WO2004016792A1 - 低温での組み換えタンパク質の発現に適した新規発現ベクター - Google Patents

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WO2004016792A1
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protein
gene
rhodococcus
ptip
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Nobutaka Nakashima
Tomohiro Tamura
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present invention relates to an expression vector capable of inducing and expressing a foreign gene in Rhodococcus bacteria.
  • the present invention relates to an inducible expression vector capable of expressing a recombinant protein in a host cell at a low temperature, and a method for expressing a recombinant protein at a low temperature using the vector. Furthermore, the present invention is capable of inducing the expression of a gene encoding a protein whose expression product inhibits the growth of a host cell in a medium of the genus Rhodococcus capable of growing under low-temperature conditions at medium-to-high temperature conditions exceeding about 15 ° C.
  • An inducible expression vector for Rhodococcus bacteria and a recombinant containing Rhodococcus containing the vector, whose expression product inhibits host cell growth under medium and high temperature conditions above about 15 ° C using Rhodococcus bacteria The present invention relates to a method for expressing a protein at a low temperature.
  • Escherichia coli is widely used for mass production of eukaryotic proteins as recombinants (We ickert et al., Curr. Op in. Biotechnol. 7 494). -499 (1996), Baneyx, Curr.Opin.Biotechnol. 10 411-421 (1999))
  • Escherichia coli is a mesophilic bacterium that grows from 18 ° C to 37 ° C, but is used to express recombinant protein.
  • the culture temperature must also be within the above temperature range.
  • eukaryotic proteins also show their activity within the same temperature range, so that some proteins, when expressed recombinantly in E. coli, inhibit the growth of E. coli, As a result, significant amounts of recombinant protein may not be obtained.
  • the optimal temperature for production is about 30 ° C, and the minimum temperature is about 15 ° C (Brock et al.).
  • J. Membr. Biol. 180 147-161 (2001), Sarramegna et al., Prote in Expr. Purif. 24 212-220 (2002)) 0, that is, the preferred growth temperature range of insect cells Si9 is It is about 18 ° C or higher, and the preferred growth temperature range for yeast is about 15 ° C or higher.
  • some proteins are modified with sugar chains and the like, which may be inconvenient for subsequent functional analysis such as three-dimensional structure analysis.
  • An object of the present invention is to express a protein that cannot be expressed by other recombinant protein expression systems such as Escherichia coli.
  • an object of the present invention is to express a protein that cannot be expressed in a transformed host cell such as Escherichia coli at a low temperature under medium and high temperature conditions exceeding 15 ° C.
  • Another object of the present invention is to induce and express a foreign recombinant protein using a bacterium belonging to the genus hodococcus.
  • the recombinant protein at a minimum temperature of 15 ° C to 18 ° C or lower, preferably around 4 ° C, which is the lowest temperature at which the recombinant protein can be expressed using a known host cell. .
  • a minimum temperature of 15 ° C to 18 ° C or lower preferably around 4 ° C, which is the lowest temperature at which the recombinant protein can be expressed using a known host cell.
  • An expression system using a bacterium that can grow at a low temperature of 15 ° C or less, especially around 4 ° C may be used.
  • the present inventors have constructed such an inducible expression vector that uses a bacterium of the genus Rhodococcus as a host to express a foreign protein in a wide temperature range (around 4 ° C to 32 ° C). Tried to solve.
  • Rhodococcus erythropol is CLarkin et al., Antonie van Leeuwenhoek 74 133-153 (1998)) is an actinomycete that grows in a wide temperature range from 4 ° C to 35 ° C.
  • An autonomously replicable composite vector (De Mot et al., Microbiology 143 3137-3147 (1997)) has also been developed, and genetic engineering research is easy.
  • Streptomyces coel icolor like Rhodococcus erythropolis, is an actin II, and a series of genes whose expression is induced by the addition of the antibiotic thiostrepton was known (Murakami et al., J. Biol. Bacterio l. 171 1459-1466 (1989)).
  • the TipA gene encodes a protein consisting of 253 amino acids, and this TipA protein covalently binds to tiostreptone, acts as a TipA-thiostrepton complex in its own promoter region, and has its own structural gene. It is known to strongly promote transcription from E. coli (Holmes et al., EMBO J. ⁇ 3183-3191 (1993),
  • This vector can be constructed by constructing a vector into which a gene group in which the structural gene of the target protein is linked downstream of the TipA structural gene and the IMJt gene promoter is introduced. Like Streptomyces bacterium, it is thought that it can be an inducible expression vector, but there was no report. ,
  • the recombinant protein can be produced at a low temperature of about 15 ° C or less, particularly at 4 ° C, not only will it produce a protein that inhibits the growth of the host, but it will also have the following advantages.
  • psychrophilic bacteria which have a preferred growth temperature range of 20 ° C or less
  • psychrotrophic animals that survive in a low-temperature environment and proteins derived from plants that survive in a low-temperature environment have low temperatures of about 15 ° C or less, especially 4 ° C. Production at around ° C is considered preferable. This is because these proteins may not be expressed as active proteins at high temperatures.
  • -amylase derived from psychrophilic bacteria using psychrophilic bacteria as a host Tutino at al., Extremopiles 5 257-264 (2001)). It is considered difficult to mass-produce quickly instead of the vector.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the construction of an expression vector capable of inducing expression of a foreign protein in a bacterium belonging to the genus Rhodococcus and an expression vector capable of inducing expression of a foreign protein at a low temperature of about 15 ° C or less. Was completed.
  • the present invention is as follows.
  • An expression vector capable of inducing and expressing a foreign gene in a host cell with an inducer, wherein the expression vector can be expressed at a temperature lower than a suitable growth temperature range of a host other than the host.
  • An expression vector capable of inducing expression of a foreign gene in a host cell with an inducer An expression vector that can be expressed at a temperature of 15 ° C or lower.
  • Rhodococcus is selected from the group consisting of R. erythropolis ⁇ R. fascians and R. opacus.
  • An expression vector according to any of (1) to (7) including a promoter sequence whose expression can be regulated by an inducer and a multicloning site into which a foreign gene can be introduced.
  • a gene encoding a protein that inhibits the growth of the host cell when expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host cell may be used in a suitable growth temperature range lower than the preferred growth temperature range of the host cell.
  • An inducible expression vector that can be induced and expressed by an inducer in other host cells may be used in a suitable growth temperature range lower than the preferred growth temperature range of the host cell.
  • (22) TipA gene promoter sequence, an expression cassette containing the first multi-cloning site capable of introducing a foreign gene and a transcription termination sequence, an induction cassette containing the second promoter sequence and the TiM gene, a plasmid for Rhodococcus bacteria.
  • Rhodococcus bacteria capable of inducing expression of a gene encoding a protein whose expression product inhibits the growth of host cells under medium-temperature conditions exceeding 15 ° C in Rhodococcus bacteria capable of growing under low-temperature conditions Type expression vector.
  • TipA gene promoter sequence an expression cassette containing the first multiple cloning site capable of introducing a foreign gene and a transcription termination sequence, a second promoter sequence and an induction cassette containing the TipA gene, a plasmid for Rhodococcus bacteria.
  • An inducible expression vector for a Rhodococcus bacterium capable of inducibly expressing a foreign gene containing a DNA region essential for autonomous replication and a thiostrepton resistance gene in a Rhodococcus bacterium capable of growing under low-temperature conditions.
  • the TipA gene promoter is the TipA-LG10 promoter (26) Or (27) an inducible expression vector for Rhodococcus bacteria.
  • PTip-NH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • pTip-CH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 108
  • pTip-CH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 109
  • SEQ ID NO: 110 PTip-LNH1 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 111
  • pTip-LNH2 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 111
  • pTip-LCHK having the base sequence represented by SEQ ID NO: 112
  • Rhodococcus genus bacterium according to any of (25) to (29), wherein the Rhodococcus genus Itoda is selected from the group consisting of R. erythropolis, R. fascians and opacus.
  • a transformant of the genus Rhodococcus comprising the inducible expression vector for the bacterium of the genus Rhodococcus according to any one of (25) to (30).
  • the protein that is difficult to express at medium and high temperatures exceeding 15 ° C is a protein that forms an inactive inclusion body when expressed at medium and high temperatures exceeding 15 ° C in Escherichia coli.
  • Rhodococcus bacteria of any of (25) to (30) containing a gene encoding a protein derived from a psychrophilic bacterium or an animal or plant that survives in a low-temperature environment. Induced for Rhodococcus spp.
  • a medium containing thiostrepton under low temperature conditions
  • a method for producing a protein derived from an animal or a plant living in a psychrophilic bacterium or a low-temperature environment at a low temperature comprising culturing a bacterium into which a type expression vector is introduced.
  • the protein that is difficult to express at medium and high temperatures exceeding 15 ° C is a protein that inhibits the growth of host cells under medium and high temperature conditions above 15 ° C.
  • Proteins that are difficult to express at medium and high temperatures exceeding 15 ° C are proteins that inhibit the growth of host cells under medium and high temperature conditions above 15 ° C. A method for screening proteins that are difficult to express at medium and high temperatures.
  • the expression vector of the present invention is a vector that is capable of autonomous replication in a cell that can grow at low temperature and is capable of inducibly expressing a foreign gene integrated in the vector, that is, an inducible expression vector. .
  • the cells that can grow at low temperatures are not limited, and any microorganisms such as Escherichia coli and yeast, insect cells, mammalian cells, and the like can be used as long as they can grow at low temperatures.
  • Bacteria belonging to the genus Rhodococcus preferably R. erythropolis, R. fascians, R. opacus, etc., are mentioned in that they can surely grow at low temperatures.
  • R. erythropolis has the highest growth rate at 4 ° C and the other two are inferior.
  • the cells in the production of a protein using the vector of the present invention, after the cells are grown at a temperature suitable for growth, the cells can be transferred to a low temperature and inducibly expressed to produce the protein. Therefore, as long as the recombinant foreign protein can be expressed and produced in step 4, the growth rate does not matter, and all species belonging to the three species of Rtiodococcus, R. erythropol is, R. fasci ans, and R. opacus, are suitable. Can be used.
  • the low temperature refers to a temperature lower than the optimal growth temperature of normal bacteria, and refers to a temperature around 4 ° C to 18 ° C, preferably 4 ° C to 15 ° C, and particularly preferably around 4 ° C.
  • the preferred growth temperature range for normal bacteria varies depending on the type of bacteria, but is from about 15 ° C to about 40 ° C or from about 18 ° C to about 40 ° C, and in this specification, a temperature exceeding about 15 ° C. Is called medium-high temperature.
  • a foreign gene is a gene that encodes a target protein to be expressed and produced using the vector of the present invention, and refers to a gene that encodes a protein derived from an organism other than a host cell.
  • the foreign gene to be incorporated into the vector of the present invention is a gene that encodes a protein that is difficult or impossible to express at a medium / high temperature exceeding about 15 ° C.
  • a protein that is difficult or impossible to express at medium and high temperatures above about 15 ° C refers to a protein with low expression efficiency or no expression at all even when trying to express at medium and high temperatures above about 15 ° C. .
  • Such a protein cannot be expressed at a temperature within the optimal growth temperature range of the host cell, but can be expressed at a temperature lower than the temperature within the preferred growth temperature range of the microorganism when the same or a different kind of host cell is used. When expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host microorganism.
  • Proteins that are lethal to the host cells but are not lethal to host cells at temperatures below the preferred growth temperature range for the same or different types of host cells expressed at temperatures within the preferred growth temperature range for the host cells
  • a protein that inhibits the growth of the host cell when allowed to grow, but does not inhibit the growth of the host cell at temperatures below the preferred growth temperature range for the same or a different type of host cell, the preferred growth temperature of the host cell When expressed at a temperature in the range, it produces an inactive protein aggregate called an inclusion body, but is expressed in those host cells at a temperature lower than the preferred growth temperature range for the same or different host cells.
  • a protein that becomes an active soluble protein when allowed to grow, a psychrophilic bacterium with a preferred growth temperature range of 20 ° C or less, and a thermophilic animal that survives in a cold environment include genes encoding a protein such as derived from plants surviving a low-temperature environment.
  • E. coli which is commonly used for the expression and production of recombinant proteins
  • E. coli in the preferred growth temperature range of 18 ° C to 37 ° C or it is lethal to E. coli.
  • a gene encoding a protein that inhibits the growth of Escherichia coli or forms an inactive inclusion body by aggregating in Escherichia coli is introduced into Rhodococcus erythropolis to transform Rhodococcus erythropolis at a low temperature of 4 ° C to 18 ° C.
  • the protein can be efficiently produced in large quantities.
  • Rhodococcus erythropolis when an attempt is made to express at a temperature exceeding about 15 using Rhodococcus erythropolis, a protein which cannot be expressed, is lethal to Rhodococcus erythropolis, or inhibits the growth of Rhodococcus erythropolis, is obtained. Even when grown at a low temperature of 4 ° C to 15 ° C using Rhodococcus erythropolis, the protein can be efficiently produced in large quantities.
  • proteins that inhibit host cell growth under medium and high temperature conditions above about 15 ° C
  • the protein is not limited, and examples thereof include proteins described in Examples described later.
  • the genes encoding these proteins may include a multiple cloning site downstream of the promoter described below, and incorporate the gene encoding the site.
  • the vector capable of inducibly expressing a foreign gene refers to a vector that is capable of inducing the expression of a foreign gene incorporated by performing a certain treatment.
  • an inducible expression vector can be constructed by incorporating a promoter capable of inducing expression with a specific regulatory substance into the vector.
  • a promoter include a promoter specifically induced by introducing a drug as an inducer into a culture medium of a host cell, and include, for example, a TipA gene promoter which is a thiostrepton inducible promoter.
  • the host cells into which the vector incorporating such an inducible promoter has been introduced are grown sufficiently at a temperature suitable for cell growth of 15 ° C to 18 ° C or higher, an agent that induces protein expression is added. By doing so, the target protein can be expressed in a large amount. Further, an appropriate promoter such as a TipA gene encoding the TipA protein, and a ThcA gene promoter for inducing the expression of the TipA gene may be incorporated.
  • the host cell is a bacterium belonging to the genus Rhodococcus, the bacterium is susceptible to thiostrepton, and thus a thiostrepton resistance gene or the like that confers resistance to thiostrepton is incorporated.
  • the expression vector of the present invention may contain a drug resistance gene.
  • the vector may be a composite vector (shuttle vector) so as to be compatible with a plurality of host cells.
  • a vector that can be introduced into both Escherichia coli and bacteria belonging to the genus Rhodococcus and that can express a foreign gene in these host cells can be mentioned.
  • it is necessary to incorporate a DNA region essential for autonomous replication of the plasmid in each host cell.
  • the E1 sequence is a DNA region essential for autonomous replication of a plasmid for Escherichia coli
  • RepA is a DNA region essential for autonomous replication of a plasmid for bacteria belonging to the genus Rhodococcus.
  • a gene may be incorporated.
  • Such a complex vector can be replicated in large quantities using Escherichia coli.
  • the expression vector of the present invention comprises a DNA sequence having at least a first promoter activity. Row, containing the first multicloning site for integration of the foreign gene. Further, it contains a ⁇ A region essential for autonomous replication of the first plasmid, a first drug resistance gene, a foreign gene linked to a first multicloning site, and a first transcription termination sequence.
  • the DNA sequence having the first promoter activity includes the TipA gene promoter.When the ⁇ gene promoter is included, the TipA gene and the second promoter sequence such as the ThcA gene promoter for expressing the TipA gene, the TipA gene It includes a second downstream transcription termination sequence.
  • the ⁇ ⁇ gene promoter may be a modified version of its sequence, such as the TipA-LG10 promoter.
  • the host cell is a Rhodococcus genus bacterium and contains a TipA gene promoter-inducible expression system, it further contains a thiostrepton resistance gene in order to confer Rhodococcus bacterium resistance to thiostrepton. Yes, there is a point.
  • the DNA sequence having the promoter activity, the foreign gene and the transcription termination sequence constitute an expression set (Expression cassette), and the TipA gene and the promoter for TipA gene expression constitute an induction cassette (Inducer cassette).
  • the expression vector for a bacterium belonging to the genus Rhodococcus of the present invention can express the protein not only at a low temperature but also at a high temperature of more than 15 ° C as long as the protein itself can be expressed at a high temperature of more than 15 ° C.
  • Examples of the expression vector of the present invention include the pTip vector described in FIG. 9 and pTip-NH1, pTip-NH2, pTip-CH1, pTi-CH2, T i-LNH LT i -LNH2. There are pT i -LCH1 and pTip-LCH2.
  • the sequences of the pTip-NH1, pTip-NH2, pTip-CHK pTip-CH2, pTip-LNHL pTip-LNH2 pTip-LCH1 and pTip_LCH2 vectors are shown in SEQ ID NOs: 106 to 113, respectively.
  • the reading frame following the II site of the multiple cloning site matches the reading frame of a commercially available pET vector (Novagen).
  • PTip-CHl K pTip-CH2.
  • the vector of the present invention can be easily constructed according to the description in the Examples below and the vector construction diagrams in FIGS. 1 to 8.
  • Expression using the expression vector of the present invention at medium to high temperatures exceeding about 15 ° C is difficult. Difficult or impossible proteins can be produced. Such proteins cannot be expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host cell, but when the same or a different type of host cell is used, the protein may be expressed at a temperature lower than the temperature within the preferred growth temperature range of the cell.
  • Proteins that are not lethal to those host cells inhibit the growth of the host cells when expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host cells, but are less than the optimal temperature of the same or different host cells. Proteins that do not inhibit the growth of their host cells at low temperatures, inactive proteins called inclusion bodies when expressed at temperatures within the preferred growth temperature range of the host cells A protein that forms an aggregate but becomes an active soluble protein when expressed in those host cells at a temperature lower than the optimal temperature of the same or a different type of host cell. Examples include a psychrophilic bacterium, a thermophilic animal living in a low-temperature environment, and a plant-derived protein living in a low-temperature environment.
  • the host cell must be a cell that can grow at a low temperature, and includes bacteria belonging to the genus Rhodococcus, preferably R. erytotropis, R. fascians, R. opacus and the like.
  • These cells can grow at low temperatures, but the preferred temperature for growth is 15 ° C or higher, the more preferable temperature is 18 ° C or higher, and the most preferable temperature is about
  • the cells are grown sufficiently at a temperature suitable for growth, and then the protein is expressed using a suitable drug using the function of the inducible promoter contained in the transfer vector under low-temperature conditions. Can be done.
  • thiostrepton may be added so as to have a final concentration of at least 0.1 g / ml, preferably at least 1 / g / ml. However, if it exceeds 10 g / ml, the growth will be poor.
  • the vectors of the present invention can be used to screen for proteins that are difficult or impossible to express at moderate to high temperatures above about 15 ° C. like this
  • When expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host cell it is lethal to the host cell, but at a temperature lower than the preferred growth temperature range of the same or a different type of host cell, the host cell is not used.
  • Proteins that are not lethal to cells, which inhibit the growth of the host cell when expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host cell but which are less than the optimal temperature of the same or a different type of host cell A protein that does not inhibit the growth of host cells, and that when expressed at a temperature within the preferred growth temperature range for host cells, aggregates inactive proteins called inclusion bodies. Proteins which are produced but which become active, soluble proteins when expressed in those host cells at a temperature lower than the optimal temperature of the same or different types of host cells are included.
  • poly (A) ⁇ RNA is extracted from an appropriate tissue of an appropriate animal species, a cDNA is synthesized, and inserted into an expression vector.
  • a host cell such as Escherichia coli is transformed using the vector, an expression library is constructed, and the integrated gene is isolated from a clone whose growth is inhibited when grown and expressed at 30 ° C. When expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host cell, it is lethal to the host cell but at a temperature lower than the preferred growth temperature range of the same or a different type of host cell.
  • Rhodococcus erytliropols is transformed with the recombinant expression vector, and is grown and expressed at a low temperature of 4C to 15T, whereby the growth is inhibited.
  • a gene encoding the protein can be screened.
  • Rhodococcus ervthropolis was transformed by incorporating the gene of the cDNA library into the expression vector of the present invention, and Alternatively, select a clone that expresses the integrated gene without inhibiting growth by culturing at a medium / high temperature exceeding about 15 ° C, or incorporate a gene that is expressed when the expression is induced. By selecting a clone, a gene encoding the above protein can be screened.
  • Proteins that are difficult or impossible to express at medium to higher temperatures than about 15 ° C obtained by the screening are also encompassed by the present invention. Examples of such proteins include the proteins described in Examples below.
  • FIG. 1 is a construction diagram of a plasmid pHN136 which is a packbone of an inducible expression vector. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (kilobase pair 1: kb).
  • FIG. 2 is a construction diagram of a plasmid PHN143 having a thiostrepton resistance gene. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. The numbers indicate base pairs (kilobase spares: kb).
  • CIAP means Cali Intestine Alkaline Phosphatase, and Blu. Means blunt end.
  • FIG. 3 is a construction diagram of a plasmid PHN62 having an inducer cassette. The locations of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (kilobase pair-one: kb). Blu. Means Blunt end.
  • FIG. 4 is a construction diagram of a plasmid PHN153 having an express ion cassette. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (7-: kb).
  • CIAP stands for (Cal f Intestine Alkaline Phosphatase; Blu. Means Blunt end).
  • FIG. 5 is a construction diagram of a plasmid PHN169 having a tetracycline resistance gene. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. The numbers indicate base pairs (kilobase spares: kb).
  • CIAP means Cali Intestine Alkaline Phosphatase, Blu. Means blunt end.
  • Figure 6 shows an inducible expression vector plasmid with PIP as the reporter gene. It is a construction drawing of pHN170 and pHN171. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (kilobase pair-one: kb).
  • CIAP means Cal f Intestine Alkaline Phosphatase.
  • Fig. 6 a series of steps are shown in two parts, but there is an overlap between them to make the order of the steps clear.
  • FIG. 7 is a construction diagram of an inducible expression vector plasmid pTip-NHK pTip-CHK pTip-LNHK pTip-LCH1 having a multiple cloning site.
  • the restriction enzyme recognition site and the location of the structural gene are shown in the figure.
  • the numbers indicate base pairs (kilobase pairs: kb).
  • a series of steps are shown in two parts, but there is an overlap between them to make the order of the steps clear.
  • FIG. 8 is a construction diagram of the inducible expression vector plasmids pTip-NH2, pTip-CH2, pTip-LNH2, and pTip-LCH2 having a multiple cloning site.
  • the restriction enzyme recognition site and the location of the structural gene are shown in the figure.
  • the numbers indicate base pairs (kilobase pairs: kb).
  • a series of steps is shown in two parts, but there is an overlap between them to make the order of the steps clear.
  • Figure 9a shows a) map of a) pTip-NHL pTip-CHK pTip-LNHK pTip-LNHK pTip-NH2, pTip_CH2, pTip-LNH2, pTip-LCH2. The function of each region and the plasmid map are shown.
  • FIG. 9 b shows the DNA sequence from the tipA gene promoter sequence of pTip-NH1 and pTip-LNH1 or the sequence of the TipA-LGlQ promoter to the multicloning site and the transcription termination sequence of the TiicA gene.
  • FIG. 9 c shows the DNA sequence from c) TipA gene promoter sequence or TipA-LGlQ promoter sequence of pTip-CHK pTip-LCH1 to the multiple cloning site and the ThcA gene transcription termination sequence.
  • FIG. 9 d shows d) the DNA sequence from the TipA gene promoter sequence of pTip-NH2 or pTip-LNH2, or the sequence of the TipA-LGlQ promoter to the multiple cloning site and the ThcA gene transcription termination sequence.
  • Figure 9e shows e) the TipA gene promoter sequence of pTip-CH2, pTip-LCH, or
  • the DNA sequence from the TipA-LGlQ promoter sequence to the multiple cloning site and the ThcA gene transcription termination sequence is shown.
  • Figure 10 shows the pine trees of Tip-CH1, pTip-LCH1, Tip-CH2.1 and Tip-LCH2.1.
  • FIG. 11 is a construction diagram of control plasmids ⁇ 172 and ⁇ 3 for measuring PIP activity. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (kilobase pair: kb).
  • CIAP means Cal Intestine Alkaline Phosphatase. ⁇ has both “Express ion casset tej” and “Inducer casset tej, while PHN173 has only Express ion casset tej and pHN172 does not have both cassets.
  • FIG. 12 shows the results of PIP activity measurement 1 using an inducible expression vector.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of measurement 2a of PIP activity using an inducible expression vector.
  • FIG. 14 is a diagram showing measurement 2b of PIP activity using an inducible expression vector.
  • FIG. 15 shows the results of PIP activity measurement 3 using the inducible expression vector.
  • FIG. 16 is a photograph showing the result of purification 1 of a foreign protein using an inducible expression vector.
  • FIG. 17 is a photograph showing the result of purification 2 of a foreign protein using an inducible expression vector.
  • FIG. 18 is a photograph showing the result of foreign protein purification 3a using an inducible expression vector.
  • FIG. 19 is a view showing the result of purification 3b of a foreign protein using an inducible expression vector.
  • FIG. 20 shows a list of proteins that inhibit the growth of E. coli at 30 ° C.
  • FIG. 21 is a diagram showing expression of a foreign protein using Rhodococcus erythropolis, Escherichia coli as a host.
  • FIG. 22 is a diagram showing a TipA gene promoter sequence.
  • FIG. 23 shows the improvement of the RBS sequence (WT RBS) in the TipA gene promoter to LG10 RBS.
  • Rhodococcus erythropolis and E. coli In order to construct a composite vector of Rhodococcus erythropolis and E. coli, we first searched for a small endogenous plasmid present in Rhodococcus bacteria. The presence of Rhodococcus erythropol is JCM2895 was confirmed. This plasmid was named PRE2895. The following is a specific description of plasmid isolation and its DNA sequencing.
  • Rhodococcus erythropolis washes 895 strains were cultured in 5 ml of LB medium (1% Diico Bacto Tryptone, 0.5% Diico Yeast Extracts 1.0% sodium chloride) at 30 ° C for 30 hours.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) ) was used to purify pRE2895.
  • After suspending in Buffer PI 250 add 51 lysozyme (100 mg / ml) and incubate at 37 ° C for 30 minutes before adding Buffer P2250 ⁇ 1, as described in the instruction manual. Worked.
  • the above DNA sample was treated with a restriction enzyme and subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis (100 V, 30 minutes). As a result, the presence of one DNA fragment of about 5.4 kb was confirmed.
  • the DNA fragment of about 5.4 kb was excised from the gel and purified using a QIAduick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual.
  • the obtained RI fragment was converted into plasmid pBluescript II SK (+) (+) according to a conventional method (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • the plasmid was subcloned into the EcoRI site of STRATAGENE and the plasmid was named pHN79.
  • DNA sequencer ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (manufactured by ABI) was used to determine the base sequence of PHN79 according to the instruction manual. Each of about 400 bases was determined.
  • the DNA region derived from the Rhodococcus erythropolis strain JCM2895 subcloned into HN79 was identical to the 5403 base pair circular DNA, pN30, whose 99.8% sequence was registered in GenBank as accession number AF312210.
  • PN30 is an endogenous plasmid pAL5000 (Rauzer et al., Gene 71315-321 (1988), Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 (1996)) isolated from Mycobacterium fortuitum 002 strain, Rhodococcus erythropol is NI86 / 21.
  • PCR Saiki et al., Science, 239 487-491 (1988)
  • the PCR enzyme used was Pfu turbo (manufactured by STRATAGENE).
  • Pfu turbo manufactured by STRATAGENE
  • Amp f in the drawing E1 sequence region necessary for autonomous replication and in E. coli ampicillin resistance gene (denoted as Amp f in the drawing).
  • This DNA fragment is double-digested with restriction enzyme l and toGI, subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis (100 V, 30 minutes), cut out from the DNA fragment, and subjected to QIAduick Gel Extraction Kit according to the instruction manual. Purified.
  • primers were designed to amplify a region deemed necessary for autonomous replication in Rhodococcus bacteria.
  • the sequence of the same primer is shown by SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing. Plasmid PHN79,
  • PCR amplification using both primers resulted in 1.9 kb amplification.
  • the obtained DNA was obtained.
  • This DNA fragment was double digested with the restriction enzyme lGI and subjected to 1.0 agarose gel electrophoresis (100 V, 30 minutes) to cut out the thigh A fragment and purified in the same manner as described above.
  • the two purified DNA fragments were ligated using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) according to the manufacturer's instructions, and the resulting plasmid was named PHN129.
  • amplification by PCR was performed using PHN129 as a template and the primers of SEQ ID Nos. 5 and 6 in the sequence listing.
  • a 0.5k DNA fragment obtained by double digesting this PCR fragment with Bglll and l was subcloned into pHN129 at the lHI and I sites.
  • the portion linked by Bglll and BamHI was within the open reading frame of the putative RepA gene (hereinafter abbreviated as 0RF), but the lHI recognition site was removed without replacing the encoded amino acid.
  • Ml recognition site was located very close to the IHI recognition site, it was designed so that the l recognition site was removed and the encoded amino acid was not substituted in the primer set forth in SEQ ID NO: 5. Therefore, the l-recognition site has been removed together with the lHI-recognition site.
  • This plasmid was named PHN135.
  • amplification was performed by PCR using plasmid PHN135 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 5 and 6 in the sequence listing.
  • a 0.5 kb DNA fragment obtained by double digestion of this PCR fragment with Pstl and SllHI was subcloned into the PstLBglll site of pHN135.
  • the ⁇ recognition site was removed without replacing the encoded amino acid.
  • the resulting plasmid was named PHN136.
  • the antibiotic tostrepton is used to induce protein expression, but Rhodococcus erythropolis is susceptible to the substance and must be conferred resistance. Therefore, the streptomycin resistance gene of Streptomyces azureus, Gene (Bibb et al., Mol. Gen. 'Genet. 199 26-36 (1985)):
  • genomic DNA of Streptomyces azureus JCM421 7 strain used as a PCR template was prepared as follows. In 5 ml of SB medium (1% Difco Bacto Tryptone, 0.5% Difco Yeast Ext ract, 0.5% sodium chloride, 0.1% Glucose, 5mM magnesium chloride, 0.5% glycine) 30 The same strain cultured at ° C was suspended in 500 1 of a SET buffer (75 mM sodium chloride, 25 mM EDTA (pH 8.0), 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ").
  • SB medium 1% Difco Bacto Tryptone, 0.5% Difco Yeast Ext ract, 0.5% sodium chloride, 0.1% Glucose, 5mM magnesium chloride, 0.5% glycine
  • Amplification by PCR was performed using the genome ⁇ A of Streptomyces azureus JCM4217 strain purified as described above as a template and the primers of SEQ ID NOS: 7 and 8 in the sequence listing. As a result, a 1.1-kb amplified DNA containing the thiostrepton resistance gene was obtained. Since this DNA fragment used platinum Pix DNA polymerase (manufactured by Gibco BRL), its ends were blunt. This DNA fragment was purified, and the 5'-terminal was T4_poly according to a standard method (Sambrook et al., Molecular Cloning: aboratory manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • Platinum Pix DNA polymerase was used for this PCR.
  • a 0.5 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with RI was purified, and the 5 'end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • T4-polynucleotide kinase As a result of subcloning these two PCR fragments into the Hindi II and EcoRI sites of plasmid pGEM-3 ⁇ +) at the same time, the part where the blunt ends were linked together is the ORF of the gene, but the encoded amino acid is The l recognition site was removed without replacement.
  • This plasmid was named PHN143.
  • TipA protein must be present in Rhodococcus bacteria in order to induce inducible expression with thostrepton.
  • a constitutive promoter was isolated from Rhodococcus erythropolis, and a structural gene encoding TipA protein was ligated downstream (Fig. 3).
  • the constitutively functioning promoter is the promoter-sequence of the ThcA gene (Nagy et al., J. Bacteriol. 676-687 (1995)), which encodes an aldehyde dehydrogenase-like protein of Rhodococcus erythropolis. Was used.
  • the genomic DNA of St. reptomyces colicolor A3 (2) strain used as a template was worked and purified in the same manner as when genomic DNA was prepared from St. reptomyces azureus.
  • the genomic DNA of Rhodococcus erythropolis JCM3201 was purified in the same manner as when genomic DNA was prepared from Streptomyces azureus, except that it was cultured in 5 ml of LB medium.
  • a 0.9 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with ⁇ was purified, and the 5 ′ end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • amplification was performed by PCR using the genomic DNA of the Rhodococcus erythropolis JCM3201 strain purified as described above as a template and the primers of SEQ ID NOS: 15 and 16 in the sequence listing. As a result, it contains the promoter sequence of the A gene (Nagy et al., J. Bacteriol.
  • amplification was performed by PCR using plasmid # 33 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 9 and 17 in the sequence listing.
  • platinum Pfx DNA polymerase was used.
  • a 0.5 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with II was purified, and the 5 ′ end on the blunt end side was further purified by a conventional method.
  • Amplification by PCR was performed.
  • platinum Pix DNA polymerase was used.
  • a 0.6 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with I was purified, and the 5 ′ end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • the portion where the blunt ends were ligated is the ORF of the TipA gene, but the encoded amino acid Should not be replaced In addition, the I (1) recognition site was removed.
  • This plasmid was named PHN50.
  • tel (2) present in pHN33 was removed by PCR using plasmid PHN33 as a template and primers of SEQ ID NOS: 9 and 19 in the sequence listing.
  • platinum-A polymerase was used.
  • a 0.8 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with II was purified, and the 5 'end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • amplification was performed by PCR using plasmid P dish 33 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 20 and 12 in the sequence listing.
  • a proline iminobeptidase derived from Thermoplasma acidophi lum (Tamura et al., FEBS Lett.) was used as a repo overnight gene downstream of the TipA gene promoter. . 398
  • PIP 101-105 (1996): hereinafter, abbreviated as PIP
  • 0RF 0RF in the figure
  • transcription is terminated downstream to suppress transcription readthrough.
  • the sequences were ligated. The details are described below (Fig. 4). .
  • Genomic DNA of the Streptomyces coel icolor A3 (2) strain purified in Amplification by PCR was performed using the primers described in SEQ ID NOS: 21 and 22 in the sequence listing as a plate.
  • an amplified DNA of 0.2 kb containing the promoter sequence of the TipA gene (denoted as TipAp in the figure) was obtained.
  • Platinum Pix DNA polymerase was used for this PCR.
  • This fragment was purified, the 5 'end was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method, and then subcloned into the I site of plasmid pBluescript II SK (+). From the direction of l recognition site- ⁇ gene promoter sequence-Sacl recognition site).
  • This plasmid was named pHN150u.
  • primers represented by SEQ ID NOS: 23 and 24 in the sequence listing were prepared using Plasmid pRSET-PIP (Tamura et al., FEBS Lett. 398 101-105 (1996): hereinafter abbreviated as PIP) as a template.
  • PIP Plasmid pRSET-PIP
  • the primer of SEQ ID NO: 24 in the sequence listing is designed so that the stop codon of the PIP gene is removed and a 6XHis tag is added to the C-terminal of the PIP protein to facilitate protein purification.
  • the 6xHis tag is a contiguous sequence consisting of six consecutive histidine residues, and a protein fused with it has a high affinity for nickel ions and the like.
  • amplification was performed by PCR using the genomic DNA of Rhodococcus erythropolis KM3201 strain purified in Example 4 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 25 and 26 in the sequence listing.
  • DNA containing a transcription termination sequence of the ThcA gene (Nagy et al., J. Bacteriol. ⁇ 7 676-687 (1995): indicated as ALDHt in the figure) was obtained.
  • This 0.2 kb DNA fragment was double-digested with restriction enzymes l and II and subcloned into pHN151u at the I and II sites.
  • a plasmid containing the PIP gene 0RF immediately downstream of the TipA gene promoter sequence and the transcription termination sequence of the ThcA gene immediately downstream thereof was created and named PHN153.
  • Amplification by PCR was performed using the genomic DNA of Streptomyces coelicolor A3 (2) strain purified in Example 4 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 27 and 28 in the sequence listing. As a result, an amplified DNA of 0.2 kb containing the promoter sequence of the Tufl gene (denoted as Tuflp in the figure) was obtained. In this PCR, platinum PixDNA polymerase was used.
  • This fragment was purified, the 5 'end was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method, and then subcloned into the HncII site of plasmid pBluescript II SK (+) (the direction of subcloning was in the 5' direction of the DNA). From the ml recognition site-Tufl gene promoter sequence-EcoRI recognition site). This plasmid was named PHN158.
  • amplification was performed by PCR using plasmid PHN159 as a template and the primers listed in Sequence Listings 31 and 32. This DNA fragment was blunt-ended because Piu turbo DNA polymerase was used. A 0.5k DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with II was purified, and The 5 'end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by the method described above.
  • amplification was performed by PCR using plasmid PHN159 as a template and primers of SEQ ID NOs: 33 and 34 in the sequence listing.
  • amplification was performed by PCR using plasmid PHN159 as a template and primers of SEQ ID NOS: 31 and 35 in the sequence listing.
  • Pfu turbo DNA polymerase was used.
  • a 0.8 k DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with 1 was purified, and the 5 'end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • amplification by PCR was performed using plasmid PHN159 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 36 and 34 in the sequence listing.
  • a 1-kb DNA fragment obtained by digesting P thigh 143 with l was subcloned into the l site of pHN136 (the direction of subcloning was estimated from the 5 'direction of the DNA.
  • the resulting plasmid was named PHN144.
  • PHN152 a 1.1-kb DNA fragment obtained by double digestion of PHN62 with II and l was subcloned into the II and I sites of PHN144.
  • the resulting plasmid was named PHN152.
  • PHN154 a 1.2k DNA fragment obtained by double digestion of PHN153 with lGI and II was subcloned into the PHN152 at the lGI and I sites.
  • the resulting plasmid was named PHN154.
  • a 1.6 kb DNA fragment obtained by double digestion of PHN169 with II and l was subcloned into the bal site of PHN154 (the subcloned direction was from the 5 'direction of the DNA to the tsr gene (F- This is the promoter sequence of the tetracycline resistance gene ORF-ThcA gene.)
  • F- the promoter sequence of the tetracycline resistance gene ORF-ThcA gene.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid PHN170 as a template and primers described in SEQ ID NOS: 21 and 37 in the sequence listing.
  • a hybrid promoter comprising a TipA gene promoter and a ribosome binding site derived from lambda phage gene 10 (hereinafter referred to as TipA-LG10 promoter: indicated as TipA-LGlOp in the figure) was obtained.
  • This 0.2k DNA fragment was double-digested with restriction enzymes GI and l and subcloned into PHN170 at lGI and Ncol sites.
  • FIG. 22 shows the TipA promoter sequence.
  • FIG. 23 shows the improvement of the ribosome binding site (RBS) sequence for the modification of the TipA Promoter to the TipA-LG10 promoter.
  • RBS ribosome binding site
  • the synthetic oligodeoxyliponucleotides described in SEQ ID NOs: 38 and 39 in the sequence listing include sequences that serve as multicloning sites and have mutually complementary sequences. These two were mixed in equimolar amounts, treated at 70 ° C. for 10 minutes, cooled to room temperature over 20 minutes, and double-stranded. As a result, the end is ready to be ligated to the vector double-digested with fel and l, and this double-stranded synthetic DNA (denoted as MCS Linker ⁇ co in the figure) is The site was subcloned. The resulting plasmid was named pTip-NH1.
  • the synthetic oligodeoxyliponucleotides (including a sequence serving as a multicloning site and having sequences complementary to each other) described in SEQ ID NOs: 40 and 41 in the sequence listing are also double-stranded.
  • the synthesized DNA (indicated as MCS Linker CNco in the figure) was subcloned into the I and I sites of ⁇ .
  • the resulting plasmid was named pTip-CHl.
  • Hybrid DNA consisting of a ribosome binding site derived from the tipA gene promoter and lambda phage gene lQ described in Example 7 was double-digested with restriction enzymes lGI and I, and BsrGI and I of Tip-NHl and Tip-CHl were digested. Each site was subcloned. The resulting plasmids were named pTip-LNH1 and pTip-LCH1, respectively. '' (Example 9)
  • Amplification by PCR was performed using plasmid ⁇ as a template and the primers shown in SEQ ID NOS: 21 and 42 in the sequence listing. As a result, DNA containing the TipA gene promoter was obtained. This 0.2 kb DNA fragment was double digested with the restriction enzyme lGI and thigh I, and subcloned into the GI of ⁇ and one site of the thigh. The resulting plus Mid was named HN183.
  • the synthetic oligodeoxyribonucleotides described in SEQ ID NOs: 43 and 4 in the sequence listing include sequences that serve as multiple cloning sites, and have mutually complementary sequences. These two were mixed in equimolar amounts, treated at 70 ° C. for 10 minutes, cooled to room temperature over 20 minutes, and double-stranded. As a result, the end is ready to be ligated to the vector double-digested with Ndel and Spel, and this double-stranded synthetic DNA (denoted as MCS Linker ' ⁇ de in the figure) is Subcloned at the I site. The resulting plasmid was named pTip-NH2.
  • the synthetic oligodeoxyliponucleotides described in SEQ ID NOs: 45 and 46 in the sequence listing are also double-stranded.
  • the synthesized DNA (indicated as MCS Linker CNde in the figure) was subcloned into the fcl and I sites of pHN183. The resulting plasmid was named pTip-CH2.
  • Amplification by PCR was performed using the plasmid pTip-LNH1 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 21 and 47 in the sequence listing.
  • hybrid DNA comprising a TipA gene promoter and a liposome binding site derived from lambda phage genelQ was obtained.
  • This 0.2 kb DNA fragment was double-digested with restriction enzymes GI and Ndel and subcloned into the lGI and Ndel sites of pTip-NH2 and pTip-CH2, respectively.
  • the resulting plasmids were named pTip-LNH2 and pTip-LCH2, respectively.
  • Fig. 9 shows the map of the plasmids prepared in Examples 8 and 9 and the sequence around the multiple cloning site.
  • the solid arrow indicates an inverted repeat sequence present in the ⁇ gene promoter.
  • the hatched arrow indicates the inverted repeat sequence present in the ThcA gene transcription termination sequence.
  • the -10 region, -35 region, and RBS, which are generally present in prokaryotic promoter regions and are important for gene transcription, are boxed. The most important SD sequence among RBS (Shine and Dalgarno, Eur. J. Biochem.
  • Chio thiostrepton induction system in FIG. 9 a comprises Thio r, ALDHp ⁇ TIPA, TipAp, the TipA- LGlOp and ALDHt.
  • TMo 1 "
  • ALDHp indicates a promoter constitutively producing TipA protein, and TipA encodes TipA protein.
  • TipAp indicates the TipA promoter
  • TipA-LGlOp indicates the improved TipA promoter
  • ALDHt indicates the transcription termination sequence.
  • Required areas include ColEl and RepA & B.
  • ColEl is for E. coli and RepA & B is for R. erytliropoUs.
  • Tunp_Tet r and Amp r are included as antibiotic resistance markers. Tuflp- Tet r is. A erythropolis for transformation marker one, Amp r is a transformation marker for E. coli.
  • DNA containing the TipA gene promoter and a multiple cloning site was obtained.
  • This 0.3 kb DNA fragment was double digested with the restriction enzymes BsrGI and l and subcloned into the iGI and I sites of pTip-CH1.
  • the resulting plasmid was named pTip-CH1.1.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid pTip_CH2 as a template and the primers of SEQ ID Nos. 21, 104 in the sequence listing.
  • DNA containing the TipA gene promoter and a multiple cloning site was obtained.
  • This 0.3 kb DNA fragment was double-digested with restriction enzymes lGI and l and subcloned into the GI and Spel sites of pTip-CH1.
  • the resulting plasmid was named pTip-CH2.1.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid pTip-LCH1 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 21 and 104 in the sequence listing.
  • DNA containing the TipA-LG10 promoter and a multiple cloning site was obtained.
  • This 0.3 kb ⁇ A fragment was double-digested with restriction enzymes GI and 1 and subcloned into PTip-CH1 at the lGI and Spel sites.
  • the resulting plasmid was named pTip-LCH1.1.
  • Amplification by PCIM was performed using plasmid pTip_LCH2 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 21 and 104 in the sequence listing.
  • DNA containing the TipA-LGlQ promoter and a multicloning site was obtained.
  • This 0.3k DNA fragment was double digested with the restriction enzymes GI and l and subcloned into the lGI and I sites of pTip_CHl.
  • the resulting plasmid was named pTip-LCH2.1.
  • a 1.6k DNA fragment obtained by double digestion of PHN169 with II and l was subcloned into the al site of pHN144 (the direction of subcloning was from the 5 'direction of the DNA in gene 0RF-tetracycline resistance gene 0RF) -Ampicillin resistance gene 0RF).
  • the resulting plasmid was named PHN172.
  • a 1.2k DNA fragment obtained by double digesting PHN153 with GI and 1 was subcloned into the BsrGL Spel site of PHN144.
  • the resulting plasmid was named PHN164.
  • a 1.6k DM fragment obtained by double digestion of PHN169 with II and l was subcloned into the 3 ⁇ 41 site of PHN164 (the subcloned direction was from the 5 'direction of the DNA to the sr gene 0RF-tetracycline). Resistance gene 0RF-ampicillin resistance gene 0RF).
  • the resulting plasmid was named pHN173.
  • PHN170 is the TipA gene promoter, £ I £ 0RF downstream, and further downstream
  • PHN173 has only express ion cassettes and pHN172 does not have both cassets.
  • Rhodococcus erythro oHs JCM3201 strain in 100 ml of LB medium at 30 ° C with shaking until the exponential growth phase. Cool the culture on ice for 30 minutes, centrifuge, and collect the cells. Add 100 ml of ice-cold sterile water to this, mix well, and centrifuge again to collect the cells. To this, add 100 ml of ice-cold 10% glycerin solution, mix well, centrifuge and collect the cells. This washing with ice-cold 10% glycerin solution is repeated once, and the cells are suspended in 5 ml of ice-cold 10% glycerin solution.
  • Each 400 / il was dispensed, flash frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 ° C until use. Remove the cells from -80 ° C, thaw on ice, and place plasmid ⁇ 0, or ⁇ 2, or ⁇ 173 in 3 1 About 300ng each). This mixture of cells and DNA was transferred to an electroporation cuvette (Bio-Rad: 0.2 cm gap cuvette) and pulsed at an electric field strength of 12.5 kV / cm using the company's gene transfer device Gene Pulser II. The controller was set to apply electric pulses with a capacitance of 25 / xF and an external resistance of 400 ⁇ .
  • the mixed solution of the cells and the DNA subjected to the electric pulse treatment was mixed with 1 ml of LB medium, cultured at 30 ° C for 4 hours, and then collected.
  • the gene is incorporated into the constructed expression vector as a reporter gene, and the inducibility and strength of the induction by thiostrepton can be confirmed by measuring the enzyme activity of PIP.
  • the amount of PIP present in the cells can be easily determined by examining the activity of hydrolyzing the artificial substrate H-Pro-j3NA (manufactured by Bachem).
  • Rhodococcus erythropol is JCM32Q1 strain prepared in Example 12 was cultured at 30 in an LB medium containing 8 ig / ml of tetracycline, and the optical density was measured at a wavelength of 600 mn (OD600). When became 0.6, thiostrepton (solvent was dimethyl sulfoxide) was added to a final concentration of 1 g / ml to induce the expression of PIP.
  • PIP activity was quantified by measuring the absorbance at 550 nm (A550) of the red color using an absorption spectrophotometer. The measurement was performed after adding FastGarnet GBCSalt and diluting with sterilized water 6661. At that time, the optical density of the cell was also measured at 550 nm, so the optical density of the cell at 550 nm (OD 550) was measured separately, and the value equivalent to 0.D. 550 used at the time of measurement was A550. The value corrected by subtracting from the value of is set to Ac550.
  • Ac550 A550-OD550XPIP
  • Rhodococcus erythropol is JCM3201 strain prepared in Example 12 was cultured at 30 ° C in an LB medium containing 8 / ml tetracycline. The temperature was lowered to 4 ° C, and the cells were cultured with shaking for 1 hour to acclimate the cells. Thiostrepton was added thereto to a final concentration of 1 g / ml to induce PIP expression. After 40 hours, a part of the culture solution was taken out, and the same experiment as at 30 ° C. was performed.
  • the Rhodococcus erythropolis JCM3201 strain was transformed with ⁇ 0, ⁇ 172, and PHN173, and the PIP activity was measured when PIP was expressed at 30 and 4 ° C., and when PIP was not expressed.
  • Figure 12 shows whether or not thiostrepton at a final concentration of lg / ml was added (+ or-), the activity value, the culture temperature, the amount of culture solution used for activity measurement, the transformed plasmid, and the plasmid The presence or absence (+ or-) of "Casset te" is indicated.
  • Rhodococcus bacteria 2 The PIP activity of cells obtained by transforming the Rhodococcus erythropolis JCM3201 strain prepared in Example 12 with pHN170 and PHN171 was measured according to Example 13.
  • Figure 13 shows the results of measuring PIP activity over time after addition of thiostrepton at a final concentration of 1 g / ml.
  • the figure shows the activity of Rhodococcus erythropolis strain JCM3201 transformed with PHN170 and expressing PIP at 30 ° (:, 4 ° C) over time.
  • the vertical axis in FIG. PIP activity (unit), horizontal axis shows time (minutes) after addition of thiostrepton at a final concentration of 1 ⁇ g / ml “ ⁇ ” at 4 ° C indicates 0.
  • D.600 is 1.0
  • the “mouth” indicates the activity when the expression induction is started when the D.600 is 2.0, and the “ ⁇ ” at 30 ° C indicates that the expression is started when the OD600 is 0.6.
  • the “mouth” indicates the activity when expression induction was started when OD600 was 1.0.
  • Fig. 14 shows the results of measurement by changing the final concentration of added thiostrepton.
  • Rhodococcus erythropolis strain JCM3201 was transformed with ⁇ and measured at 30 ° C. and 4 ° C. while changing the concentration of thiostrepton, which adds the activity when expressing PIP. Show.
  • the vertical axis shows the activity value of PIP (units), and the horizontal axis shows the final concentration (g / ml) of thostrepton added to the medium.
  • the PIP per cell can be as high as 500 to 1000 minutes (about 8 to 16 hours) at 30 ° C and 3000 minutes (50 hours) at 4 ° C.
  • the expression level was shown to reach the maximum.
  • Rhodococcus opacus DSM44193 was transformed with pHN170 in the same manner as in Example 12. As a result, it was possible to transform not only Rhodococcus erythropolis but also Rhodococcus fascians and Rhodococcus opacus by ⁇ . Therefore, it was shown that the autonomous replication origin derived from Rhodococcus erythropolis 895 introduced into PHN170 also functions in Rhodococcus fascians Rhodococcus opacus. In addition, PIP activity was performed using these transformants according to Example 13. The properties were measured.
  • FIG. Fig. 15 shows the results of transforming the hodococcus erythropolis M3201, the Rhodococcus fascians JCM10002 strain, and the hodococcus opacus DSM44193 strain with PHN170.
  • the figure shows whether or not a final concentration of 1 ig / ml of thiostrepton was added (+ or-), the activity value, the culture temperature, the amount of the culture solution used for the activity measurement, and the transformation with HN170.
  • the host is shown.
  • Rhodococcus bacteria transformed with PHN170 when cultured without the addition of thiostrepton, they showed yellow, but when added, they showed red. However, the expression was lower in the Rhodococcus fascians JCM10002 strain and the Rhodococcus opacus DSM44193 strain than in the Rhodococcus erythropolis JCM3201 strain.
  • Rhodococcus erythropolis JCM3201 strain was transformed in the same manner as in Example 12, and PIP was converted to 30 ° C according to Example 13 at 30 ° C. Each was expressed at 4 ° C.
  • thiostrepton at a final concentration of 1 g / ml
  • the cells were recovered over time and PIP was purified.
  • the C-terminal of PIP has a 6XHis tag, and purification was performed using Ni-NTA Superflow (manufactured by Qiagen) according to the instruction manual.
  • the specific purification method is shown below, but the purification was performed at 4 ° C.
  • the cells expressing the protein (20 ml culture solution) were collected, suspended in 1 ml of NT-Buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM sodium chloride, and lmM dithiothreitol). Glass beads (0.105-0.125 mm in diameter) were added. This is Fast-prep FP120
  • the cells were disrupted by reciprocating for 20 seconds at a speed of 6 m / sec (manufactured by SAVANT). 20, Centrifuged at OOOXg, and Ni-NTA Superflow previously equilibrated with NT-Buiier was added to the supernatant to a bed volume of 401. While rotating this for 1 hour, the Ni-NTA Superflow beads were combined with the 6XHis-tagged protein. After washing the beads 4 times with NT-Buffer, the NTE-Bufier (50 mM
  • Tris-HCl pH7.0
  • lOOmM sodium chloride lmM dithiothreitol
  • 400mM The protein with the 6XHis tag was eluted from the beads by three suspensions in midazole.
  • Figure 16 shows the results of subjecting 10 / _U of the above samples to 12% SDS polyacrylamide electrophoresis in a conventional manner.
  • Rhodococcus erythropo lis JCM32Q 1 strain was transformed with ⁇ (expression from the TipA gene promoter overnight: two figures on the left) and pHN171 (TipA-LGlO promoter-expression from the evening: two figures on the right) Then, PIP was expressed at 4 ° C (top two figures) and 30 ° C (bottom two figures). After addition of thiostrepton at a final concentration of 1 g / ml, the cells were recovered over time and purified using Ni-NTA Superflow using a 6XHis tag attached to the C-terminal of PIP.
  • the cells were collected at 0 ° C (leftmost lane), 180 minutes (second lane from the left), 420 minutes (third lane from the left), and 1080 minutes (leftmost).
  • the rightmost lane shows a sample purified from cells cultured without induction (ie, without addition of thiostrepton).
  • the expression from the TipA-LG10 promoter was slightly lower than that from the TipA gene motor, but at 4 ° C, the expression from the TipA-LGlO motor was conversely lower. Expression was higher. The induction of expression was also strictly controlled with the TipA-LGlO promoter.
  • Rhodococcus erythropolis so-called 201 strain was transformed in the same manner as in Example 12, and according to Example 13
  • PIP was expressed at 32 ⁇ , 30 ° C, 15 ° C and 4 ° C, respectively.
  • induction started at 0.3 ° C at 0.6 ° C at 32 ° C for 960 minutes (16 hours).
  • the added chiostrepton has a final concentration of lxg / ml. Purification was performed in the same manner as in Example 16.
  • FIG. 17 shows the results of subjecting 10 l of the above samples to 12% SDS polyacrylamide electrophoresis according to a conventional method.
  • PIP was expressed at 30 ° C (lanes 3 and 4) and 32 ° C (lanes 1 and 2). Purification was performed using Ni-NTA Superflow using the 6XHis tag attached to the C-terminus of PIP.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid pRSET-ATPIP as a template and the primers of SEQ ID Nos. 48 and 49 in the sequence listing.
  • DNA containing a PIP gene derived from Arabidopsis thaliana (Tamura et al., FEBS Lett. 398 101-105 (1996): hereinafter abbreviated as AtPIP) was obtained.
  • the Okb DNA fragment was double-digested with restriction enzymes l and I and subcloned into pTip-CH1 and pTip-LCH1 at the I and II sites, respectively.
  • Amplification by PCR was performed using the primers described in 1. As a result, it contains a gene (abbreviated below) that encodes fluorescent green protein derived from Aeguorea victoria
  • DNA was obtained.
  • the 0.8 kb DNA fragment was double digested with restriction enzymes fiHI and l and subcloned into pTip-NH1 and pTip-LNH1 at the 1 and SnaBI sites, respectively.
  • Plasmids containing the GFP (N-terminal 6X His tag) gene under the control of the gene promoter or TipA-LGlQ promoter were created and named pHN187 and pHN186, respectively.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid GEX-2T (Amersham Bioscience) as a template and the primers of SEQ ID NOS: 52 and 53 in the sequence listing.
  • DNA containing a gene encoding daltathione-S-transferase protein (hereinafter abbreviated as ⁇ 1) was obtained.
  • a 0.7 kb DNA fragment was double digested with restriction enzymes 3 ⁇ 41 and l and subcloned into pTip_NH2 and pTip-LNH2 at the I and Xhol sites, respectively, under the control of the TipA gene promoter or TipA-LGlQ promoter.
  • Plasmids containing the GST gene (having a 6XHis tag at the N-terminus) were created and named pHN282 and PHN283, respectively.
  • Rhodococcus erythropolis JCM3201 strain was transformed in the same manner as in Example 12 using PHN170 (described in Example 7), ⁇ ⁇ (described in Example 7), female 76, frequency 77, ⁇ 187, ⁇ 186, ⁇ 282, ⁇ 283.
  • PIP, AtPIP, GFP, and GST proteins were expressed at 30T and 4 respectively.
  • the added thiostrepton has a final concentration of lg / ml. Purification was performed from a culture solution of 50 ml at 4 ° C and 20 ml at 30 ° C.
  • Figure 18 shows the results of subjecting 10 ⁇ 1 of the above samples to 12% SDS polyacrylamide electrophoresis in a conventional manner.
  • PIP downstream of the TipA gene promoter lanes 1, 9
  • PHN171 lanes 2, 10 downstream of the TipA-LG10 promoter
  • pHN176 AtPIP downstream of the TipA gene promoter: lanes 3, 11
  • PHN177 AtPIP downstream of TipA-LGlQ promoter: lanes 4, 12
  • PHN187 GFP downstream of TipA gene promoter: lanes 5, 13
  • pHN186 pHN186
  • an expression library for Escherichia coli was prepared using mouse liver-derived Poly (A) ⁇ RNA (manufactured by STRATAGENE) . Was built. This will be specifically described below.
  • the expression vector for E. coli used an arabinose inducible vector.
  • a pBAD-Linker was prepared in which a multiple cloning site was modified in order to facilitate introduction of cDNA.
  • the creation process is described below.
  • Equimolar amounts of synthetic oligodeoxyribonucleotides (including cloning sequences consisting of I ⁇ RI, ill, and XhoI recognition sites and having mutually complementary sequences) described in SEQ ID NOs: 54 and 55 in the sequence listing Each was mixed, treated at 70 ° C. for 10 minutes, cooled to room temperature over 20 minutes, and double-stranded.
  • a replica of the agar medium was prepared on a LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin and 0.2% L-arabinose using GenHunter's Easy Transfer Replica Plating Device, and protein expression was induced at 30 ° C. Incubated overnight. As a result, 426 colonies that could grow on a medium without arabinose but could not grow on a medium containing arabinose were selected.
  • the 426 TOP10 transformants were cultured in 1.5 ml of LB medium containing 50 g / ml ampicillin, and the plasmid was separated and purified according to a conventional method.
  • the obtained plasmid was subjected to 1% agarose electrophoresis after double digestion of restriction enzymes RI and I, and the length of the cDNA fragment derived from mouse was estimated.
  • the obtained plasmid was synthesized using a synthetic oligodeoxyliponucleotide represented by SEQ ID NO: 56 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of the mouse-derived cDNA portion was determined using a DNA sequencer-ABI PRISM (R) 3100 Genetic Analyzer. The base was determined.
  • the results are shown in FIG. The figure shows the result of homology search based on the determined DNA sequence using the BLAST program to identify genes.
  • Serum amyloid A Serum amyloid A (Saal)
  • NADH de ydorogenase 1 alpha subcomplex 4 Cytochrome 3 ⁇ 45 like
  • RIKEN1500015G18 RIKEN1500015G18
  • Transferrin, Apol i Sir rotein A-V, Pantoienate kinase 1 ⁇ , Peroxiredoxin 4, IKEN1300017J02 (Transferrin Homo log) were expressed using Rhodococcus erythropolis JCM3201 and E. coli T0P10 as hosts.
  • the following 4 groups and 10 types of proteins were similarly expressed.
  • DNA containing a Saal gene (GenBank accession number M11131) encoding a mouse-derived Serum Amyloid Protein A protein (Meeker et al., Proteins 30 381-387 (1998)) was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzymes 1 and 1 I and subcloned into the fcl and Xhol sites of pTip-LNHl, resulting in a plasmid containing the Saal gene placed under the control of the TipA-LGlO promoter.
  • Named PHN205 Amplification by PCR was performed using plasmid LE20 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 59 and 60 in the sequence listing.
  • DNA containing mouse-derived Saal gene was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzymes I and EMI, and subcloned into the XhoL I site of pBAD / HisA.As a result, a plasmid containing the Saal gene placed under the control of the arabinose-inducible promoter was created, and PHN193 and Named.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid L113 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 61 and 62 in the sequence listing.
  • DNA containing a gene encoding mouse-derived NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4 (Walker et al., J. Mol.
  • DNA containing Cytochrome b51 was obtained. This DNA fragment was digested with restriction enzyme thigh 1 and EcoRI. As a result of double digestion with pTip-LNHl and subcloning into the fcI and RI sites of pTip-LNH1, a plasmid containing the Cytochromel gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter was created, and named PHN208. Amplification by PCR was performed using plasmid L3 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 66 and 65 in the sequence listing. As a result, DNA containing mouse-derived Cytochrome b51 gene was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzymes II and M and subcloned into the PBAD / HisA II and EcoRI sites, resulting in a plasmid containing the Cytochrome b51 gene placed under the control of an arabinose-inducible promoter. , PHN199.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid LE123 as a template and the primers shown in SEQ ID NOs: 67 and 68 in the sequence listing.
  • TLE123 a DNA containing a gene encoding a putative protein of unknown function derived from mouse
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzymes and EcoRI and subcloned into the thigh I and EcoRI sites of pTip-LM1, resulting in a plasmid containing the LE123 gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter. I named it.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid LE123 as a template and primers of SEQ ID NOS: 69 and 68 in the sequence listing. As a result, DNA containing mouse-derived LE123 gene was obtained.
  • This MA fragment was double digested with restriction enzymes and RI, and subcloned into the XhoI and EcoRI sites of PBAD / HisA.As a result, a plasmid containing the LE123 gene placed under the control of the arabinose-inducible promoter was created. Named PHN276.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid LE280 as a template and the primers shown in SEQ ID NOs: 70 and 71 in the sequence listing. As a result,
  • Amplification by PCR was performed using plasmid LE295 as a template and the primers shown in SEQ ID NOs: 73 and 74 in the sequence listing.
  • the gene encoding mouse-derived Apol ipoprotein A-V van der Vliet et al., J. Biol. Chem. 276 44512-44520 (2001): GenBank accession number ## 080434: abbreviated as Apoa5
  • the resulting DNA was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with the restriction enzymes fel and RI, and subcloned into the NcoL EcoRI site of pTip-LNH2.As a result, a plasmid containing the L gene placed under the control of the TipA-LGlO promoter was created. Named. Amplification by PCR was performed using plasmid LE295 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 75 and 74 in the sequence listing. As a result, DNA containing mouse-derived Apoa5 gene was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzyme II and subcloned into the pBAD / HisA II and RI sites, resulting in a plasmid containing the Apoa5 gene placed under the control of the arabinose-inducible promoter. Named PHN281.
  • RT-PCR (Larrick, Trends Biotechnol. JjO 146-152 (1992)) using mouse liver Poly (A) NA and the primers of SEQ ID NOs: 76 and 77 in the sequence listing Amplification was performed.
  • ⁇ -PCR was performed using the STRATAGENE ProSTAR Ultra HF RT-PCR System according to the instruction manual (hereinafter all RT-PCR was performed using the same kit).
  • all RT-PCR was performed using the same kit.
  • mouse-derived Catlieps in D gene (Grusby et al., Nucleic Acids Res. 18 4008 (1990), Babe et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 213-252 (2000) ⁇ GenBank accession number X52886) was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzymes l and I and subcloned into NcoI and 1I sites of Tip-LCH1, resulting in the Catheps in D gene placed under the control of the TiA-LG10 promoter.
  • a plasmid was created and named PHN270.
  • a 1.2 kb DNA fragment obtained by double digestion of PHN270 with Ncol and l was subcloned into the I and I sites of pBAD / HisA.
  • the resulting plasmid was named PHN273.
  • mouse liver Poly (A) NA the sequence of SEQ ID NO: 78, 79 in the sequence listing was used. Amplification by RT-PCR was performed with a primer.
  • Amplification by RT-PCR was performed using mouse liver Poly (A) NA with the primers of SEQ ID NOs: 80 and 81 in the sequence listing.
  • A mouse liver Poly
  • the mouse-derived Kallikrein 6 gene (Evans et al., J. Biol. Chem. 262 8027-8034 (1987), Babe et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews H 213-252 (2000): GenBank accession number ⁇ ) # 010639) was obtained.
  • This MA fragment was double digested with restriction enzyme 1 and subcloned into the pTip-LCH1] ⁇ 1, 1 1 sites, resulting in a plasmid containing the Kallikrein6 gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter.
  • pHN272 A 0.7 kb DNA fragment obtained by double digestion of PHN272 with ⁇ ⁇ ⁇ and I was subcloned into the tel and Ilml sites of pBAD / HisA. The resulting plasmid was named PHN275.
  • Amplification by RT-PCR was performed using mouse liver Poly (A) ⁇ NA and the primers of SEQ ID NOs: 82 and 83 in the sequence listing.
  • A mouse liver Poly
  • SEQ ID NOs: 82 and 83 in the sequence listing.
  • a DNA containing the mouse-derived LSDNAse gene (Baron et al., Gene 215 291-301 (1998): GenBank accession number AF047355) was obtained.
  • This MA fragment was double-digested with restriction enzymes I and II and subcloned into the Ndel and II sites of pTip-LNHl, resulting in a plasmid containing the LSDNAse gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter. Named pHN299.
  • Amplification by RT-PCR was performed using mouse liver Poly (A) NA with the primers of SEQ ID NOs: 84 and 85 in the sequence listing.
  • DNA containing a mouse-derived DLAD gene (Shiokawa and Tanuma, Nucleic Acids Res. 27 4083-4089 (1999): GenBank accession number AF128888) was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzymes I and RI, and subcloned into pTip-LNH2 at the 1 and RI sites.As a result, a plasmid containing the DLAD gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter was created. I named it.
  • Amplification by RT-PCR was performed using mouse liver Poly (A) ⁇ RNA with the primers of SEQ ID NOs: 86 and 87 in the sequence listing.
  • a containing the mouse-derived HMG-1 gene (Pauken et al., Mamin. Genome 591-99 (1994), Lee et al., Gene 225 97-105 (1998): GenBank accession number U00431) was obtained. Obtained.
  • This DNA fragment was double digested with restriction enzymes l and RI and subcloned into the NcoI and EcoRI sites of T1P-LNH2, resulting in a plasmid containing the HMG-1 gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter. It was named PHN285.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid PHN285 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 88 and 87 in the sequence listing.
  • DNA containing mouse-derived HMG-1 gene was obtained.
  • This DNA fragment was double digested with restriction enzymes II and RI, and subcloned into the I and EcoRI sites of PBAD / HisA, resulting in a plasmid containing the HMG-1 gene placed under the control of an arabinose-inducible promoter. , Named PHN305.
  • This raA fragment was double digested with restriction enzymes ⁇ and aiidlll, and subcloned into the NcoL Hindi II site of pTip-LNH2.As a result, a plasmid containing the Kidl gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter was created. I named it. Amplification by RT-PCR was performed using mouse liver Po ( ⁇ ) ⁇ with the primers of SEQ ID Nos. 91 and 92 in the sequence listing. As a result, DNA containing mouse-derived Baxalpha gene (Oltvai et al., Cell 74609-619 (1993), Donnelly et al., Protein Expr. Purif.
  • Amplification by RT-PCR was performed using mouse liver Poly (A) NA with the primers of SEQ ID NOS: 94 and 95 in the sequence listing.
  • DNA containing a mouse-derived Glucokinase gene (Lin et al., Protein Ex. Purif. 169-176 (1990): GenBank accession number BC011139) was obtained.
  • This MA fragment was double digested with restriction enzymes fcl and II and subcloned into the thigh 1 and I sites of pTip-LNH1, resulting in a plasmid containing the Glucokinase gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter overnight. Created and named PHN298.
  • PHN306 a 1.4 kb MA fragment obtained by double digestion of PHN298 with l and 1 ⁇ 1 was subcloned into NcoI and 3 ⁇ 41 sites of pBAD / HisA. The resulting plasmid was named PHN306.
  • Amplification by PCR was performed using pET22b-D immediately 37A with the primers of SEQ ID NOS: 105 and 96 in the sequence listing.
  • DNA containing a gene encoding p37A derived from Drosophilaielanogaster (Holzl et al., J. Cell Biol. 150 119-129 (2000): GenBank accession number AF145312) was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzymes l and II, and subcloned into the Xhol site of pTip-LCH2, resulting in a plasmid containing the 37A gene placed under the control of the TipA-LGlQ promoter. I named it.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid PHN291 as a template and primers of SEQ ID NOs: 97 and 25 in the sequence listing.
  • DNA containing the p37A gene derived from Drosophilamelanogaster was obtained.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzyme l, partially digested with Ncol (do not cut with I inside P37A), and subcloned into pBAD / HisA at NcoI, ⁇ 1 site.
  • a plasmid containing the 37A gene placed under the control of a sex promoter was created and named pHN308.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid LE59 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 98 and 99 in the sequence listing. As a result,
  • Amplification by RT-PCR was performed using mouse liver Poly (A) NA and primers described in Sequence Listing 100 and 101.
  • DNA containing a gene encoding mouse-derived Peroxiredoxin4 (GenBank accession number BC019578) was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with restriction enzymes II and l and subcloned into the ADI and Knl sites of pBAD / HisA, resulting in a plasmid containing the Peroxiredoxin 4 gene placed under the control of an arabinose-inducible promoter. Created and named pHN278.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid LE156 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 102 and 103 in the sequence listing.
  • Prothrombin has a subclone of the DNA sequence encoding “Prethrombin-2” (Soejima et al., J. Biochem. J30 269-277 (2001)) immediately before becoming mature Thrombin.
  • PHN171 (described in Example 7), p5, pHN206, p08, ⁇ 287, ⁇ 289, ⁇ 28 ⁇ , ⁇ 270, ⁇ 27 ⁇ ⁇ 272, ⁇ trans 9, ⁇ brittle 84, ⁇ 5, ⁇ 286, ⁇ 217, ⁇ Rhodococcus erythropolis JCM3201 strain was transformed using PHN291 in the same manner as in Example 12, and each protein was expressed at 30 ° C. and 4 ° C. according to Example 13.
  • NT-Bufier Suspended in NT-Bufier.
  • the cells were crushed using an ultrasonic generator UD-20 (manufactured by T0MY). 20, centrifuged at OOOXg, and Ni-NTA Superflow previously equilibrated with NT-Buifer was added to 900 U of the supernatant to a bed volume of 40 l. The mixture was stirred for 1 hour with rotation to bind the Ni-NTA Superflow beads to the 6XHis-tagged protein. After washing the beads four times with NT-Buffer, the 6XHis-tagged protein was eluted from the beads by suspending three times in 1201 NTE-Buffer. All the above operations were performed at 4 ° C.
  • FIG. 21 The results of quantification are shown in FIG. 21.
  • the second column from the left shows the name of the expressed protein.
  • the third column from the left shows 6 at either the N-terminal or C-terminal of the expressed protein.
  • the fourth column from the left shows the estimated molecular weight (kDa) of the full-length protein including the signal sequence, etc., and the number in parentheses shows the estimated molecular weight of the actually expressed protein part.
  • the fifth and ninth columns from the left show the names of the plasmids used when expressing the protein.
  • the sixth, eighth, and tenth columns from the left show the mass of the recombinant protein obtained per liter of culture (only The results are shown separately for the case of purification from the supernatant fraction (Sup) at 20, OOO X g and the case of purification from the precipitate fraction (Ppt) at 20, OOO X g.
  • each transformant contains an expression inducer (Rhodococcus erythropolis for thiostrepton, and for Escherichia coli 0.2% L-arabinose). It shows the growth rate when spread on agar agar. The transformant that grew fastest is +++, and the transformant that did not grow at all is-. The host used and the temperature at the time of induction of expression are shown at the top. ND (Not Detected) indicates that it was below the detection limit.
  • an expression inducer Rhodococcus erythropolis for thiostrepton, and for Escherichia coli 0.2% L-arabinose. It shows the growth rate when spread on agar agar. The transformant that grew fastest is +++, and the transformant that did not grow at all is-. The host used and the temperature at the time of induction of expression are shown at the top. ND (Not Detected) indicates that it was below the detection limit.
  • Table 1 shows a list of each plasmid used in the examples
  • Table 2 shows a list of strains used in the examples.
  • the use of the expression vector of the present invention enables the expression and production of the protein encoded by the foreign gene under the low temperature condition of 4. It is.

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Abstract

低温でタンパク質を発現することができる誘導型発現ベクターおよび該ベクターを用いて低温でタンパク質を発現させる方法の提供。　約15℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、低温条件下で増殖可能な宿主細胞中で誘導発現し得る誘導型発現ベクター。

Description

低温での組み換えタンパク質の発現に適した新規発現ベクター 技術分野
本発明は、 Rhodococcus 属細菌中で外来遺伝子を誘導発現し得る発現ベクター に関する。
また、 本発明は、 低温において宿主細胞中で組み換えタンパク質を発現するこ とができる誘導型発現ベクターおよ明び該ベクターを用いて低温で組み換えタンパ ク質を発現させる方法に関する。 さらに、田本発明は約 15°Cを超える中高温条件下 では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、 低 温条件下で増殖可能な Rhodococcus属細菌で誘導発現し得る Rhodococcus属細菌 用誘導型発現ベクターおよび該ベクタ一を含む低温条件下で増殖可能な Rhodococcus属細菌を用いて約 15°Cを超える中高温条件下では発現産物が宿主細 胞の増殖を阻害する組み換えタンパク質を低温で発現させる方法に関する。 背景技術 ·
現在、 真核生物由来のタンパク質を組み換え体として大量調製するためには大 腸菌を宿主とした発現システムが広く用いられている （We ickert et al. , Curr. Op in. B iotechnol. 7 494-499 (1996)、 Baneyx, Curr. Opin. Biotechnol. 10 411-421 (1999) ) o 大腸菌は中温菌で、 18°Cから 37°Cで生育するが、 組み換え夕 ンパク質を発現させるための培養温度も上記温度範囲内でなければならない。 しかし、 真核生物由来のタンパク質がその活性を示すのもまた同じ温度範囲内で あり、 そのため、 いくつかのタンパク質は組み換え体として大腸菌内で発現させ ると、 大腸菌の生育を阻害してしまい、 その結果、 有意な量の組み換え夕ンパク 質が得られないことがある。
大 S昜菌以外では Saccharomyces cerevi s iaeや P ichi a pas tor i s (Cereghino and
Cregg, Curr. Opin. Biotechnol. 10 422-427 (1999) )、 Si9細胞（Mi l l er, Curr.
Opin. Genet. Dev. 3 97-101 (1993) )など真核細胞を宿主として用いた発現シス テムが知られているが、 これらも培養温度が 30°C前後でないと組み換えタンパク 質を効率よく発現させることが出来ず、 同様の理由からその調製が困難な場合が ある。 例えば、 組み換えタンパク質の産生に通常用いられている昆虫細胞 Si9 を用いて外来タンパク質の産生を行う場合、その産生のための至適温度は約 28°C であり、 最低温度は約 18°Cである （Agathos et al.， Ann. N. Y. Acad. Sc i. 589 372-398 (1990) , Faber e t al. , Yeas t ϋ 1331-1344 (1995) )。 また、 酵母 (P ichia pas tori s) を用いて外来タンパク質の産生を行う場合、 その産生のための至適温 度は約 30°Cであり、最低温度は約 15°Cである （Brock et al.， J. Membr. B io l. 180 147-161 (2001)、 Sarramegna et al. , Prote in Expr. Puri f. 24 212-220 (2002) ) 0 すなわち、 昆虫細胞 Si9の好適生育温度範囲は約 18°C以上であり、 酵母の好適生 育温度範囲は約 15°C以上である。 またこれらを宿主とした場合、 いくつかのタン パク質は糖鎖などの修飾を受けてしまい、 その後の立体構造解析などの機能解析 に不都合なことがある。
発明の開示
本発明は、 大腸菌をはじめとする他の組み換えタンパク質発現システムで発現 させることが出来ないタンパク質を発現させることを目的とする。 例えば、 15°C を超える中高温条件下で大腸菌等の形質転換宿主細胞中で発現させることができ ないタンパク質を低温で発現させることを目的とする。
また、 本発明は、 hodococcus 属細菌を用いて外来の組み換えタンパク質を誘 導発現させることを目的とする。
上記問題を解決するためには、 組み換えタンパク質の活性を抑制するために、 低温で発現させることが有効だと考えられる。 大腸菌においては、 低温誘導性プ 口モータ一を用いた 15〜16°Cでの発現システムが、最も低い温度で組み換えタン パク質を産生させた例である （特表平 10-503090、 Muj ac ic e t al.， Gene 238 325-332 (1999) )。 また、 上述のように昆虫細胞や酵母でも 15°C〜18°Cでの組み 換えタンパク質の産生が従来知られていた最も低い温度での組み換えタンパク質 の産生である。 従って、 従来の公知の宿主細胞を用いての組み換えタンパク質を 発現させ得る最低温度である '15°C〜18°C以下、 好ましくは 4°C前後で発現させる ことが有効であると考えられた。 しかし、 15°C以下、 特に 4^前後では上述の宿 主細胞はいずれも生育が困難であり、 タンパク質の産生も不可能であるため、 約 15°C以下の低温、 特に 4°C前後でも生育できる細菌を宿主とした発現システムを 用いれば良いと考えられる。 そこで、 本発明者らは、 Rhodococcus 属細菌を宿主 とした、 広範な温度域 （4°Cから 32°C前後） において、 外来蛋白質を発現せしめ る誘導型発現ベクターを構築することによって、かかる問題を解決しょうとした。
Rhodococcus erythropol is CLarkin et al. , Antonie van Leeuwenhoek 74 133-153 (1998) ) は 4°Cから 35°Cまでの広範な温度域で生育する放線菌で、 同菌と大腸菌 との両細胞種で自律複製可能な複合ベクター （De Mot et al. , Microbiology 143 3137-3147 (1997) ) も開発されており遺伝子工学の研究も容易である。
また Rhodococcus属細菌全般でも、大腸菌との複合ベクターが開発されており（特 開平 5-64589、 特開平 8-56669)、 外来遺伝子を構成的に発現せしめる汎用的発現 ベクターも存在する （特開平 10- 248578)。
しかし、 効率よく迅速に低温でタンパク質を発現させるためには、 容易に、 厳 密に、 強力にタンパク質の発現調節が出来る誘導型発現べクタ一の開発が不可欠 である。 すなわち、 まず発現を抑制した状態で、 30°Cにおいて細胞を増殖させ、 その後温度を例えば 4°Cに下げて発現を誘導するのである。 しかし、 これまでに 同菌においてそのような誘導型発現ベクターの報告がなく、 他種の細菌由来の発 現誘導システムを流用することが有効だと考えられた。
Streptomyces coel icolorは Rhodococcus erythropol i sと同しく放線囷のー ii で、 同菌では抗生物質チォストレプトンの添加によって発現が誘導される一連の 遺伝子群が知られていた（Murakami et al.， J. Bacterio l. 171 1459-1466 (1989) )。 そのうちの一つ TipA遺伝子は 253アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、 この TipAタンパク質はチォストレプトンと共有結合し、自身のプロモーター領域 に TipA-チォストレプトン複合体として作用し、 自身の構造遺伝子からの転写を 強力に促進することが知られていた（Holmes et al.， EMBO J. ϋ 3183-3191 (1993)、
Chiu et al. , B iochemis try 35 2332-2341 (1996) )。 また、 この TipA遺伝子プロ モータ一と TipA 構造遺伝子を用いた誘導型発現ベクターも開発されており、
Streptomyces属内で外来タンパク質を発現させた例がある (Engui t a e t al. , FEMS
Microbiol. Let t. 137 135-140 (1996) )。 Rhodococcus erythropo l i sにおいても、
TipA構造遺伝子、 並びに IMJt伝子プロモーターの下流に標的タンパク質の構 造遺伝子を連結した遺伝子群を導入したベクターを構築すれば、 この Streptomyces属細菌同様に、 誘導型発現ベクターになりうると考えられるが、 そ の報告はなかった。 ，，
また、約 15°C以下の低温、特に 4°Cで組み換えタンパク質を生産可能になれば、 宿主の増殖を阻害するタンパク質を生産させるだけでなく、 以下に述べるような 利点もあると考えられる。
大腸菌で組み換えタンパク質を 37°Cで発現させると、封入体と呼ばれる不活性 なタンパク質の凝集を作る場合がある。 しかし、 同一のタンパク質でも発現時の 温度を 30°C以下にすると活性のある可溶性のタンパク質が生産される例が多数 知られている (Schein and Noteborn, Bio/Technology 6291-294 (1988), Piatak et al. , J. Biol. Chem. 2634837-4843 (1988)、 Schirano and Shibata, FEBSLett. 271128-130 (1990)、 Vasni and Baneyx, Protein Expr. Purif. 9211-218 (1997)、 Lin et al. , Protein Expr. Purif. 丄 169 - 176 (1990))。 従って、 約 15°C以下の 低温、 特に 4°C前後での発現システムが構築されればこの可溶化の問題も解決さ れると考えられる。
さらに、 好適生育温度範囲が 20°C以下の細菌である好冷菌、 低温環境下に生存 する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質も約 15°C以下の低温、 特に 4°C前後での生産が好ましいと考えられる。 これは、 これらのタンパク質 は温度が高い場合、 活性のあるタンパク質として発現されないことがあると考え られるからである。 これに関しては、 好冷菌由来の - amylaseを好冷菌を宿主と して発現させた例が唯一存在するものの （Tutino at al. , Extremop iles 5 257-264 (2001))、 発現誘導型のベクタ一ではなく、 迅速に大量生産させるのは困 難だと考えられる。
そこで本発明者らは、 Rhodococcus 属細菌中で外来タンパク質を誘導発現し得 る発現ベクターおよび約 15°C以下の低温で外来タンパク質を誘導発現し得る発 現ベクターの構築について鋭意検討を行い本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1) 宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクター であって、 該宿主以外の宿主の好適生育温度範囲以下の温度で発現し得る発現べ クタ一。
( 2 ) 宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクター であって、 15°C以下の温度で発現し得る発現ベクター。
(3) 4°Cで発現し得る （1) または （2) の発現ベクター。
(4) 宿主細胞が Rhodococcus属細菌である、 (1) から （3) のいずれかの発 現ベクター。
(5) Rhodococcus属細菌が R. erythropolisゝ R. fasciansおよひ R. opacus からなる群から選択される、 （4) の発現ベクター。
(6) 誘導物質がチォストレプトンである、 （1) から （5) のいずれかの発現 パ、々々■
(7) 外来遺伝子が、 15°Cを超える中高温条件下で宿主細胞の増殖を阻害する タンパク質をコードする、 （1) から （6) のいずれかの発現べクタ一。
(8) 誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、 外来遺伝子を導入 可能なマルチクローニング部位を含む （1) から （7) のいずれかの発現べクタ
(9) (1) から （8) のいずれかの発現ベクターを含む形質転換体。
(1 0) (1) から （8) のいずれかの発現ベクターを用いてタンパク質を産 生する方法。
(1 1) 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞 の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、 該宿主細胞の好適生育温度 範囲より低い好適生育温度範囲を有する他の宿主細胞中で誘導物質により誘導発 現し得る誘導型発現ベクター。
(12) 4でで発現し得る （1 1) の発現べクタ一。
(1 3) 宿主細胞が Rhodococcus属細菌である、 (1 1) または （1 2) の発現 ベクター。
(14) Rhodococcus属細菌が R. erythropol is、 R. f asciansおよび R. opacus からなる群から選択される、 （1 3) の発現ベクター。
(1 5) 誘導物質がチォストレプトンである、 （1 1) から （14) のいずれか の発現ベクター。
(1 6) 誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、 外来遺伝子を導 入可能なマルチクローニング部位を含む （1 1) から （1 5) のいずれかの発現 ベクター。 (1 7) (1 1) から （1 6) のいずれかの発現べクタ一を含む形質転換体。
(1 8) (1 1) から （16) のいずれかの発現ベクターを用いてタンパク質 を産生する方法。
(1 9) Rhodococcus 属細菌中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る 発現べクタ一。
(20) Rhodococcus属細菌が R. erythropol is. . f asciansおよび R. opacus からなる群から選択される、 （1 9) の発現ベクター。
(2 1) 誘導物質がチォストレプトンである、 （1 9) または （20) の発現べ クタ一。
(22) TipA遺伝子プロモーター配列、 外来遺伝子を導入可能な第 1のマルチ クロ一ニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、 第 2のプロモーター 配列および TiM遺伝子を含む誘導カセット、 Rhodococcus属細菌用プラスミドの 自律複製に必須な DNA領域ならびにチォストレプトン耐性遺伝子を含む、 （19) から （21) のいずれかの発現ベクター。
(23) (19) から （22) のいずれかの発現べクタ一を含む Rhodococcus 属細菌形質転換体。
(24) (19) から （22) のいずれかの発現べクタ一を用いてタンパク質 を産生する方法。
(25) 15°Cを超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害する タンパク質をコードする遺伝子を、 低温条件下で増殖可能な Rhodococcus属細菌 で誘導発現し得る Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
(26) TipA遺伝子プロモーター配列、 外来遺伝子を導入可能な第 1のマルチ クローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、 第 2のプロモ一ター 配列および TipA遺伝子を含む誘導カセット、 Rhodococcus属細菌用プラスミドの 自律複製に必須な DNA領域ならびにチォストレプトン耐性遺伝子を含む、 外来遺 伝子を低温条件下で増殖可能な Rhodococcus 属細菌内で誘導発現し得る Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
(27) さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必須な DNA領域を含み、 大腸 菌中で複製可能な （26) の Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
(28) TipA遺伝子プロモーターが TipA- LG10プロモーターである (26) ま たは （27) の Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
(29) 配列番号 106に表される塩基配列を有する pTip - NH1、 配列番号 1 0
7に表される塩基配列を有する pTip-NH2、配列番号 108に表される塩基配列を 有する pTip- CH1、配列番号 109に表される塩基配列を有する pTip-CH2、配列番 号 1 1 0に表される塩基配列を有する pTip- LNH1、 配列番号 1 11に表される塩 基配列を有する pTip-LNH2、 配列番号 1 1 2に表される塩基配列を有する pTip-LCHK配列番号 1 1 3に表される塩基配列を有する pTip- LCH2、 pTip-CHl.1、 pTip-CH2.1、 Tip-LCHl.1および pTip-LCH2.1からなる群から選択される (26) から （28) のいずれかの Rhodococcus属細菌用誘導型発現べクタ一。
(30) Rhodococcus属糸田菌が R. erythropol is, R. fasciansおよび opacus からなる群から選択される、 （25) から （29) のいずれかの Rhodococcus属細 菌用誘導型発現ベクター。
(31) (25) から （30) のいずれかの Rhodococcus属細菌用誘導型発現 ベクターを含む Rhodococcus属細菌形質転換体。
(32) 外来遺伝子として 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタン パク質をコードする遺伝子を含む（25)から （30) のいずれかの Rhodococcus 属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能な Rhodococcus属細菌に導入し、 低温条件下でチォストレプトンを含む培地を用いて前記 Rhodococcus属細菌用誘 導型発現べクタ一導入細菌を培養することを含む、 15°Cを超える中高温条件下で は発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質を低温で産生させる方法。
(33) 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 15°Cを 超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、 （32)の タンパク質を低温で産生させる方法。 .
(34) 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 大腸菌 で 15°Cを超える中高温で発現させた場合に不活性な封入体を作るタンパク質で ある、 （32) のタンパク質を低温で産生させる方法。
(35) 好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク 質をコードする遺伝子を含む （25) から （30) のいずれかの Rhodococcus属 細菌用誘導型発現べクタ一を低温で増殖可能な Rhodococcus属細菌に導入し、 低 温条件下でチォストレプトンを含む培地を用いて前記 Rhodococcus属細菌用誘導 型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、 好冷菌または低温環境下に生存 する動物もしくは植物由来のタンパク質を低温で産生させる方法。
(3 6) 外来遺伝子を含む （2 5) から （3 0) のいずれかの Rhodococcus属 細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能な Rhodococcus 属細菌に導入し、 15°Cを超える中高温条件下および低温条件下でチォストレプトンを含む培地を用 いて前記 Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養し、 15°C以下 の低温条件下でのみ発現される遺伝子を選択することを含む、 15°Cを超える中高 温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
(3 7) 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 15°Cを 超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、 （3 6)の 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする 方法。
(3 8) 大腸菌に導入し 15°Cを超える中高温で発現させよとした場合に、 発現 しないかまたは大腸菌の増殖を阻害する遺伝子を選択し、 次いで該遺伝子を外来 遺伝子として含む （25) から （3 0) のいずれかの Rhodococcus属細菌用誘導 型発現ベクターを低温で増殖可能な Rhodococcus属細菌に導入し、 低温条件下で チォストレプトンを含む培地を用いて前記 Rhodococcus属細菌用誘導型発現べク 夕一導入細菌を培養したときに発現しうる遺伝子を選択することを含む、 15DCを 超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
(3 9) 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 大腸菌 の増殖を 30°C以上で阻害するタンパク質である、 （38) のタンパク質をスクリ —ニングする方法。
(40) 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 大腸菌 で 15°Cを超える中高温で発現させた場合に封入体を作るタンパク質である、 （3 8) のタンパク質をスクリーニングする方法。
(41) 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 15°Cを 超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、 （3 8)の 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする 方法。
(42) (3 6) から （41) のいずれかのスクリーニングする方法により得 られた 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 本発明の発現ベクターの構築
本発明の発現ベクターは、 低温で増殖可能な細胞中で自律複製可能で、 該べク 夕一中に組込まれた外来遺伝子を誘導的に発現し得るベクター、 すなわち誘導型 発現べクタ一である。
低温で増殖可能な細胞は限定されず、 低温で増殖できる細胞ならば大腸菌、 酵 母等のいずれの微生物、 昆虫細胞、 哺乳類細胞等も使用しうる。 確実に低温で増 殖し得るという点で Rhodococcus属に属する細菌、好ましくは R. erythropol i s, R. f asc ians, R. opacus等が挙げられる。 これら 3種類の Rtiodococcus属細菌の うち、 R. erythropo l i sが 4°Cでの増殖速度が最も大きく他の 2種はそれよりも劣 る。 しかし、 本発明のベクターを用いたタンパク質の産生においては、 細胞を増 殖に適した温度で増殖させた後に、 該細胞を低温に移して誘導的に発現させタン パク質を産生させ得る。従って、 4 で組み換え外来タンパク質を発現産生可能な 限り増殖速度は問題とならず、 R. erythropol i s , R. f asc i ans、 R. opacus の 3 種の Rtiodococcus属に属する種すベてを好適に用い得る。
低温とは、 通常の細菌の至適増殖温度よりも低い温度をいい、 4°Cから 18°C、 好ましくは 4°Cから 15°C、 特に好ましくは 4で前後の温度をいう。 通常の細菌の 好適生育温度範囲は細菌の種類によっても異なるが約 15°Cから約 40°Cまたは約 18°Cから約 40°Cであり、本明細書においては約 15°Cを超える温度を中高温という。 外来遺伝子とは、 本発明のベクターを用いて発現産生させようとする標的タン パク質をコードする遺伝子であり、 宿主細胞以外の生物由来のタンパク質をコー ドする遺伝子をいう。 本発明のベクターに組込む外来遺伝子は、 約 15°Cを超える 中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質をコードする 遺伝子である。約 15°Cを超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不 可能なタンパク質とは約 15°Cを超える中高温で発現させようとしても、発現効率 が低いか全く発現しないタンパク質をいう。 このようなタンパク質として宿主細 胞の至適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主 細胞を用いた場合にその微生物の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現で きるタンパク質、 宿主微生物の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該 宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育 温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻 害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも 低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、 宿主細胞の好適生育 温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝 集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度より も低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質とな るタンパク質、 好適生育温度範囲が 20°C以下である好冷菌、 低温環境下に生存す る変温動物、 低温環境下に生存する植物由来のタンパク質等をコードする遺伝子 が挙げられる。
ある遺伝子を大腸菌に基づく発現系で約 15°Cを超える中高温で発現させよう としたとき、 または該遺伝子を本発明の発現べクタ一に含ませ Rhodococcus属細 菌で約 15°Cを超える中高温で発現させようとしたときに、発現しないかまたは発 現量が外来遺伝子を本発明の発現ベクターに含ませ Rhodococcus属細菌で低温で 発現させたときの発現量より有意に低い場合に、該タンパク質は約 15でを超える 中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能な夕ンパク質であるといえ る。
例えば、 通常組み換えタンパク質の発現産生によく用いられる大腸菌を用いて 発現させようとした場合に、大腸菌の好適生育温度範囲である 18°Cから 37°Cで発 現できないか、 大腸菌に致死的となるか、 大腸菌の増殖を阻害するか、 大腸菌内 で凝集し不活性な封入体を作るタンパク質をコードする遺伝子を、 Rhodococcus erythropol i sに導入して Rhodococcus erythropo l i s を 4°Cから 18°Cの低温で増 殖させることにより前記タンパク質を効率的に大量に産生させることができる。 また、 Rhodococcus erythropol i sを用いて約 15でを超える温度で発現させようと した場合に、 発現できないか、 Rhodococcus erythropo l i s に致死的となるか、 Rhodococcus erythropol i s の増殖を阻害するようなタンパク質を、 Rhodococcus erythropol i sを用いて 4°Cから 15°Cの低温で増殖させても前記タンパク質を効率 的に大量に産生させることができる。
約 15°Cを超える中高温条件下で宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質の種類 は限定されないが、 例えば後述の実施例に記載のタンパク質を例示することがで きる。 これらのタンパク質をコードする遺伝子は、 後述のプロモータ一の下流に マルチクローニング部位を含ませておきその部位にコードする遺伝子を組込めば よい。
外来遺伝子を誘導的に発現し得るベクターとは、 一定の処理を施すことにより 組込まれた外来遺伝子の発現が誘導されるベクターをいう。 例えば、 特定の調節 物質で発現を誘導し得るプロモーターをベクターに組込むことにより誘導型発現 ベクターを構築することが可能である。 このようなプロモーターとして宿主細胞 の培養培地中に誘導物質である薬剤を導入することにより特異的に誘導するプロ モータ一があり、例えばチォストレプトン誘導性プロモーターである TipA遺伝子 プロモーターが挙げられる。 このような誘導性プロモーターを組込んだベクタ一 を導入した宿主細胞を 15°Cから 18°C以上の細胞の増殖に適した温度で十分増殖 させた後に、 タンパク質の発現を誘導する薬剤を添加することにより目的のタン パク質を大量に発現させることができる。 さらに、 TipAタンパク質をコードする TipA遺伝子、 TipA遺伝子の発現を誘導する ThcA遺伝子プロモーター等の適当な プロモーターを組込めばよい。 宿主細胞が Rhodococcus属に属する細菌である場 合、 該細菌はチォストレプトンに対して感受性であるため、 チォストレプトンに 対しての耐性を付与するチォストレプトン耐性遺伝子等を組込む。
また、 本発明の発現ベクターは、 薬剤耐性遺伝子を含んでいてもよい。
さらに、複数の宿主細胞に適合させるだめに複合ベクター（シャトルベクター） であってもよい。 例えば、 大腸菌および Rhodococcus属に属する細菌のいずれに も導入可能でこれらの宿主細胞中で外来遺伝子を発現しうるベクターが挙げられ る。 このようなベクターを構築する場合、 それぞれの宿主細胞でプラスミドの自 律複製に必須な DNA 領域を組込んでおく必要がある。 例えば、 大腸菌と Rhodococcus 属に属する細菌に適した複合ベクターの場合、 大腸菌用プラスミド の自律複製に必須な DNA領域として E1配列を、 Rhodococcus属に属する細菌 用プラスミドの自律複製に必須な DNA領域として RepAおよび 伝子を組込 めばよい。 このような複合ベクターは大腸菌を用いて大量に複製することが可能 である。
本発明の発現べクタ一は、 少なくとも第 1のプロモーター活性を有する DNA配 列、 外来遺伝子を組込むための第 1のマルチクローニング部位を含む。 さらに、 第 1のプラスミドの自律複製に必須な丽 A領域、 第 1の薬剤耐性遺伝子、 第 1の マルチクローニング部位に連結された外来遺伝子、 第 1の転写終結配列を含む。 第 1のプロモーター活性を有する DNA配列として TipA遺伝子プロモーターが挙げ られ、 ΤίρΑ遺伝子プロモーターを含む場合、 T ipA遺伝子、 および TipA遺伝子を 発現させるための ThcA遺伝子プロモーター等の第 2のプロモーター配列、 T ipA 遺伝子下流の第 2の転写終結配列を含む。 Τ ίρΑ遺伝子プロモータ一は TipA- LG10 プロモータ一等のその配列を改変させたものでもよい。 さらに、 TipA遺伝子プロ モーター誘導発現系を含む場合であって、 宿主細胞が Rhodococcus属細菌である 場合には、 Rhodococcus 属細菌にチォストレプトンに対する耐性を付与するため にチォストレプトン耐性遺伝子を含んでいる 、要がある。
プロモーター活性を有する DNA配列、 外来遺伝子および転写終結配列は発現力 セット （Express ion casse t t e) を構成し、 TipA遺伝子および TipA遺伝子発現用 プロモーターは誘導カセット （Inducer casse t te) を構成する。
本発明の Rhodococcus属細菌用発現ベクターは、 タンパク質自体が 15°Cを超え る中高温で発現可能なものならば低温ばかりでなく 15°Cを超える中高温におい ても該タンパク質を発現させ得る。
本発明の発現ベクターとして、 図 9に記載の pTipベクターが挙げられ、マルチ クローニング部位の構造により図 9 aに示すように pTip- NHl、pT ip- NH2、pTip- CH1、 pT i -CH2, T i -LNH L T i -LNH2. pT i -LCH 1および pTip- LCH2、がある。 pT ip- NH1、 pTip-NH2, pTip-CHK pTip-CH2, pTip-LNHL pTip-LNH2 pTip-LCHlおよび pT ip_LCH2 ベクターの配列はそれぞれ、 配列番号 1 0 6〜1 1 3に示される。
さらに、本発明の発現ベクターとして、 Tip-CHL pTip- CH2、 pTip-LCHK pTip-LCH2 において、マルチクローニング部位の I I部位以降の読み枠を市販の pETベクタ 一 (Novagen 社） の読み枠と一致させるために ill と 1 部位を分けた pTip-CHl. K pTip-CH2. K pT ip-LCHl. pTip - LCH2. 1がある。
本発明のベクターは、 後述の実施例の記載および図 1から図 8のベクター構築 図に従えば容易に構築することができる。
2 . 本発明のベクターの使用
本発明の発現ベクターを用いて、約 15°Cを超える中高温で発現させることが困 難であるかまたは不可能なタンパク質を産生させることができる。 このような夕 ンパク質として、 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一の または異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその細胞の好適生育温度範囲内の温 度よりも低温で発現できるタンパク質、 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で 発現させた場合に該宿主細胞にとつて致死性となるが同一のまたは異なる種類の 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性 でないタンパク質、 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該 宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度より も低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、 宿主細胞の好適生 育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の 凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温でそれら の宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質、 好適生育温度範囲が 20°C以下である好冷菌、 低温環境下に生存する変温動物、 低 温環境下に生存する植物由来のタンパク質が挙げられる。
これらのタンパク質をコードする遺伝子を本発明の発現ベクターのマルチクロ 一二ング部位に適当な制限酵素を用いて組込み、 該ベクターで宿主細胞を形質転 換し、 宿主細胞を低温条件下で培養することにより前記タンパク質を発現させる ことができる。宿主細胞は、低温で増殖し得る細胞である必要があり、 Rhodococcus 属に属する細菌、 好ましくは R. eryt ropol i s, R. f asc ians, R. opacus等が挙 げられる。 これらの細胞は低温で増殖可能であるが、 増殖に好適な温度は 15°C以 上、 さらに好適な温度は 18°C以上、 特に好適な温度は約 前後であり、遺伝子 を組込んだタンパク質を発現させる前に、 増殖に適した温度で十分増殖させたの ちに、 低温条件下に移しべクタ一中に含まれる誘導型プロモーターの機能を利用 して適当な薬剤を用いてタンパク質を発現させることができる。
本発明のベクターが、 TipA遺伝子プロモーターを含む場合、 チォストレプトン を培地に添加することによりタンパク質の発現が誘導される。 この際チォストレ プトンは、 終濃度 0. \ ii gM以上、 好ましくは 1 / g/ml以上となるように添加す ればよい。 ただし、 lO g/mlを越えると生育が悪くなる。
本発明のベクタ一を用いて、約 15°Cを超える中高温で発現させることが困難で あるかまたは不可能なタンパク質をスクリーニングすることができる。 このよう なタンパク質として、 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現できないが同 一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその細胞の好適生育温度範囲内 の温度よりも低温で発現できるタンパク質、 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温 度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種 類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致 死性でないタンパク質、 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合 に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度 よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、 宿主細胞の好 適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク 質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温でそ れらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク 質が挙げられる。
例えば、適当な動物種の適当な組織から poly (A) ÷RNAを抽出し、 cDNAを合成し、 発現ベクターに組込む。 次いで、 該ベクタ一を用いて大腸菌等の宿主細胞を形質 転換し、 発現ライブラリーを構築し、 30°Cで増殖発現させた場合に、 増殖が阻害 されるクローンから組込まれた遺伝子を単離することにより、 宿主細胞の好適生 育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一 のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれ らの宿主細胞に致死性でないタンパク質または宿主細胞の好適生育温度範囲内の 温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類 の宿主細胞の至適温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタン パク質をコードする遺伝子を選択する。 この際、 発現ベクターに適当な薬剤で誘 導されるプロモーターを組込んでおき薬剤で発現を誘導した場合に宿主細胞の増 殖が阻害され、 誘導しない場合には宿主細胞が増殖するようなクローンを選択す ればよい。 次いで、 単離した遺伝子を本発明の発現ベクターに組込んで、 該組み 換え発現べクタ一で Rhodococcus erytliropol i sを形質転換し、 4 Cから 15Tの低 温で増殖発現させ、 増殖が阻害されることなく前記遺伝子を発現するクローンを 選択することにより、 上記タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングする ことができる。 また、 cDNAライブラリーの遺伝子を本発明の発現ベクターに組込 んで、 該組み換え発現ベクターで Rhodococcus ervthropol i sを形質転換し、 低温 または約 15°Cを超える中高温で培養し、増殖が阻害されることなく組込んだ遺伝 子を発現するクローンを選択するか、 または発現誘導させたときに発現される遺 伝子を組込んだクローンを選択することにより上記タンパク質をコードする遺伝 子をスクリーニングすることができる。
前記スクリーニングにより得られた約 15°Cを超える中高温で発現させること が困難であるかまたは不可能なタンパク質も本発明に包含される。 このような夕 ンパク質として、 後述の実施例に記載されたタンパク質が例示できる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2002-235008号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、誘導型発現ベクターのパックボーンになるプラスミド pHN136の構築図 である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キ 口ベースペア一： kb) を示す。
図 2は、チォストレプトン耐性遺伝子を持つプラスミド PHN143の構築図である。 図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。 数字は塩基対 （キロべ一 スペア一： kb) を示す。 CIAPは Cal i Intes t ine Alkal ine Phosphat aseを、 Blu. は平滑末端 （Blunt en d ) を意味する。
図 3は、 Inducer casset teを持つプラスミド PHN62の構築図である。 図中に制 限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペア一： kb) を示す。 Blu.は平滑末端 （Blunt end) を意味する。
図 4は、 Express ion casse t teを持つプラスミド PHN153の構築図である。 図中 に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。 数字は塩基対 （キロベースべ 7—： kb) を示す。 CIAPは (Cal f Intest ine Alkal ine Phosphataseを Blu.は平 滑末端 （Blunt end) を意味する。
図 5は、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミド PHN169の構築図である。 図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。 数字は塩基対 （キロべ一 スペア一：kb) を示す。 CIAPは Cal i Intes t ine Alkal ine Phosphataseを、 Blu. は平滑末端 （Blunt end) を意味する。
図 6は、 PIP をレポーター遺伝子として持つ誘導型発現ベクタープラスミド pHN170、 pHN171の構築図である。 図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を 示す。 数字は塩基対 （キロベースペア一： kb) を示す。 CIAP は Cal f Intes t ine Alkal ine Phosphataseを意味する。 図 6において一連の工程を 2つに分けて示し てあるが、 工程の順序が明確になるように両者には重複部分がある。
図 7は、 マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミ ド pTip-NHK pTip-CHK pTip-LNHK pTip-LCHlの構築図である。 図中に制限酵素認 識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペア一： kb) を示 す。 図 7において一連の工程を 2つに分けて示してあるが、 工程の順序が明確に なるように両者には重複部分がある。
図 8は、 マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミ ド pTip-NH2, pTip-CH2, pTip-LNH2、 pTip- LCH2の構築図である。 図中に制限酵素認 識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペア一： kb) を示 す。 図 8において一連の工程を 2つに分けて示してあるが、 工程の順序が明確に なるように両者には重複部分がある。
図 9 aは、 a ) pTip-NHL pTip-CHK pTip-LNHK pTip-LNHK pTip- NH2、 pTip_CH2、 pTip- LNH2、 pTip- LCH2のマップを示す図である。 各領域の機能と、 プラスミドの マツプを示す。
図 9 bは、 b ) pTip- NH1、 pTip-LNHlの TipA遺伝子プロモーター配列、 または TipA-LGlQプロモータ一配列から、 マルチクロ一ニング部位、 TiicA遺伝子転写終 結配列までの DNA配列を示す。
図 9 cは、 c ) pTip-CHK pTip- LCH1の TipA遺伝子プロモータ一配列、 または TipA-LGlQプロモータ一配列から、 マルチクローニング部位、 ThcA遺伝子転写終 結配列までの DNA配列を示す。
図 9 dは、 d ) pTip- NH2、 pTip-LNH2の TipA遺伝子プロモーター配列、 または TipA-LGlQプロモータ一配列から、 マルチクローニング部位、 ThcA遺伝子転写終 結配列までの DNA配列を示す。
図 9 eは、 e ) pTip- CH2、 pTip-LCH の TipA遺伝子プロモーター配列、 または
TipA-LGlQプロモー夕一配列から、 マルチクローニング部位、 ThcA遺伝子転写終 結配列までの DNA配列を示す。
図 1 0は、 Tip-CHl. 1、 pTip-LCHl. 1、 Tip-CH2. 1および Tip-LCH2. 1 のマツ プを示す図である。
図 1 1は、 PIP活性測定のためのコントロールプラスミド ρΗΝ172、 ρΗΝΠ3の構 築図である。 図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。 数字は塩基対 (キロベースペア一 ： kb) を示す。 また、 CIAP は Cal i Intest ine Alkal ine Phosphataseを意味する。 ρΗΝΠΟは、「Express ion casset tejと「Inducer casset tej 両方をもつのに対して、 PHN173 は Express ion casset tej のみをもち、 pHN172 は両 casset teを持たない。
図 1 2は、 誘導型発現ベクターを用いた PIP活性の測定 1の結果を示す図であ る。
図 1 3は、 誘導型発現ベクターを用いた PIP活性の測定 2 aの結果を示す図で ある。
図 1 4は、 誘導型発現ベクターを用いた PIP活性の測定 2 bを示す図である。 図 1 5は、 誘導型発現ベクターを用いた PIP活性の測定 3の結果を示す図であ る。
図 1 6は、 誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製 1の結果を示す 写真である。
図 1 7は、 誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製 2の結果を示す 写真である。
図 1 8は、 誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製 3 aの結果を示 す写真である。
図 1 9は、 誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製 3 bの結果を示 す図である。
図 2 0は、大腸菌の増殖を 30°Cで阻害するタンパク質のリストを示す図である。 図 2 1は、 Rhodococcus erythropol is, 大腸菌を宿主とした外来タンパク質の 発現を示す図である。
図 2 2は、 TipA遺伝子プロモーター配列を示す図である。
図 2 3は、 TipA遺伝子プロモーター中の RBS配列 （WT RBS) の LG10 RBSへの 改良を示す図である。
発明を実施するための最良の形態 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例 1〕
Rhodococcus erytlirouolis由来の、 Rhodococcus属細菌内で自律複製可能なプラ スミドの分離とその一部 DNA配列の決定
Rhodococcus erythropol is と大腸菌の複合ベクターを作成するために、 まず Rhodococcus 属細菌内に存在する小型の内在性プラスミドを検索した。 すると、 Rhodococcus erythropol is JCM2895 株にその存在が確認された。 このプラスミド に PRE2895と名前を付けた。 以下にプラスミドの分離と、 その DNA配列決定につ いて具体的に述べる。
Rhodococcus erythropol is濯 895株を 5mlの LB培地（1% Diico Bacto Tryptone, 0.5% Diico Yeast Extracts 1.0% 塩化ナトリゥム） にて、 30°Cで 30時間培養した 菌体から QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製） を用いて pRE2895を精製し た。 この際、 Buffer PI 250 1に懸濁後、 Buffer P2250^ 1を加える前に、 5 1 のリゾチーム（100mg/ml)を加え 37°Cで 30分ィンキュベートした点を除いては、 使用説明書通りに作業した。
上記 DNAサンプルを制限酵素 で処理し、 1.0%ァガロースゲル電気泳動 (100V, 30分） に供したところ、 約 5.4kbの DNA断片 1本の存在が確認された。 この約 5.4kb の DNA 断片をゲルから切り出し、 QIAduick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 使用説明書通りに精製した。 得られた RI断片を常 法 (Sambrook et al.， Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) に 従って、 プラスミド pBluescript II SK (+) (STRATAGENE社製） の EcoRI部位に サブクローンし、 このプラスミドに pHN79と名前を付けた。
PHN79を Reverse、 M13-20 両プライマー （共に STRATAGENE社製） を用い、 DNA シークェンサ一 ABI PRISM ( ) 3100 Genetic Analyzer (ABI 社製） を用いて、 使 用説明書に準じて、 PHN79の塩基配列を約 400塩基ずつそれぞれ決定した。 相同 性検索の結果、 HN79にサブクローンされた Rhodococcus erythropolis JCM2895 株由来の DNA領域はその 99.8%の配列が GenBankに受入番号 AF312210として登録 されている 5403塩基対の環状 DNA、 pN30と一致した。 分離した PRE2895は全塩基配列を決定しなかったが、 PN30との相同性は極めて 高く、また制限酵素切断地図も PN30の配列から予想されるものと一致したことか ら、 これらの相同性はプラスミド全体にわたっていると予想された。 また、 pN30 は Mycobacterium fortuitum 002 株から分離された内在性プラスミド pAL5000 (Rauzer et al. , Gene 71315-321 (1988), Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 (1996))、 Rhodococcus erythropol is NI86/21 株から分離された PFAJ2600 (De Mot et al., Microbiology 143 3137-3147 (1997)) と相同性が高 く、 類似の機構で自律複製していると考えられた。 AL5QQ0は推定 RepA遺伝子、 推定 伝子、推定複製開始点を含む領域のみで各細菌内で自律複製するため に十分であるため、 本発明者らが分離した PRE2895も同様の領域のみを発現べク 夕一中に組み込めば、 Rhodococcus 属細菌内で自律複製するために十分と考えら れた。
〔実施例 2〕
ベクタープラスミド PHN136の構築
実施例 1で分離した PRE2895の一部と大腸菌内で自律複製可能なプラスミドの 一部を用いて両菌の複合ベクターを作成するため以下の作業を行った （図 1 )。 プラスミド pBluescript II SK (-) (STRATAGENE社製）をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 1、 2に記載の合成ォリゴデォキシリポヌクレオチドプライ マ一 （以下プライマーと略記） を用いて、 ポリメラーゼチェーンリアクション法
(以下、 PCRと略記： Saiki et al. , Science, 239 487-491 (1988)) による DNA の増幅を行った。 なお、 用いた PCR用の酵素は Pfu turbo (STRATAGENE社製） で ある。 その結果、 アンピシリン耐性遺伝子 （図中においては Ampfと表記） と大腸 菌内で自律複製させるために必要な E1 配列領域を含む 2. Okb の増幅された DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 lと toGIで二重消化し、 1.0%ァガロー スゲル電気泳動 （100V、 30 分） に供し、 該 DNA 断片を切り出し、 QIAduick Gel Extraction Kitを用いて、 使用説明書に準じて精製した。
一方、 pN30 (実施例 1) の配列をもとに Rhodococcus属細菌内で自律複製する ために必要と思われる領域を増幅するプライマーを設計した。 なお、 同プライマ 一の配列は配列表中の配列番号 3、 4で示される。 プラスミド PHN79を、
トとして、 両プライマーを用いて PCRによる増幅を行ったところ 1.9kbの増幅 された DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 lGIと 1で二重消化し、 1.0 ァガロースゲル電気泳動 （100V、 30分） に供し、 該腿 A断片を切り出し、 上述の 方法と同様に精製した。
上記 2つの精製された DNA断片を DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製） を用 いて、使用説明書通りにライゲーシヨンし、得られたプラスミドに PHN129と名前 を付けた。
次に PHN129に存在する制限酵素認識部位 aiHI、 Iを除去するため以下の作 業をおこなった。 まず、 PHN129 をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 5、 6に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 この PCR断片を Bglll と lで二重消化して得られた 0.5k の DNA断片を pHN129の lHI、 I部位に サブクローンした。 結果、 Bglllと BamHIで連結された部分においては推定 RepA 遺伝子のオープンリーディングフレーム （以下 0RFと略記） 内であるが、 コード されるアミノ酸が置換されることなく、 lHI 認識部位が除去された。また Ml 認識部位は I HI認識部位のごく近傍に存在したが、 配列番号 5に記載のプライ マ一中において、 l認識部位が除かれ、 かつ、 コードされるアミノ酸が置換さ れないよう設計されていることから、 lHI認識部位と同時に l認識部位も除 去されている。 このプラスミドに PHN135と名前を付けた。
次に PHN135に存在する制限酵素認識部位 ΜΠを除去するため以下の作業をお こなった。 まず、 プラスミド PHN135をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 5、 6に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 この PCR断片を Pstlと SllHIで二重消化して得られた 0.5kbの DNA断片を pHN135の PstLBglll 部位にサブクローンした。 結果、 HI と Bglllで連結された部分においては推 定 RepB遺伝子の 0RF部分であるが、コードされるァミノ酸が置換されることなく、 ΜΠ認識部位が除去された。 この結果得られたプラスミドに PHN136と名前をつ けた。
〔実施例 3〕
ベクタープラスミド PHN143の構築
タンパク質の発現誘導には抗生物質チォストレプトンを用いるが、 Rhodococcus erythropolisは同物質に対して感受性であるために、耐性を付与させなければな らない。 そこで Streptomyces azureusが持つチォストレプトン耐性遺伝子、 in 遺伝子 （Bibb et al. , Mol. Gen.' Genet. 199 26-36 (1985) ：図中においては、
Thiofと表記する） を複合べクタ一中に組み込むこととした。 なお、 この遺伝子が Rhodococcus erythropol i s内で機能し、 チォス卜レプトン耐性を付与することは すでに報告されている (Shao and Behki, Le t t. Appl. Microbiol. 1 261-266 (1995) 以下に、 同遺伝子の分離について具体的に述べる （図 2 )。
まず、 PCRのテンプレートに使用する Streptomyces azureus JCM421 7株のゲ ノム DNAを以下のように調製した。 5mlの SB培地 （1% Di fco Bacto Tryptone, 0. 5% Di fco Yeas t Ext ract, 0. 5% 塩化ナトリウム、 0. 1% Glucose, 5mM塩化マグ ネシゥム、 0. 5% グリシン） にて 30°Cで培養した同菌株を 500 1の SETバッファ ― (75mM塩化ナトリゥム、 25mM EDTA (pH8. 0)、 20mM Tr i s-HCl (pH7. 5)") に '懸濁し た。 そこに、 5 1 のリゾチーム溶液 （lOOmg/ml) を加え、 37°Cで 30分インキュ ベ一トした。 そして、 14 1のプロテアーゼ K溶液 （20mg/nil) と 60 1の硫酸ド デシルナトリウム溶液 （10%) を加え、 よく混合した後 55°Cで 2時間インキュべ —トした。 その後、 200 // I の塩化ナトリウム溶液 （5M) と 500 1のクロ口ホル ムを加え、 20分間室温で回転撹拌した。 遠心分離し、 700 1の上清をとつた。 こ れをイソプロパノ一ル沈殿後、乾燥させ、 50 1の TE溶液（ 1 OmM Tr i S- HC 1 (pH8. 0)、 lmM EDTA (pH8. 0) ) に溶解した。
上記のように精製した St reptomyces azureus JCM4217株のゲノム丽 Aをテン プレートとして、 配列表中の配列番号 7、 8に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 チォストレプトン耐性遺伝子を含む 1. lkbの増 幅された DNA を得た。 なおこの DNA 断片はプラチナ Pix DNA ポリメラーゼ (Gibco BRL社製） を用いたため、 その末端は平滑末端である。 この DNA断片を 精製し、 常法 (Sambrook e t al. , Molecular Cloning: a l aboratory manual, 2nd edi t ion (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) に従い 5'末端を T4_ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、 プ ラスミド pGEM- 3ΖΠ+) (Promega社製） の ncII部位にサブクローンした （サブ クローンされた向きは DNAの 5 '方向から Slid 111認識部位-!^遺伝子 O P-EcoR I 認識部位である）。 このプラスミドに PHN137と名前を付けた。
次に PHN137に存在する制限酵素認識部位 lを除去するため以下の作業をお こなった。 まず、 プラスミド PHN137をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 9、 1 0に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 なおこの PCR にはプラチナ Pix DNA ポリメラーゼを用いた。 この PCR 断片の片方の末端を Hindi I Iで消化して得られた 0. 6kbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑 末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。 一方、 プ ラスミド PHN137をテンプレートとして、配列表中の配列番号 1 1、 1 2に記載の プライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。なおこの PCRにはプラチナ Pix DNA ポリメラ一ゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を RIで消化して得られた 0. 5kbの DNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4 -ポリヌク レオチドキナーゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR断片を同時にプラスミ ド pGEM- 3ΖΠ+)の Hindi I I、EcoRI部位にサブクローンした結果、 平滑末端同士で 連結された部分においては 遺伝子の 0RF部分であるが、 コードされるァミノ 酸が置換されることなく、 l認識部位が除去された。 このプラスミドに PHN143 と名前を付けた。
〔実施例 4〕
ベクタ一プラスミド PHN62の構築
チォストレプトンによって誘導型発現をさせるためには Rhodococcus属細菌内 に TipA タンパク質を存在させなければならない。 そのために、 Rhodococcus erythropol i sから構成的なプロモー夕一を分離し、 その下流に TipAタンパク質 をコードする構造遺伝子を連結した（図 3 )。構成的に機能するプロモーターとし ては Rhodococcus erythropol i sのアルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコ ードする ThcA遺伝子 (Nagy et al. , J. Bac teriol. ΥΠ 676-687 (1995) ) のプ ロモ—夕—配列を用いた。
テンプレートに使用する St reptomyces coe l icolor A3 (2)株のゲノム DNA は Streptomyces azureusからゲノム DNAを調製したときと同様に作業し、精製した。 また、 Rhodococcus erythropol i s JCM3201株のゲノム DNAは 5mlの LB培地で培 養した点を除いては Streptomyces azureusからゲノム DNAを調製したときと同様 に作業し、 精製した。
上述のように精製した Streptomyces coel icolor A3 (2)株のゲノム DNAをテン プレートとして、 配列表中の配列番号 1 3、 1 4に記載のプライマ一を用いて、
PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRにはプラチナ Pfx DNAポリメラーゼを用 いた。その結果、 T ipA遺伝子の ORF並びにその下流の転写終結配列を含む DNA (図 中においては TipAと表記） を得た。 .
この PCR断片の片方の末端を ΜΠで消化して得られた 0. 9kbの DNA断片を精 製し、さらに常法により平滑末端側の 5 '末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼに よりリン酸化した。 一方、 上述のように精製した Rhodococcus erythropo l i s JCM3201株のゲノム DNAをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 1 5、 1 6 に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 アルデヒド デヒドロゲナ一ゼ様タンパク質をコードする The A 遺伝子 (Nagy e t al. , J. Bac ter i ol. Π7 676-687 (1995) ) のプロモーター配列 （図中においては ALMp と表記） を含む DNAを得た。 なおこの PCRにはプラチナ P fx DNAポリメラ一ゼを 用いた。この PCR断片の片方の末端を I Iで消化して得られた 0. 2kbの DNA断片 を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナー ゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR断片を同時にプラスミド pGEM- 3ΖΠ+) の I I、 HI部位にサブクローンした結果、 ThcA遺伝子のプロモーター配列の すぐ下流に TipA遺伝子の 0RF並びに転写終結配列を含むプラスミドが作成され、 PHN33と名前を付けた。
次に PHN33に存在する制限酵素 l認識部位 2力所（以下、 I (1)、 Ncol (·2) と表記する） を除去するため以下の作業をおこなった。
まず、 プラスミド ΡΗΝ33をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 9、 1 7 に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRにはプラ チナ Pfx DNAポリメラ一ゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を I Iで消化し て得られた 0. 5kbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を
T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、 プラスミド PHN33をテ ンプレートとして、配列表中の配列番号 1 8、 1 2に記載のプライマーを用いて、
PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRにはプラチナ Pix DNAポリメラーゼを用 いた。この PCR断片の片方の末端を Iで消化して得られた 0. 6kbの DNA断片を 精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼ によりリン酸化した。 これら 2つの PCR断片を同時にプラスミド pGEM-3Z f (+)の I、 toi部位にサブクローンした結果、 平滑末端同士で連結された部分におい ては TipA遺伝子の 0RF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることな く、 I (1)認識部位が除去された。 このプラスミドに PHN50と名前を付けた。 次に pHN33に存在する制限酵素認識部位 tel (2)を除去するため以下の作業を おこなった。 まず、 プラスミド PHN33をテンプレートとして、 配列表中の配列番 号 9、 1 9に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCR にはプラチナ Ρίχ丽 Aポリメラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を I I で消化して得られた 0. 8kbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。 一方、 プラスミド P皿 33 をテンプレー卜として、 配列表中の配列番号 2 0、 1 2に記載のプライマ —を用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRにはプラチナ Pfx DNAポリ メラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を ¾1で消化して得られた 0. 3kb の DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオ チドキナーゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR 断片を同時にプラスミド pGEM- 3Ζί (+)の I、KmI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結され た部分においては TipA遺伝子の 0RF部分であるが、コードされるァミノ酸が置換 されることなく、 l (2)認識部位が除去された。 このプラスミドに PHN51と名前 を付けた。
最後に以下の作業を行った。 PHN50 を ¾1 と ^ I で二重消化して得られた 0. 7kbの DNA断片と pHN51を lと ΜΙで二重消化した 0. 4k の断片を同時に プラスミド GEM-3Zf (+)の Xbal、 Kpnl部位にサブクローンした。 結果、 I (Dと Ncol (2)両方の制限酵素部位を欠いた TipA遺伝子を持つプラスミドを取得し、 こ れに pHN62と名前をつけた。
〔実施例 5〕
ベクタープラスミド PHN 153の構築
目的のタンパク質を誘導的に発現せしめることができるかどうか確認するため に、 TipA遺伝子のプロモーターの下流にレポ一夕一遺伝子として Thermopl asma acidophi lum由来のプロリンィミノべプチダーゼ (Tamura et al.， FEBS Let t. 398
101-105 (1996) ：以下 PIPと略記する） をコードする遺伝子の 0RF (図中におい ては PIP 0RFと表記） を連結し、 さらにその下流に転写のリードスルーを抑制す るために転写終結配列を連結した。 以下に具体的に述べる （図 4 )。 .
実施例 4にて精製した Streptomyces coel icolor A3 (2)株のゲノム DNAをテン プレートとして、 配列表中の配列番号 2 1、 2 2に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 TipA遺伝子のプロモーター配列 (図中にお いては TipApと表記）を含む 0. 2kbの増幅された DNAを得た。なおこの PCRにはプ ラチナ Pix DNAポリメラ一ゼを用いた。 この断片を精製し、 常法により 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミド pBluescript I I SK (+)の I部位にサブクローンした （サブクローンされた向きは DNAの 5'方 向から l認識部位- ΠΡΑ遺伝子プロモーター配列- Sacl認識部位である）。この プラスミドに pHN150uと名前を付けた。
次に、 プラスミ pRSET-PIP (Tamura et al. , FEBS Let t. 398 101 - 105 (1996) ： 以下 PIPと略記する） をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 3 , 2 4に 記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 なお、 配列表中の配列番 号 2 4のプライマ一は PIP遺伝子の終止コドンを除いて、 かつタンパク質の精製 を容易にするために 6 XHi sタグが PIPタンパク質の C末端に付くように設計され ている。 6 xHisタグは、 6つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、 こ れを融合したタンパク質は、 ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。 従って、 ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマ卜グラフィ一で精製が容 易になる （Crowe et al. , Methods Mol. Biol. 371-387 (1994) )。 この PIP 遺伝子を含む 0. 9kbの DNA断片を制限酵素 l と lで二重消化し、 pHN150u の NcoL I部位にサブクローンした結果、 TipA遺伝子のプロモーター配列の すぐ下流に PIP遺伝子の 0RFを含むプラスミドが作成され、 pHN151uと名前を付 けた。
次に、 実施例 4にて精製した Rhodococcus erythropol is KM3201株のゲノム DNA をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 5， 2 6に記載のプライマー を用いて、 PCRによる増幅を行った。その結果、 ThcA遺伝子の転写終結配列 (Nagy et al. , J. Bacteriol. Π7 676-687 (1995) ： 図中においては ALDHtと表記) を含む DNAを得た。この 0. 2kbの DNA断片を制限酵素 lと I Iで二重消化し、 pHN151uの I、 I I部位にサブクローンした。 その結果、 TipA遺伝子のプロモ 一ター配列のすぐ下流に PIP遺伝子の 0RFを含み、またそのすぐ下流に ThcA遺伝 子の転写終結配列を含むプラスミドが作成され、 PHN153と名前を付けた。
〔実施例 6〕 ベクタープラスミド PHN169の構築
Rhodococcus erythropolisをプラスミドで形質転換するためには適当な形質転 換マー力一が必要になる。 そこで Rhodococcus属細菌内で機能する強力なプロモ —ターの下流に薬剤耐性遺伝子を連結し、 使用することとした。 プロモーターと しては、 Streptomyces 属細菌由来の Elongation factor Tu をコードする Tuf 1 遺伝子プロモーターを用いることとしたが、 これは同プ口モーターが強力に下流 の遺伝子を転写せしめるとの報告があるからである （Wezel et al.， Biochim. Biophys. Acta 1219 543-547 (1994))。 また、 薬剤耐性遺伝子は入手が容易なテ トラサイクリン耐性遺伝子を用いた。 以下に具体的に述べる （図 5)。
実施例 4にて精製した Streptomyces coelicolor A3 (2)株のゲノム DNAをテン プレートとして、 配列表中の配列番号 27、 28に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 Tufl遺伝子のプロモーター配列 (図中にお いては Tuflpと表記） を含む 0.2kbの増幅された DNAを得た。 なおこの PCRには プラチナ PixDNAポリメラ一ゼを用いた。 この断片を精製し、 常法により 5'末端 を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミド pBluescript II SK (+) の HncII 部位にサブクローンした （サブクローンされた向きは DNA の 5'方向から ml認識部位- Tufl遺伝子プロモーター配列- EcoRI認識部位であ る）。 このプラスミドに PHN158と名前を付けた。
次に、 プラスミド PACYC184 (Rose, Nucleic Acids Res. 16 355 (1988)) をテ ンプレートとして、配列表中の配列番号 29、 30に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 テトラサイクリン耐性遺伝子 （図中にお いては Tetfと表記） を含む DNAを得た。 この 1.3kbの DNA断片を制限酵素 1 I と lで二重消化し、 PHN158の I、 I部位にサブクローンした結果、 Mi 遺伝子のプロモータ一配列のすぐ下流にテトラサイクリン耐性遺伝子を含むブラ スミドが作成され、 PHN159と名前を付けた。
次に PHN159に存在する制限酵素認識部位 lHIを除去するため以下の作業をお こなった。 まず、 プラスミド PHN159をテンプレートとして、 配列表 3 1、 32に 記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの DNA断片は Piu turbo DNAポリメラーゼを用いたため、 その末端は平滑末端である。 この PCR断 片の片方の末端を I Iで消化して得られた 0.5k の DNA断片を精製し、さらに常 法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し た。 一方、 プラスミド PHN159をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 3 3、 3 4に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRには Pfu turbo DNAポリメラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を lで消化 して得られた 1. lkbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端 を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR断片を 同時にプラスミド pB luescript I I SK (+)の I I、 Not l部位にサブクローンした 結果、 平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子の 0RF部分であるが、 コードされるァミノ酸が置換されることなく、 lHI部位が除 去された。 このプラスミドに PHN165と名前を付けた。
次に PHN159に存在する制限酵素認識部位 ilを除去するため以下の作業をお こなった。 まず、 プラスミド PHN159をテンプレートとして、配列表中の配列番号 3 1、 3 5に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCR には Pfu turbo DNAポリメラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を 1 で消化して得られた 0. 8k の DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。 一方、 プラスミド PHN159をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 3 6、 3 4に記載のプライマ 一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRには Pfu turbo DNA ポリメ ラ一ゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を l で消化して得られた 0. 8kb の DNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチ ドキナーゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR 断片を同時にプラスミ ド pBluescript I I SK (+) の 1 Ι、 I部位にサブクローンした結果、 平滑末端同 士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子の 0RF部分であるが、 コードされるアミノ酸が置換されることなく、 l認識部位が除去された。 この プラスミドに pHN166と名前を付けた。
最後に以下の作業を行った。 PHN166 を Ml と l で二重消化して得られた 0. 9kbの DNA断片を PHN165の I、 I部位にサブクローンした。 結果、 BamHI と l 両方の制限酵素認識部位を欠くテトラサイクリン耐性遺伝子クローンを 取得し、 このプラスミドに PHN169と名前をつけた。
〔実施例 7〕 ベクタープラスミド pHN170、 ρΗΝΠΙの構築
実施例 2から 6までに分離してきた遺伝子群を連結し、 Rhodococcus 属細菌内 で誘導可能な発現ベクターを構築するために以下の作業を行った （図 6 )。
P腿 143を lで消化して得られた 1. lkbの DNA断片を pHN136の l部位に サブクローンした （サブクローンされた向きは DNAの 5'方向から推定 RepB遺伝 子 ORF- tsr遺伝子 0RF-アンピシリン耐性遺伝子 0RFである）。 その結果できたプ ラスミドに PHN144と名前をつけた。
次に、 PHN62を I Iと lで二重消化して得られた 1. lkbの DNA断片を PHN144 の I I、 I部位にサブクローンした。 その結果できたプラスミドに PHN152と 名前をつけた。
次に、 PHN153 を lGI と I I で二重消化して得られた 1. 2k の DNA断片を PHN152 の lGI、 I 部位にサブクローンした。 その結果できたプラスミドに PHN154と名前をつけた。
次に、 PHN169を I Iと lで二重消化して得られた 1. 6kbの DNA断片を PHN154 の bal部位にサブクローンした （サブクローンされた向きは DNAの 5'方向から tsr遺伝子 ( F-テトラサイクリン耐性遺伝子 ORF- ThcA遺伝子プロモーター配列で ある）。 その結果 ΠρΑ遺伝子プ口モーターの制御下に置かれた PIP遺伝子を含む プラスミドが作成され、 できたプラスミドに ρΗΝΠΟと名前をつけた。
また組み換えタンパク質の高発現化のため、 TipA遺伝子プロモ一夕一下流の'」 ポソーム結合部位を翻訳効率の良いとされるラムダファージ genelO 由来の配列
(Gold and Stormo, Methods Enzymol. 185 89-93 (1990) ) に変化させた （図 6 )。 以下に具体的に述べる。
プラスミド PHN170をテンプレ一トとして、配列表中の配列番号 2 1 , 3 7に記 載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 TipA遺伝子プロ モータ一とラムダファージ gene 10 由来リボソーム結合部位からなるハイブリッ ドプロモータ一 (以下 TipA- LG10 プロモーターと表記する： 図中に置いては TipA-LGlOpと表記） を得た。 この 0. 2k の DNA断片を制限酵素 GI と lで 二重消化し、 PHN170の lGI、 Ncol部位にサブクローンした。その結果 TipA- LG10 プロモーターの制御下に置かれた £1 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 でき たプラスミドに PHN171と名前をつけた。 図 2 2に TipAプロモーター配列を、 図 2 3に TipAプロモ一夕一の TipA- LG10プロモータ一への改変のためのリボソーム 結合部位 (RBS)配列の改良を示す。
〔実施例 8〕
ベクタ一プラスミド pTip -丽 1、 Tip-CHK pTip-LNHK pTip- LCH1の構築
実施例 7で述べたプラスミドからレポ一夕一である PIP遺伝子を除き、 マルチ クロ一ニング部位を導入するため以下の作業を行った （図 7 )。
配列表中の配列番号 3 8、 3 9に記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド はマルチクロ一ニング部位になる配列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ。 こ れら 2つを等モル量ずつ混合し、 70°Cで 10分処理し、 20分かけて室温に冷却し、 2本鎖化させた。 その結果、 その末端は felと lで二重消化されたベクター と連結可能な状態になり、この 2本鎖化した合成 DNA (図中においては MCS Linker 丽 coと表記） を ρΗΝΠΟの I、 I部位にサブクローンした。 その結果できた プラスミドに pTip- NH1と名前をつけた。 また、 配列表中の配列番号 4 0、 4 1に 記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド （マルチクロ一ニング部位になる配 列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ） を同様に 2本鎖化させた合成 DNA (図 中においては MCS Linker CNcoと表記） を ρΗΝΠΟの I、 I部位にサブクロ —ンした。 その結果できたプラスミドに pTip-CHlと名前をつけた。
実施例 7で述べた TipA遺伝子プ口モータ一配列とラムダファ一ジ gene lQ由来 リボソーム結合部位からなるハイプリッド DNAを制限酵素 lGIと Iで二重消 化し、 Tip-NHl と Tip-CHlの BsrGI、 I部位にそれぞれサブクローンした。 結果得られたプラスミドに pTip- LNH1、 pTip-LCHlとそれぞれ名前を付けた。 ' 〔実施例 9〕
ベクタ一プラスミド pTip-NH2、 pTip- CH2、 pTip - LNH2、 pTip- LCH2の構築
実施例 8で述べたプラスミド pTip-腿、 Tip-CHK pTip -醒、 Tip-LCHlにお いて、 マルチクローニング部位の最も上流の Ncol部位を Ndelに変更するために 以下の作業を行った （図 8 )。
プラスミド ρΗΝΠΟをテンプレートとして、配列表中の配列番号 2 1、 4 2に記 載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 TipA遺伝子プロ モーターを含む DNAを得た。この 0. 2kbの DNA断片を制限酵素 lGI と腿 Iで二 重消化し、 ρΗΝΠΟの GI、 腿1部位にサブクローンした。 結果得られたプラス ミドに HN183と名前を付けた。
配列表中の配列番号 4 3 , 4 に記載の合成オリゴデォキシリボヌクレオチド はマルチクローニング部位になる配列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ。 こ れら 2つを等モル量ずつ混合し、 70°Cで 10分処理し、 20分かけて室温に冷却し、 2本鎖化させた。 その結果、 その末端は Ndelと Spelで二重消化されたベクター と連結可能な状態になり、この 2本鎖化した合成 DNA (図中においては MCS Linker '丽 deと表記） を PHN183の l、 I部位にサブクローンした。 その結果できた プラスミドに pTip- NH2と名前をつけた。 また、配列表中の配列番号 4 5、 4 6に 記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド （マルチクローニング部位になる配 列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ） を同様に 2本鎖化させた合成 DNA (図 中においては MCS Linker CNdeと表記） を pHN183の fcl、 I部位にサブクロ —ンした。 その結果できたプラスミドに pTip-CH2と名前をつけた。
プラスミド pTip-LNHlをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 1、 4 7 に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 TipA遺伝子 プロモ—ターとラムダファージ genelQ 由来リポソーム結合部位からなるハイブ リッド DNAを得た。この 0. 2kbの DNA断片を制限酵素 GIと Ndelで二重消化し、 pTip-NH2と pTip- CH2の lGI、 Ndel部位にそれぞれサブクローンした。 結果得 られたプラスミドに pTip- LNH2、 pTip-LCH2とそれぞれ名前を付けた。
実施例 8， 9で作成したプラスミドのマップと、 マルチクローニング部位周辺 の配列をまとめて図 9に示す。該図中、実線の矢印は ΠρΑ遺伝子プロモーター中 に存在する Inverted repeat配列を示す。斜線の矢印は ThcA遺伝子転写終結配列 に存在する Inverted repeat配列を示す。 また、 原核生物のプロモーター領域に 一般的に存在し、 遺伝子の転写に重要な- 10領域、 -35領域、 RBSは四角で囲んで ある。また RBSの中でも最も重要な SD配列（Shine and Dalgarno, Eur. J. Bioc em.
57 221-230 (1975) ) は下線を引いてある。 図 9 a中のチォストレプトン誘導シス テムは、 Thior、 ALDHpゝ TipA、 TipAp, TipA- LGlOpおよび ALDHtを含む。 TMo1"は、
R. erythropol isにチォストレブトン耐性を付与する。また、 ALDHpは TipA夕ンパ ク質を構成的に産生するプロモーターを示し、 TipAは TipAタンパク質をコード する。 また、 TipApは TipAプロモーターを示し、 TipA-LGlOpは改良 TipAプロモ 一夕一を示し、 ALDHt は転写終結配列を示す。 さらに、 プラスミドの自律複製に 必須な領域として、 ColElおよび RepA&Bを含む。 ColElは大腸菌用であり、 RepA &Bは R. erytliropoUs用である。さらに、抗生物質耐性マ一カーとして Tunp_Tetr および Amprを含む。 Tuflp- Tetrは . erythropolis用形質転換マーカ一であり、 Amprは大腸菌用形質転換マーカーである。
〔実施例 10〕
ベクタ一プラスミド Tip-CHl.1、 Tip-CH2.1、 Tip-LCHl.1、 Tip-LCH2.1の構築 実施例 8及び 9で述べたプラスミド Tip-CHK pTip-CH2, pTip-LCHK pTip-LCH2 において、マルチクローニング部位の I I部位以降の読み枠を市販の pETベクタ 一 （Novagen社） の読み枠と一致させるために以下の作業を行った （図 10)。 プラスミド pTip- CH1をテンプレートとして、配列表中の配列番号 21, 104 に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 TipA遺伝子 プロモーターとマルチクローニング部位を含む DNAを得た。 この 0· 3kbの DNA断 片を制限酵素 BsrGIと lで二重消化し、 pTip- CH1の iGI、 I部位にサブ クローンした。 結果得られたプラスミドに pTip-CHl.1と名前を付けた。
プラスミド pTip_CH2をテンプレートとして、配列表中の配列番号 21, 104 に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 TipA遺伝子 プロモータ一とマルチクローニング部位を含む DNAを得た。 この 0.3kbの DNA断 片を制限酵素 lGIと lで二重消化し、 pTip-CHlの GI、 Spel部位にサブ クローンした。 結果得られたプラスミドに pTip-CH2.1と名前を付けた。
プラスミド pTip-LCHlをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 21、 10 4に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 TipA- LG 10 プロモーターとマルチクローニング部位を含む DNAを得た。 この 0.3kbの丽 A 断片を制限酵素 GIと lで二重消化し、 PTip- CH1の lGI、 Spel部位にサ ブクローンした。 結果得られたプラスミドに pTip- LCH1.1と名前を付けた。
プラスミド pTip_LCH2をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 21、 10 4に記載のプライマ一を用いて、 PCIMこよる増幅を行った。 その結果、 TipA-LGlQ プロモーターとマルチクロ一ニング部位を含む DNAを得た。 この 0.3k の DNA 断片を制限酵素 GIと lで二重消化し、 pTip_CHlの lGI、 I部位にサ ブクローンした。 結果得られたプラスミドに pTip-LCH2.1と名前を付けた。
〔実施例 11〕 ベクタ—プラスミド pHN 172、 pHN173の構築
発現の誘導が厳密に調節されているかを調べるために以下のようなコントロー ル実験用プラスミドを作成した （図 1 1 )。
PHN169を I Iと lで二重消化して得られた 1. 6k の DNA断片を pHN144の al部位にサブクローンした（サブクローンされた向きは DNAの 5'方向から in 遺伝子 0RF-テトラサイクリン耐性遺伝子 0RF-アンピシリン耐性遺伝子 0RFであ る）。 その結果できたプラスミドに PHN172と名前をつけた。
次に、 PHN153 を GI と 1 で二重消化して得られた 1. 2k の DNA断片を PHN144 の BsrGL Spel 部位にサブクローンした。 その結果できたプラスミドに PHN164と名前をつけた。次いで、 PHN169を I Iと lで二重消化して得られた 1. 6k の DM断片を PHN164の ¾1部位にサブクローンした （サブクローンされ た向きは DNAの 5'方向から t sr遺伝子 0RF-テトラサイクリン耐性遺伝子 0RF -ァ ンピシリン耐性遺伝子 0RFである）。 その結果できたプラスミドに pHN173と名前 をつけた。
PHN170は、 TipA遺伝子プロモーター、 その下流に £I£ 0RF、 さらにその下流に
ThcA 遺伝子転写終結配列、 の 3因子が連結された遺伝子カセッ ト （以下
Express ion casset te と表記） と、 ThcA遺伝子プロモー夕一、 その下流に TipA 遺伝子、 の 2因子が連結された遺伝子カセット （以下 Inducer casse t teと表記） 両方をもつ。 PHN173は Express ion casse t teのみをもち、 pHN172は両 casset te を持たない。
〔実施例 1 2〕
Rhodococcus属細菌の形質転換
Rhodococcus erythro oHs JCM3201株を LB培地 100mlにて対数増殖期に至る まで 30°Cで振とう培養する。 培養液を 30分間氷冷し、 遠心分離し、 菌体を回収 する。 これに 100mlの氷冷滅菌水を加え、 よく撹拌し、 再び遠心分離し、 菌体を 回収する。 これに 100mlの氷冷 10%グリセリン溶液を加え、 よく撹拌し、 遠心分 離し、 菌体を回収する。 この氷冷 10%グリセリン溶液での洗浄をもう一度繰り返 し、 菌体を 5mlの氷冷 10%グリセリン溶液に懸濁する。 400 /i lずつ分注し、 液体 窒素で瞬間冷凍し、使用するまで- 80°Cにて保存した。 -80°Cから菌体を取り出し、 氷上にて融解し、 プラスミド ρΗΝΠ0、 または ρΗΝΠ2、 または ρΗΝ173を 3 1 (そ れぞれ約 300ng)加えた。 この菌体と DNAの混合液をエレクトロポレーシヨンキュ ベット （Bio-Rad社： 0.2cmギャップキュベット） に移し、 同社の遺伝子導入装置 ジーンパルサー IIを用いて、 電場強度 12.5kV/cmで、 パルスコントローラーの設 定はキャパシタンス 25/xF、外部抵抗 400Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電 気パルス処理した菌体と DNAの混合液を 1mlの LB培地に混合し、 30°Cにて 4時間 培養した後集菌し、 20/2 g/mlテトラサイクリン入り LB寒天培地（寒天は濃度 1.8¾) に塗布し、 30°Cにて 3日培養し、 それぞれの形質転換体を得た。
〔実施例 1 3〕
Rhodococcus属細菌における PIP活性の測定 1
構築された発現ベクターにはレポーター遺伝子として 遺伝子が組み込まれ ており、 チォストレプトンによる誘導性、 誘導の強さなどを、 PIP の酵素活性を 測定することで、 確認することができる。 菌体中に存在する PIPの量は人工基質 H-Pro-j3NA (Bachem社製） を加水分解する活性を調べることで容易に定量が可能 である。
実施例 12にて作成した Rhodococcus eryt ropol is JCM32Q1株の形質転換体を 8 ig/mlのテトラサイクリンを含む LB培地で 30でにて培養し、 600mnの波長で測 定したオプティカルデンシティ一 （O.D.600) が 0.6になった時点で、 終濃度 1 g/mlになるようにチォストレプトン（溶媒はジメチルスルホォキサイド）を加え、 PIPの発現を誘導させた。
16 時間後に培養液の一部を取り出し、 8 zg/ml のテ卜ラサイクリンを含む LB 培地で 200 1にメスアップし、 60°Cにて 1分加温する。そこに PIPの基質として 2n \ の H- Pro- jSNA (100mM:溶媒はジメチルスルホオキサイド） を加え 60°Cにて 20分インキュベートする （PIPは 60°Cが至適温度）。 PIPよって H-Pro-/3NAから 加水分解されて遊離した^ NA を観察するために、 発色剤として 134 1 の Fast Garnet GBC Salt 溶液 （和光純薬社製で濃度 0.5mg/ml ： 1M酢酸ナトリゥムバッ ファ一 （pH4.2)、 10% Triton X-100が溶媒） を加える。 PIPが発現していなけれ ば上記混合液は黄色を呈するが、 発現していれば赤色を呈する。 また、 呈色した 赤色を吸光分光光度計を用い、 550nniでの吸光度 （A550) を測定し、 PIP活性を定 量した。 測定は FastGarnet GBCSaltを加えた後、 滅菌水 666 1を加え希釈して 行った。 その際、 550nm では細胞のオプティカルデンシティ一も測定してしまうので、 550nmでの細胞のオプティカルデンシティ一 （O. D. 550) は別測定し、 測定時に使 用した 0. D. 550に相当する値を A550の値から差し引いて補正した値を Ac550とす る。 すなわち、 Ac550=A550— O. D. 550 X PIP の活性測定に使用した培養液量 （ml) で計算される。 ユニット値は 「20 分間の測定で得られる、 培養液 1ml あたり、 0. D. 600=1あたりの Ac550の値」 とし、 「Ac550÷PIPの活性測定に使つた培養液量 (ml) ÷0. D. 600」 で計算した。
ρΗΝΠΟで形質転換した細胞において、チォストレプトンを加えずに培養した場 合は黄色を呈したが、 加えた場合赤色を呈した。 pHN172、 PHN173で形質転換した 細胞においては、 チォストレプトンの有無に関わらず、 黄色を呈した。
実施例 1 2にて作成した Rhodococcus erythropol i s JCM3201株の形質転換体を 8 /mlのテトラサイクリンを含む LB培地で 30°Cにて培養し、 0. D. 600が 2. 0に なったら、 直ちに 4°Cに温度を下げ、 菌体を馴化させるために、 1時間振とう培養 した。 そこに終濃度 l g/ml になるようにチォストレプトンを加え、 PIPの発現 を誘導させた。 40時間後に培養液の一部を取り出し、上記 30°Cと同様の実験を行 つた。
PHN170 で形質転換した細胞において、チォス卜レプトンを加えずに培養した場 合は黄色を呈したが、 加えた場合赤色を呈した。 ρΗΝ172、 ΡΗΝΠ3で形質転換した 細胞においては、 チォストレプトンの有無に関わらず、 黄色を呈した。
以上の結果をまとめて図 1 2に示す。
図 1 2に示すように Rhodococcus erythropol i s JCM3201株を ρΗΝΠ0、ρΗΝ172、 PHN173で形質転換し、 30 、 4°Cで PIPを発現させた時と発現させない時、 それ ぞれの PIP活性を測定した。 図 1 2には終濃度 l g/mlのチォストレプトンを加 えたか否か （+または-）、 活性値、 培養温度、 活性測定に使用した培養液量、 形 質転換したプラスミド、 プラスミドの持つ 「Casset te」 の有無 （+または-） が示 されている。
この結果から、 広範な温度域において、 チォストレプトンによって誘導可能な 発現べクターが構築されたことが確認された。
〔実施例 1 4〕
Rhodococcus属細菌における PIP活性の測定 2 実施例 1 2にて作成した Rhodococcus erythropolis JCM3201 株を pHN170、 PHN171で形質転換体した細胞の PIP活性を実施例 1 3に準じて測定した。
図 1 3に終濃度 l g/mlのチォストレプトンを加えてから時間を追って PIP活 性を測定した結果を示す。 該図は Rhodococcus erythropolis JCM3201 株を PHN170で形質転換し、 30° (：、 4°Cで PIPを発現させた時の活性を時間を追って測 定したものを示す。 図 1 3中、 縦軸は PIPの活性値 （ユニット）、 横軸は終濃度 1 ^g/mlのチォストレプトンを加えてからの時間（分）を示す。 4°Cの「〇」は 0. D.600 が 1.0の時に発現誘導開始させた時、 「口」は 0. D.600が 2.0の時に発現誘導開始 させた時の活性を示す。 30°Cの 「〇」 は O.D.600が 0.6の時に発現誘導開始させ た時、 「口」 は O.D.600が 1.0の時に発現誘導開始させた時の活性を示す。
また、 図 14に加えるチォストレプトンの終濃度を変化させて測定した結果を 示すが、発現誘導時間は 4°Cが 0. D.600=2.0で誘導開始し、 2400分（40時間）で、 30°Cが 0. D.600= 0.6で誘導開始し、 960分 （16時間） である。 図 14に示す実施 例においては、 Rhodococcus erythropolis JCM3201株を ρΗΝΠΟで形質転換し、 30°C、4°Cで PIPを発現させた時の活性を加えるチォストレプトンの濃度を変えて 測定したものを示す。 図 14中、 縦軸は PIPの活性値 （ュニット）、 横軸は培地中 に添加したチォストレプトンの終濃度 （ g/ml) を示す。
この結果から、 発現誘導には 30°Cでも 4°Cでも、 l g/mlのチォストレプトン で十分なことが判明した。 また、 発現誘導の時期によるが、 30°Cの場合は 500か ら 1000分 （約 8 - 16時間） 程度、 4°Cの場合は 3000分 （50時間） からそれ以上で 細胞あたりの PIPの発現量は最大に達することが示された。
〔実施例 1 5〕
Rhodococcus属細菌における PIP活性の測定 3
Rhodococcus erythropolis JCM3201株、 Rhodococcus fascians KM10002株、
Rhodococcus opacus DSM44193株において実施例 1 2と同様に pHN170による形質 転換を行った。 その結果、 ρΗΝΠΟによって Rhodococcus erythropolisのみなら ず、 Rhodococcus fascians、 Rhodococcus opacusをも开質転換することができた。 従って、 PHN170中に導入された、 Rhodococcus erythropolis謂 895株由来の自 律複製起点は Rhodococcus fascians Rhodococcus opacusにおいても機能するこ とが示された。 また、 これらの形質転換体を用いて、 実施例 1 3に準じて PIP活 性を測定した。なお、いずれの菌株においても、発現誘導時間は 4°Cが 0. D.600=2.0 で誘導開始し、 2400分 （40時間） で、 30°Cが O.D.600= 0.6で誘導開始し、 960 分（16時間）である。結果を図 1 5に示す。図 1 5には、;hodococcus erythropolis M3201株、 Rhodococcus fascians JCM10002株、 hodococcus opacus DSM44193 株を PHN170で形質転換し、 30° (：、 4 で PIPを発現させた時と発現させない時、 それぞれの PIP活性を測定した。 図には終濃度 1 ig/mlのチォストレプトンを加 えたか否か（+または-)、活性値、培養温度、活性測定に使用した培養液量、 HN170 で形質転換された宿主、 が示されている。
PHN170で形質転換されたすベての Rhodococcus属細菌において、チォストレプ トンを加えずに培養した場合は黄色を呈したが、 加えた場合赤色を呈した。 しか し、 Rhodococcus fascians JCM10002株、 Rhodococcus opacus DSM44193株におい ては Rhodococcus erythropolis JCM3201株に比べて発現は低かった。
〔実施例 16〕
Rhodococcus属細菌における外来タンパク質の発現と精製 1
PHN170 (実施例 7に記載）、 HN171 (実施例 7に記載） を用いて、 実施例 1 2と 同様に Rhodococcus erythropolis JCM3201株を形質転換し、 実施例 1 3に準じて PIPを 30°C、 4°Cでそれぞれ発現させた。 ここでは、 終濃度 l g/mlのチォストレ プトンを加えた後、 時間を追って菌体を回収し、 PIPの精製を行った。 PIPの C末 端には 6XHisタグがついており、 Ni- NTA Superflow (Qiagen社製） を用いて、 その使用説明書に準じて精製を行った。
以下に具体的な精製法を示すが、 精製の作業は 4°Cで行った。 タンパク質を発 現させた菌体 （20ml 培養液分） を回収し、 1ml の NT- Buffer (50mM Tris-HCl (pH8.0)、 lOOmM塩化ナトリウム、 lmMジチオスレィトール） に懸濁し、 lgのガラ スビーズ （直径 0.105- 0.125 ミリメートル） を加えた。 これを Fast- prep FP120
(SAVANT社製) にて 6m/秒の速度、 20秒間往復振とうさせることで、 細胞を破壊 した。 20, OOOXgにて遠心し、 その上清 に、 予め NT-Buiierで平衡化され た Ni-NTA Superflowをべッド体積 40 1になるように加えた。 これを 1時間回転 撹拌しながら Ni- NTA Superflowビーズと 6XHisタグのついたタンパク質とを結 合させた。このビーズを NT - Bufferで 4回洗浄した後、 の NTE-Bufier (50mM
Tris-HCl (pH7.0)、 lOOmM塩化ナトリウム、 lmMジチオスレイト一ル、 400mMィ ミダゾール） に 3回懸濁することで、 ビーズから 6 X Hi sタグのついたタンパク質 を溶出させた。
上記サンプルのうち 10 /_U を常法に従い、 12% SDSポリアクリルアミド電気泳 動に供した結果を図 1 6に示す。 Rhodococcus erythropo l i s JCM32Q 1株を ΗΝΠΟ (T ipA遺伝子プロモ一夕一からの発現：左 2枚の図）、 pHN171 (TipA-LGl Oプロモ —夕一からの発現：右 2枚の図） で形質転換し、 4°C (上 2枚の図）、 30°C (下 2 枚の図）で P IPを発現させた。終濃度 l g/mlのチォストレプトンを加えてから、 時間を追って菌体を回収し、 PIP の C末端につけられた 6 X Hi s タグを利用して Ni-NTA Superf low を用いて精製した。 菌体を回収した時間は 4°Cにおいては、 0 分 （一番左のレーン）、 180分 （左から 2番目のレーン）、 420分 （左から 3番目の レーン）、 1080分 （左から 4番目のレーン）、 1440分 （左から 5番目のレーン）、 1860分 （左から 6番目のレーン）、 2520分 （左から 7番目のレーン）、 3060分 （左 から 8番目のレーン） で、 30°Cにおいては、 0分 （1番左のレーン）、 120分 （左 から 2番目のレーン）、 240分 （左から 3番目のレーン）、 420分 （左から 4番目の レーン）、 540分 （左から 5番目のレーン）、 720分 （左から 6番目のレーン）、 900 分 （左から 7番目のレーン）、 1440 分 （左から 8番目のレーン） である。 図 1 6 の各図中、一番右のレーンは誘導せずに（すなわちチォストレプトンを加えずに） 培養を続けた菌体から精製したサンプルを示す。 30°Cにおいては、 TipA遺伝子プ 口モーターからの発現に比べると TipA-LG10プロモー夕一からの発現は若干低か つたが、 4°Cにおいては、逆に T ipA-LGlOプ口モーターからの発現の方が高かった。 また、 T ipA-LGlO プロモーターにおいても発現の誘導は厳密にコントロールされ ていた。
両プロモーターからの発現量の詳細な比較は実施例 1 8に詳しく述べる。
〔実施例 1 7〕
Rhodococcus属細菌における外来タンパク質の発現と精製 2
PHN170 (実施例 7に記載）、 ΗΝΠ Ι (実施例 7に記載） を用いて、 実施例 1 2と 同様に Rhodococcus erythropol i s謂 201株を形質転換し、 実施例 1 3に準じて
PIPを 32^、 30°C、 15°C , 4°Cでそれぞれ発現させた。 なお、 発現誘導時間は 4°C が 0. D. 600=2. 0で誘導開始し、 2400分 （40時間） で、 15°Cが 0. D. 600= 1. 0で誘導 開始し、 1500分 （25時間） で、 30°Cが O. D. 600=0. 6で誘導開始し、 960分（16時 間）で、 32°Cが 0. D. 600= 0. 6で誘導開始し、 960分 （16時間） である。 加えたチォ ストレプトンは終濃度 l x g/mlである。 精製は実施例 1 6と同様に行った。
上記サンプルのうち 10 l を常法に従い、 12% SDSポリアクリルアミド電気泳 動に供した結果を図 1 7に示す。 Rhodococcus erythropol i s JCM3201株を ρΗΝΠΟ
(TipA遺伝子プロモータ一からの発現：レーン 1、 3、 5、 7)、 pHN171 (TipA-LGlQプ 口モータ一からの発現：レーン 2、 4、 6、 8) で形質転換し、 4°C (レーン 7、 8)、 15°C
(レーン 5、 6)、 30°C (レーン 3、 4)、 32°C (レーン 1、 2)、 で PIPを発現させた。 PIPの C末端につけられた 6 X Hisタグを利用して Ni- NTA Superf lowを用いて精 製した。
32°Cから 4°Cの広範な温度域において、 TipA 遺伝子プロモータ一、 並びに TipA-LGlQプロモーターからの PIPの発現が確認された。 32°C、 30°Cにおいては TipAプロモーターからの PIPの発現量の方が多かったが、 15°C、 4°Cにおいては TipA-LGlQプロモーターからの発現の方が多かった。
〔実施例 1 8〕
Rhodococcus属細菌における外来タンパク質の発現と精製 3
PIP 以外のタンパク質も該発現ベクターを用いて、 発現させることができるか どうか調べるために、 以下の実験を行った。
プラスミド pRSET-ATPIPをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 4 8、 4 9に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。その結果、 Arabidops i s thal iana由来 PIP遺伝子 (Tamura et al. , FEBS Le t t. 398 101-105 (1996) ：以 下 AtPIPと略記) を含む DNAを得た。 この 1. Okbの DNA断片を制限酵素 l と Iで二重消化し、 pTip- CH1、 並びに pTip- LCH1 の I、 I I部位にそれぞれ サブクローンした結果、 TipA遺伝子プロモーターもしくは TipA-LGlQプロモータ —の制御下に置かれた AtPIP遺伝子 (6 XHi sタグを C末端に持つ） を含むプラス ミドが作成され、 ρΗΝ176、 ΡΗΝΠ7とそれぞれ名前を付けた。
プラスミド pTrc99a-GFPをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 5 0、 5
1に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 Aeguorea vic tor i a由来蛍光緑色タンパク質をコードする遺伝子 (以下 と略記） を含む
DNAを得た。 0. 8kbの DNA断片を制限酵素 fiHIと lで二重消化し、 pTip- NH1 並びに pTip- LNH1の 1、 SnaBI部位にそれぞれサブクローンした結果、 TipA遺 伝子プロモーターもしくは TipA-LGlQプロモーターの制御下に置かれた GFP (6X Hisタグを N末端に持つ） 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 pHN187、 pHN186 とそれぞれ名前を付けた。
プラスミド GEX-2T (アマシャムバイオサイエンス社)をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 52、 53に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を 行った。 その結果、 ダルタチオン- S-トランスフェラーゼタンパク質をコードす る遺伝子（以下 ^1と略記）を含む DNAを得た。 0.7kbの DNA断片を制限酵素 ¾1 と] lで二重消化し、 pTip_NH2、 並びに pTip- LNH2の I、 Xhol部位にそれぞ れサブクローンした結果、 TipA遺伝子プロモーターもしくは TipA-LGlQプロモー ターの制御下に置かれた GST遺伝子 (6XHisタグを N末端に持つ） を含むプラス ミドが作成され、 pHN282、 PHN283とそれぞれ名前を付けた。
PHN170 (実施例 7に記載）、 ρΗΝΠΙ (実施例 7に記載）、雌 76、頻 77、 ρΗΝ187、 ρΗΝ186,ρΗΝ282,ρΗΝ283を用いて、実施例 1 2と同様に Rhodococcus erythropolis JCM3201株を形質転換し、 実施例 1 3に準じて PIP、 AtPIP, GFP, GST各タンパク 質を 30T、 4ででそれぞれ発現させた。 いずれも、 発現誘導時間は 4°Cが O.D.600=2.0で誘導開始し、 2400分 （40時間） で、 30°Cが 0. D.600=0.6で誘導開 始し、 960分 （16時間） で、 加えたチォストレプトンは終濃度 l g/mlである。 なお、 4°Cでは 50ml、 30°Cでは 20mlの培養液から精製を行った。
上記 4種のタンパク質には全て 6XHisタグがついており、実施例 1 6に準じて 精製を行った。
上記サンプルのうち 10^1 を常法に従い、 12% SDSポリアクリルアミド電気泳 動に供した結果を図 1 8に示す。 Rhodococcus erythropolis JCM32Q1株を HN17Q
(TipA遺伝子プロモーターの下流に PIP：レーン 1、 9)、 PHN171 (TipA- LG 10プロ モー夕一の下流に レーン 2、 10)、 pHN176 (TipA遺伝子プロモーターの下流 に AtPIP：レーン 3、 11)、 PHN177 (TipA-LGlQプロモーターの下流に AtPIP： レー ン 4、 12)、 PHN187 (TipA遺伝子プロモーターの下流に GFP：レーン 5、 13), pHN186
(TipA-LGlQプロモータ一の下流に GFP： レーン 6、 14)、 p丽 282 (TipA遺伝子プ ロモ一ターの下流に ^ I： レーン 7、 15)、 pHN283 (TipA-LGlQプロモーターの下 流に^!： レーン 8、 16) で形質転換し、 4°C (レーン 9から 16) 30°C (レーン 1 から 8) で各タンパク質を発現させた。 各タンパク質の末端につけられた 6XHis タグを利用して Ni- NTA Superf lowを用いて精製した。
また、 デンシトメ一夕一にてバンドの密度を測定し、 定量した結果を図 1 9に 示すが、 これは図 1 8で示された SDSポリアクリルアミド電気泳動像のバンドか ら定量したものである。 該図では、 それぞれの外来タンパク質が 1リットルの培 養液からどれだけ精製されたかを示す。単位は Digで示されている。一番右のカラ ム （倍率） は、 TipA 遺伝子プロモーターを用いて発現させた場合に比べて、 TipA-LGlO プロモータ一を用いて発現させた場合、 何倍のタンパク質が精製され るか示されている。 この結果、 4°Cにおいて、 TipA 遺伝子プロモーターよりも TipA-LGlO プロモータ一から発現させる方が、 得られる組み換えタンパク質の量 が多いことがわかった。 しかし、 30°Cの場合は必ずしも TipA- LG10プロモーター から発現させる方が、得られる組み換え夕ンパク質の量が多いとは限らなかった。 〔実施例 1 9〕
大腸菌に対して 30°Cで増殖阻害効果を示すマウス由来タンパク質の分離
具体的にどの遺伝子が発現されると宿主に対して増殖阻害効果を示すのかを調 ベるために、 マウス肝臓由来の Poly (A) }RNA (STRATAGENE社製） を用いて大腸菌 用発現ライブラリーを構築した。 以下に具体的に述べる。
大腸菌用発現べクタ一はァラビノース誘導性ベクターを用いることとした。 ま ず該ベクタ一、 pBAD/HisA (Invi trogen社製） において、 cDNAの導入を容易にす るために、 マルチクローニング部位を改変した pBAD- Linkerを作成した。 以下に その作成過程を述べる。 配列表中の配列番号 5 4、 5 5に記載の合成オリゴデォ キシリボヌクレオチド （I^RI、 ill, Xho I認識部位からなるクローニング配列 を含み、 お互いに相補的な配列を持つ） を等モル量ずつ混合し、 70°Cで 10分処理 し、 20分かけて室温に冷却し、 2本鎖化させた。結果、その末端は l と lindlll で二重消化されたべクタ一と連結可能な状態になり、 これを pBAD/HisAの M^I、 Hindi I I部位にサブクローンした。 その結果できたプラスミドに pBAD-Linkerと 名前をつけた。
STRATAGENE社製 cDNA synthes is ki tを用い、 その使用説明書に従って、 上記 Poly (A) ÷RNAより 2本鎖 cDNAを合成した。 次いで、 この cDNAを pBAD- Linkerの EcoRI> I部位にライゲ―シヨンした。このライゲーシヨン産物を常法に従い、 大腸菌 T0P10 (Invitrogen社製） に形質転換し、 50 g/ml アンピシリン入り LB 寒天培地上にて、 5万個の形質転換体を得た。 その寒天培地のレプリカを 50 g/mlアンピシリンと 0.2% L-ァラビノースを含んだ LB寒天培地に GenHunter社 製 Easy Transfer Replica Plating Deviceを用いて作成し、 タンパク質の発現を 誘導させ、 30°Cにて一晩インキュベートした。 その結果、 ァラビノースを含まな い培地上では生育できるが、 ァラビノースを含む培地上では生育できないコロニ 一が 426個選別された。
この 426個の TOP 10形質転換体を 1.5mlの 50 g/mlアンピシリン入り LB培地 にて培養した後、 常法に従いプラスミドを分離、 精製した。 得られたプラスミド は制限酵素 RI、 Iの二重消化後、 1%ァガロース電気泳動に供し、 マウス由 来の cDNA断片の長さを見積もった。さらに、得られたプラスミドは配列表中の配 列番号 56記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド用い、 DNA シークェンサ 一 ABI PRISM (R) 3100 Genetic Analyzerにて、 マウス由来 cDNA部分の塩基配列 を約 500塩基決定した。 その結果を図 2 0に示す。 該図は BLASTプログラムを用 いて、 決定された DNA配列を元に相同性検索を行い、 遺伝子を同定した結果を示 す。
〔実施例 2 0〕
Rhodococcus属細菌、 並びに大腸菌における外来タンパク質の発現と精製
実施例 1 9にて分離した遺伝子のうち、 Serum amyloid A (Saal)、 NADH de ydorogenase 1 alpha subcomplex 4、 Cytochrome ¾5 like 、 RIKEN1500015G18
Transferrin, Apol i卿 rotein A - V、 Pantoienate kinase 1 β , Peroxiredoxin 4、 IKEN1300017J02 (Transferrin Homo log)を Rhodococcus erythropolis JCM3201 と大腸菌 T0P10を宿主として発現させた。 また、 以下の 4群、 1 0種類のタンパ ク質も同様に発現させた。 1群） 大腸菌で発現させると不活性な封入体となるこ とが知られている 3種類のプロテアーゼ、 CathepsinD, Prothrombin, Kallikrein
6、 2群）その生理活性から大腸菌での発現が困難だと予想される 2種類の DNAse、
LSDNAse, DLAD、 3群）他のグループの研究で、 その細胞増殖阻害活性により大腸 菌での発現が困難だとされているもの、 丽 G- 1、 Kidl、 Bax alpha, 4群） 他のグ ループの研究で、 低温依存的に可溶化されるとされているもの、 Glucokinase、 p37Ao なお、 Rhodococcus erythropolisにおいては 30°Cと 4°Cで、 大腸菌は 30°C で組み換えタンパク質をそれぞれ発現させた。 以下に詳しく述べる。 プラスミド LE20をテンプレートとして、配列表中の配列番号 5 7、 5 8に記載 のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Serum Amyloid Protein A タンパク質 （Meeker et al.， Proteins 30 381-387 (1998)) をコードする Saal遺伝子 (GenBank受入番号 M11131) を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 1と 1 Iで二重消化し、 pTip-LNHlの fcl、 Xhol部位に サブクローンした結果、 TipA-LGlOプロモーターの制御下に置かれた Saal遺伝子 を含むプラスミドが作成され、 PHN205 と名前を付けた。 また、 プラスミド LE20 をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 5 9、 60に記載のプライマ一を用 いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Saal遺伝子を含む DNAを 得た。 この DNA断片を制限酵素 Iと EMIで二重消化し、 pBAD/HisAの XhoL I部位にサブクローンした結果、 ァラビノース誘導性プロモーターの制御下に 置かれた Saal遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN193と名前を付けた。 プラスミド L113をテンプレートとして、配列表中の配列番号 6 1、 6 2に記載 のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 マウス由来 NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4をコードする遺伝子（Walker et al.， J. Mol. Biol. 226 1051-1072 (1992) ： GenBank受入番号 BC011114：以下 NADH4と略記) を含む DNAを得た。この DNA断片を制限酵素 1と EcoRIで二重消化し、 pTip-LNHl の NdeL EcoRI部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlOプロモーターの制御下 に置かれた NADH4遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN206 と名前を付けた。 また、 プラスミド L113をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 6 3、 6 2に 記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来 NADH4 遺伝子を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 1と！^ RIで二重消化し、 PBAD/HisAの X I、 RI部位にサブクローンした結果、 ァラビノース誘導性プ 口モーターの制御下に置かれた NADH遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN195 と名前を付けた。
プラスミド L3をテンプレートとして、配列表中の配列番号 64、 6 5に記載の プライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来 Cytochrome b5 like タンパク質をコードする遺伝子 （GenBank 受入番号 AK002426：以下
Cytochrome b51と略記)を含む DNAを得た。この DNA断片を制限酵素腿1と EcoRI で二重消化し、 pTip-LNHlの fcI、 RI部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQ プロモーターの制御下に置かれた Cytochrome l遺伝子を含むプラスミドが作成 され、 PHN208 と名前を付けた。 また、 プラスミド L3をテンプレートとして、 配 列表中の配列番号 6 6、 6 5に記載のプライマ一を用いて、 PCR による増幅を行 つた。 その結果、 マウス由来 Cytochrome b51遺伝子を含む DNAを得た。 この DNA 断片を制限酵素 I Iと Mで二重消化し、 PBAD/Hi sAの I I、 EcoRI部位にサ ブクローンした結果、 ァラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれた Cytochrome b51遺伝子を含むプラスミドが作成され、 pHN199と名前を付けた。 プラスミド LE123をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 6 7、 6 8に記 載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 マウス由来機能 不明な推定上のタンパク質をコードする遺伝子（GenBank受入番号匪 #025439：以 T LE123と略記)を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 と EcoRIで二 重消化し、 pTip- LM1 の 腿 I、 EcoRI 部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQ プロモーターの制御下に置かれた LE123 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN287と名前を付けた。 また、 プラスミド LE123をテンプレートとして、 配列表 中の配列番号 6 9、 6 8に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 LE123遺伝子を含む DNAを得た。 この MA断片を制限酵素 と RIで二重消化し、 PBAD/Hi sAの XhoI、 EcoRI部位にサブクローンした 結果、 ァラビノース誘導性プロモータ一の制御下に置かれた LE123遺伝子を含む プラスミドが作成され、 PHN276と名前を付けた。
プラスミド LE280をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 7 0、 7 1に記 載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 マウス由来
Trans ferr inをコ一ドする遺伝子 (Mason et aL , Protein Expr. Puri f. 23 142-150
(2001) ： GenBank受入番号 BC022986) を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵 素 Ndel と idinで二重消化し、 pTip- LNH1の fcl、 Hindi I Iで部位にサブクロ ーンした結果、 TipA-LGlQプロモーターの制御下に置かれた Transferr in遺伝子 を含むプラスミドが作成され、 PHN289と名前を付けた。 また、 プラスミド LE280 をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 7 2、 7 1に記載のプライマーを用 いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Trans ferrin遺伝子を含 む DNAを得た。この DNA断片を制限酵素 I Iと Slidl l lで二重消化し、 pBAD/HisA の XhoI、 Sl dll l部位にサブクローンした結果、 ァラビノース誘導性プロモータ —の制御下に置かれた Transferrin遺伝子を含むプラスミドが作成され、 pHN277 と名前を付けた。
プラスミド LE295をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 7 3、 7 4に記 載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Apol ipoprotein A- Vをコードする遺伝子 (van der Vl iet et al. , J. Biol. Chem. 276 44512-44520 (2001) ： GenBank受入番号丽 #080434:以下 Apoa5と略記) を含 む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 felと RIで二重消化し、 pTip- LNH2 の NcoL EcoRI部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlOプロモーターの制御下 に置かれた L遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN288 と名前を付けた。 また、 プラスミド LE295をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 7 5、 7 4 に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Apoa5遺伝子を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 I Iと で二重消 化し、 pBAD/HisAの I I、 RI部位にサブクロ—ンした結果、 ァラビノース誘 導性プロモーターの制御下に置かれた Apoa5遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN281と名前を付けた。
マウス肝臓 Poly (A) NAを用いて、 配列表中の配列番号 7 6、 7 7に記載のプ ライマ一にて、 RT- PCR (Larrick, Trends Biotechnol. JjO 146-152 (1992) ) に よる増幅を行つた。 Π- PCRには STRATAGENE社製の ProSTAR Ul tra HF RT-PCR System を用い、その使用説明書通りに行った（以下全ての RT- PCRは同キットを用いて行 つた）。 その結果、 マウス由来 Catlieps in D遺伝子 (Grusby et al.， Nucle ic Acids Res. 18 4008 (1990)、 Babe et al. , Biotechnology and Genet ic Engineering Reviews 213-252 (2000) ·· GenBank受入番号 X52886) を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 lと Iで二重消化し、 Tip-LCHlの NcoI、 1 I部位に サブクローンした結果、 T i A-LG 10プロモーターの制御下に置かれた Catheps in D 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN270 と名前を付けた。 また、 PHN270 を Ncolと lで二重消化して得られた 1. 2kbの DNA断片を pBAD/HisAの I、 I 部位にサブクローンした。 その結果できたプラスミドに PHN273と名前をつけた。 マウス肝臓 Poly (A) NAを用いて、 配列表中の配列番号 7 8、 7 9に記載のプ ライマーにて、 RT- PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Prothrombin 遺伝子（Degenet al., DNA Cel 1 Biol.9487-498 (1990) : GenBank受入番号 X52308) を含む DNAを得た。この丽 A断片を制限酵素 felと I Iで二重消化し、 pTip- LCH1 の I、 I I部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQプロモーターの制御下に 置かれた Prothrombin遺伝子を含むプラスミドが作成され、 pHN271と名前を付け た。
マウス肝臓 Poly(A) NAを用いて、 配列表中の配列番号 80、 8 1に記載のプ ライマーにて、 RT- PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Kallikrein 6 遺伝子 （Evans et al. , J. Biol. Chem. 262 8027-8034 (1987)、 Babe et al. , Biotechnology and Genetic Engineering Reviews H 213-252 (2000) ： GenBank 受入番号丽 #010639) を含む DNAを得た。 この MA断片を制限酵素 1 と で二重消化し、 pTip- LCH1の] ^1、 Χ Ι部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQ プロモーターの制御下に置かれた Kallikrein6遺伝子を含むプラスミドが作成さ れ、 pHN272と名前を付けた。 また、 PHN272を ϋ^Ιと Iで二重消化して得られ た 0.7kbの DNA断片を pBAD/HisAの tel、 Ilml部位にサブクローンした。その結 果できたプラスミドに PHN275と名前をつけた。
マウス肝臓 Poly(A)¾NAを用いて、 配列表中の配列番号 82、 83に記載のプ ライマーにて、 RT- PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 LSDNAse遺伝 子 （Baron et al. , Gene 215 291-301 (1998) ： GenBank受入番号 AF047355) を含 む DNAを得た。 この MA断片を制限酵素腿 I と I Iで二重消化し、 pTip-LNHl の Ndel、 I I部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQプロモーターの制御下に 置かれた LSDNAse遺伝子を含むプラスミドが作成され、 pHN299と名前を付けた。 マウス肝臓 Poly(A) NAを用いて、 配列表中の配列番号 84、 85に記載のプ ライマーにて、 RT-PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 DLAD遺伝子 (Shiokawa and Tanuma, Nucleic Acids Res. 27 4083-4089 (1999) ： GenBank受 入番号 AF128888) を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 I と RIで 二重消化し、 pTip-LNH2の 1、 RI部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQ プロモーターの制御下に置かれた DLAD 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN284と名前を付けた。 マウス肝臓 Poly(A)†RNAを用いて、 配列表中の配列番号 86、 87に記載のプ ライマーにて、 RT- PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 HMG-1遺伝子 (Pauken et al. , Mamin. Genome 5 91-99 (1994)、 Lee et al. , Gene 225 97-105 (1998) ： GenBank受入番号 U00431) を含む丽 Aを得た。 この DNA断片を制限酵素 lと RIで二重消化し、 T1P-LNH2の NcoI、 EcoRI部位にサブクローンした 結果、 TipA-LGlQプロモーターの制御下に置かれた HMG-1遺伝子を含むプラスミ ドが作成され、 PHN285 と名前を付けた。 また、 プラスミド PHN285をテンプレー トとして、 配列表中の配列番号 88、 87に記載のプライマーを用いて、 PCR に よる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 HMG- 1遺伝子を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 I Iと RIで二重消化し、 PBAD/HisAの I、 EcoRI部位 にサブクローンした結果、 ァラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれた HMG - 1遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN305と名前を付けた。
マウス肝臓 Poly(A)¾NAを用いて、 配列表中の配列番号 89、 90に記載のプ ライマ一にて、 RT-PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Kidl遺伝子 (Tekki-Kessaris et al.， Gene 240 13-22 (1999)、 Suter-Crazzolara and Unsicker Bio/Technology 19202-204 (1995) ·· GenBank受入番号 AF 184111) を含 む DNAを得た。この raA断片を制限酵素 Ιと aiidlllで二重消化し、 pTip-LNH2 の NcoL Hindi II部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQプロモーターの制御 下に置かれた Kidl遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN286と名前を付けた。 マウス肝臓 Po (Α) ΝΑを用いて、 配列表中の配列番号 9 1、 92に記載のプ ライマーにて、 RT- PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Baxalpha遺 伝子 (Oltvai et al., Cell 74609-619 (1993)、 Donnelly et al. , Protein Expr. Purif. 22 422-429 (2001) ： GenBank受入番号 L22472) を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素腿旦 I と E^RIで二重消化し、 pTip- LNH1の腿1、 RI部位 にサブクローンした結果、 TipA-LGlQプロモーターの制御下に置かれた Bax alpha 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 ΡΗΝ2Πと名前を付けた。 また、 プラスミド PHN217をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 93、 92に記載のプライマ 一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Bax alpha遺伝子 を含む DNAを得た。この DNA断片を制限酵素 I Iと！^ RIで二重消化し、 pBAD/HisA の] QioI、 RI部位にサブクローンした結果、 ァラビノース誘導性プロモーター の制御下に置かれた Bax alpha遺伝子を含むプラスミドが作成され、 pHN212と名 刖を付けた。
マウス肝臓 Poly(A) NAを用いて、 配列表中の配列番号 94、 9 5に記載のプ ライマーにて、 RT- PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Glucokinase 遺伝子 (Lin et al. , Protein Ex r. Purif. 丄 169-176 (1990) ： GenBank受入番 号 BC011139) を含む DNAを得た。 この MA断片を制限酵素 fclと I Iで二重消 化し、 pTip- LNH1の腿1、 I部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQプロモ 一夕一の制御下に置かれた Glucokinase 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN298 と名前を付けた。 また、 PHN298を lと 1^1で二重消化して得られた 1.4kbの MA断片を pBAD/HisAの NcoI、 ¾1部位にサブクローンした。 その結果 できたプラスミドに PHN306と名前をつけた。
pET22b-D即 37A を用いて、 配列表中の配列番号 1 0 5、 9 6に記載のプライマ 一にて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 Drosophilaielanogaster由来 p37A をコードする遺伝子 （Holzl et al., J. Cell Biol. 150 119-129 (2000) ： GenBank 受入番号 AF145312) を含む DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 lと I Iで 二重消化し、 pTip-LCH2の 1、 Xhol部位にサブクローンした結果、 TipA-LGlQ プロモーターの制御下に置かれた 37A 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN291 と名前を付けた。 また、 プラスミド PHN291 をテンプレートとして、 配列 表中の配列番号 9 7、 2 5に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行つ た。 その結果、 Drosophilamelanogaster由来 p37A遺伝子を含む DNAを得た。 こ の DNA断片を制限酵素 lで消化後、 Ncolで部分消化し (P37A内部の Iで切 断しないように）、 pBAD/HisAの NcoI、 ¾1部位にサブクローンした結果、 ァラ ピノ一ス誘導性プロモーターの制御下に置かれた 37A遺伝子を含むプラスミド が作成され、 pHN308と名前を付けた。
プラスミド LE59をテンプレートとして、配列表中の配列番号 9 8、 9 9に記載 のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 マウス由来
Pantothenate kinase 1 betaタンパク質をコードする遺伝子（Rocket al., J. Biol.
Chem. 275 1377-1383 (2000) ： GenBank受入番号 AF200357：以下 Lと略記） を 含む DNAを得た。この DNA断片を制限酵素 I Iと teRIで二重消化し、 PBAD/HisA の XhoL RI部位にサブクローンした結果、 ァラビノース誘導性プロモーター の制御下に置かれた PanK遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN279 と名前を 付けた。
マウス肝臓 Poly(A) NAを用いて、 配列表 100、 1 01に記載のプライマ一 にて、 RT- PCRによる増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Peroxiredoxin4をコ —ドする遺伝子 （GenBank受入番号 BC019578) を含む DNAを得た。 この DNA断片 を制限酵素 I Iと lで二重消化し、 pBAD/HisAの ¾I、 K nl部位にサブク口 ーンした結果、 ァラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれた Peroxiredoxin 4遺伝子を含むプラスミドが作成され、 pHN278と名前を付けた。 プラスミド LE156をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 102、 1 03 に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 マウス由来 Transferrin様タンパク質をコードする遺伝子 （GenBank受入番号 AK005035：以 下 1£1_と略記）を含む DNAを得た。 この MA断片を制限酵素 I Iと RIで二重 消化し、 BAD/HisAの腳、 I^RI部位にサブクローンした結果、 ァラビノース 誘導性プロモーターの制御下に置かれた TFL遺伝子を含むプラスミドが作成され、 PHN280と名前を付けた。
また、 上述したタンパク質のうち、 シグナルペプチドを持つものは全てシグナ ルペプチドをコードする DNA 配列を除いてサブクローンされている。 また、 Prothrombinは成熟 Thrombinになる直前の 「Pre thrombin- 2」 をコードする DNA 配列 （Soejima et al.， J. Bioc em. j30 269-277 (2001)) がサブクローンされ ている。
PHN171 (実施例 7に記載）、 p翻 5、 pHN206, p願 08、 ρΗΝ287, ρΗΝ289, ρΗΝ28δ, ΡΗΝ270, ΡΗΝ27Κ ρΗΝ272, ρ翻 9、 ρ脆 84、 ρ顧 5、 ρΗΝ286、 ρΗΝ217, ρ腿 98、 PHN291 を用いて、 実施例 12と同様に Rhodococcus erythropolis JCM3201株を 形質転換し、 実施例 13に準じて各タンパク質を 30°C、 4°Cでそれぞれ発現させ た。
これらのタンパク質には全て 6XHisタグが末端についており、実施例 16と同 様に精製を行った。 またこれに加え、 今回は細胞破壊後に 20， OOOXgにて遠心し てできた沈殿 （実施例 1 6に記載） からも精製を行った。 具体的に以下に沈殿物 からの精製法を示すが、 その作業は室温で行った。 1ml の DN- Buiier (50mM Tris-HCl (pH8.0) , 8M尿素） に沈殿物を懸濁し、 20, OOOXgにて遠心し、 その上清 700 lに、予め DN- Bufferで平衡化された Ni - NTASuperilowをべッド体積 40 1 になるように加えた。 これを 1時間回転撹拌しながら Ni - NTASuperilowビーズと 6XHisタグのついたタンパク質とを結合させた。 このビーズを DN- Bufferで 4回 洗浄した後、 120 1の DNE- Buffer (50mMTris-HCl (pH7.0) , 尿素、 400mMイミ ダゾール）に 3回懸濁することで、 ビーズから 6X Hisタグのついたタンパク質を 溶出させた。
pBAD/His/lacZ (Invitrogen 社）、 pHN193、 雌 95、 pHN199、 pHN276, pHN277, p腿 81、 pHN273、 p匿 75、 p顏 5、 p腿 12、 p議 6、 pHN308、 pHN279, p丽 278、 PHN280を用レ Invitrogen社の pBAD/Hisキットの使用説明書の通りに、大腸菌に てタンパク質の発現を行った。
以下に具体的な精製法を示す。 タンパク質を発現させた菌体を回収し、 1ml の
NT-Bufierに懸濁した。 これを超音波発生器 UD- 20 (T0MY社製） を用いて細胞を 破壌した。 20， OOOXgにて遠心し、 その上清 900 Uに、 予め、 NT-Buiferで平衡 化された Ni- NTA Superflowをべッド体積 40 l になるように加えた。 これを 1 時間回転撹拌しながら Ni-NTA Superflowビーズと 6XHisタグのついたタンパク 質とを結合させた。 このビーズを NT-Buffer で 4回洗浄した後、 120 1 の NTE-Bufferに 3回懸濁することで、 ビーズから 6XHisタグのついたタンパク質 を溶出させた。 上記の作業はすべて 4°Cで行った。
また、細胞破壊後、 20, OOOXgにて遠心してできた沈殿からも精製を行ったが、 その作業工程は上述した方法と同様である。
上記サンプルのうち 10 を常法に従い 12% SDSポリアクリルアミド電気泳動 に供し、 デンシトメ一夕一にてバンドの密度を測定し、 定量した結果を図 2 1に 示す。 該図において、 左から 2番目のカラムは発現させたタンパク質の名前を示 す。 左から 3番目のカラムは発現させたタンパク質の N末端、 C末端どちらに 6
XHisタグを付けたかを示す。 左から 4番目のカラムは、 シグナル配列等を含め た完全長のタンパク質の推定分子量（kDa) を示すが、括弧内の数字は実際に発現 させたタンパク質部分の推定分子量を示す。左から 5、 9番目のカラムはタンパク 質を発現させた時に用いたプラスミドの名前を示す。左から 6、 8、 10番目のカラ ムは 1リットルの培養液あたり、得られた組み換えタンパク質の質量を示すが（単 位はミリグラム）、 20, OOO X g での上清画分 （Sup) から精製したときと、 沈殿画 分 （Ppt) から精製したときとに分けて示してある。 左から 7、 11番目のカラム中 の十、 -はそれぞれの形質転換体を発現誘導剤 (Rhodococcus erythropol i s の場 合は のチォストレプトン、 大腸菌の場合は 0. 2% L-ァラビノース） を含 んだ寒天培地上に塗布した時の、 増殖の速度を表している。 最も早く増殖した形 質転換体が + + +で、 全く増殖しなかった形質転換体が-である。 また、 用いた宿 主、 発現誘導時の温度が最上部に示されている。 N. D. (Not Detected)は検出限界 以下だったことを示す。
表 1に実施例で用いた各プラスミドのリストを、 表 2に実施例で用いた菌株の リストを示す。
表 1
Figure imgf000052_0001
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表 2
Figure imgf000054_0001
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
実施例 1 3から 1 8並びに実施例 2 0に示されるように、 本発明の発現べクタ —を用いることにより、 4 という低温条件下で外来遺伝子のコードするタンパク 質を発現産生させることが可能である。
配列表フリ一ヮード
配列 1〜 1 0 5 ：プライマー
配列 1 0 6〜 1 1 3 ：ベクタ一

Claims

請求の範囲
1 . 宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクター であって、 該宿主以外の宿主の好適生育温度範囲以下の温度で発現し得る発現べ クタ一。
2 . 宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクター であって、 15°C以下の温度で発現し得る発現ベクター。
3 . 4°Cで発現し得る請求項 1または 2記載の発現ベクター。
4 . 宿主細胞が Rhodococcus属細菌である、 請求項 1から 3のいずれか 1項 に記載の発現ベクター。
5 . Rhodococcus属細菌が R. erythropol i s, R. fasc iansおよび R. opacus からなる群から選択される、 請求項 4記載の発現べクタ一。
6 . 誘導物質がチォストレプトンである、 請求項 1から 5のいずれか 1項に 記載の発現ベクター。
7 . 外来遺伝子が、 15°Cを超える中高温条件下で宿主細胞の増殖を阻害する タンパク質をコードする、 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の発現ベクター。
8 . 誘導物質により発現を調節し得るプロモータ一配列、 外来遺伝子を導入 可能なマルチクローニング部位を含む請求項 1から 7のいずれか 1項に記載の発 現べクタ一。
9 . 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
1 0 . 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載の発現ベクターを用いてタンパ ク質を産生する方法。
1 1 . 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞 の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、 該宿主細胞の好適生育温度 範囲より低い好適生育温度範囲を有する他の宿主細胞中で誘導物質により誘導発 現し得る誘導型発現ベクター。
1 2 . 4°Cで発現し得る請求項 1 1記載の発現ベクター。
1 3 . 宿主細胞が Rhodococcus属細菌である、 請求項 1 1または 1 2に記載 の発現べクタ一。
1 4 . Rhodococcus属細菌が R. erythropol i s, R. f asc iansおよび R. opacus からなる群から選択される、 請求項 1 3記載の発現ベクター。
1 5 . 誘導物質がチォストレプトンである、 請求項 1 1から 1 4のいずれか 1項に記載の発現ベクター。
1 6 . 誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、 外来遺伝子を導 入可能なマルチクローニング部位を含む請求項 1 1から 1 5のいずれか 1項に記 載の発現ベクター。
1 7 . 請求項 1 1から 1 6のいずれか 1項に記載の発現ベクターを含む形質 転換体。
1 8 . 請求項 1 1から 1 6のいずれか 1項に記載の発現ベクターを用いて夕 ンパク質を産生する方法。
1 9 . Rhodococcus 属細菌中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る 発現ベクター。
2 0 . Rhodococcus属細菌が R. erythropol isゝ R. f asc i ansおよび R. opacus からなる群から選択される、 請求項 1 9記載の発現ベクター。
2 1 . 誘導物質がチォス卜レプトンである、 請求項 1 9または 2 0記載の発 現べクタ一。
2 2 . TipA遺伝子プロモーター配列、 外来遺伝子を導入可能な第 1のマルチ クローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、 第 2のプロモーター 配列および TipA遺伝子を含む誘導カセッ卜、 hodococcus属細菌用プラスミドの 自律複製に必須な DNA領域ならびにチォストレプトン耐性遺伝子を含む、 請求項 1 9から 2 1のいずれか 1項に記載の発現ベクター。
2 3 . 請求項 1 9 〜 2 2のいずれか 1項に記載の発現ベクターを含む Rhodococcus属細菌形質転換体。
2 4 . 請求項 1 9から 2 2のいずれか 1項に記載の発現べクタ一を用いて夕 ンパク質を産生する方法。
2 5 . 15でを超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害する タンパク質をコードする遺伝子を、 低温条件下で増殖可能な Rhodococcus属細菌 で誘導発現し得る Rhodococcus属細菌用誘導型発現べクター。
2 6 . TipA遺伝子プロモーター配列、 外来遺伝子を導入可能な第 1のマルチ クロ一ニング部位および転写終結配列を含む発現カセッ卜、 第 2のプロモーター 配列および TipA遺伝子を含む誘導カセット、 Rhodococcus属細菌用プラスミドの 自律複製に必須な DNA領域ならびにチォストレプトン耐性遺伝子を含む、 外来遺 伝子を低温条件下で増殖可能な Rhodococcus 属細菌内で誘導発現し得る Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
2 7 . さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必須な DNA領域を含み、 大腸 菌中で複製可能な請求項 2 6記載の Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
2 8 . TipA遺伝子プロモーターが TipA- LG10プロモーターである請求項 2 6 または 2 7に記載の Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
2 9 . 配列番号 1 0 6に表される塩基配列を有する pT ip- NH1、配列番号 1 0 7に表される塩基配列を有する pT ip-NH2、配列番号 1 0 8に表される塩基配列を 有する pTip- CH1、配列番号 1 0 9に表される塩基配列を有する pTip-CH2、配列番 号 1 1 0に表される塩基配列を有する pTip- LNH1、 配列番号 1 1 1に表される塩 基配列を有する pT ip- LNH2、 配列番号 1 1 2に表される塩基配列を有する pTip-LCHK配列番号 1 1 3に表される塩基配列を有する pT ip-LCH2, pTip-CHl. 1、 pTip-CH2. 1、 pTip-LCHl. 1および pTip - LCH2. 1からなる群から選択される請求項 2 6から 2 8のいずれか 1項に記載の Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
3 0 . Rhodococcus属細菌が R. e rythropol i s^ R. f asc i ansおよび R. opacus からなる群から選択される、 請求項 2 5から 2 9のいずれか 1項に記載の Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
3 1 . 請求項 2 5から 3 0のいずれか 1項に記載の Rhodococcus属細菌用誘 導型発現べク夕一を含む Rhodococcus属細菌形質転換体。
3 2 . 外来遺伝子として 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタン パク質をコードする遺伝子を含む請求項 2 5から 3 0のいずれか 1項に記載の Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能な Rhodococcus属細 菌に導入し、 低温条件下でチォス トレプトンを含む培地を用いて前記 Rhodococcus 属細菌用誘導型発現べクタ一導入細菌を培養することを含む、 15°C を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質を低 温で産生させる方法。
3 3 . 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 15°Cを 超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、 請求項 3 2記載のタンパク質を低温で産生させる方法。
3 4 . 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 大腸菌 で 15°Cを超える中高温で発現させた場合に不活性な封入体を作るタンパク質で ある、 請求項 3 2記載のタンパク質を低温で産生させる方法。
3 5 . 好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク 質をコードする遺伝子を含む請求項 2 5から 3 0のいずれか 1項に記載の R odococcus属細菌用誘導型発現べクタ一を低温で増殖可能な Rhodococcus属細 菌に導入し、 低温条件下でチォス トレプトンを含む培地を用いて前記 Rhodococcus 属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、 好冷 菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質を低温で産生 させる方法。
3 6 . 外来遺伝子を含む請求項 2 5から 3 0のいずれか 1項に記載の Rhodococcus属細菌用誘導型発現べク夕一を低温で増殖可能な hodococcus属細 菌に導入し、 1 5°Cを超える中高温条件下および低温条件下でチォストレプトンを 含む培地を用いて前記 Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養 し、 15°C以下の低温条件下でのみ発現される遺伝子を選択することを含む、 15°C を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
3 7 . 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 を 超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、 請求項 3 6記載の 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリー ニングする方法。
3 8 . 大腸菌に導入し 15°Cを超える中高温で発現させよとした場合に、 発現 しないかまたは大腸菌の増殖を阻害する遺伝子を選択し、 次いで該遺伝子を外来 遺伝子として含む請求項 2 5から 3 0のいずれか 1項に記載の Rhodococcus属細 菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能な Rhodococcus属細菌に導入し、 低温 条件下でチォストレプトンを含む培地を用いて前記 Rhodococcus属細菌用誘導型 発現ベクター導入細菌を培養したときに発現しうる遺伝子を選択することを含む、 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする 方法。
3 9 . 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 大腸菌 の増殖を 30°C以上で阻害するタンパク質である、請求項 3 8記載のタンパク質を スクリーニングする方法。
4 0 . 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 大腸菌 で 15°Cを超える中高温で発現させた場合に封入体を作るタンパク質である、請求 項 3 8記載の夕ンパク質をスクリ一二ングする方法。
4 1 . 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、 15°Cを 超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、 請求項 3 8記載の 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリ一 ニングする方法。
4 2 . 請求項 3 6から 4 1のいずれか 1項に記載のスクリーニングする方法 により得られた 15°Cを超える中高温で発現させることが困難なタンパク質。
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