JP3325512B2 - 大腸菌変異株 - Google Patents
大腸菌変異株Info
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- JP3325512B2 JP3325512B2 JP03171898A JP3171898A JP3325512B2 JP 3325512 B2 JP3325512 B2 JP 3325512B2 JP 03171898 A JP03171898 A JP 03171898A JP 3171898 A JP3171898 A JP 3171898A JP 3325512 B2 JP3325512 B2 JP 3325512B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大腸菌変異株に関
する。さらに詳しくは、大腸菌内で発現された不安定蛋
白質を安定化する機能を有する大腸菌変異株、該大腸菌
変異株の製造方法、該大腸菌変異株を用いる不安定蛋白
質の大腸菌内での安定発現方法、該大腸菌変異株を用い
る大腸菌由来の不安定蛋白質の安定化方法、該大腸菌変
異株に外来蛋白質をコードする遺伝子を導入して得られ
る形質転換体及び該形質転換体を用いる外来蛋白質の製
造方法に関する。
する。さらに詳しくは、大腸菌内で発現された不安定蛋
白質を安定化する機能を有する大腸菌変異株、該大腸菌
変異株の製造方法、該大腸菌変異株を用いる不安定蛋白
質の大腸菌内での安定発現方法、該大腸菌変異株を用い
る大腸菌由来の不安定蛋白質の安定化方法、該大腸菌変
異株に外来蛋白質をコードする遺伝子を導入して得られ
る形質転換体及び該形質転換体を用いる外来蛋白質の製
造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌を用いた外来遺伝子の発現による
有用蛋白質の産生は、基本的にはすでに確立された技術
といえるが、大腸菌の菌体内で急速に分解される蛋白質
も多く、必ずしも満足できる発現量が得られるとは限ら
ない。大腸菌内で不安定な外来蛋白質を安定に発現させ
る一つの手段として、プロテアーゼ遺伝子の変異株を宿
主として用いることが考えられ、実際 clpＰＸ遺伝子及
び lon遺伝子の二重変異株が外来蛋白質生産のための宿
主として作製されている（特開平８−１４０６７１号公
報）。しかし、種々の外来蛋白質を安定に発現させると
いう点において未だ有効な変異株は得られていない。
有用蛋白質の産生は、基本的にはすでに確立された技術
といえるが、大腸菌の菌体内で急速に分解される蛋白質
も多く、必ずしも満足できる発現量が得られるとは限ら
ない。大腸菌内で不安定な外来蛋白質を安定に発現させ
る一つの手段として、プロテアーゼ遺伝子の変異株を宿
主として用いることが考えられ、実際 clpＰＸ遺伝子及
び lon遺伝子の二重変異株が外来蛋白質生産のための宿
主として作製されている（特開平８−１４０６７１号公
報）。しかし、種々の外来蛋白質を安定に発現させると
いう点において未だ有効な変異株は得られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、大腸
菌の菌体内で不安定な蛋白質を安定化する機能を有する
大腸菌変異株を提供することにある。本発明の他の目的
は、かかる大腸菌変異株の製造方法を提供することにあ
る。本発明のさらに他の目的は、かかる大腸菌変異株を
用いる不安定蛋白質の安定発現方法を提供することにあ
る。本発明のさらに他の目的は、かかる大腸菌変異株を
用いる大腸菌由来の不安定蛋白質の安定化方法を提供す
ることにある。本発明のさらに他の目的は、かかる大腸
菌変異株に外来蛋白質をコードする遺伝子を導入して得
られる形質転換体を提供することにある。本発明のさら
に他の目的は、かかる形質転換体を用いて不安定蛋白質
を製造する方法を提供することにある。
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、大腸
菌の菌体内で不安定な蛋白質を安定化する機能を有する
大腸菌変異株を提供することにある。本発明の他の目的
は、かかる大腸菌変異株の製造方法を提供することにあ
る。本発明のさらに他の目的は、かかる大腸菌変異株を
用いる不安定蛋白質の安定発現方法を提供することにあ
る。本発明のさらに他の目的は、かかる大腸菌変異株を
用いる大腸菌由来の不安定蛋白質の安定化方法を提供す
ることにある。本発明のさらに他の目的は、かかる大腸
菌変異株に外来蛋白質をコードする遺伝子を導入して得
られる形質転換体を提供することにある。本発明のさら
に他の目的は、かかる形質転換体を用いて不安定蛋白質
を製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記プロテアーゼには弱
いながらも基質特異性が認められており、ある蛋白質は
Ｌｏｎにより分解されるが、Ｃｌｐでは分解されないと
いうことがある。したがって、新たなプロテアーゼを発
見し、それらの変異を既存のプロテアーゼの変異と組み
合わせることにより、様々な外来蛋白質の発現に対応可
能な、蛋白質分解を抑制した宿主が開発できるものと期
待される。
いながらも基質特異性が認められており、ある蛋白質は
Ｌｏｎにより分解されるが、Ｃｌｐでは分解されないと
いうことがある。したがって、新たなプロテアーゼを発
見し、それらの変異を既存のプロテアーゼの変異と組み
合わせることにより、様々な外来蛋白質の発現に対応可
能な、蛋白質分解を抑制した宿主が開発できるものと期
待される。
【０００５】本発明者らは、このような観点から、大腸
菌内で折り畳みが異常になった蛋白質を処理するという
機能を指標に、新規プロテアーゼ遺伝子の探索を試み、
hslＶ／Ｕオペロンを単離した。 hslＶ／Ｕオペロンの
塩基配列は既に報告されており、また hslＶ／Ｕオペロ
ンがコードする２つの蛋白質ＨｓｌＶとＨｓｌＵはそれ
ぞれＡＴＰ依存性プロテアーゼの触媒サブユニットと調
節サブユニットであることが報告されている（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 93,5808-5813(1996); J.Biol. Che
m. 271,14035-14040(1996))。
菌内で折り畳みが異常になった蛋白質を処理するという
機能を指標に、新規プロテアーゼ遺伝子の探索を試み、
hslＶ／Ｕオペロンを単離した。 hslＶ／Ｕオペロンの
塩基配列は既に報告されており、また hslＶ／Ｕオペロ
ンがコードする２つの蛋白質ＨｓｌＶとＨｓｌＵはそれ
ぞれＡＴＰ依存性プロテアーゼの触媒サブユニットと調
節サブユニットであることが報告されている（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 93,5808-5813(1996); J.Biol. Che
m. 271,14035-14040(1996))。
【０００６】本発明者らは、ＨｓｌＶ／Ｕ蛋白質を過剰
発現させた大腸菌内ではヒトプロウロキナーゼは著しく
不安定になり、 hslＶ／Ｕ欠失変異株では外来蛋白質と
して用いたヒトプロウロキナーゼが２倍程度安定化する
ことを認めた。ところが、さらに、他のＡＴＰ依存性プ
ロテアーゼの欠失変異と組み合わせたところ、驚くべき
ことに、 hslＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子、 lon遺伝
子の三重欠失変異株で、野生型はもちろん clpＰＸ遺伝
子、 lon遺伝子の二重変異株、および hslＶ／Ｕ欠失変
異株に比較してもヒトプロウロキナーゼが著しく安定化
することを見出し、本発明を完成するに至った。
発現させた大腸菌内ではヒトプロウロキナーゼは著しく
不安定になり、 hslＶ／Ｕ欠失変異株では外来蛋白質と
して用いたヒトプロウロキナーゼが２倍程度安定化する
ことを認めた。ところが、さらに、他のＡＴＰ依存性プ
ロテアーゼの欠失変異と組み合わせたところ、驚くべき
ことに、 hslＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子、 lon遺伝
子の三重欠失変異株で、野生型はもちろん clpＰＸ遺伝
子、 lon遺伝子の二重変異株、および hslＶ／Ｕ欠失変
異株に比較してもヒトプロウロキナーゼが著しく安定化
することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１） hslＶ／
Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に三重欠失変
異を有し、かつ、大腸菌内で発現された不安定蛋白質を
安定化する機能を有する大腸菌変異株、（２） clpＰ
Ｘ遺伝子及び lon遺伝子に二重欠失変異を有する大腸菌
変異株を用いて、さらに hslＶ／Ｕ遺伝子に欠失変異を
導入することを特徴とする、前記（１）記載の大腸菌変
異株の製造方法。（３） 前記（１）記載の大腸菌変異
株を用いることを特徴とする、大腸菌内での不安定蛋白
質の安定発現方法、（４） 前記（１）記載の大腸菌変
異株を用いることを特徴とする、大腸菌由来の不安定蛋
白質の安定化方法、（５） 前記（１）記載の大腸菌変
異株に、外来蛋白質をコードする遺伝子を発現させるベ
クターを導入してなる形質転換体、（６） 前記（５）
記載の形質転換体を用いることを特徴とする、外来蛋白
質の製造方法、に関する。
Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に三重欠失変
異を有し、かつ、大腸菌内で発現された不安定蛋白質を
安定化する機能を有する大腸菌変異株、（２） clpＰ
Ｘ遺伝子及び lon遺伝子に二重欠失変異を有する大腸菌
変異株を用いて、さらに hslＶ／Ｕ遺伝子に欠失変異を
導入することを特徴とする、前記（１）記載の大腸菌変
異株の製造方法。（３） 前記（１）記載の大腸菌変異
株を用いることを特徴とする、大腸菌内での不安定蛋白
質の安定発現方法、（４） 前記（１）記載の大腸菌変
異株を用いることを特徴とする、大腸菌由来の不安定蛋
白質の安定化方法、（５） 前記（１）記載の大腸菌変
異株に、外来蛋白質をコードする遺伝子を発現させるベ
クターを導入してなる形質転換体、（６） 前記（５）
記載の形質転換体を用いることを特徴とする、外来蛋白
質の製造方法、に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明において、大腸菌変異株と
は、大腸菌内で発現された不安定蛋白質を安定化する機
能を有する大腸菌変異株をいう。例えば、 hslＶ／Ｕ遺
伝子、 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に三重欠失変異を
有し、かつ、前記機能を有する大腸菌変異株等が挙げら
れる。
は、大腸菌内で発現された不安定蛋白質を安定化する機
能を有する大腸菌変異株をいう。例えば、 hslＶ／Ｕ遺
伝子、 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に三重欠失変異を
有し、かつ、前記機能を有する大腸菌変異株等が挙げら
れる。
【０００９】本発明において、「不安定蛋白質」とは、
大腸菌内で発現しても速やかに分解を受ける、すなわ
ち、極めて半減期の短い蛋白質をいい、熱ショック転写
因子σ 32等の大腸菌由来の蛋白質及びヒトプロウロキナ
ーゼ、スギ花粉抗原ＣｒｙｊII、各種サイトカイン、成
長因子等の大腸菌内での高発現が困難な外来蛋白質を含
む。
大腸菌内で発現しても速やかに分解を受ける、すなわ
ち、極めて半減期の短い蛋白質をいい、熱ショック転写
因子σ 32等の大腸菌由来の蛋白質及びヒトプロウロキナ
ーゼ、スギ花粉抗原ＣｒｙｊII、各種サイトカイン、成
長因子等の大腸菌内での高発現が困難な外来蛋白質を含
む。
【００１０】本発明において、「安定化する」とは、前
記不安定蛋白質の半減期を有意に延長することをいう。
半減期は、例えば後述の放射標識したアミノ酸を用いる
パルス−チェイス実験により、測定することができる。
記不安定蛋白質の半減期を有意に延長することをいう。
半減期は、例えば後述の放射標識したアミノ酸を用いる
パルス−チェイス実験により、測定することができる。
【００１１】前記三重欠失変異とは、 hslＶ／Ｕ遺伝
子、 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子を、それぞれ、全部
又は一部欠失させることにより、かかる遺伝子がコード
するプロテアーゼが、例えば、ウエスタンブロッティン
グ法等により、大腸菌内に検出されないことをいう。
子、 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子を、それぞれ、全部
又は一部欠失させることにより、かかる遺伝子がコード
するプロテアーゼが、例えば、ウエスタンブロッティン
グ法等により、大腸菌内に検出されないことをいう。
【００１２】前記三重欠失変異の大腸菌染色体中への導
入は、ＰＣＲ法により確認することができる。
入は、ＰＣＲ法により確認することができる。
【００１３】前記三重欠失変異を導入する大腸菌株は特
に制限されないが、Ｋ１２株、Ｂ株等が用いられ、生物
学的封じ込めの観点から、Ｋ１２株が好適に用いられ
る。
に制限されないが、Ｋ１２株、Ｂ株等が用いられ、生物
学的封じ込めの観点から、Ｋ１２株が好適に用いられ
る。
【００１４】本発明においては、不安定蛋白質をより安
定化するという観点から、Ｋ１２株の派生株であるＭＣ
４１００株[F- araDΔ(argF-lac)U169 rpsL relA flbB
deoCptsF rbsR] の hslＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子
及び lon遺伝子に三重欠失変異を導入して得られたＫＹ
２２６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３９）並びにＫ１２
株の派生株であるＷ３１１０株[thyA36 deoC2 IN(rrnD-
rrnE)1 rph1]の hslＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子及び
lon遺伝子に三重欠失変異を導入して得られた、３０℃
〜４２℃で増殖可能なＫＹ２８９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６２４３）が、特に好ましい。
定化するという観点から、Ｋ１２株の派生株であるＭＣ
４１００株[F- araDΔ(argF-lac)U169 rpsL relA flbB
deoCptsF rbsR] の hslＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子
及び lon遺伝子に三重欠失変異を導入して得られたＫＹ
２２６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３９）並びにＫ１２
株の派生株であるＷ３１１０株[thyA36 deoC2 IN(rrnD-
rrnE)1 rph1]の hslＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子及び
lon遺伝子に三重欠失変異を導入して得られた、３０℃
〜４２℃で増殖可能なＫＹ２８９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６２４３）が、特に好ましい。
【００１５】本発明の大腸菌変異株を製造する方法を、
前記ＫＹ２２６６株及びＫＹ２８９３株を例にとって、
以下に詳細に説明する。特に明記しない限り、以下の方
法は、例えば Sambrook, J. et al., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, New York, 1989年発行等に記載の
方法を参考にして行うことができる。
前記ＫＹ２２６６株及びＫＹ２８９３株を例にとって、
以下に詳細に説明する。特に明記しない限り、以下の方
法は、例えば Sambrook, J. et al., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, New York, 1989年発行等に記載の
方法を参考にして行うことができる。
【００１６】まず、ＫＹ２２６６株の製造方法を説明す
る。前記ＭＣ４１００株の clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝
子に二重欠失変異を導入し、ＫＹ２２６３株を得る。次
に、該ＫＹ２２６３株を用いてさらに hslＶ／Ｕ遺伝子
に欠失変異を導入することにより、 hslＶ／Ｕ遺伝子、
clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に三重欠失変異を有する
ＫＹ２２６６株を得る。
る。前記ＭＣ４１００株の clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝
子に二重欠失変異を導入し、ＫＹ２２６３株を得る。次
に、該ＫＹ２２６３株を用いてさらに hslＶ／Ｕ遺伝子
に欠失変異を導入することにより、 hslＶ／Ｕ遺伝子、
clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に三重欠失変異を有する
ＫＹ２２６６株を得る。
【００１７】（１）ＫＹ２２６３株の製造方法 小原大腸菌整列クローン＃１４８より、Ｌｏｎ（Ｌａ）
プロテアーゼ及びＣｌｐプロテアーゼの触媒サブユニッ
トＣｌｐＰをそれぞれコードしているlon 遺伝子及び c
lpＰ遺伝子を周辺領域を含めて多コピープラスミドにク
ローニングする。 clpＰ遺伝子及びlon 遺伝子は大腸菌
染色体上で近傍にあり、該遺伝子間にはＣｌｐプロテア
ーゼの１つであるＣｌｐＸＰの調節サブユニットである
ＣｌｐＸをコードする clpＸ遺伝子があり、 clpＰ遺伝
子とオペロンを形成している（図１）。 clpＰ遺伝子内
の MluＩ部位と lon遺伝子内の SalＩ部位間の３．７ｋ
ｂｐの断片をｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ３７０３３）
（Chang, A. C. and Cohen,S. N., J. Bacteriol. 134,
1141-1156(1978))由来のクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（cat)遺伝子(HincII −Nhe Ｉ断片
１．６ｋｂｐ）で置換することにより、欠失変異を生じ
させる（図１）。得られるプラスミドをｐＫＶ１１９
６、欠失変異をΔ(clpＰＸ-lon) 1196::cat と名づけ
る。
プロテアーゼ及びＣｌｐプロテアーゼの触媒サブユニッ
トＣｌｐＰをそれぞれコードしているlon 遺伝子及び c
lpＰ遺伝子を周辺領域を含めて多コピープラスミドにク
ローニングする。 clpＰ遺伝子及びlon 遺伝子は大腸菌
染色体上で近傍にあり、該遺伝子間にはＣｌｐプロテア
ーゼの１つであるＣｌｐＸＰの調節サブユニットである
ＣｌｐＸをコードする clpＸ遺伝子があり、 clpＰ遺伝
子とオペロンを形成している（図１）。 clpＰ遺伝子内
の MluＩ部位と lon遺伝子内の SalＩ部位間の３．７ｋ
ｂｐの断片をｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ３７０３３）
（Chang, A. C. and Cohen,S. N., J. Bacteriol. 134,
1141-1156(1978))由来のクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（cat)遺伝子(HincII −Nhe Ｉ断片
１．６ｋｂｐ）で置換することにより、欠失変異を生じ
させる（図１）。得られるプラスミドをｐＫＶ１１９
６、欠失変異をΔ(clpＰＸ-lon) 1196::cat と名づけ
る。
【００１８】前記ｐＫＶ１１９６をHindIII で切断して
直鎖状にしたＤＮＡを用いて、 recＤ変異株であるＦＳ
１５７６株（Stahl, F. W. et al., Genetics 113,215-
227(1986))の形質転換を行う。クロラムフェニコール耐
性となった形質転換体より染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣ
Ｒを用いて前記欠失変異が染色体中に導入されたことを
確認する。
直鎖状にしたＤＮＡを用いて、 recＤ変異株であるＦＳ
１５７６株（Stahl, F. W. et al., Genetics 113,215-
227(1986))の形質転換を行う。クロラムフェニコール耐
性となった形質転換体より染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣ
Ｒを用いて前記欠失変異が染色体中に導入されたことを
確認する。
【００１９】ＰＩファージ（Yarmolinsky, M. B. and S
ternberg, N., The Bacteriophages(ed. Calendar,
R.), Plenum Press, New York, vol. 1,291-438(1988))
を用いてΔ(clpＰＸ-lon) 1196::cat を野生株ＭＣ４
１００株に導入する。得られた変異株は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＫＹ２２６３と命名、表示され、日本国茨城県つくば
市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−６２３８として寄託されている（原寄託日：１
９９７年２月１８日、国際寄託日：１９９８年１月２６
日）。
ternberg, N., The Bacteriophages(ed. Calendar,
R.), Plenum Press, New York, vol. 1,291-438(1988))
を用いてΔ(clpＰＸ-lon) 1196::cat を野生株ＭＣ４
１００株に導入する。得られた変異株は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＫＹ２２６３と命名、表示され、日本国茨城県つくば
市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−６２３８として寄託されている（原寄託日：１
９９７年２月１８日、国際寄託日：１９９８年１月２６
日）。
【００２０】（２）ＫＹ２２６６株の製造方法 ＳＧ２２０９４株（ＭＣ４１００株 clpＰ１::cat Δ l
on-510、特開平８−１４０６７１号公報）より、Ｈｓｌ
Ｖ／Ｕプロテアーゼをコードする hslＶ／Ｕオペロンを
周辺領域を含めて多コピープラスミドにクローニングす
る。 hslＶ遺伝子内の NsiＩ部位と hslＵ遺伝子内のNr
uI部位間の０．６ｋｂｐの断片をｐＢＲ３２２由来のテ
トラサイクリン耐性(tet) 遺伝子（EcoRI-AvaI断片 1.4
kbp)で置換する（図２）。得られるプラスミドをｐＫＶ
１１７２、欠失変異をΔ hslＶ／Ｕ1172::tet と名づけ
る。
on-510、特開平８−１４０６７１号公報）より、Ｈｓｌ
Ｖ／Ｕプロテアーゼをコードする hslＶ／Ｕオペロンを
周辺領域を含めて多コピープラスミドにクローニングす
る。 hslＶ遺伝子内の NsiＩ部位と hslＵ遺伝子内のNr
uI部位間の０．６ｋｂｐの断片をｐＢＲ３２２由来のテ
トラサイクリン耐性(tet) 遺伝子（EcoRI-AvaI断片 1.4
kbp)で置換する（図２）。得られるプラスミドをｐＫＶ
１１７２、欠失変異をΔ hslＶ／Ｕ1172::tet と名づけ
る。
【００２１】前記ｐＫＶ１１７２をＥｃｏＲＩで切断し
て直鎖状にしたＤＮＡを用いて、ＦＳ１５７６株の形質
転換を行う。テトラサイクリン耐性となった形質転換体
より染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用いて前記欠失変
異が染色体中に導入されたことを確認する。
て直鎖状にしたＤＮＡを用いて、ＦＳ１５７６株の形質
転換を行う。テトラサイクリン耐性となった形質転換体
より染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用いて前記欠失変
異が染色体中に導入されたことを確認する。
【００２２】（１）と同様に、ＰＩファージを用いて、
Δ hslＶ／Ｕ1172::tet を（１）で得られたＫＹ２２６
３株に導入する。得られた変異株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
Ｙ２２６６と命名、表示され、日本国茨城県つくば市東
１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ
−６２３９として寄託されている（原寄託日：１９９７
年２月１８日、国際寄託日：１９９８年１月２６日）。
Δ hslＶ／Ｕ1172::tet を（１）で得られたＫＹ２２６
３株に導入する。得られた変異株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
Ｙ２２６６と命名、表示され、日本国茨城県つくば市東
１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ
−６２３９として寄託されている（原寄託日：１９９７
年２月１８日、国際寄託日：１９９８年１月２６日）。
【００２３】こうして得られた本発明の大腸菌変異株で
あるＫＹ２２６６株は、親株のＭＣ４１００株や二重変
異株のＫＹ２２６３株と比べて、３７℃、栄養培地にお
いて、成長速度、形質転換方法及び保存方法等に差異は
なく、通常の操作で取り扱いができる点が有利である。
あるＫＹ２２６６株は、親株のＭＣ４１００株や二重変
異株のＫＹ２２６３株と比べて、３７℃、栄養培地にお
いて、成長速度、形質転換方法及び保存方法等に差異は
なく、通常の操作で取り扱いができる点が有利である。
【００２４】次に、ＫＹ２８９３株の製造方法を説明す
る。ＫＹ２８９３株の製造方法は、、前記ＫＹ２２６６
株の製造方法において、ＭＣ４１００株の代わりにＷ３
１１０株を用いることを除いて同様に行なう。具体的に
は、Ｗ３１１０株の clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に二
重欠失変異を導入する。得られた変異株は、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＫＹ２７８３と命名、表示され、日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６２４４として寄託されている（原寄託日：
１９９８年２月３日）。
る。ＫＹ２８９３株の製造方法は、、前記ＫＹ２２６６
株の製造方法において、ＭＣ４１００株の代わりにＷ３
１１０株を用いることを除いて同様に行なう。具体的に
は、Ｗ３１１０株の clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に二
重欠失変異を導入する。得られた変異株は、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＫＹ２７８３と命名、表示され、日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６２４４として寄託されている（原寄託日：
１９９８年２月３日）。
【００２５】次いで、該ＫＹ２７８３株を用いてさらに
hslＶ／Ｕ遺伝子に欠失変異を導入することにより、 h
slＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に三重
欠失変異を有するＫＹ２８０４株を得て、該ＫＹ２８０
４株から３０℃以上で増殖可能な変異株ＫＹ２８９３株
を分離する。得られたこれらの変異株は、それぞれ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＹ２８０４及びＥ．ｃｏｌｉ ＫＹ２
８９３と命名、表示され、日本国茨城県つくば市東１丁
目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
６２４５及びＦＥＲＭ ＢＰ−６２４３として寄託され
ている（原寄託日：１９９８年２月３日）。
hslＶ／Ｕ遺伝子に欠失変異を導入することにより、 h
slＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に三重
欠失変異を有するＫＹ２８０４株を得て、該ＫＹ２８０
４株から３０℃以上で増殖可能な変異株ＫＹ２８９３株
を分離する。得られたこれらの変異株は、それぞれ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＹ２８０４及びＥ．ｃｏｌｉ ＫＹ２
８９３と命名、表示され、日本国茨城県つくば市東１丁
目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
６２４５及びＦＥＲＭ ＢＰ−６２４３として寄託され
ている（原寄託日：１９９８年２月３日）。
【００２６】また、こうして得られた本発明の大腸菌変
異株であるＫＹ２８９３株も、親株のＷ３１１０株や二
重変異株のＫＹ２７８３株と比べて、３７℃、栄養培地
において、成長速度、形質転換方法及び保存方法等に差
異はなく、通常の操作で取り扱いができる点が有利であ
る。
異株であるＫＹ２８９３株も、親株のＷ３１１０株や二
重変異株のＫＹ２７８３株と比べて、３７℃、栄養培地
において、成長速度、形質転換方法及び保存方法等に差
異はなく、通常の操作で取り扱いができる点が有利であ
る。
【００２７】また、本発明は、前記大腸菌変異株を用い
て、大腸菌内で不安定蛋白質を安定発現させる方法を提
供する。不安定蛋白質は、外来蛋白質が好ましく、ヒト
プロウロキナーゼ、スギ花粉抗原ＣｒｙｊII等が本発明
の大腸菌変異株により有意に安定発現されるので、さら
に好ましい。
て、大腸菌内で不安定蛋白質を安定発現させる方法を提
供する。不安定蛋白質は、外来蛋白質が好ましく、ヒト
プロウロキナーゼ、スギ花粉抗原ＣｒｙｊII等が本発明
の大腸菌変異株により有意に安定発現されるので、さら
に好ましい。
【００２８】不安定蛋白質が外来蛋白質の場合、目的の
外来蛋白質をコードする遺伝子をベクターに導入して組
換えベクターを調製する。該ベクターは、プロモーター
配列、ＳＤ配列、複製開始点、マーカー遺伝子等本発明
の大腸菌変異株での発現制御に必要な配列を有するもの
であり、市販のｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３
等が用いられる。得られる組換えベクターを本発明の大
腸菌変異株に導入し、マーカー遺伝子に応じた方法でコ
ロニーを選択することにより、目的の外来蛋白質を発現
する形質転換体を得る。
外来蛋白質をコードする遺伝子をベクターに導入して組
換えベクターを調製する。該ベクターは、プロモーター
配列、ＳＤ配列、複製開始点、マーカー遺伝子等本発明
の大腸菌変異株での発現制御に必要な配列を有するもの
であり、市販のｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３
等が用いられる。得られる組換えベクターを本発明の大
腸菌変異株に導入し、マーカー遺伝子に応じた方法でコ
ロニーを選択することにより、目的の外来蛋白質を発現
する形質転換体を得る。
【００２９】また、本発明は、前記形質転換体をも提供
する。
する。
【００３０】次に、前記形質転換体を培養することによ
り、目的の不安定な外来蛋白質を安定に発現させること
ができる。形質転換体の培養方法は、通常の方法が用い
られ、培地は栄養培地、合成培地いずれでも構わない
し、培養温度は、２０〜４２℃の範囲内で任意に選ばれ
るが、３７℃付近が最も好ましい。
り、目的の不安定な外来蛋白質を安定に発現させること
ができる。形質転換体の培養方法は、通常の方法が用い
られ、培地は栄養培地、合成培地いずれでも構わない
し、培養温度は、２０〜４２℃の範囲内で任意に選ばれ
るが、３７℃付近が最も好ましい。
【００３１】対数増殖期の形質転換体を含む培地に35Ｓ
−メチオニンを添加して形質転換体細胞で合成される蛋
白質を１分間標識した後、過剰の非放射性メチオニンを
加えるパルス−チェイス実験により、目的の外来蛋白質
の安定性を測定することができる。外来蛋白質の安定性
は、半減期により表される。
−メチオニンを添加して形質転換体細胞で合成される蛋
白質を１分間標識した後、過剰の非放射性メチオニンを
加えるパルス−チェイス実験により、目的の外来蛋白質
の安定性を測定することができる。外来蛋白質の安定性
は、半減期により表される。
【００３２】さらに、本発明は、前記大腸菌変異株を用
いて、大腸菌由来の不安定蛋白質を安定化する方法を提
供する。以下、大腸菌由来の熱ショック転写因子σ32を
例にとって説明する。本発明の大腸菌変異株を前記形質
転換体と同様の方法で培養することにより、大腸菌由来
の不安定蛋白質を安定化することができる。該大腸菌変
異株細胞から蛋白質を通常の方法で溶出する。一定量の
溶出蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロー
ス膜に転写後、抗σ32抗体を用いるウエスタンブロッテ
ィング法により、σ32の発現量の最も多い大腸菌変異株
を選択することができる（特開平８−１４０６７１号公
報）。
いて、大腸菌由来の不安定蛋白質を安定化する方法を提
供する。以下、大腸菌由来の熱ショック転写因子σ32を
例にとって説明する。本発明の大腸菌変異株を前記形質
転換体と同様の方法で培養することにより、大腸菌由来
の不安定蛋白質を安定化することができる。該大腸菌変
異株細胞から蛋白質を通常の方法で溶出する。一定量の
溶出蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロー
ス膜に転写後、抗σ32抗体を用いるウエスタンブロッテ
ィング法により、σ32の発現量の最も多い大腸菌変異株
を選択することができる（特開平８−１４０６７１号公
報）。
【００３３】前記σ32の発現量の最も多い本発明の大腸
菌変異株は、σ32を分解するプロテアーゼを欠失してお
り、目的蛋白質の直接的な分解が抑制されるばかりでな
く、σ32によって産生される大量の熱ショック蛋白質の
シャペロン機能により、外来遺伝子の発現により産生さ
れた目的蛋白質をさらに安定に保持し得ることが期待さ
れるので、特に有用である。
菌変異株は、σ32を分解するプロテアーゼを欠失してお
り、目的蛋白質の直接的な分解が抑制されるばかりでな
く、σ32によって産生される大量の熱ショック蛋白質の
シャペロン機能により、外来遺伝子の発現により産生さ
れた目的蛋白質をさらに安定に保持し得ることが期待さ
れるので、特に有用である。
【００３４】さらに、本発明は、前記形質転換体を用い
る外来蛋白質の製造方法を提供する。前記形質転換体を
前記と同様の方法で培養し、必要があれば発現誘導を行
う。形質転換体からの外来蛋白質の回収及び精製は、形
質転換体を破砕して遠心分離し、上清を回収し、ゲル濾
過や各種のカラムクロマトグラフィー等、蛋白質の精製
に使用されている通常の方法で精製すればよい（Curren
t Protocols in Protein Science(ed. Coligan, J. E.
et al.), John Wiley and Sons, Inc., Chapter 6)。ま
た、目的蛋白質がペリプラズムに存在する場合には、Wi
llsky らの方法（J. Bacteriol., 127, 595-609 (197
6)) 等を参考にして精製することができる。
る外来蛋白質の製造方法を提供する。前記形質転換体を
前記と同様の方法で培養し、必要があれば発現誘導を行
う。形質転換体からの外来蛋白質の回収及び精製は、形
質転換体を破砕して遠心分離し、上清を回収し、ゲル濾
過や各種のカラムクロマトグラフィー等、蛋白質の精製
に使用されている通常の方法で精製すればよい（Curren
t Protocols in Protein Science(ed. Coligan, J. E.
et al.), John Wiley and Sons, Inc., Chapter 6)。ま
た、目的蛋白質がペリプラズムに存在する場合には、Wi
llsky らの方法（J. Bacteriol., 127, 595-609 (197
6)) 等を参考にして精製することができる。
【００３５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例
は、 Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, New York, 1989年発行に記載の方法で行っ
た。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例
は、 Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, New York, 1989年発行に記載の方法で行っ
た。
【００３６】実施例１ＫＹ２２６６株の調製 小原大腸菌整列クローン＃１４８より、Ｌｏｎ（Ｌａ）
プロテアーゼ及びＣｌｐプロテアーゼの触媒サブユニッ
トＣｌｐＰをそれぞれコードしているlon 遺伝子及び c
lpＰ遺伝子を周辺領域を含めて多コピープラスミドｐＢ
Ｒ３２２にクローニングした。lon 遺伝子及び clpＰ遺
伝子は大腸菌染色体上で近傍にあり、該遺伝子間にはＣ
ｌｐプロテアーゼの１つであるＣｌｐＸＰの調節サブユ
ニットであるＣｌｐＸをコードする clpＸ遺伝子があ
り、 clpＰ遺伝子とオペロンを形成している（図１）。
clpＰ遺伝子内の MluＩ部位と lon遺伝子内の SalＩ部
位間の３．７ｋｂｐの断片をｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣ
Ｃ３７０３３）（Chang, A.C. and Cohen,S. N., J. Ba
cteriol. 134,1141-1156(1978))由来のcat 遺伝子(Nhe
Ｉ−HincII断片１．６ｋｂｐ）で置換することにより、
欠失変異を生じさせた（図１）。得られたプラスミドを
ｐＫＶ１１９６、欠失変異をΔ(clpＰＸ-lon)1196::cat
と名づけた。
プロテアーゼ及びＣｌｐプロテアーゼの触媒サブユニッ
トＣｌｐＰをそれぞれコードしているlon 遺伝子及び c
lpＰ遺伝子を周辺領域を含めて多コピープラスミドｐＢ
Ｒ３２２にクローニングした。lon 遺伝子及び clpＰ遺
伝子は大腸菌染色体上で近傍にあり、該遺伝子間にはＣ
ｌｐプロテアーゼの１つであるＣｌｐＸＰの調節サブユ
ニットであるＣｌｐＸをコードする clpＸ遺伝子があ
り、 clpＰ遺伝子とオペロンを形成している（図１）。
clpＰ遺伝子内の MluＩ部位と lon遺伝子内の SalＩ部
位間の３．７ｋｂｐの断片をｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣ
Ｃ３７０３３）（Chang, A.C. and Cohen,S. N., J. Ba
cteriol. 134,1141-1156(1978))由来のcat 遺伝子(Nhe
Ｉ−HincII断片１．６ｋｂｐ）で置換することにより、
欠失変異を生じさせた（図１）。得られたプラスミドを
ｐＫＶ１１９６、欠失変異をΔ(clpＰＸ-lon)1196::cat
と名づけた。
【００３７】前記ｐＫＶ１１９６をHindIII で切断した
ＤＮＡを用いて、 recＤ変異株であるＦＳ１５７６株
（Stahl, F. W. et al., Genetics 113,215-227(1986))
の形質転換を行った。クロラムフェニコール耐性となっ
た形質転換体より染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用い
て前記欠失変異が染色体中に導入されたことを確認し
た。
ＤＮＡを用いて、 recＤ変異株であるＦＳ１５７６株
（Stahl, F. W. et al., Genetics 113,215-227(1986))
の形質転換を行った。クロラムフェニコール耐性となっ
た形質転換体より染色体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用い
て前記欠失変異が染色体中に導入されたことを確認し
た。
【００３８】ＰＩファージ（Yarmolinsky, M. B. and S
ternberg, N., The Bacteriophages(ed. Calendar,
R.), Plenum Press, New York, vol. 1,291-438(1988))
を用いてΔ(clpＰＸ-lon) 1196::cat を野生株ＭＣ４
１００株に導入した。得られた変異株をＫＹ２２６３株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３８）と名づけた。
ternberg, N., The Bacteriophages(ed. Calendar,
R.), Plenum Press, New York, vol. 1,291-438(1988))
を用いてΔ(clpＰＸ-lon) 1196::cat を野生株ＭＣ４
１００株に導入した。得られた変異株をＫＹ２２６３株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３８）と名づけた。
【００３９】ＳＧ２２０９４株（ＭＣ４１００株 clpＰ
１::cat Δ lon-510、特開平８−１４０６７１号公報）
より、ＨｓｌＶ／Ｕプロテアーゼをコードする hslＶ／
Ｕオペロンを周辺領域を含めて前記多コピープラスミド
にクローニングした。 hslＶ遺伝子内の NsiＩ部位と h
slＵ遺伝子内のNruI部位間の０．６ｋｂｐの断片をｐＢ
Ｒ３２２由来のtet 遺伝子（EcoRI-AvaI断片 1.4kbp)で
置換した（図２）。得られたプラスミドをｐＫＶ１１７
２、欠失変異をΔ hslＶ／Ｕ1172::tet と名づけた。
１::cat Δ lon-510、特開平８−１４０６７１号公報）
より、ＨｓｌＶ／Ｕプロテアーゼをコードする hslＶ／
Ｕオペロンを周辺領域を含めて前記多コピープラスミド
にクローニングした。 hslＶ遺伝子内の NsiＩ部位と h
slＵ遺伝子内のNruI部位間の０．６ｋｂｐの断片をｐＢ
Ｒ３２２由来のtet 遺伝子（EcoRI-AvaI断片 1.4kbp)で
置換した（図２）。得られたプラスミドをｐＫＶ１１７
２、欠失変異をΔ hslＶ／Ｕ1172::tet と名づけた。
【００４０】前記ｐＫＶ１１７２をＥｃｏＲＩで切断し
たＤＮＡを用いて、ＦＳ１５７６株の形質転換を行っ
た。テトラサイクリン耐性となった形質転換体より染色
体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用いて前記欠失変異が染色
体中に導入されたことを確認した。
たＤＮＡを用いて、ＦＳ１５７６株の形質転換を行っ
た。テトラサイクリン耐性となった形質転換体より染色
体ＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用いて前記欠失変異が染色
体中に導入されたことを確認した。
【００４１】ＰＩファージを用いて、Δ hslＶ／Ｕ117
2::tet を前記ＫＹ２２６３株に導入した。得られた変
異株をＫＹ２２６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３９）と
名づけた。
2::tet を前記ＫＹ２２６３株に導入した。得られた変
異株をＫＹ２２６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３９）と
名づけた。
【００４２】実施例２ＫＹ２８９３株の調製 実施例１と同様にして、ＰＩファージを用いて、Δ(clp
ＰＸ-lon) 1196::catを野生株Ｗ３１１０株に導入し
た。得られた変異株をＫＹ２７８３株（ＦＥＲＭＢＰ−
６２４４）と名づけた。
ＰＸ-lon) 1196::catを野生株Ｗ３１１０株に導入し
た。得られた変異株をＫＹ２７８３株（ＦＥＲＭＢＰ−
６２４４）と名づけた。
【００４３】さらに、実施例１と同様にして、ＰＩファ
ージを用いて、Δ hslＶ／Ｕ1172::tet を前記ＫＹ２７
８３株に導入した。得られた変異株をＫＹ２８０４株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４５）と名づけた。
ージを用いて、Δ hslＶ／Ｕ1172::tet を前記ＫＹ２７
８３株に導入した。得られた変異株をＫＹ２８０４株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４５）と名づけた。
【００４４】前記ＫＹ２８０４株をＬ液体培地中で４２
℃で増殖させた後、適当に希釈してＬ寒天培地上に塗布
し、３７℃又は３０℃で一日培養すると、４２℃での培
養に比べ、コロニー数がそれぞれ、１／１０又は１／１
０，０００に低下した。このことにより、ＫＹ２８０４
株が低温感受性であることがわかった。
℃で増殖させた後、適当に希釈してＬ寒天培地上に塗布
し、３７℃又は３０℃で一日培養すると、４２℃での培
養に比べ、コロニー数がそれぞれ、１／１０又は１／１
０，０００に低下した。このことにより、ＫＹ２８０４
株が低温感受性であることがわかった。
【００４５】そこで、該ＫＹ２８０４株をＬ液体培地中
で４２℃で一夜培養し、培養液の２μｌをＬ寒天培地上
に塗布し、３０℃で１日培養した。増殖してきたコロニ
ーから重なりのないものを選び、Ｌ寒天培地上にストリ
ークした後、再び３０℃で培養した。同様に増殖してき
たコロニーをＬ寒天培地上にストリークし、４２℃で培
養して単一コロニーを分離し、３０℃〜４２℃で増殖可
能なＫＹ２８９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４３）を得
た。
で４２℃で一夜培養し、培養液の２μｌをＬ寒天培地上
に塗布し、３０℃で１日培養した。増殖してきたコロニ
ーから重なりのないものを選び、Ｌ寒天培地上にストリ
ークした後、再び３０℃で培養した。同様に増殖してき
たコロニーをＬ寒天培地上にストリークし、４２℃で培
養して単一コロニーを分離し、３０℃〜４２℃で増殖可
能なＫＹ２８９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４３）を得
た。
【００４６】実施例３ＫＹ２２６６株中でのヒトプロウロキナーゼの安定発現
方法 ｐＵＫ−０２ｐｍ０はlacIq 遺伝子と tacプロモーター
下流にヒトプロウロキナーゼ遺伝子を持つ多コピープラ
スミドであり、該プラスミドで形質転換した大腸菌は培
地中のＩＰＴＧ濃度に依存してプロウロキナーゼを合成
する（Kanemori, M. et al., J. Bacteriol. 176, 5648
-5653(1994))。該プラスミドでＭＣ４１００株（野生
株）、ＫＹ２２６３株、ＫＹ２２６６株を形質転換し、
アンピシリン耐性によりコロニーを選択し、選択された
コロニー中のヒトプロウロキナーゼの発現をウエスタン
ブロッティングにより確認することにより、形質転換体
を得た。得られた形質転換体をそれぞれ、３０℃、合成
培地(medium E)（培地１リットル当たり、 MgSO4・7H2O
0.2g 、クエン酸・H2O 2g、K2HPO4 10g、NaNH4HPO4・4
H2O 3.5g を含む）中で対数増殖させ、前記合成培地に
最終濃度１０μＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、ヒト
プロウロキナーゼの合成を誘導した。ＩＰＴＧ添加後１
時間目にサンプリングし、抗ヒトプロウロキナーゼ抗体
を用いるウエスタンブロッティングによりヒトプロウロ
キナーゼの量を調べた。
方法 ｐＵＫ−０２ｐｍ０はlacIq 遺伝子と tacプロモーター
下流にヒトプロウロキナーゼ遺伝子を持つ多コピープラ
スミドであり、該プラスミドで形質転換した大腸菌は培
地中のＩＰＴＧ濃度に依存してプロウロキナーゼを合成
する（Kanemori, M. et al., J. Bacteriol. 176, 5648
-5653(1994))。該プラスミドでＭＣ４１００株（野生
株）、ＫＹ２２６３株、ＫＹ２２６６株を形質転換し、
アンピシリン耐性によりコロニーを選択し、選択された
コロニー中のヒトプロウロキナーゼの発現をウエスタン
ブロッティングにより確認することにより、形質転換体
を得た。得られた形質転換体をそれぞれ、３０℃、合成
培地(medium E)（培地１リットル当たり、 MgSO4・7H2O
0.2g 、クエン酸・H2O 2g、K2HPO4 10g、NaNH4HPO4・4
H2O 3.5g を含む）中で対数増殖させ、前記合成培地に
最終濃度１０μＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、ヒト
プロウロキナーゼの合成を誘導した。ＩＰＴＧ添加後１
時間目にサンプリングし、抗ヒトプロウロキナーゼ抗体
を用いるウエスタンブロッティングによりヒトプロウロ
キナーゼの量を調べた。
【００４７】その結果、ＭＣ４１００株形質転換体と比
較して、ＫＹ２２６３株形質転換体及びＫＹ２２６６株
形質転換体では有意にプロウロキナーゼの含有量が増加
していた（図３）。発現速度には変化がなかったため、
含有量の違いは安定性の違いを反映したものである。栄
養培地（Ｌ−培地）（培地１リットル当たり、バクトト
リプトン（登録商標、Difco Laboratories製) １０ｇ、
酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを含む、ｐＨ７．４）
中、３７℃の培養条件においても、前記形質転換体中の
ヒトプロウロキナーゼの含有量に関して同様の結果が得
られた。
較して、ＫＹ２２６３株形質転換体及びＫＹ２２６６株
形質転換体では有意にプロウロキナーゼの含有量が増加
していた（図３）。発現速度には変化がなかったため、
含有量の違いは安定性の違いを反映したものである。栄
養培地（Ｌ−培地）（培地１リットル当たり、バクトト
リプトン（登録商標、Difco Laboratories製) １０ｇ、
酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを含む、ｐＨ７．４）
中、３７℃の培養条件においても、前記形質転換体中の
ヒトプロウロキナーゼの含有量に関して同様の結果が得
られた。
【００４８】前記と同様の方法により培養した対数増殖
期の形質転換体を含む培地に、ＩＰＴＧ添加後、35Ｓ−
メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）を添加し、形質転換
体細胞で合成される蛋白質を１分間標識した後、過剰の
非放射性メチオニン（終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加え
て１分後を０分とし、１０、２０、３０、４０分後の各
形質転換体をサンプリングすることにより、パルス−チ
ェイス実験を行なった。
期の形質転換体を含む培地に、ＩＰＴＧ添加後、35Ｓ−
メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）を添加し、形質転換
体細胞で合成される蛋白質を１分間標識した後、過剰の
非放射性メチオニン（終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加え
て１分後を０分とし、１０、２０、３０、４０分後の各
形質転換体をサンプリングすることにより、パルス−チ
ェイス実験を行なった。
【００４９】前記各形質転換体中のヒトプロウロキナー
ゼの含有量を免疫沈降法により定量し、半減期を測定し
たところ、ＭＣ４１００株では１０分、ＫＹ２２６３株
では３０分であるのに対し、ＫＹ２２６６株では４０分
以上であり、有意に半減期が延長されていた（図４）。
ゼの含有量を免疫沈降法により定量し、半減期を測定し
たところ、ＭＣ４１００株では１０分、ＫＹ２２６３株
では３０分であるのに対し、ＫＹ２２６６株では４０分
以上であり、有意に半減期が延長されていた（図４）。
【００５０】実施例４ＫＹ２２６６株中でのスギ花粉抗原ＣｒｙｊIIの安定発
現方法 ＣｒｙｊII発現ベクターｐＫＣＪ２Ｉを用いて、実施例
３と同様の方法で、各形質転換体を得た。得られた各形
質転換体を栄養培地中、３７℃で培養し、対数増殖期に
ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように培地に添加して
ＣｒｙｊIIの合成を誘導した。１時間後にスペクチノマ
イシンを最終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように添加
し、蛋白質合成を停止させた（０分）。５、１０、２
０、４０分後の各形質転換体をサンプリングした。
現方法 ＣｒｙｊII発現ベクターｐＫＣＪ２Ｉを用いて、実施例
３と同様の方法で、各形質転換体を得た。得られた各形
質転換体を栄養培地中、３７℃で培養し、対数増殖期に
ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように培地に添加して
ＣｒｙｊIIの合成を誘導した。１時間後にスペクチノマ
イシンを最終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように添加
し、蛋白質合成を停止させた（０分）。５、１０、２
０、４０分後の各形質転換体をサンプリングした。
【００５１】前記各形質転換体中のＣｒｙｊIIをウエス
タンブロッティングにより定量したところ、ＭＣ４１０
０株では半減期が７分であるのに対し、ＫＹ２２６３株
及びＫＹ２２６６株では４０分経過後も、ＣｒｙｊIIの
残量は、それぞれ、約０．９及び約１．０とほぼ初期値
を維持しており、ＣｒｙｊIIが非常に安定化されている
ことが明らかとなった（図５）。
タンブロッティングにより定量したところ、ＭＣ４１０
０株では半減期が７分であるのに対し、ＫＹ２２６３株
及びＫＹ２２６６株では４０分経過後も、ＣｒｙｊIIの
残量は、それぞれ、約０．９及び約１．０とほぼ初期値
を維持しており、ＣｒｙｊIIが非常に安定化されている
ことが明らかとなった（図５）。
【００５２】実施例５ＫＹ２２６６株中でのσ32の安定化 ３０℃、合成培地(medium E)で培養した対数増殖期のＫ
Ｙ２２６６株を含む培地に、35Ｓ−メチオニン（１００
μＣｉ／ｍｌ）を添加し、ＫＹ２２６６株で合成される
蛋白質を１分間標識した後、過剰の非放射性メチオニン
（終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えて１分後を０分と
し、５、１０、１５、２０分後のＫＹ２２６６細胞をサ
ンプリングすることにより、パルス−チェイス実験を行
なった。σ 32に対する抗体を用いて、各ＫＹ２２６６細
胞中のσ32含量を免疫沈降法により定量した。ＭＣ４１
００株では、半減期が約１．５分、ＫＹ２２６３株では
半減期が約８分であるのに対し、ＫＹ２２６６株では半
減期が約４０分と有意に半減期が延長されていた。
Ｙ２２６６株を含む培地に、35Ｓ−メチオニン（１００
μＣｉ／ｍｌ）を添加し、ＫＹ２２６６株で合成される
蛋白質を１分間標識した後、過剰の非放射性メチオニン
（終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えて１分後を０分と
し、５、１０、１５、２０分後のＫＹ２２６６細胞をサ
ンプリングすることにより、パルス−チェイス実験を行
なった。σ 32に対する抗体を用いて、各ＫＹ２２６６細
胞中のσ32含量を免疫沈降法により定量した。ＭＣ４１
００株では、半減期が約１．５分、ＫＹ２２６３株では
半減期が約８分であるのに対し、ＫＹ２２６６株では半
減期が約４０分と有意に半減期が延長されていた。
【００５３】実施例６ＫＹ２８９３株中でのσ32の安定化 ３７℃、栄養培地で培養した対数増殖期のＷ３１１０
株、ＫＹ２７８３株およびＫＹ２８９３株をそれぞれ含
む培地に、クロラムフェニコールを最終濃度１００μｇ
／ｍｌとなるように添加し、蛋白質合成を停止させた
（０分）。０、０．５、１．０、１．５分後（Ｗ３１１
０株）または０、５、１０、１５分後（ＫＹ２７８３株
およびＫＹ２８９３株）に菌をサンプリングした。菌体
中のσ32をウエスタンブロッティングにより定量したと
ころ、Ｗ３１１０株では半減期が約１分、ＫＹ２７８３
株では約１０分であるのに対し、ＫＹ２８９３株では１
５分後もほぼ初期値を維持しており、σ32が非常に安定
化されていることが明らかとなった（図６）。
株、ＫＹ２７８３株およびＫＹ２８９３株をそれぞれ含
む培地に、クロラムフェニコールを最終濃度１００μｇ
／ｍｌとなるように添加し、蛋白質合成を停止させた
（０分）。０、０．５、１．０、１．５分後（Ｗ３１１
０株）または０、５、１０、１５分後（ＫＹ２７８３株
およびＫＹ２８９３株）に菌をサンプリングした。菌体
中のσ32をウエスタンブロッティングにより定量したと
ころ、Ｗ３１１０株では半減期が約１分、ＫＹ２７８３
株では約１０分であるのに対し、ＫＹ２８９３株では１
５分後もほぼ初期値を維持しており、σ32が非常に安定
化されていることが明らかとなった（図６）。
【００５４】
【発明の効果】本発明によれば、大腸菌内で発現された
不安定蛋白質を安定化する機能を有する大腸菌変異株、
該大腸菌変異株の製造方法、該大腸菌変異株を用いる不
安定蛋白質の安定発見方法、該大腸菌変異株を用いる大
腸菌由来の不安定蛋白質を大腸菌内で安定化する方法、
該大腸菌変異株に外来蛋白質をコードする遺伝子を導入
して得られる形質転換体及び該形質転換体を用いる外来
蛋白質の製造方法が提供される。本発明により、有用外
来蛋白質の効率的な遺伝子工学的生産が可能となる。
不安定蛋白質を安定化する機能を有する大腸菌変異株、
該大腸菌変異株の製造方法、該大腸菌変異株を用いる不
安定蛋白質の安定発見方法、該大腸菌変異株を用いる大
腸菌由来の不安定蛋白質を大腸菌内で安定化する方法、
該大腸菌変異株に外来蛋白質をコードする遺伝子を導入
して得られる形質転換体及び該形質転換体を用いる外来
蛋白質の製造方法が提供される。本発明により、有用外
来蛋白質の効率的な遺伝子工学的生産が可能となる。
【図１】図１は、 clpＰＸオペロンとlon 遺伝子の大腸
菌染色体上での模式図及び clpＰ遺伝子内の MluＩ部位
と lon遺伝子内の SalＩ部位間の塩基配列をcat 遺伝子
(HincII −Nhe Ｉ）で置換する欠失変異を示す。矢印
は、転写の方向を示す。
菌染色体上での模式図及び clpＰ遺伝子内の MluＩ部位
と lon遺伝子内の SalＩ部位間の塩基配列をcat 遺伝子
(HincII −Nhe Ｉ）で置換する欠失変異を示す。矢印
は、転写の方向を示す。
【図２】図２は、hsl Ｖ／Ｕオペロンの大腸菌染色体上
での模式図及びhsl Ｖ遺伝子内の NsiＩ部位と hslＵ遺
伝子内のNruI部位間の塩基配列をtet 遺伝子（AvaI-Eco
RI) で置換する欠失変異を示す。矢印は、転写の方向を
示す。
での模式図及びhsl Ｖ遺伝子内の NsiＩ部位と hslＵ遺
伝子内のNruI部位間の塩基配列をtet 遺伝子（AvaI-Eco
RI) で置換する欠失変異を示す。矢印は、転写の方向を
示す。
【図３】図３は、ウエスタンブロッティングによるヒト
プロウロキナーゼの発現を示す電気泳動の写真である。
プロウロキナーゼの発現を示す電気泳動の写真である。
【図４】図４は、ＫＹ２２６６株を用いるヒトプロウロ
キナーゼの安定化を測定するためのパルス−チェイス実
験の結果を示す図である。
キナーゼの安定化を測定するためのパルス−チェイス実
験の結果を示す図である。
【図５】図５は、ＫＹ２２６６株を用いるＣｒｙｊIIの
安定化を測定するためのウエスタンブロッティングの結
果を示す図である。
安定化を測定するためのウエスタンブロッティングの結
果を示す図である。
【図６】図６は、ＫＹ２８９３株を用いるσ32の安定化
を測定するためのウエスタンブロッティングの結果を示
す図である。
を測定するためのウエスタンブロッティングの結果を示
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/72 (Ｃ１２Ｎ 9/72 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/415 C07K 14/745 C12N 1/21 C12N 9/72 C12P 21/02
Claims (13)
- 【請求項１】 hslＶ／Ｕ遺伝子、 clpＰＸ遺伝子及び
lon遺伝子に三重欠失変異を有し、かつ、大腸菌内で発
現された不安定蛋白質を安定化する機能を有する大腸菌
変異株。 - 【請求項２】 大腸菌変異株がＫ１２株由来である請求
項１記載の大腸菌変異株。 - 【請求項３】 大腸菌変異株がＫＹ２２６６株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６２３９）又はＫＹ２８９３株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２４３）である、請求項１記載の大腸菌変異
株。 - 【請求項４】 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に二重欠
失変異を有する大腸菌変異株を用いて、さらに hslＶ／
Ｕ遺伝子に欠失変異を導入することを特徴とする、請求
項１〜３いずれか記載の大腸菌変異株の製造方法。 - 【請求項５】 clpＰＸ遺伝子及び lon遺伝子に二重欠
失変異を有する大腸菌変異株がＫＹ２２６３株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６２３８）又はＫＹ２７８３株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２４４）である、請求項４記載の製造方法。 - 【請求項６】 請求項１〜３いずれか記載の大腸菌変異
株を用いることを特徴とする、大腸菌内での不安定蛋白
質の安定発現方法。 - 【請求項７】 不安定蛋白質が外来蛋白質である請求項
６記載の安定発現方法。 - 【請求項８】 外来蛋白質がヒトプロウロキナーゼであ
る請求項７記載の安定発現方法。 - 【請求項９】 外来蛋白質がスギ花粉抗原ＣｒｙｊIIで
ある請求項７記載の安定発現方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜３いずれか記載の大腸菌変
異株を用いることを特徴とする、大腸菌由来の不安定蛋
白質の安定化方法。 - 【請求項１１】 大腸菌由来の不安定蛋白質が熱ショッ
ク転写因子σ32である請求項１０記載の安定化方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜３いずれか記載の大腸菌変
異株に、外来蛋白質をコードする遺伝子を発現させるベ
クターを導入してなる形質転換体。 - 【請求項１３】 請求項１２記載の形質転換体を用いる
ことを特徴とする、外来蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03171898A JP3325512B2 (ja) | 1997-03-19 | 1998-02-13 | 大腸菌変異株 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8591497 | 1997-03-19 | ||
| JP9-85914 | 1997-03-19 | ||
| JP03171898A JP3325512B2 (ja) | 1997-03-19 | 1998-02-13 | 大腸菌変異株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10313863A JPH10313863A (ja) | 1998-12-02 |
| JP3325512B2 true JP3325512B2 (ja) | 2002-09-17 |
Family
ID=26370226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03171898A Expired - Fee Related JP3325512B2 (ja) | 1997-03-19 | 1998-02-13 | 大腸菌変異株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3325512B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7494801B2 (en) | 2002-12-12 | 2009-02-24 | Showa Denko K.K. | Method of selecting Escherichia coli strain which highly expresses exogenous genes, Escherichia coli mutant strains selected by this method and process for producing enzymes and compounds using the same |
-
1998
- 1998-02-13 JP JP03171898A patent/JP3325512B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10313863A (ja) | 1998-12-02 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |