SD840 strain (Accession number: FERM BP-08546).
  • a method for producing an enzyme comprising expressing a foreign gene of the Escherichia coli strain highly expressing a foreign gene according to any of the above items 4 to 15.
  • a method for producing a compound comprising reacting a treatment solution containing an Escherichia coli strain highly expressing a foreign gene according to any of the above items 4 to 15 or an enzyme produced by the enzyme with a substrate of the enzyme.
  • the exogenous gene-stable high-expressing Escherichia coli strain refers to a strain whose expression level is relatively large when the exogenous gene is introduced into Escherichia coli by a conventional method, and whose expression is stable.
  • the foreign gene to be expressed is not particularly limited, but the present invention is particularly useful when introducing a “difficult to express foreign gene”.
  • a foreign gene that is difficult to express refers to a gene whose expression in a foreign gene decreases during the subculture when the transformed E. coli is subcultured after being introduced into Escherichia coli. Say.
  • it is an exogenous gene whose expression is reduced due to causes other than plasmid omission or mutation, It refers to a gene that, when introduced into Escherichia coli in a form that can be expressed on a plasmid, does not produce protein despite the absence of a plasmid, mutation, or other abnormality.
  • a method for producing a mutant strain of Escherichia coli will be described. Selection of this mutant is performed using a transformant obtained by transforming host Escherichia coli with a recombinant vector having a gene that is difficult to express.
  • a recombinant vector it is possible to use an expression plasmid having a sequence necessary for controlling expression in E. coli, for example, commercially available pET, pTrc99A, pKK2333, pUC18, etc. it can.
  • a vector in which a difficult-to-express gene is recombined into an appropriate site of these expression plasmids that is, an Escherichia coli promoter and its regulator, preferably a hybrid promoter such as a 1ac promoter, a Trp motor, a Tac promoter, Construction of a recombinant Escherichia coli vector consisting of a difficult-to-express gene connected to the ribosome fixing site, a structural marker gene that can function as a transcription terminator, etc., downstream of the T5 promoter, T7 promoter, etc. I do.
  • the Escherichia coli strain to be transformed in the present invention is not particularly limited, but preferably, K12 strain, B strain and the like are used, and from the viewpoint of biological containment, K12 strain is suitably used.
  • K12 strain is suitably used.
  • commercially available as a general host available from Stratagene, TOYOBO in Japan
  • XL 1—B 1 ue strain Bullock, Fernandez & Short, 1987, Biotechniques, 5: 376-378
  • JM 1 The strain is widely used as an E. coli host, such as strain 09 (purchasable from TaKaRa) and strain HB101, and strains with stable traits can be used.
  • a transformant selection substance for example, an antibiotic such as ampicillin
  • an antibiotic such as ampicillin
  • the transformant is spread on an agar plate medium, preferably an M9 Darco plate, which is further plated with agar. 20 ° C to 40 ° C, preferably 25 ° C to 35 ° C, more preferably 25. Incubate for 16 hours to 72 hours, preferably 24 hours to 48 hours, until the knee is clearly formed.
  • Transformants with difficult-to-express genes often form heterogeneous colonies.
  • selection is performed from the transformant strains using the strength of the stress response as an index.
  • the type of stress response that can be used is not particularly limited, but examples of usable ones include hydrogen peroxide decomposition activity, growth recovery after heat treatment (heat resistance), and the like.
  • the hydrogen peroxide decomposition activity is such that when a small amount of hydrogen peroxide solution is reacted with a colony, the magnitude of the amount of oxygen generated by decomposing hydrogen peroxide is large and small, and the strength of the stress response can be visually identified. It is preferable because it can be done.
  • the selection may be repeated with the same index as the temporary selection.
  • the selection among the strains exhibiting a stress response, those in which the color tone of the colony is closer to white than others and those in which the diameter of the colon is significantly smaller are particularly preferable for selection.
  • further selection may be performed by using the analysis of the produced protein by a known method.
  • the recombinant vector used at the time of selection can be dropped, thereby obtaining a host Escherichia coli mutant.
  • the subculture stability of the obtained host Escherichia coli mutant strain is determined by observing the expression of the foreign gene after subculturing until the predetermined number of divisions is obtained without applying selective pressure with a drug under normal conditions under which the strain grows. Can be evaluated. For example, inoculating a nutrient medium such as LB broth with an amount of a test strain having an initial turbidity of 0.1 and culturing until the turbidity reaches 3 or more results in a passage number of about 5 generations. 6 times under the same conditions By repeating this culture, cells of the 30th generation can be obtained, and the expression of the foreign gene in the cells can be evaluated using the production amount of the protein derived from the foreign gene as an index.
  • mutant strain it is not necessary to perform a mutation treatment during the selection of the mutant strain, but depending on the host Escherichia coli used, it may be preferable to perform a commonly used mutation treatment, for example, ultraviolet irradiation, treatment with a mutant drug, or the like.
  • a commonly used mutation treatment for example, ultraviolet irradiation, treatment with a mutant drug, or the like.
  • the thus obtained mutant Escherichia coli of the present invention has no difference in growth rate, transformation method, storage method, etc. as compared with the parent strain, and has a temperature range of 25 ° C. to 37 ° C. in a normal nutrient medium. , Can be handled by normal operation.
  • strains with high stress responsiveness have high expression and high activity, but it seems that the expression of foreign genes is related to a type of stress. However, since high stress responsiveness is thought to act in the direction of suppressing foreign gene expression and reducing stress, the present inventors have found that strains with high stress responsiveness have high expression and high activity. Is completely unexpected.
  • the present invention provides an E. coli strain selected by the above method.
  • the E. coli strain selected according to the present invention is, as described above, a stable, high-expressing E. coli strain in any transformed strain of substantially any E. coli strain.
  • Escherichia coli SD840 An example of the mutant obtained in this manner is Escherichia coli SD840.
  • This is a stable, high-expressing E. coli strain selected by the above-mentioned method from a transformed strain into which the plant phenylalanine ammonia lyase gene has been introduced, using the XL1-B1ue strain as a parent strain.
  • Escherichia coli SD840 strain was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at 1-1-1 Tsukuba East Higashi, Ibaraki Prefecture, Japan (zip code 305-8566). Deposited at the Center (Deposit date: September 27, 2002, Accession number: FERMP-19047) and transferred to the International Depositary on November 10, 2003 (International accession number: FERMBP-08546).
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • FERMP-19047 Deposited at the Center
  • International Depositary on November 10, 2003 International accession number: FERMBP-08546
  • the remarkable characteristics of the SD840 strain which is one of the Escherichia coli mutant strains obtained by the selection method of the present invention, are listed below in comparison with the parent strain.
  • the mutant Escherichia coli strain of the present invention is also characterized by a characteristic gene that is highly expressed as compared to the parent strain. These genes include those whose functions have not yet been identified.Some of these mutants are those that cause stable expression of difficult-to-express genes and those that are the result. It indicates the properties of the SD 840 strain.
  • Characteristic genes that are significantly expressed are op pA, ompA, tuf B, tuf A, fu sA, ga pA, rp sA, ahp C inf C, kat E, yd iH, lacl, ic dA, op pC , Rp oB, ynhA, ompX, dnaj, oppB, yceD, dnaK, aco2, cld, zipA, minC, galF, gnd, yafK, fabB, trmD, cysK, cydA , Hs IV, pe pN, op pF, rp oC, ompF, rp oA, phe S, rps B, op pD, pe pD, ser S, to pA, gr pE, yea F, as n
  • the present invention provides a method for producing a foreign protein, typically an enzyme, using the Escherichia coli mutant.
  • the Escherichia coli mutant is cultured, and if necessary, expression is induced.
  • a usual method is used for culturing the transformant, and the medium may be a nutrient medium or a synthetic medium.
  • the cultivation temperature is arbitrarily selected within the range of 20 to 42 ° C, but is most preferably around 30 ° C.
  • transformants are crushed, centrifuged, the supernatant is recovered, and used for protein purification such as gel filtration and various column chromatography. It may be produced by a usual method (for example, (Current Protocols in Protein Science fed.
  • the production method of the present invention can be applied to any enzyme or other foreign protein that can be produced by a gene to be introduced into Escherichia coli.
  • examples of such enzymes and other foreign proteins include plant phenylalanine ammonia lyase.
  • plant phenylalanine nuclease produces, for example, a protein derived from a foreign gene in the SD840 strain that is at least 10 times as large as that of the parent strain XL1-B1ue, and the generation of the transformant for 30 generations. This is a very preferable example that can be stably expressed without change.
  • the quantification of enzymes and other proteins produced by gene expression can be performed by ordinary SDS-PAGE, western blotting using an antibody, or the like.
  • the protein is an enzyme, it can be measured by activity measurement or the like.
  • the present invention provides a method for producing a useful substance using the Escherichia coli mutant.
  • the Escherichia coli mutant is cultured in the same manner as described above, and expression induction is performed if necessary.
  • the useful substance produced according to the present invention depends on the type of the enzyme produced by the mutant strain of Escherichia coli.
  • the enzyme is a degrading enzyme, a decomposed product of the substrate, and if the enzyme is a transferase, the substrate has a predetermined group.
  • a compound or the like in which a predetermined group has been removed from a compound obtained by crushing or a substrate is obtained.
  • ammonia lyase adds amino acids to unsaturated bonds of unsaturated carboxylic acids in the presence of ammonia to produce amino acids.
  • a variety of optically active amino acids are prepared by reacting with cinnamic acids in the presence of ammonia using the SD840 strain that highly expresses plant phenylalanine ammonia lyase. Can be produced.
  • the SD840 strain is a scale that requires many passages without any problems such as decreased expression due to passage. In up-production, stable high production that could not be achieved by the parent stock can be realized.
  • FIG. 1 is a restriction map of the plasmid used in the examples.
  • Figure 2 shows the results of SDS-PAGE and Western plotting.
  • the amount of enzyme protein was quantified by the biuret method based on serum albumin.
  • the cinnamic acid and L-phenylalanine were separated and quantified by HP LC under the following conditions.
  • M9 medium 0.6% disodium hydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.05% sodium chloride, 0.1% salted ammonium, 0.1% glucose, lmM magnesium sulfate, thiamine Hydrochloride 0.001%, chloride power 0.1 ⁇ , ⁇ ⁇ 7.4) plus ampicillin 100 ppm or L
  • a medium in which ampicillin (100 ppm) was added to a B medium (polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, Shiridani sodium 1%) was used.
  • agar plate medium solidified by adding 2% agar to each medium was used.
  • the cells collected by centrifugation from the culture broth cultured at 25 ° C in the above-mentioned medium (5 to 1001111) for more than 38 hours were mixed with physiological saline in the same volume as the culture broth. After washing the cells, suspend the cells in half the volume of the culture solution (4 M ammonia / ammonium carbonate ( ⁇ .3)) and add the substrate at a final concentration of 0.2% (2000 mg / L). The reaction was performed while shaking at 30 ° C. An aliquot of this reaction solution was taken at an appropriate time (usually between 2 and 6 hours), the cells were removed by centrifugation, and the supernatant was analyzed by HP LC.
  • Example 1 Preparation of recombinant vector
  • Plasmids were prepared from the six formed colonies using QIAprep Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN), and the cut pattern by the restriction enzyme Hindill was examined. As a result, it was confirmed that all the plasmids extracted from the six strains were plasmids from which the desired His-tag coding sequence had been removed.
  • Example 2 Preparation of transformant showing PAL (phenylalanine ammonia lyase) activity
  • E. coli XL1-B1ue strain transformed with pQEPAL2ZAH is6 obtained in Example 1 was used for LB agar containing 100 ppm of isopropyl-1-j3-D-thiogalatatopyranoside (IPTG) O.lmM and ampicillin.
  • IPTG isopropyl-1-j3-D-thiogalatatopyranoside
  • O.lmM isopropyl-1-j3-D-thiogalatatopyranoside
  • IPTG isopropyl-1-thiogalatatopyranoside
  • Example 2 All 24 colonies obtained in Example 2 were streaked on an LB agar plate medium containing isopropyl 1 / 3-D-chiogala-tatobilanoside (I PTG) O.lmM and ampicillin at 100 ppm for 48 hours at 25 ° C. Cultured. The isolated colonies were cultured in the same manner as in Example 2 and the activity was measured. As shown in Table 3, strains with variable activity appeared. Table 3
  • Example 4 Method for identifying highly active strains by stress responsiveness
  • the hydrogen peroxide decomposition activity of each strain and the growth recovery after heat treatment were investigated in order to examine whether there were any features that could be easily and reliably identified, rather than visual noise-based identification methods. (Heat resistance) was examined.
  • the hydrogen peroxide decomposition activity was determined by adding the hydrogen peroxide solution of the formula (1) to the cells on the streaked LB agar plate medium and observing the state of air bubble generation on the plate.
  • the cells on the agar plate were cultured in the above-mentioned M9 medium for 16 hours, then collected by centrifugation, suspended in physiological saline, and gently shaken for 8 hours to obtain resting cells.
  • the resting cells were treated at 55 ° C for 2 minutes, streaked on an LB agar plate medium containing 100 ppm of ampicillin, and cultured at 25 ° C.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the E. coli XL1-B1ue strain transformed with pQEPAL2 / AHis6 was replaced with isopropyl-1-j3-D-thiogalactopyranoside (IPTG) O.lmM and ampicillin 100 pL. It was spread on LB agar plate medium containing pm and cultured at 25 ° C for 48 hours. When 1 ⁇ l of 30% hydrogen peroxide solution was added so as to be in contact with a part of each formed colony, foaming due to decomposition was observed, and vigorous foaming was observed in some colonies. From this, 24 colonies were isolated, placed on a # 9 agar plate medium containing 100 ppm of ampicillin, and cultured at 25 ° C for 48 hours.
  • IPTG isopropyl-1-j3-D-thiogalactopyranoside
  • the activity of the 24 isolated strains was cultured in the same manner as in Example 2, and the activity was measured. As shown in Table 4, high activity was confirmed in all strains. From among these, three strains with relatively good growth conditions and clear colony formation were selected. Table 4
  • the selected highly active strains Nos. 16, 20, and 21 were streaked on an LB agar plate medium containing 100 ppm of ampicillin, and cultured at 25 ° C. for 48 hours. From the cultured cells, streaking on the same LB agar plate medium was repeated 5 times. Between each subculture, the cells were cultured in the same manner as in Example 2, and a change in the activity for each subculture was confirmed. As shown in Table 5, two of these strains (Nos. 16 and 20) showed little change in activity due to subculture and showed high activity as a stable trait. Table 5
  • No. 16 strain was selected from the two strains that were found to exhibit stable and high activity in Example 6, and retained.
  • the plasmid was prepared, and its entire nucleotide sequence (about 5.5 kb) and the activity of the retransformant were examined.
  • Plasmids were extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by QIAGE), and the entire nucleotide sequence was decoded by gene walking analysis on both strands.
  • the sequence was determined by standard use of the DNA sequencer model 377 ver.3.0, that is, by standard PCR reaction and electrophoresis / data analysis methods.
  • the determined sequence binding of each partial sequence was performed using nucleic acid sequence automatic binding software GENETYX-WIN / ATSQ (manufactured by Software Development Co., Ltd.). As a result, it was confirmed that there was no abnormality such as substitution or omission over the entire sequence.
  • E. coli XL1-B1ue was transformed and transferred to an LB agar plate containing isopropyl _j3-D-thiogalactovyranoside (IPTG) O.lmM and ampicillin 100 ppm. After application and culturing at 25 ° C. for 48 hours, colonies of various sizes were produced as described in Example 2. From each colony, 24 strains were arbitrarily selected and cultured and the activity was measured in the same manner as in Example 2. As shown in Table 6, the activity of each transformant was determined as the unisolated transformant strain. Assuming that the activity was 1, the relative activity was varied in the range of 0 to 3 times.
  • IPTG isopropyl _j3-D-thiogalactovyranoside
  • the highly active strain No. 16 obtained in Example 6 and the colony No. 24 and No. 12 strains of Example 7 were combined with the LB medium 5 containing 100 ppm of ampicillin according to the method described in Example 2.
  • Cultured at m1. 3-4 hours after cultivation Isopropyl 1) 8—D—Chogalata Topylanoside (IPTG) O.lmM was added, and the cells were further cultured for 4 hours.
  • the turbidity (660 nm) of the obtained culture was measured, and after confirming that the turbidity was almost the same, 0.1 ml of the culture was centrifuged and collected.
  • the cells were suspended in 0.15 ml of physiological saline, and treated with 4 X SDS electrophoresis sample (1 MT ris—HC 1 (pH 6.8) 2.1 ml, SDS 860 mg, 2-mercaptoethanol 2 m1, glycerol 2.8 ml, and BPB lmg were mixed and adjusted to 10 ml with deionized water. 0.05 ml was added, mixed well, and boiled at 100 ° C for 5 minutes.
  • the treated solution was centrifuged (12,000 rpm for 5 minutes), and the supernatant (10 ⁇ l) from which the precipitate was removed was subjected to 10 to 20% polyacrylamide gel electrophoresis (duplicate).
  • Example 10 After culturing the highly active strain No. 16 obtained in Example 6 in 8 medium 51111 containing 20 ppm of tetracycline at 35 ° C. for 24 hours, a part of the culture solution was subcultured and cultured under the same conditions for 10 days. It was repeated. The culture solution on day 10 was spread on an LB agar plate medium, and cultured at 35 ° C for 24 hours to form colonies. Arbitrarily select 50 formed colonies and inoculate them on an LB agar plate containing 2 O ppm of tetracycline and 100 ppm of ampicillin and an LB agar plate containing only 20 ppm of tetracycline at 25 ° C. And cultured for 48 hours. A strain that does not grow on a medium containing ampicillin and grows on a medium that does not contain The strain was named Escherichia coli SD840 strain.
  • Example 10 Reaction using highly active strain
  • the highly active strain No. 16 obtained in Example 6 was cultured in 100 ml of LB medium containing 100 ppm of ampicillin according to the method described in Example 2. This culture solution was further inoculated into a 5 L jar armament containing LB medium 21 containing 100 ppm of ampicillin and isopropyl-1-D-thiogalatatopyranoside (I PTG) O.lmM, and incubated at 30 ° C. The cells were cultured with aeration and agitation at 800 rpm and aeration of 1 ml 1 Zmin for 38 hours.
  • I PTG isopropyl-1-D-thiogalatatopyranoside
  • the cells obtained by centrifuging the stationary phase culture solution were resuspended in 1 L of 4 M ammonia / ammonium carbonate (pH 103), and 2 Og of cinnamic acid was added.
  • the reaction was carried out with stirring at rpm. A part of the reaction solution was taken every hour, and L-phenylalanine generated in the reaction solution was quantified by HP LC. When the reaction was continued while adding the substrate successively so that the substrate concentration was maintained at about 2%, about 3.5% of L-phenylalanine was accumulated in the reaction solution in about 3 hours.
  • Escherichia coli that stably expresses a foreign gene at a high level particularly Escherichia coli that stably expresses a gene that is difficult to express in Escherichia coli at a high level
  • plant-derived ammonia lyase has been considered to be a gene that is difficult to express in Escherichia coli
  • the method of the present invention can stably and highly express a plant-derived ammonia lyase gene. Therefore, it is useful for adding an amino group to various unsaturated carboxylic acids to synthesize a compound such as L-amino acid panthocyanin.

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Abstract

過酸化水素分解能等のストレス耐性能を指標にした外来遺伝子を高発現する大腸菌変異株の選択方法、その選択方法により選択された大腸菌変異株、その変異株による酵素の製造方法、及びその変異株を用いたアミノ酸(特にL-アミノ酸)等の有用化合物の製造方法に関する。本発明によれば、継代しても遺伝子発現が低下しない大腸菌変異株を獲得でき、植物アンモニアリアーゼ等を利用した化合物を効率的に製造することができる。

Description

明 細 書 外来遺伝子高発現大腸菌株の選択方法、 その方法により選択される大腸菌変 異株及びそれを用いる酵素及び化合物の製造方法 技術分野
本発明は、 外来遺伝子を高発現する大腸菌株の選択方法、 その選択方法に より選択される大腸菌、 及ぴその菌株を用いる酵素及び化合物の製造方法に 関する。 さらに詳しくは、 大腸菌内での発現が不安定な酵素遺伝子を導入し た形質転換体群から当該遺伝子を安定的に高発現する突然変異株を選択する 方法、 この方法により選択した外来遺伝子高発現性突然変異株、 及びその菌 株を用いる酵素及ぴ化合物、 特にアンモニアリァーゼ及ぴァミノ酸の製造方 法に関する。 背景技術
大腸菌を用いた外来遺伝子の発現は、 極めて多くの研究と実用技術の開発 が成されている分野であり、 分子生物学 ·遺伝子工学では最も進んだ分野の 一つである。 現在では工業における製造手段としての重要性は極めて高く、 多くのバイオ医薬が大腸菌を用いた方法により工業的に製造されている。 分子生物学の研究に最も頻用されている大腸菌の菌株は、 K 1 2株から誘 導された菌株である（Swartz, 1996, In Escherichia coli and Salmonella-Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press Washington, p.p.1693-1711)。近年では B L 2 1のような大腸菌 B株から誘導された菌株も多く使用されており、 組 換えタンパク質の産生に最も頻用されている菌株の一覧表が Wingfield,1997 によって提示されている （Current Protocols in Protein Science.Coliganら， Ed- John Wiley & Sons, Inc. 5.0.1-5.0.3) 。 細菌宿主中でタンパク質を発現させる多数の系が文献に記載されている
(Makrides, 1996, Microbiol. Rev.60： 512-538;Current Opinions in Biotechnology, 1996, 7) 。 発現系は、 プロモーター及ぴそのレギュレーター、 リボソーム固 定部位及びその下流で有益な遺伝子が挿入され得る制限部位、 転写ターミネ 一ターとして機能し得る構造、 超発現した有益なタンパク質の品質を同時発 現によつて改善すべく任意に存在する遺伝子、 並びに、 これらの組合せを宿 主に導入し得る 1つまたは複数のベクターとから構成されている。
これらのベクターは、 プラスミド R NA I及ぴ R NAII (Polisky, 1988, Cell 55:929-932) によってコードされている 2つの R NAの相互作用によって決定 される所定のコピー数で細胞中に存在している。 大腸菌中の発現プラスミド のコピー数の調節に関しては、 複数の戦略が文献に記載されている （Swartz, 1996， In Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press Washington, p.p.1693-1711 , Makrides, 1996, Microbiol. Rev.60 ： 512-538;Current Opinions in Biotechnology, 1996, 7) 0
大腸菌に外来遺伝子を組み込み発現させる場合、 発現させようとする外来 遺伝子と、 これらの大腸菌とその遺伝子発現系には 「相性」 があり、 試行錯 誤法で選択されるのが一般的である。 目的タンパク質が充分量得られない状 況としては、 生産されたタンパク質が本来有する正常な構造を取り得ず沈殿 物 （インクルージョン 'ボディ） となる場合や、 生産されても直ちに分 さ れるといった場合があるが、 このような様々な問題を解決する多くの手段も 文献で紹介されている （特開平 10-313863号公報、 特開平 8-140671号公報、 Makrides, 1996, Microbiol. Rev.60： 512-538;Current Opinions in Biotechnology, 1996, 7)。
上記のように、 多くの情報と膨大な数の発現系や大腸菌株を以てしても、 未だ安定に発現させることが困難な遺伝子は多く、 目的とする外来遺伝子を 発現させてタンパク質を得ようとする時、 充分な量が得られないことは非常 に多い。 さらには、 一度目的に合わせて作成した大腸菌菌株でも、 保存中や 継代する間に遺伝子発現が低下することもしばしば見られる現象であり、 そ の原因はまだ不明な場合が多い。 例えば、 本明者らは、 酵素アンモニアリア 一ゼのァミノ基付加反応を利用して各種の桂皮酸類から L—アミノ酸類を製 造する方法を発明し特許出願している （特開 2003-225092号公報） 1 この研 究過程においても、 大腸菌を形質転換して酵素アンモニアリアーゼを発現さ せた場合、 継代を重ねるにつれ形質転換体の活性が低下する現象が見られた。 この継代による活性低下は、 一般に言われる発現調節部位のメチル化やブラ スミドの脱落'変異等によるものでは無く、 既知情報の何れによっても回避 できない困難なものであった。
小スケールの培養で目的が果たせる基礎研究の場合は、 新たに形質転換を やり直し、 再度形質転換体を得ることで解決するのが一般的であるが、 比較 的大スケールで培養時間が長く、 多数の継代を経る工業生産の場合、 遺伝子 発現の不安定さは極めて深刻な問題である。
しかしながら、 遺伝子発現の安定化に関する問題としてこれまでに取り上 げられ、 対策が研究されているのは、 プラスミドの脱落による外来遺伝子の 脱落の防止、 プラスミドの修飾や変異による転写不全の回避のみであり、 宿 主そのものの変異による発現低下の対策が論じられることは無かつた。 この 事実は、 実験室で宿主として用いられている大腸菌の多くはプラスミドの変 異ゃ修飾を行わず安定に保持するよう改変された変異株であり、 これ以上の 改変に関する情報は未だない状況であることによると思われる。 さらにはプ ラスミドを含む外来遺伝子側の改変により問題を回避することが可能な場合 もあり、 通常は宿主大腸菌の変異に取り組むよりは技術的に実績のある外来 遺伝子側の改変を試みることが多かった。 しかしながら、 外来遺伝子の改変 は時間と労力を要する作業であり、 必ずしも成功するものではない。 また外 来遺伝子の改変をもってしても安定化できない遺伝子の発現には対策がない 状況であった。 発明の開示
本発明の課題は、 継代や保存によって発現量が低下する傾向がある発現不 安定な外来遺伝子から充分なタンパク質を得る時に有用な大腸菌変異株を提 供すること、 及びそのような菌株を用いた工業的に重要な化学物質の製造方 法を提供することにある。
さらに詳細には、 プラスミドの脱落 ·変異 ·修飾以外の原因で発現が低下 する外来遺伝子の発現を安定化した大腸菌変異株を提供すること、 及びその ような菌株を用いた工業的に重要な化学物質の製造方法を提供することにあ る。
特に、 プラスミドの異常を伴わずに大腸菌における発現が低下する傾向の 強い植物由来フエ二ルァラニンアンモニアリアーゼ遺伝子の発現を安定化し た大腸菌変異株を提供すること、 及びそのような菌株を用いて工業的に重要 なァミノ酸類を製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、 過酸化水素分 解能という、 タンパク質生産には直接には関係しない一種のストレス耐性能. を指標にして大腸菌株の選択を行なえば、 継代しても遺伝子発現が低下しな い変異株を獲得できることを見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、 継代や保存によって発現量が低下する傾向がある発現 不安定な外来遺伝子から充分なタンパク質を得る時に有用な大腸菌変異株を 与え、 そのような菌株を用いて工業的に重要な化学物質を製造する方法を与 えるものである。
すなわち、 本発明は下記の大腸菌株選択方法、 選択された大腸菌株、 これ を用いた酵素の製造方法及びその酵素を用いた有用化合物の製造方法を提供 する。 [I] ストレス応答の強さを指標として選抜することを特徴とする外来遺 伝子高発現性大 3§菌株の選択方法。
[2] ストレス応答が過酸ィヒ水素分解活性である前記 1に記載の選択方法。
[3] 大腸菌に導入された際に、 プラスミドの脱落や変異以外の原因によ り低発現化する外来遺伝子を高発現する前記 1または 2に記載の選択方法。
[4] ストレス応答の強さを指標として選抜された外来遺伝子高発現性大 腸菌株。
[5] ストレス応答が過酸ィ匕水素分解活性である前記 4に記載の外来遺伝 子高発現性大腸菌株。
[6] 大腸菌に導入された際に、 プラスミ ドの脱落や変異以外の原因によ り低発現化する外来遺伝子を高発現する前記 4または 5に記載の外来遺伝子 高発現性大腸菌株。
[7] 大腸菌株を 30世代継代する間に発現量が 2分の 1まで低下する遺 伝子を発現させたときに、 発現量が初代の水準に維持されるかまたは向上す る前記 4乃至 6のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
[8] プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子 力 アンモニアリァーゼの遺伝子である前記 6または 7に記載の外来遺伝子 高発現性大腸菌株。
[9] アンモニアリァーゼの発現系遺伝子がフエ二ルァラニンアンモニア リァーゼの遺伝子である前記 8に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
[10] フエ二ルァラニンアンモニアリアーゼの遺伝子が、 植物由来であ る前記 9に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
[I I] 植物力 Sムラサキ科ムラサキ (Lithospermum erythrorhizon) でめる刖 記 10に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
[12] 大腸菌株が K1 2株由来である前記 4乃至 1 1のいずれかに記載 の外来遺伝子高発現性大腸菌株。 [1 3] 大腸菌株が XL 1 -B 1 u e株由来である前記 1 2に記載の外来 遺伝子高発現性大腸菌株。
[14] 大腸菌株が Escherichia coli SD840株である前記 13に記載の外来遺 伝子高発現性大腸菌株。
[15] 大腸菌株が Escherichia coli SD840株からクローン選択または遺伝子 操作によつて得られる誘導株である前記 14に記載の外来遺伝子高発現性大 腸菌株。
[16] Escherichia coli SD840株 （受託番号： FERM BP-08546) 。
[1 7] 前記 4乃至 15のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株 の外来遺伝子を発現させることを特徴とする酵素の製造方法。
[18] 前記 4乃至 1 5のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株 またはその産生する酵素を含む処理液をその酵素の基質と反応させることを 特徴とする化合物の製造方法。
[19] 酵素がアンモニアリアーゼであり、 基質が不飽和カルボン酸であ り、 得られる化合物が L—アミノ酸およぴ またはその誘導体である前記 1 8に記載の化合物の製造方法。
[発明の実施の形態]
(1) 高発現性大腸菌株の選択方法
本発明において外来遺伝子安定的高発現性大腸菌株とは、 慣用の手法によ つて大腸菌に外来遺伝子を導入した際に相対的に発現量が大きく、 さらに、 その発現が安定している株を指す。 発現させるべき外来遺伝子は特に限定さ れないが、 「発現困難な外来遺伝子」 を導入しようとする場合、 本発明は特 に有用である。 ここで、 「発現困難な外来遺伝子」 とは、 大腸菌に導入し形 質を転換し当該形質転換大腸菌を継代培養したときに、 継代する間に外来遺 伝子の発現が低下する遺伝子をいう。 より詳しくは、 プラスミドの脱落や変 異以外の原因により低発現化する外来遺伝子であり、 大腸菌の発現プラスミ ド上に発現可能な形で組み込んで大腸菌に導入した時に、 プラスミドの脱落 や変異等の異常がないにもかかわらずタンパク質生産が行われない遺伝子を 指す。
本発明の大腸菌変異株選択方法を、 以下に詳細に説明する。 なお、 変異の 誘導等は、特に明記しない限り、例えば Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 年発行等に記載の方法を参考にして行うことができる。
まず、 大腸菌変異株の製造方法を説明する。 本変異株の選抜は、 発現困難 な遺伝子を有する組換えベクターで宿主大腸菌を形質転換した形質転換体を 用いて行う。 組換えベクターの作成には大腸菌での発現制御に必要な配列を 有する発現プラスミ ド、 例えば市販の p E T、 p T r c 9 9 A、 p K K 2 3 3、 p U C 1 8等を用いることができる。 これらの発現プラスミドの適当な サイトに発現困難な遺伝子を組み換えたベクター、 すなわち、 大腸菌プロモ 一ター及ぴそのレギュレーター、 好ましくは 1 a cプロモーター、 T r ρプ 口モーター、 T a cプロモーター等のハイブリッドプロモーター、 T 5プロ モーター、 T 7プロモーター等の下流に、 リボソーム固定部位と連続した発 現困難な遺伝子、 転写ターミネータ一として機能し得る構造おょぴマーカー 遺伝子等から構成されている大腸菌組換えベクターを構築する。
本発明において形質転換する大腸菌株は特に制限されないが、 好ましくは、 K 1 2株、 B株等が用いられ、 生物学的封じ込めの観点から、 K 1 2株が好 適に用いられる。例えば、一般的な宿主として市販されている（stratagene社、 日本国内では TOYOBOより購入可能） X L 1— B 1 u e株 (Bullock, Fernandez & Short, 1987, Biotechniques, 5:376-378) 、 J M 1 0 9株 (TaKaRaより購入可 能） 、 H B 1 0 1株等、 広く大腸菌宿主として用いられ、 形質の安定した株 を用いることができる。
通常用いられる大腸菌が生育可能な培地に、 使用する組換えベクターに対 応した形質転換体選抜物質 （例えば、 アンピシリン等の抗生物質） を適量加 え、 さらに寒天を加えて平板化した寒天平板培地、 好ましくは M 9ダルコ一 スプレートに、 形質転換体を塗布し、 2 0 °C〜 4 0 °C、 好ましくは 2 5 °C〜 3 5 °C、 より好ましくは 2 5。じでコ口ニーが明確に形成されるまで 1 6時間 〜 7 2時間、 好ましくは 2 4時間〜 4 8時間培養する。
発現困難な遺伝子を有する形質転換体は、 多くの場合不均一なコロニーを 形成する。 本発明では、 この形質転換体菌株の中からストレス応答の強さを 指標として選抜を行なう。 利用可能なストレス応答のタイプは特に限定され ないが、 利用可能なものとしては、 過酸化水素分解活性、 熱処理後の生育回 復性 （熱耐性） 等が挙げられる。 この中でも過酸化水素分解活性は、 コロニ 一に微量の過酸化水素液を反応させた時、 過酸化水素を分解して酸素を発生 する量の大小でストレス応答の強さを目視により見分けることができるので 好ましい。
必要であれば、 一時選抜と同じ指標を以てさらに選抜を操り返してもよい。 また、 選抜に際しては、 ストレス応答を示す株の中で、 コロニーの色調が他 と比較して白色に近いものや、 コ口二一径が有意に小さいものが特に選抜対 象として好ましい。 また、 二次選抜以降の株について、 既知の手法による生 成タンパク質の解析を併用してさらなる選抜を行なってもよい。
得られた変異株を薬剤圧のない培地で継代することにより、 選択時に使用 した組み換えベクターを脱落させることができ、 これにより宿主大腸菌変株 を得る。
得られた宿主大腸菌変異株の継代安定性は、 菌株が生育する通常の条件で 薬剤による選択圧をかけずに所定の分裂回数が得られるまで継代培養した後、 外来遺伝子の発現を見ることで評価することができる。 例えば、 L Bブロス のごとき栄養培地に、 初期濁度が 0 . 1になる量の被検菌株を植菌し、 濁度 3以上に達するまで培養すると、 約 5世代の継代数となる。 同じ条件で 6回 の培養を繰り返すことで 3 0世代継代の菌体を得ることができ、 この菌体の 外来遺伝子発現を、 外来遺伝子に由来するタンパク質の生産量等を指標にし て評価すればよい。
変異株の選抜中に特に変異処理を施す必要はないが、 用いる宿主大腸菌に よっては通常用いる変異処理、 例えば紫外線照射、 変異薬剤処理等を施すこ とが好適な場合もある。
こうして得られた本発明の大腸菌変異株は、 親株と比べて成長速度、 形質 転換方法及ぴ保存方法等に差異はなく、 2 5 °C〜3 7 °Cの温度範囲、 通常の 栄養培地において、 通常の操作で取り扱いができる。
ストレス応答性の高い株が高発現 ·高活性を持つ理由は明らかではないが、 外来遺伝子の発現がストレスの一種であることと関係していると思われる。 もっとも、 高ス トレス応答性は、 外来遺伝子の発現を抑圧してストレスを軽 減する方向に働くとも考えられるから、 ストレス応答性の高い株が高発現 · 高活性を持つことを見出した本発明の知見は全く予想外のものである。
( 2 ) 安定的高発現性大腸菌株
本発明は上記の方法により選択される大腸菌株を提供する。 本発明により 選択される大腸菌株は、 上記の通り、 実質的に任意の大腸菌株の任意の形質 転換株における安定的高発現性大腸菌株である。
このようにして得られる変異株の例としては、 Escherichia coli SD840株が挙 げられる。これは、 X L 1— B 1 u e株を親株とし、植物フエ二ルァラニン ァ ンモニアリアーゼ遺伝子を導入した形質転換株から上記の手法により選抜さ れた安定的高発現性大腸菌株であり、 親株 X L 1— B 1 u e株の 1 0倍以上 の外来遺伝子由来のタンパク質を生成し、 さらに形質転換体の 3 0世代の継 代によつて変化することなく安定に発現する。
Escherichia coli SD840株は、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央 第 6 (郵便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センターに寄託し （受託日：2002年 9月 27日， 受託番号： FERMP-19047) 、 2003年 11月 10日付で国際寄託に移管した（国際受託番号: FERMBP-08546)。 本発明の選択方法により取得された大腸菌変異株の一つである S D 840 株の顕著な特徴を親株と対比して以下に挙げる。
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さらに本発明の大腸菌変異株は、 生育後期 （定常期以降） のゲノム解析の 結果、 親株に比較して高い発現をしている特徴的な遺伝子によってもその性 質が示される。 これらの遺伝子には未だ機能が特定されていないものも含ま れ、 発現困難な遺伝子が安定発現される原因であるものと結果であるものが 混在しているが、 本変異株の一つである SD 840株の性質を示すものであ る。有意に発現している特徴的な遺伝子は、 o p pA、 ompA、 t u f B、 t u f A、 f u sA、 g a pA、 r p sA、 a h p C i n f C、 k a t E、 y d iH、 l a c l、 i c dA、 o p pC、 r p oB、 ynhA、 ompX、 dn a j、 o p p B、 y c eD、 dn aK、 a c o 2、 c l d、 z i pA、 m i nC、 g a l F、 g n d、 y a f K、 f a b B、 t rmD、 c y s K、 c y dA、 h s I V、 p e pN、 o p pF、 r p oC、 ompF、 r p oA、 p h e S、 r p s B、 o p pD、 p e pD、 s e r S、 t o pA、 g r pE、 y e a F、 a s nB、 s e r C、 p p i B、 t o l B、 y c bK、 y b e Y、 p r sA、 r p s G、 g y rA、 a hp F、 t y r S、 p h eA、 c l pB、 r p s L、 c y dB、 a s p s、 y b dR、 f t s Z、 a r oG、 r p l j、 t s f 、 r p s P、 Cn t 5、 r p l A、 a c eA、 mdh、 yb g F、 a d d、 y j j Z、 r p l C、 (e r f K) 、 d c p、 g l f 、 amn、 a c e B、 r p sD、 mo p B、 g p t、 y a i r p oD、 yn f B、 p g mU、 r p l E、 r f b B、 s e qA、 a s n S、 zw f 、 e d a、 f a b Z、 o t sA、 Cn t 5、 l r p、 y c hB、 p a l、 r p l Y、 f o l E、 r p l N、 g l nS、 r i mM、 y e f G、 y d c F、 r l pA、 y a cA、 f a bD、 Cn t 5、 r f bD、 d i cA、 me tG、 p p c、 (y e eT)、 y a f JT、 a s pC、 p y r C、 l e uS、 y c b L r p l T、 y k f F、 s o dB、 430 # 6、 r n b、 r p s E、 y e b C、 r p s j、 664 # 1 1、 y l i j、 y c f C、 p n p、 r f bA、 y b i C、 r p l S、 t r pA、 hu pB、 h i s C、 r p l B、 r p sH、 p h e T、 y e f l、 1 p dA、 s e rA、 l o l A、 wb b J、 l e uC、 r l p B、 r p l D、 s u cB、 f k pBZs l pA、 y g f B、 r p l X、 h t pG、 mo pA、 p n tA、 r p s F、 i n f B、 y c i I、 (y hhX) 、 mo a B、 y c j X、 g l yQ、 y a gU、 t o 1 C、 g c vR、 g d hA、 y a dF、 p u r B、 s p eE、 (y e f J ) 、 y g gB、 a c cA、 y b i T、 m o a E、 r p s K、 y l eA、 mu kEZk i cA、 p r f B、 y b aD、 r i b F、 h s 1 U、 a d k、 r p s M、 r p 1 Q、 n f nB、 y f hF、 y f i B、 y a e S/u p p SZr t h、 a r oA、 d a pD、 221 # 1 5、 t k tA、 ( c y b B) 、 y h bH、 h i sH、 p b p B/ f t s I a n sA、 g l t B、 b c p、 gm4D、 y o a B、 232 # 7、 u g d、 ma p、 r f a L、 r p 1 W、 r f b C、 r p l K、 r p s C、 g l y S、 s p e G、 g u a A、 r pmB、 r p 1 F、 p t s N、 s m t A、 r pmA、 y k gA、 ompT、 r p l U、 l s pA、 e x oX、 h i s l、 d a cA、 f a bF、 y c bW、 s u cD、 120# 5、 k d gK：、 t r mU、 I o n, n t pA、 y c iM、 t o l Q、 r f a P、 r f a l、 u p l 8、 y f gM、 r p l R、 g u a B、 r i bH、 a t pB、 y a e a t oE、 y a gB、 p d xH、 c s p j、 r p lM、 r p l O、 p o tD、 r f bX、 y r f H / s 1 R, f c 1 Zw c aG、 t r xB、 p I sX、 g I tX、 d n aA、 y d f G、 p r i B、 r p sN、 yh cN、 ma nA、 s u rA、 p u r E、 s e c Ύ / p r 1 d x r、 y e a J N y f c B、 d l d、 c y s P、 f b p、 323 # 1、 i n tD、 h u p A、 f t s L、 a c e K：、 c o d A等 が挙げられる。
(3) 安定的高発現性大腸菌株による酵素 （タンパク質） の製造方法 さらに、 本発明は、 前記大腸菌変異株を用いる外来タンパク質、 典型的に は酵素の製造方法を提供する。
本発明の酵素その他のタンパク質の製造方法では、 前記大腸菌変異株を培 養し、 必要があれば発現誘導を行う。 形質転換体の培養方法は、 通常の方法 が用いられ、 培地は栄養培地、 合成培地いずれでも構わない。 培養温度は、 20〜42°Cの範囲内で任意に選ばれるが、 30°C付近が最も好ましい。 大 腸菌変異株からの外来タンパク質の回収及び精製は、 形質転換体を破碎して 遠心分離し、上清を回収し、ゲル濾過や各種のカラムクロマトグラフィー等、 タンパク質の精製に使用されている通常の方法（例えば、 （Current Protocols in Protein Science fed. Coligan, J. E. et al.), John Wiley and Sons, Inc., Chapter 6) で 製すればよい。 また、 目的タンパク質がペリブラズムに存在する場合には、 Willskyらの方法（J. Bacteriol., 127, 595-609 (1976))等を参考にして精製するこ とができる。
本発明の製造方法は、 大腸菌に導入する遺伝子によつて製造され得る任意 の酵素その他の外来タンパク質について適用できるが、 特に、 従来、 大腸菌 内で発現困難であった遺伝子の発現により製造される酵素その他の外来タン パク質の製造方法として有用である。 こうした酵素その他の外来タンパク質としては、 例えば、 植物フエニルァ ラニン アンモニアリアーゼ等が挙げられる。 特に植物フエ二ルァラニン ァ ンモユアリァーゼは、 例えば S D 8 4 0株において親株 X L 1— B 1 u e株 の 1 0倍以上の外来遺伝子由来のタンパク質を生成し、 さらに形質転換体の 3 0世代の継代によって変化することなく安定に発現する、 非常に好ましい 例である。
なお、 遺伝子発現によつて生成された酵素その他のタンパク質の定量は、 通常の S D S— P A G E、 抗体を用いたウェスタンブロッティング法等によ り行うことができる。 タンパク質が酵素である場合は活性測定等により行う こともできる。
( 4 ) アミノ酸等の製造方法
さらに、 本発明は、 前記大腸菌変異株を用いる有用物質の生産法を提供す る。 前記大腸菌変異株を前記と同様の方法で培養し、 必要があれば発現誘導 を行う。 この培養液から得られる大腸菌変異株菌体、 またはその処理物を目 的の物質を与える基質物質と反応させ、 生成物を得ることにより、 野生株を 用いた場合に対して、 有意に効率的な物質生産を行うことができる。
本発明により生産される有用物質は大腸菌変異株が生産する酵素の種類に より、 例えば、 酵素が分解酵素であれば基質の分解物、 酵素が転移酵素であ れば基質に所定の基が付カ卩された化合物または基質から所定の基が除去され た化合物等が得られる。 例えば、 アンモニアリアーゼはアンモニアの存在下 に、 不飽和カルボン酸の不飽和結合にアンモニアを付加してアミノ酸を生成 する。
本発明によれば、 植物フエ二ルァラニン アンモニアリア一ゼを高発現する S D 8 4 0株を用いて、 アンモニア存在下、 桂皮酸類と反応させることによ り、 対応する各種の光学活性なアミノ酸類を生産することができる。 S D 8 4 0株は継代による発現低下等の問題が無く、 多くの継代を要するスケール アップ製造において、 親株ではなし得なかった安定高生産を実現することが できる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例で使用したプラスミドの制限地図である。
図 2は、 SDS— PAGEとウェスタンプロッティングの結果である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの 実施例により何ら限定されるものではない。 特に明記しない限り、 以下の実 施例の条件及ぴ操作は、 Sambrook, J. ら著、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989年発饤に記 載の方法による。
なお実施例において酵素活性を測定する場合は、 0.1M ホウ酸ナトリゥム緩 衝液 pH8.5、 基質として L—フエ二ルァラニン 1 OmMの存在下、 30°Cに おいて毎分 Ι μπιο 1 eの桂皮酸を遊離する酵素量を 1ユニット （U) と定 義した。
酵素タンパク質量の定量は、 ビウレット法により、 ゥシ血清アルブミンを 基準として定量した。
また桂皮酸および L—フエ二ルァラニンは、 反応液を以下の条件下、 HP LCで分離定量した。
カラム： Sh o d e x (登録商標） R S p a k NN— 614 (昭和電工株 式会社製）
カラム温度： 40°C
溶離液：ァセトニトリル Z水/ 5 OmM H3P04— KH2PO4水溶液 （p H3) =20/70/10 流速： 1.0m 1 / m i n
検出： UV 210nmの吸収による
形質転換体の培養には、 M9培地 （リン酸水素ニナトリウム 0.6%、 リン酸 二水素力リウム 0.3%、 塩化ナトリウム 0.05%、 塩ィ匕アンモニゥム 0.1%、 グ ルコース 0.1%、 硫酸マグネシウム lmM、 チアミン塩酸塩 0.001%、 塩化力 ルシゥム 0.1πιΜ、 ρ Η7.4) にアンピシリン 100 p pmを加えたものか、 L
B培地 （ポリぺプトン 1 %、 酵母エキス 0.5%、 塩ィ匕ナトリウム 1 %) にアン ピシリン 100 p pmを加えた培地を用いた。 用途に応じて、 各培地に 2% 寒天を加えて固化した寒天平板培地を用いた。
形質転換体の酵素活性測定には、 上記培地 5〜1 0 01111で25°(、 38 時間以上培養した培養液から遠心分離によって集菌した菌体を、 培養液と等 容量の生理食塩水で菌体を洗浄した後、 この菌体を培養液の半容量の反応液 (4 Mアンモニア/炭酸アンモニゥム（ρΗΙΟ.3))に懸濁し、終濃度 0.2% (2000 mg/L) の基質を加えて 30°Cで振盪しながら反応させた。 この反応液の 一部を適当な時間（通常 2〜 6時間の間） に取り、菌体を遠心分離して除き、 上清を HP LC分析して生成物量を定量した。 実施例 1 ：組み換えベクターの作成
本実施例で用いた植物フエ二ルァラニン アンモニアリアーゼ遺伝子の取 得法に関しては、本発明者らの先出願（特開 2003-225092号公報） に詳細に記 載されている。特開 2003-225092号公報に記載の組み換えベクターを用いるこ ともできる力 ここでは、矢崎らの報告（Biosci. Biotech. Biochem. (1997)， 61(12), 1995-2003) に記載されている組み換えベクター p QEPAL 2より、 H i s - t a gコード配列を削除したプラスミド pQEPAL 2ΖΔΗ i s 6 (図 1参照） を作成して用いた。
なお、 図 1中、 各記号の意味は以下の通りである。 PT5 ： T 5プロモー ター； 1 a c ： 1 a cオペレーター； RB SII：合成リボゾーム結合サイト； a l :フエ二ルァラニン アンモニアリアーゼ遺伝子； t 0/T 1 ：転写タ ーミネーター； 6 XH i s : H i s— t a gコード配列； OR I ：複製起点； 1 a ： j3—ラクタマーゼ遺伝子 =アンピシリン耐性遺伝子。
PQEPAL 2より H i s— t a gコード配列を削除するには、 組み換え ベクターの H i s— t a gコード配列の前後の位置に相当する、 配列番号 1 に記載のプライマー （5，側； 18 me rのオリゴヌクレオチド） 及び配列番号 2に記載のプライマー （3，側； 18me rのオリゴヌクレオチド） を合成し、 H i s— t a gコード配列以外の部分を下記条件の PC Rで増幅し、 末端平 滑ィ匕およびリン酸化処理の後、 セルフライゲーションすることによって作成 した。 下記配列番号 1のプライマーでは、 目的物であることを容易に確認で きるよう、 ベクター由来の H i n d I I Iサイトの一つが消失するよう 1塩 基置換を施してある。
[PCR条件]
反応液組成：
錶型プラスミド 1 t
プライマー 各 100 pmo 1
dNTP溶液 各 1 mM
10 X反応バッファー 10 1
ExTa q DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） 2.5U 計 50 1 反応条件：
熱変性 94°C、 30秒
アニーリング 55°C、 60秒
伸長 72°C、 300秒
サイクル数 30回'
以上の条件により クタ一断片の増幅を行ったところ、 理論的に算出され る断片長約 5.5k bの断片がほぼ特異的に増幅された。 この PCR反応液を用 いて、 TaKaRa BKL Kit (宝酒造社製） の標準的なプロトコルに従って断片を セルフライゲーションした。 続いてライゲーション溶液で宿主大腸菌 JM1 09株を形質転換し、 アンピシリン 100 p pmを含む LB寒天平板培地に 塗布し、 35 °Cで 24時間培養した。
形成されたコロニー 6株より、 QIAprep Miniprep Kit (QIAGEN社製） を用 いてプラスミドを調整し、 制限酵素 H i n dill によるカツトパターンを調べ た。 この結果、 6株より抽出されたプラスミ ドは全て目的の H i s— t a g コード配列が除かれたプラスミドであることが確認できた。 実施例 2 ： PAL (フエ二ルァラニンアンモニアリアーゼ） 活性を示す形質 転換体の作成
実施例 1で得た pQEPAL2ZAH i s 6で形質転換した大腸菌 X L 1 -B 1 u e株を、 イソプロピル一 j3— D—チォガラタトピラノシド （I PT G) O.lmMおよびアンピシリン 100 p p mを含む L B寒天平板培地に塗布 し、 25 °Cで 48時間培養すると様々な大きさのコロニーが生成した。 これ らのコロニーから任意に各 24株を選択し、 LB培地 5m 1で培養した。 培 養開始 34時間後、 イソプロピル一 —チォガラタトピラノシド （I P TG) を O.lmMになるよう培養液に加えてさらに 4時間培養した。 得られた 培養液をそれぞれ遠心分離して集菌し、 得られた菌体を上記の方法で反応に 供した。 3時間反応後の生成物を HPLCにより定量したところ、 表 2に示 すように、 各形質転換体の活性は未分離の形質転換体株の活性を 1として、 相対活性 0〜 4倍の範囲で様々な活性を示した。 表 2
Figure imgf000019_0001
実施例 3 ：単コロニー分離と継代後の形質転換体の活性
実施例 2で得たコロニー 24株全てを、 イソプロピル一 /3—D—チォガラ タトビラノシド （I PTG) O.lmMおよびアンピシリン 100 p pmを含む LB寒天平板培地に画線し、 25 °Cで 48時間培養した。 この分離コロニー を、 実施例 2と同様に培養して活性測定したところ、 表 3に示すように、 活 性が変動する株が出現した。 表 3
Figure imgf000020_0001
本活性測定で高活性を示した株を、 他の株と比較すると、 Νο.7 コロニーは 生育不良であつたが、 No.8, 10, 23株は何れも有意に色調が白く、 かつ表面光 沢を帯ぴ、 形状の異なる株で ¾>つた。 実施例 4 ： ス トレス応答性による高活性株の識別法
目視によるノイズの多い識別法ではなく、 容易かつ確実に識別可能な特徴 がないかを調べるため、 各株の過酸化水素分解活性、 熱処理後の生育回復性 (熱耐性） を調べた。 過酸化水素分解活性は、 画線培養した LB寒天平板培 地上の菌体に、 数 1の過酸化水素水を加え、 平板上で気泡の発生状況を観 察した。
熱耐性試験は、 寒天平板上の菌体を上記 M 9培地で 16時間培養した後遠 心で集菌し、 生理食塩水に懸濁し 8時間穏やかに振とうして休止菌体とした。 この休止菌体を 55 °Cで 2分間処理した後、 アンピシリン 100 p pmを含 む L B寒天平板培地に画線して 25 °Cで培養した。
この試験の結果、 高活性株は全て一般〜低活性な株より生育初期から過酸 化水素分解活性が高い傾向が認められた。 一方、 熱耐性は 3株中 2株で高い 傾向が見られたが、 1株は通常株と同様生育不良であった。 そこでコロニー 形状と生育初期の過酸化水素分解活性を指標に高活性株の分離選抜を試みた。 実施例 5 高活性形質転換体の分離選抜
実施例 1と同様にして、 pQEPAL2/AH i s 6で形質転換した大腸 菌 XL 1— B 1 u e株を、 イソプロピル一 j3—D—チォガラクトピラノシド ( I PTG) O.lmMおよびアンピシリン 100 p pmを含む LB寒天平板培 地に塗布し、 25 °Cで 48時間培養した。 形成された各コロニーの一部に接 するように 30%過酸化水素水 1 μ 1を添カ卩し、 分解による発泡を観察した ところ、 幾つかのコロニーで旺盛な発泡が観察された。 この中からコロニー 24株を単離し、 アンピシリン 100 p pmを含む Μ9寒天平板培地に取り、 25°Cで 48時間培養した。
単離した 24株の活性を実施例 2と同様にして培養し、 活性を測定したと ころ、 表 4に示すように全ての株で高い活性が確認された。 この中から、 比 較的生育状況も良く、 コロニー形成も明確な 3株を選択した。 表 4
Figure imgf000022_0001
実施例 6 ：高活性株の継代安定性
選択した高活性株 No.16, 20, 21株を、それぞれアンピシリン 1 0 0 p p mを 含む L B寒天平板培地に画線し、 2 5 °Cで 4 8時間培養した。 この培養菌体 から、 同じ L B寒天平板培地に画線培養することを 5回繰り返した。 各植え 継ぎの間に、 実施例 2と同様にして培養し、 植え継ぎ毎の活性の変動を確認 した。表 5に示すように、これらの株のうち 2株（No.16及び 20)については、 植え継ぎによる活性変動は小さく、 安定した形質として高活性を示すことが 確認された。 表 5
Figure imgf000023_0001
実施例 7 ：高活性株のプラスミド確認
活性の変化がプラスミドの変異に由来するものか、 宿主の変異によるもの かを調べる目的で、実施例 6で安定高活性を示すことが判った 2株より No.16 株を選択し、 その保持プラスミドを調整し、 その全塩基配列 （約 5.5 k b ) お よび再形質転換体の活性を調べた。
QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGE 社製） を用いてプラスミドを抽出し、 全塩基配列を両鎖に対するジーンウォーキング解析により解読した。 配列決 定は D NAシーケンサー model377 ver.3.0の標準的な使用法、 すなわち標準的 な P C R反応およぴ泳動 ·データ解析方法によって決定した。 決定した各部 分配列の配列結合は核酸配列自動結合ソフトウェア GENETYX-WIN/ATSQ (ソ フトウェア開発株式会社製） により行った。 その結果、全配列に渡って置換' 脱落等の異常はないことが確認された。
同じ上記プラスミドを用いて、 大腸菌 X L 1— B 1 u e株を形質転換し、 イソプロピル _ j3—D—チォガラクトビラノシド （I P T G) O.lmMおよび アンピシリン 1 0 0 p p mを含む L B寒天平板培地に塗布し、 2 5 °Cで 4 8 時間培養したところ、 実施例 2に記載したのと同様、 様々な大きさのコロニ 一が生成した。 本コロニーから任意に各 2 4株を選択し、 実施例 2と同様に して培養し活性を測定したところ、 表 6に示すように、 各形質転換体の活性 は未分離の形質転換体株の活性を 1として、 相対活性 0〜 3倍の範囲で様々 な活性を示した。 これらの事実より、 高活性株から抽出したプラスミドは選抜分離前のブラ スミドと全く同じものであり、 高活性化はプラスミドの変化によるものでは なく、 宿主大腸菌株の変化であることが確認された。
表 6
Figure imgf000024_0001
実施例 8 ：高活性株のタンパク質生産の確認
施例 6で得られた高活性株 No.16と、実施例 7のコロニー No.24及ぴ No.12 株を、 実施例 2に記載の方法に従い、 アンピシリン 1 0 0 p p mを含む L B 培地 5 m 1で培養した。 培養 3 4時間後イソプロピル一 )8— D—チォガラタ トピラノシド （I PTG) O.lmMを添加し、 さらに 4時間培養した。 得られ た培養液の濁度（660 nm) を測定し、 ほぼ同じ濁度であることを確認後、 培養液の 0.1m 1を遠心分離して集菌した。 この菌体を 0.15m 1の生理食塩水 に懸濁し、 4 X SD S泳動電気泳動サンプル処理液 (1MT r i s— HC 1 (p H6.8) 2,1m 1、 SDS 860mg、 2—メルカプトエタノール 2 m 1、 グリセロール 2.8m l、 BPB lmgを混合し、 脱イオン水で 10 m 1にした もの） 0.05mlを加え、 良く混合した後、 100°Cで 5分間煮沸した。
処理液を遠心（12,000 r pmX 5分） して沈殿物を除いた上清 10 μ 1をそ れぞれ 10〜 20 %ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ 2連） に供した。
分離後のアクリルアミドゲルの一方は CBB染色液でタンパク質染色した。 他方のゲルは、 標準的な条件のエレクトロブロッティングにより二トロセル ロース膜へタンパク質を転写した後、抗 PAL (兎）抗体を一次抗体として、 Phototope-HRP Western Blot Detection System (Amersham社製） の標準的な手法 に従い、 ウェスタンプロッティングを行った。 その結果、 活性の高低は P A L (フエ二ルァラニンアンモニアリアーゼ） タンパク質の生成量と一致する ことが確認された （図 2参照） 。 実施例 9 ：高活性株よりプラスミド除去
実施例 6で得られた高活性株 No.16 をテトラサイクリン 20 p p mを含む 8培地51111、 35°C、 24時間培養した後、 培養液の一部を植え継ぎ同 条件で培養行うことを 10日間繰り返して行った。 10日目の培養液を L B 寒天平板培地に塗布し、 35 °Cで 24時間培養し、 コロニーを形成させた。 形成されたコロニーを、 任意に 50個選択し、 テトラサイクリン 2 O p p mとアンピシリン 100 p pmを含む LB寒天平板培地と、 テトラサイクリ ン 20 p p mのみ含む L B寒天平板培地上に植菌し、 25 °C、 48時間培養 した。 アンピシリン含有培地で生育せず、 含有しない培地で生育する株を単 離し、 Escherichia coli SD840株と命名した。 実施例 10 ：高活性株を用いた反応
実施例 6で得た高活性株 No.16を、実施例 2に記載の方法に従い、アンピシ リン 100 p p mを含む L B培地 100mlで培養した。 この培養液をさら にアンピシリン 100 p pmとイソプロピル一 —D—チォガラタトピラノ シド （I PTG) O.lmMを含む LB培地 21を入れた 5 Lジャーフアーメン ターに植菌し、 30°C、 800 r pm、 通気 1 m 1 Zm i n. で 38時間通 気攪拌培養した。
定常期の培養液を遠心分離して得た菌体を、 4 Mアンモニア/炭酸アンモニ ゥム （pHlO.3) 1 Lに再懸濁し、 2 O gの桂皮酸を加え、 30°C、 800 r pmで撹拌しながら反応を行った。 反応液の一部を 1時間毎に取り、 反応液 中に生じた L—フエ二ルァラニンを HP LCにより定量した。 基質濃度が約 2 %を保つよう基質を逐次添加しながら反応を継続して行ったところ、 約 3 時間で反応液中に約 3.5%の L—フエニルァラ二ンが蓄積した。 産業上の利用可能性
本発明の選択方法によれば、 外来遺伝子を安定的かつ高水準で発現する大 腸菌、 特に大腸菌内で発現困難な遺伝子を安定的かつ高水準で発現する大腸 菌を容易かつ確実に選択できる。 植物由来アンモニアリアーゼは大腸菌内で 発現困難な遺伝子と考えられてきたが、 本発明の方法によれば、 植物由来ァ ンモニアリアーゼ遺伝子を安定的に高発現できる。 従って、 各種不飽和カル ボン酸にアミノ基を付加して L一アミノ酸ゃァントシァニン等の化合物を合 成するのに有用である。

Claims

請求 の範囲
1 . ス トレス応答の強さを指標として選抜することを特徴とする外来遺伝子 高発現性大腸菌株の選択方法。
2 . ス トレス応答が過酸ィヒ水素分解活性である請求の範囲 1に記載の選択方 法。
3 . 大腸菌に導入された際に、 プラスミ ドの脱落や変異以外の原因により低 発現化する外来遺伝子を高発現する請求の範囲 1または 2に記載の選択方法。
4 . ス トレス応答の強さを指標として選抜された外来遺伝子高発現性大腸菌 株。
5 . ス トレス応答が過酸化水素分解活性である請求の範囲 4に記載の外来遺 伝子高発現性大腸菌株。
6 . 大腸菌に導入された際に、 プラスミ ドの脱落や変異以外の原因により低 発現化する外来遺伝子を高発現する請求の範囲 4または 5に記載の外来遺伝 子高発現性大腸菌株。
7 . 大腸菌株を 3 0世代継代する間に発現量が 2分の 1まで低下する遺伝子 を発現させたときに、 発現量が初代の水準に維持されるかまたは向上する請 求の範囲 4乃至 6のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
8 . プラスミドの脱落や変異以外の原因により低発現化する外来遺伝子が、 アンモニアリァーゼの遺伝子である請求の範囲 6または 7に記載の外来遺伝 子高発現性大腸菌株。
9 . アンモニアリァーゼの発現系遺伝子がフエ二ルァラニンアンモニアリァ ーゼの遺伝子である請求の範囲 8に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
1 0 . フエ二ルァラニンアンモニアリアーゼの遺伝子が、 植物由来である請 求の範囲 9に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
1 1 . 植物がムラサキ科ムラサキ （Lithospermum erythrorhizon) である請求の 範囲 1 0に記載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
1 2 . 大腸菌株が K 1 2株由来である請求の範囲 4乃至 1 1のいずれかに記 載の外来遺伝子高発現性大腸菌株。
1 3 . 大腸菌株が X L 1— B 1 u e株由来である請求の範囲 1 2に記載の外 来遺伝子高発現性大腸菌株。
1 4 .大腸菌株が Escherichia coli SD840株である請求の範囲 1 3に記載の外来 遺伝子高発現性大腸菌株。
1 5 .大腸菌株が Escherichia coli SD840株からクローン選択または遺伝子操作 によって得られる誘導株である請求の範囲 1 4に記載の外来遺伝子高発現性 大腸菌株。
1 6 . Escherichia coli SD840株 （受託番号： FERM BP-08546) 。
1 7 . 請求の範囲 4乃至 1 5のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌 株の外来遺伝子を発現させることを特徴とする酵素の製造方法。
1 8 . 請求の範囲 4乃至 1 5のいずれかに記載の外来遺伝子高発現性大腸菌 株またはその産生する酵素を含む処理液をその酵素の基質と反応させること を特徴とする化合物の製造方法。
1 9 . 酵素がアンモニアリアーゼであり、 基質が不飽和カルボン酸であり、 得られる化合物が L—アミノ酸および Zまたはその誘導体である請求の範囲 1 8に記載の化合物の製造方法。
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