CN113461790B

CN113461790B - 一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件

Info

Publication number: CN113461790B
Application number: CN202110797401.4A
Authority: CN
Inventors: 邢力; 潘元晴; 吴长新
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2041-07-14
Also published as: CN113461790A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672SspH1蛋白N端的208个氨基酸残基片段，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO：2所示。本发明得到的增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件，可以在工业界或科研中把它用作一个提升蛋白产量和蛋白活力的工具，有助于科学研究和生物医药工业生产以及抗传染病疫苗制备。此外，谷胱甘肽S转移酶(GST)是一个含有211个氨基酸的蛋白，是最常用的蛋白表达的稳定多肽，但对不同目标蛋白效果差异大。本发明鉴定出的SspH1前导稳定元件可以提供一个新的选择，以获得理想的活性蛋白的表达。

Description

一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。

背景技术

在科学研究和生物医药工业生产和抗传染病疫苗制备中，常常需要在原核细菌中(包括但不限于大肠杆菌，沙门氏菌，志贺氏菌，结核分枝杆菌等)表达或者纯化有生物活性的蛋白。

但目前在细菌中表达外源蛋白经常遇到下列问题：

(1)无产量或低产量。目标蛋白无法通过敏感技术(例如Western印迹)检测到或被检测到。含量很低(每升培养物低于微克)时，问题通常在于异源蛋白发挥有害作用或者蛋白本身不稳定。

(2)蛋白质失活。获得大量的可溶性蛋白质并不是最终目标。这种蛋白质可能仍然质量不佳，即，它没有应有的活力。

因此如何增强细菌中蛋白的活性和表达一直是一个需要解决的重要问题。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件，为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1蛋白N端的208个氨基酸残基片段，包含可变N端区域，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO：2所示。

一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，PCR克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因的最小启动子(265个核苷酸)和SspH1蛋白N端208个氨基酸残基的编码序列(含有翻译起始密码子，编码208个氨基酸残基的前导多肽，也就是T3SS区)。

步骤2，将步骤1克隆得到的SspH1基因的最小启动子和其N端208个氨基酸残基的编码序列通过XhoI/NotI限制酶酶切连接到酶切位点修饰过的pGL3-Basic质粒的荧光素酶编码区上游，得到重组质粒。在这个重组质粒中，SspH1的前导多肽编码区和荧光素酶编码区同框，以表达SspH1前导多肽-荧光素酶融合蛋白。

步骤3，将得到的重组质粒分别转染到大肠杆菌E.coli C2566中，在LB肉汤培养基中培养12个小时，收获细胞并裂解，使用发光计Lumat LB9507测量细胞裂解物中的相对萤光素酶活性，从而鉴定出增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。因为荧光素酶的活性和荧光素酶的表达量成正比，测定荧光素酶的活性变化可以同时反应其表达量的变化。

进一步，所述步骤1中沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因的最小启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：3所示。

进一步，所述步骤1中克隆所用的引物对序列如SEQ.ID.NO：4和SEQ.ID.NO：5所示；PCR克隆的反应条件为：95℃ 2min；35个循环的95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min；72℃5min。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

1、本发明利用的沙门氏菌SspH1基因的最小启动子，在大肠杆菌中依然保持活性，是一个有普遍活性的启动子，有潜力应用到其它不同种的原核细菌中。

2、谷胱甘肽S转移酶(GST)是一个含有211个氨基酸的蛋白，是最常用的蛋白表达的稳定多肽，但对不同目标蛋白效果差异大。本发明鉴定出的SspH1前导稳定元件可以提供一个新的选择，以获得理想的活性蛋白的表达。

3、本发明得到的前导稳定元件能显著增强外源蛋白(荧光素酶)在细菌中的表达和活性，可以在工业界或科研中把它用作一个提升蛋白产量和蛋白活力的工具，有助于科学研究和生物医药工业生产以及抗传染病疫苗制备。

附图说明

图1为SspH1基因的最小启动子DNA序列和SspH1蛋白N端208个氨基酸的编码DNA序列。TS表示潜在转录起始位点。

图2为SspH1蛋白N端208个氨基酸序列。

图3为实施例构建的不同重组质粒的结构图，箭头代表转录起始位点和方向。

图4为实施例构建的不同重组质粒中荧光素酶的活性，图中*代表P<0.01。

具体实施方式

下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

因为荧光素酶的活性和荧光素酶的表达量成正比，测定荧光素酶的活性变化可以同时反应其表达量的变化，因此下列实施例通过测荧光素酶的活性来展现其在大肠杆菌中的活性与表达。

实施例

增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件的鉴定：

1、克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1的最小启动子(SEQ.ID.NO：3)和SspH1蛋白N端208个氨基酸残基的编码序列(共计889个核苷酸序列，见图1所示)；

根据沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672染色体序列(GenBank序列号：CP047323.1)中的SspH1基因编码区设计引物对pSspH1-265-F/pSspH1-R2，用引物对pSspH1-265-F/pSspH1-R2，细菌基因组DNA和高保真Tag DNA聚合酶建立聚合酶链式反应(PCR)，反应条件为95℃ 2min，然后是35个循环的95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min；最后是72℃ 5min。PCR产生的0.9kb DNA条带用琼脂糖凝胶电泳纯化。

引物序列如下：(下划线为酶切位点)

pSspH1-265-F(SEQ.ID.NO：4)：

5’-GGCCTCGAGCCATCAGGGAAAAATGTGCT-3’

pSspH1-R2(SEQ.ID.NO：5)：

5’-GGCGCGGCCGCGGTAAGACCTGACGCTCCC-3’

2、将步骤1纯化得到的PCR产物通过XhoI/NotI限制酶酶切连接到限制酶(XhoI/NotI)酶切位点修饰过的pGL3-Basic质粒(Promega Inc.)(图3)的荧光素酶编码区上游，使SspH1蛋白的N端208个氨基酸残基的编码序列(SspH1-T3SS区)与荧光素酶编码序列同框，得到能表达融合蛋白的重组质粒pGL3-psspH1-265-T3SS(图3)；质粒pGL3-psspH1-265、pGL3-Basic作为对照；

3、将上述3中质粒转染进大肠杆菌E.coli C2566中，在LB肉汤培养基中摇荡培养12小时后，收集细菌，裂解后用发光计Lumat LB9507(EG&G Berthold，Bad Wildbad，德国)测量检测相对荧光素酶的活性。每个载体检测3次，计算3次重复的平均值±标准偏差。

从图4可以得出，在载体pGL3-Basic中相对荧光素酶活性几乎为0，而在重组载体pGL3-psspH1-265中相对荧光素酶的活性很高，表明来自沙门氏菌的启动子在大肠杆菌中依然表现很强的活性。此外，重组载体pGL3-psspH1-265-T3SS中荧光素酶的活性显著高于重组载体pGL3-psspH1-265和载体pGL3-Basic中的荧光素酶的活性，表明SspH1蛋白N-端208个氨基酸序列可以做为前导稳定元件，通过与目标蛋白的融合增强外源蛋白在大肠杆菌中的表达。

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtttaata tccgcaatac acaaccttct gtaagtatgc aggctattgc tggtgcagcg 60

gcaccagagg catctccgga agaaattgta tgggaaaaaa ttcaggtttt tttcccgcag 120

gaaaattacg aagaagcgca acagtgtctc gctgaacttt gccatccggc ccggggaatg 180

ttgcctgatc atatcagcag ccagtttgcg cgtttaaaag cgcttacctt ccccgcgtgg 240

gaggagaata ttcagtgtaa cagggatggt ataaatcagt tttgtattct ggatgcaggc 300

agcaaggaga tattgtcaat cactcttgat gatgccggga actataccgt gaattgtcag 360

gggtacagtg aagcacatga cttcatcatg gacacagaac cgggagagga atgcacagaa 420

ttcgcggagg gggcatccgg gacatccctc cgccctgcca caacggtttc acagaaggca 480

gcagagtatg atgctgtctg gtcaaaatgg gaaagggatg caccagcagg agagtcaccc 540

ggccgcgcag cagtggtaca ggaaatgcgt gattgcctga ataacggcaa tccagtgctt 600

aacgtgggag cgtcaggtct tacc 624

<210> 2

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Asn Ile Arg Asn Thr Gln Pro Ser Val Ser Met Gln Ala Ile

1 5 10 15

Ala Gly Ala Ala Ala Pro Glu Ala Ser Pro Glu Glu Ile Val Trp Glu

20 25 30

Lys Ile Gln Val Phe Phe Pro Gln Glu Asn Tyr Glu Glu Ala Gln Gln

35 40 45

Cys Leu Ala Glu Leu Cys His Pro Ala Arg Gly Met Leu Pro Asp His

50 55 60

Ile Ser Ser Gln Phe Ala Arg Leu Lys Ala Leu Thr Phe Pro Ala Trp

65 70 75 80

Glu Glu Asn Ile Gln Cys Asn Arg Asp Gly Ile Asn Gln Phe Cys Ile

85 90 95

Leu Asp Ala Gly Ser Lys Glu Ile Leu Ser Ile Thr Leu Asp Asp Ala

100 105 110

Gly Asn Tyr Thr Val Asn Cys Gln Gly Tyr Ser Glu Ala His Asp Phe

115 120 125

Ile Met Asp Thr Glu Pro Gly Glu Glu Cys Thr Glu Phe Ala Glu Gly

130 135 140

Ala Ser Gly Thr Ser Leu Arg Pro Ala Thr Thr Val Ser Gln Lys Ala

145 150 155 160

Ala Glu Tyr Asp Ala Val Trp Ser Lys Trp Glu Arg Asp Ala Pro Ala

165 170 175

Gly Glu Ser Pro Gly Arg Ala Ala Val Val Gln Glu Met Arg Asp Cys

180 185 190

Leu Asn Asn Gly Asn Pro Val Leu Asn Val Gly Ala Ser Gly Leu Thr

195 200 205

<210> 3

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatcaggga aaaatgtgct gtggccggac gccgatggaa acgttacttg atggaaaacg 60

catctggtct gagaagaatt taagccagat gtaatctgac agatacctgt ataaataacc 120

ggtaactgtc agatcaggtc tgagctaata caactaattg tatgttattt gtcgtttatt 180

gctaaatata tatcgttaat tgaaggcttg atgcgtgtgt ctgcgttaat ctcttttcat 240

tgtgctgtaa attaggcagt ggaat 265

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcctcgagc catcagggaa aaatgtgct 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcgcggccg cggtaagacc tgacgctccc 30

Claims

1.一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件，其特征在于：所述前导稳定元件为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672(Salmonella entericasubsp.enterica serovar Typhimurium strain RM13672)SspH1基因的最小启动子和SspH1蛋白N端的208个氨基酸残基的编码序列，所述最小启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，所述编码序列包含可变N端区域，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述细菌为大肠杆菌，且所述编码序列与外源蛋白编码序列同框。

2.一种权利要求1所述的增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，PCR克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因的最小启动子和SspH1蛋白N端208个氨基酸残基的编码序列；

步骤2，将步骤1克隆得到的SspH1的最小启动子和其N端208个氨基酸残基的编码序列通过XhoI/NotI限制酶酶切连接到酶切位点修饰过的pGL3-Basic质粒的荧光素酶编码区上游，得到重组质粒；

步骤3，将得到的重组质粒转染到大肠杆菌E.coli C2566中，在LB肉汤培养基中培养12个小时，收获细胞并裂解，使用发光计Lumat LB9507测量细胞裂解物中的相对萤光素酶活性，从而鉴定出增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。

3.根据权利要求2所述的一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件的鉴定方法，其特征在于：所述步骤1中沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因的最小启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求2所述的一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件的鉴定方法，其特征在于：所述步骤1中克隆所用的引物对序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；PCR克隆的反应条件为：95℃2min；35个循环的95℃30sec，55℃30sec，72℃1min；72℃5min。