CN108220317A - 一种重组表达质粒及其制备方法、用途 - Google Patents

一种重组表达质粒及其制备方法、用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108220317A
CN108220317A CN201711307979.7A CN201711307979A CN108220317A CN 108220317 A CN108220317 A CN 108220317A CN 201711307979 A CN201711307979 A CN 201711307979A CN 108220317 A CN108220317 A CN 108220317A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
plasmid
recombinant expression
nuclease
lysozyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711307979.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108220317B (zh
Inventor
昌增益
刘洋
余家钰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University
Original Assignee
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University filed Critical Peking University
Priority to CN201711307979.7A priority Critical patent/CN108220317B/zh
Publication of CN108220317A publication Critical patent/CN108220317A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108220317B publication Critical patent/CN108220317B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物学、基因工程和蛋白质工程领域，具体提供了一种重组表达质粒及其制备方法、用途，重组表达质粒包含：溶菌酶基因和核酸酶基因；核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列；重组表达质粒可以稳定表达溶菌酶并积累在细胞质内，稳定表达的核酸酶积累在膜间质的空间中，两者的表达积累并不干扰菌体正常生长和目的蛋白的表达积累。当释放目的蛋白时，改变宿主细胞的通透性，溶菌酶进入膜间质空间中降解肽聚糖层，核酸酶进入细胞质中降解基因组核酸和质粒，使宿主细胞稳定可控发生自溶释放细胞内目的蛋白，同时降解所释放的核酸，时间短，释放目的蛋白的效率高，且无需使用昂贵的仪器或添加额外的溶菌酶，成本低。

Description

一种重组表达质粒及其制备方法、用途
技术领域
本发明属于微生物学、基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种可使宿主细胞稳定可控发生自溶进而高效率释放细胞内蛋白产物，并且同时降解所释放的核酸的重组表达质粒及其制备方法、用途。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，是生命活动的主要承担者，一切重要的生命现象和生理机能都与蛋白质有关。在基础科研中，研究蛋白质的功能可以揭示出生命活动的机制。在工业生产和制药领域，蛋白质和多肽也是非常重要和必需的产品，如胰岛素、白细胞介素等。蛋白质通常是在体外获取，然后再进行一系列的生化操作和研究。目前，在体外生产蛋白质和多肽产品的蛋白表达系统中最常用的宿主细胞是大肠杆菌，具有操作方便、周期短和产量高等优点。
大肠杆菌的细胞结构比较简单，具有细胞壁、细胞膜、细胞质等结构，无成形的细胞核，具体的结构为在细胞质外具有内、外两层膜结构，两层膜之间被称作膜间质空间，膜间质空间具有肽聚糖层，外膜和肽聚糖层共同组成了大肠杆菌的细胞壁。大肠杆菌表达的蛋白质或多肽通常位于大肠杆菌的细胞质内或者膜间质中，因此，在分离纯化目标蛋白之前，有效的将细胞破碎使目标蛋白释放出来是极其关键的步骤。
由于肽聚糖层聚合成网状结构，具有一定的机械强度，因此大肠杆菌细胞破碎的主要阻力来自于位于膜间质空间的肽聚糖层。为克服上述肽聚糖层所带来的阻力、使菌体细胞有效的破碎，目前破碎菌体细胞的方法主要采用机械法、化学法和酶溶法等。但是上述方法存在如下缺陷：1)机械法包括使用高压破碎仪破碎、超声波破碎和珠磨法，均需要特殊的仪器设备，成本高，能量消耗大，同时产生的机械剪切力也可能会使目标蛋白产物失活；2)化学法是通过渗透压将细胞内容物释放，但其对产物的释放具有一定的选择性，效率低、通用性差；3)酶溶法是使用溶菌酶将肽聚糖层切断来使细胞破碎，目前常采用外加溶菌酶的方法进行破碎，但是酶产品价格高，限制了其大规模应用。为克服上述缺陷，科研人员提出了通过基因工程改造的方法使细菌宿主自身表达出裂解细菌的外源蛋白，使得细胞进行自溶，进而达到破碎细胞的目的，如中国农业科学院的周志刚等人将E7裂解蛋白与目标产物一起表达在宿主胞质内，但是该裂解蛋白的表达受到宿主代谢的影响，并且不可控，一旦表达出来就会开始裂解菌体，导致最终目标产物产量少，表达过程不稳定，释放效率不理想。
另外，无论是使用化学法、酶溶法或是基因工程改造方法破碎菌体后，均会产生大量的核酸(菌体自身基因组以及转入的相关表达质粒)与目标蛋白一起释放，导致细胞悬浮液黏度大，使得后续分离纯化步骤操作困难，同时也可能会导致所用的表达质粒在最终蛋白产品中有残留，造成工具质粒的泄漏。目前解决破碎液中核酸的方法通常是额外加入核酸酶降解，如Novagen公司提供的产品按一定比例将溶菌酶和核酸酶混合，进行蛋白的抽提，但是由于酶产品成本很高，限制了其大规模的应用。也有科研人员提出了通过基因工程改造的方法使细菌宿主能够在膜间质空间表达核酸酶，同时细菌宿主再表达穿孔素等蛋白，在穿孔素等蛋白的作用下，可以将膜间质空间表达的核酸酶释放至细胞质中降解核酸，但是在该方法中，由于穿孔素等蛋白的大量表达，使得细菌宿主不受控裂解，影响菌体的生长，导致目标蛋白不能大量的积累，降低生产效率。
因此，研发一种高效率低成本稳定可控的使菌体细胞内目标蛋白释放同时无核酸残留的方法，对于蛋白质的科学研究和工业生产都意义重大。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种可使大肠杆菌宿主稳定可控发生自溶，高效率释放目标蛋白产物并且同时降解释放的核酸(包括菌体自身基因组以及所转入的相关表达质粒)的重组表达质粒及其制备方法、用途。
为此，本发明提供了一种重组表达质粒，所述重组表达质粒包含：溶菌酶基因和核酸酶基因；所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列。所述重组表达质粒中的上述溶菌酶基因和核酸酶基因在宿主菌内能够适量表达，即所述重组表达质粒中包含有能够表达上述溶菌酶基因和核酸酶基因的表达盒。
所述的重组表达质粒，所述重组表达质粒中启动溶菌酶基因和核酸酶基因表达的启动子序列或所述包含有能够表达上述溶菌酶基因和核酸酶基因的表达盒中的启动子序列选自：质粒J61002的常量表达启动子或质粒pSB1A2的常量表达启动子。所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述的重组表达质粒，所述溶菌酶基因选自λ噬菌体R溶菌酶基因、大肠杆菌素E7基因或PhiX174噬菌体溶菌酶E基因。所述溶菌酶的基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述核酸酶的基因序列选自粘质沙雷菌的核酸内切酶基因、T5噬菌体Dl5核酸外切酶基因、大肠杆菌RecBCD核酸外切酶基因或大肠杆菌endA核酸酶基因。所述的核酸酶的基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述编码膜间质定位信号肽的基因序列选自大肠杆菌的osmY基因、surA基因或dsbA基因。所述编码膜间质定位信号肽的基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
所述重组表达质粒，从5’端到3’端依次包括抗性基因表达盒、复制子序列、启动子、溶菌酶基因序列、膜间质定位信号肽基因序列、核酸酶基因序列和终止子序列。
为了使所述重组表达质粒中的溶菌酶基因具有较高的翻译效率，所述的重组表达质粒中在溶菌酶基因的上游还包括膜间质前导肽基因序列。所述膜间质前导肽基因序列选自osmY基因前导肽序列、surA基因前导肽序列或skp基因前导肽序列。所述的膜间质前导肽基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述序列配合重组表达质粒上启动溶菌酶基因和核酸酶基因表达的启动子序列，可以保证所述溶菌酶基因维持一定较高的表达量。
所述的重组表达质粒，所述溶菌酶基因和核酸酶基因在重组表达质粒中的位置或在表达上述溶菌酶基因和核酸酶基因的表达盒中自上游至下游依次为启动子序列、膜间质前导肽基因序列、溶菌酶基因序列、串联连接序列、编码膜间质定位信号肽的基因序列和核酸酶基因序列。
所述串联连接序列如SEQ ID NO:6所示。使用所述串联序列使得溶菌酶基因和核酸酶基因的表达程度相近，并且都维持在不影响菌体生长但可以充分发挥各自功能的较高的表达水平。
所述的重组表达质粒，从5’端到3’端依次包括抗性基因表达盒、复制子序列、启动子、膜间质前导肽基因序列、溶菌酶基因序列、串联连接序列、膜间质定位信号肽基因序列、核酸酶基因序列和终止子序列。
所述的终止子序列选自pBAD/Myc-His A质粒载体上的终止子序列。
所述抗性基因表达盒为氯霉素抗性基因表达盒，复制子序列为p15A，两者均来自载体pACYC184质粒。
所述的重组表达质粒，用于构建所述的重组表达质粒的出发载体为可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体。
所述的重组表达质粒，所述的出发载体为pBAD/Myc-His A质粒。
所述的重组表达质粒，所述的重组表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明提供了一种构建所述的重组表达质粒的方法，包括如下步骤：
(1)分别将溶菌酶基因、核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列克隆至选定的质粒载体上，获得所述重组表达质粒；
(2)将步骤(1)中获得的所述重组表达质粒转化至感受态细胞中，筛选、测序，选择测序结果正确的质粒载体。
优选的，构建所述的重组表达质粒的方法，包括如下步骤：
S1将选定的抗性基因表达盒和复制子序列克隆至出发质粒载体上，然后将含有膜间质前导肽基因和膜间质定位信号肽基因的序列克隆至上述载体上，替换上述载体中原有的调控单元和开放阅读框序列，所获得的质粒载体记为A；
S2将溶菌酶基因序列克隆至质粒载体A中膜间质前导肽基因的下游，并替换膜间质前导肽基因下游的序列，然后将启动子基因克隆至膜间质前导肽基因的上游，所获得的质粒载体记为B；
S3将核酸酶基因序列克隆至质粒载体A中膜间质定位信号肽基因的下游，替换膜间质定位信号肽基因下游的序列，所获得的质粒载体记为C，以质粒载体C为模板，扩增带有膜间质信号肽基因的核酸酶基因片段，并通过引物在其5’端加上串联连接序列，将上述获得的片段克隆插入质粒载体B中溶菌酶基因的下游；
S4将步骤S3中获得的所述重组表达质粒转化至感受态细胞中，筛选、测序，选择测序结果正确的质粒载体。
本发明提供了一种重组表达质粒组合物，包括：至少一个包含溶菌酶基因的重组表达质粒；和至少一个包含核酸酶基因的重组表达质粒，所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列。
本发明提供了含有所述的重组表达质粒的生物材料。
所述的生物材料，所述生物材料包括载体、宿主菌、工程菌、细胞、表达盒或利用所述的重组表达质粒进行细胞破碎所获得的裂解液。
本发明提供的所述的重组表达质粒、所述的重组表达质粒组合物或所述的生物材料在细胞破碎中的用途。
所述的用途，所述细胞为大肠杆菌细胞。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种重组表达质粒，所述重组表达质粒包含：溶菌酶基因和核酸酶基因；所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列；所述重组表达质粒中的溶菌酶基因和核酸酶基因在宿主菌内能够同时适量表达；将上述重组表达质粒与表达目的蛋白的质粒共同转化至宿主细胞中，上述重组表达质粒可以稳定表达溶菌酶并积累在细胞质内，无法破碎宿主细胞；稳定表达的核酸酶的N端连接有膜间质定位信号肽，在定位信号肽的作用下，使得核酸酶积累在膜间质的空间中，无法降解细胞质内的核酸。当目的蛋白表达积累到一定程度后，需要破碎细胞进行释放时，可以通过冻融或加入试剂以改变宿主细胞细胞膜的通透性，使得积累在细胞质中的溶菌酶进入膜间质空间中降解肽聚糖层，实现细胞的可控自溶，同时位于膜间质空间中的核酸酶进入细胞质中降解基因组核酸和质粒，使得破碎后的菌液澄清透明，更加的方便进行后续的纯化步骤，实现了将细胞质内的目的蛋白释放以及消除基因组核酸和质粒的目的，同时不会造成工具质粒的泄漏，整个过程仅需要10分钟左右，大大提高了释放目的蛋白的效率，且无需使用昂贵的仪器或添加额外的溶菌酶，成本低。
2.本发明提供的重组表达质粒，所述重组表达质粒中的启动子序列选自：质粒J61002的常量表达启动子或质粒pSB1A2的常量表达启动子。所述的重组表达质粒中还包括膜间质前导肽基因序列，所述膜间质前导肽基因序列选自osmY基因前导肽序列、surA基因前导肽序列或skp基因前导肽序列；所述串联连接序列如SEQ ID NO:6所示。为保证目的蛋白可以正常的表达积累，细菌自身的生长和代谢必需不受干扰，因此在细胞内表达的溶菌酶和核酸酶，两者表达量必须维持在一定的水平，不影响菌体的正常生长，同时又要有足够的积累量完成后续的破碎和降解过程，基于以上内容，在本发明所提供的重组质粒上，溶菌酶和核酸酶同时表达，两者的表达量经过长时间的摸索，最终使用特定的常量表达启动子序列、膜间质前导肽序列以及串联连接序列，保证两者的表达不会干扰菌体的正常生长以及目标蛋白的正常积累，同时两者的表达量足以在后续的破碎过程中，较好的完成细胞裂解和核酸的降解，实现宿主细胞的可控裂解，使得细胞破碎与核酸降解同时完成，并且不引入大量的外源的溶菌酶或者核酸酶，因此也降低了后续目标蛋白提纯的难度。
3.本发明提供的重组表达质粒，所述溶菌酶的基因序列选自λ噬菌体R溶菌酶基因、大肠杆菌素E7基因或PhiX174噬菌体溶菌酶E基因；所述核酸酶的基因序列选自粘质沙雷菌的核酸内切酶基因、T5噬菌体Dl5核酸外切酶基因、大肠杆菌RecBCD核酸外切酶基因或大肠杆菌endA核酸酶基因；所述编码膜间质定位信号肽的基因序列选自大肠杆菌的osmY基因、surA基因或dsbA基因；优选的，所述编码膜间质定位信号肽的基因序列的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。通过选择λ噬菌体R溶菌酶基因、osmY基因的膜间质信号肽基因、粘质沙雷菌的核酸内切酶基因，具有对菌体生长干扰极小、处理后能有效破碎细胞和降解核酸的有益效果。
4.本发明提供的一种重组表达质粒组合物，包括：至少一个包含溶菌酶基因的重组表达质粒；和至少一个包含核酸酶基因的重组表达质粒，所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列；将上述重组表达质粒组合物与表达目的蛋白的质粒共同转化至宿主细胞中，至少一个重组表达质粒可以稳定表达溶菌酶并积累在细胞质内，无法破碎宿主细胞，至少一个重组表达质粒可稳定表达的核酸酶的N端连接有膜间质定位信号肽，在定位信号肽的作用下，使得核酸酶积累在膜间质的空间中，无法降解细胞质内的核酸，当需要破碎细胞释放目的蛋白时，可以通过冻融或加入试剂以改变宿主细胞细胞膜的通透性，使得积累在细胞质中的溶菌酶进入膜间质空间中降解膜间质空间中的肽聚糖层，实现细胞的可控自溶，同时位于膜间质空间中的核酸酶进入细胞质中降解基因组核酸和质粒，达到了将细胞质内的目的蛋白的释放以及消除基因组核酸和质粒，使得破碎后的菌液澄清透明，更加方便进行后续的纯化步骤，同时不会造成工具质粒的泄漏，整个过程所用的时间仅需要10分钟左右，大大提高了释放目的蛋白的效率，且无需使用昂贵的仪器或添加额外的溶菌酶，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中重组表达质粒p16R5CY-RS的图谱；
图2是本发明实施例2中菌株BL21(DE3/p16R5CY-RS)与菌株BL21(DE3/p16R5CY-vec)的生长速率曲线图；
图3是本发明实施例3中p16R5CY-RS质粒进行菌体的破碎前后的菌浑浊度比较以及释放蛋白情况的检测；
图4是本发明实施例4中p16R5CY-RS质粒进行菌体破碎后，破碎液中重组烟草蚀纹病毒蛋白酶rTEV酶切活性测试；
图5是本发明实施例4中p16R5CY-RS质粒进行菌体破碎后，质粒载体的降解情况检测。
具体实施方式
下述实施例中所应用的试剂、质粒、引物等均为市售产品。如下述实施例中涉及的：
所有实施例中涉及的引物均由赛默飞公司合成；
pACYC184质粒载体可购于Novagen公司；pBAD/Myc-His A质粒载体可购于invitrogen公司；pET28a质粒载体可购于Novagen公司；pASK-IBA43plus质粒可购于IBA公司；
BW25113菌株可由日本Nara科技中心(Institute of Science and Technology)提供；BL21(DE3)菌株感受态细胞购买自北京全式金生物技术有限公司；
Pfu buffer(5X)、dNTP为市售产品；
抽提质粒试剂盒购自于北京全式金生物技术有限公司；
分光光度仪购自于上海光谱；
电泳仪购自于北京市六一仪器厂；
高压破碎仪购自于聚能生物有限公司，型号JN-3000plus；
下述实施例中涉及的restriction free(RF)克隆的方法已公开于如下文献中：RFcloning:a restriction-free method for inserting target genes into plasmids。
下述实施中涉及的培养基制备方法如下：
LB培养基配方为：1g蛋白胨，0.5g酵母浸出液，0.5g氯化钠，100毫升去离子水；按照上述配方选取原料混合均匀，高压灭菌后使用。
实施例1重组表达质粒p16R5CY-RS的构建
本实施例提供了一种重组表达质粒p16R5CY-RS的构建方法，包括如下步骤：
1合成λ噬菌体R溶菌酶基因
根据Genebank中的记载的λ噬菌体R溶菌酶基因序列(Genebank登录号：NC_001416.1)，设计如下引物对F1-5’和R1-3’，F2-5’和R2-3’，F3-5’和R3-3’，F4-5’和R4-3’，F5-5’和R5-3’，F6-5’和R6-3’，F7-5’和R7-3’，F8-5’和R8-3，上述引物见下表1，用北京全式金生物技术有限公司的fast pfu DNA聚合酶试剂盒，通过overlap PCR从头合成λ噬菌体R溶菌酶基因，反应体系见下表2，反应条件及过程如下：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持1min；步骤5，循环步骤2至4，共30个循环；步骤6，于72℃保持10min。合成λ噬菌体R溶菌酶基因序列如SEQ ID NO:2所示。
表1通过overlap PCR合成λ噬菌体R溶菌酶基因的引物序列
表2重叠延伸PCR反应体系
2合成粘质沙雷菌的DNA/RNA非特异核酸内切酶基因
根据Genebank中的记载的粘质沙雷菌的DNA/RNA非特异核酸内切酶基因序列(Genebank登录号：NZ_HG326223.1)，设计如下引物对F-smne1-5’和R-smne1-3’，F-smne2-5’和R-smne2-3’，F-smne3-5’和R-smne3-3’，F-smne4-5’和R-smne4-3’，F-smne5-5’和R-smne5-3’，F-smne6-5’和R-smne6-3’，F-smne7-5’和R-smne7-3’，F-smne8-5’和R-smne8-3’，F-smne9-5’和R-smne9-3’，F-smne10-5’和R-smne10-3’，F-smne11-5’和R-smne11-3’，F-smne12-5’和R-smne12-3’，上述引物见下表3，用北京全式金生物技术有限公司的fastpfu DNA聚合酶试剂盒，通过overlap PCR从头合成粘质沙雷菌的DNA/RNA非特异核酸内切酶基因，反应体系见下表4，反应条件及过程如下：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持1min；步骤5，循环步骤2至4，共30个循环；步骤6，于72℃保持10min。合成粘质沙雷菌的DNA/RNA非特异核酸内切酶基因序列如SEQ IDNO:3所示。
表3通过overlap PCR合成粘质沙雷菌的DNA/RNA非特异核酸内切酶基因的引物序列
表4重叠延伸PCR反应体系
Pfu buffer(5X) 4μl
Forward Primer,10μM 1μl
Reverse Primer,10μM 1μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 11.5μl
3表达质粒载体骨架的制备
(1)以pACYC184质粒载体为模板，设计正向引物araC-p15A-5’(F)和反向引物ter-chl-3’(R)，引物araC-p15A-5’核苷酸序列如下所示5’-AGCAAGAGATTACGCGCAGACCAAAACGATCTCAAGACGAAGCAGGGATTCTG-3’，引物ter-chl-3’核苷酸序列如下所示5’-CAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAGCTTCGCAACGTTCAAAT-3’，利用上述引物通过PCR扩增得到该载体的抗性基因表达盒和复制子p15A序列片段，PCR反应体系如下表5所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持1.5min；步骤5，循环步骤2至4，共30个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表5 PCR反应体系
(2)根据RF克隆方法，将上述步骤(1)扩增得到的抗性基因表达盒和复制子p15A序列片段克隆至pBAD/Myc-His A质粒载体上，获得的质粒命名为pR5C，PCR反应体系如下表6，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表6 PCR反应体系
pBAD/Myc-His A质粒载体 5ng
步骤(1)的PCR产物 20ng
Pfu buffer(5X) 4μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 8.5μl
(3)采用DpnI酶消化步骤(2)中的PCR产物中的pBAD/Myc-His A质粒载体，反应体系如下表7，反应条件：37℃放置2个小时。
表7 DpnI消化反应体系
步骤(2)的PCR产物 10ng
DpnI酶 1μl
10×FastDigest buffer 1μl
(4)将连接产物转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的质粒载体作为表达质粒载体骨架。
4质粒pR5C-OsmY的构建
(1)利用(北京全式金生物技术有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒)提取大肠杆菌BW25113菌株获得的DNA基因组为模板，设计正向引物pR5C-osmy-5’和反向引物pR5C-osmy-3’，所述的正向引物pR5C-osmy-5’的核苷酸序列如下所示5’-TCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTATGGCTATGACAAGACTG-3’，引物pR5C-osmy-3’的核苷酸序列如下所示5’-CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGGGCCCTTACTTAGTTTTCAGATCATTTTT-3’，利用上述引物通过PCR扩增得到osmY基因片段，PCR反应体系如下表8所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持1min；步骤5，循环步骤2至4，共30个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表8 PCR反应体系
DNA基因组 2ng
Forward Primer,10μM 2μl
Reverse Primer,10μM 2μl
Pfu buffer(5X) 10μl
dNTP 5μl
Pfu DNA聚合酶 1μl
ddH2O 28μl
(2)根据RF克隆方法，将上述步骤(1)扩增得到的osmY基因片段克隆至步骤3获得的质粒pR5C上，替换该质粒pR5C上的原有的阿拉伯糖调控序列araC以及开放阅读框序列(ORF)，终止子序列仍保留，获得的质粒命名为pR5C-OsmY，反应体系如下表9，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表9 PCR反应体系
pR5C质粒载体 5ng
步骤(1)的PCR产物 20ng
Pfu buffer(5X) 4μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 8.5μl
(3)采用DpnI消化步骤(2)中的PCR产物中的pR5C质粒载体，反应体系如下表10，反应条件：37℃放置2个小时。
表10 DpnI消化反应体系
步骤(2)的PCR产物 10ng
DpnI 1μl
10×FastDigest buffer 1μl
(4)将连接产物转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的质粒载体。
5质粒pR5C-R的构建
(1)设计正向引物pR5C-R-5’和反向引物pR5C-R-3’，所述正向引物pR5C-R-5’，其核苷酸序列如下所示5’-TAATGTTGACCTCTGCCGTCGCGACCGGCTCTGCCTAAGGAGATAGCAATGGTAGAAATCAATAATCAA-3’，pR5C-R-3’的核苷酸序列如下所示5’-CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGGGCCCTCATACATCAATCTCTCTGACC-3’，根据RF克隆方法，利用上述引物对将步骤1获得的λ噬菌体R溶菌酶基因(R基因)克隆至pR5C-OsmY质粒上，接在OsmY蛋白前导肽序列的下游(编码OsmY蛋白前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)，替换OsmY蛋白前导肽序列下游的osmY基因序列，得到的质粒命名为pR5CY-R，PCR反应体系如下表11所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表11 PCR反应体系
(2)采用DpnI消化步骤(1)中的PCR产物中的pR5C-OsmY质粒载体，反应体系如下表12，反应条件：37℃放置2个小时。
表12 DpnI消化反应体系
步骤(1)的PCR产物 10ng
DpnI 1μl
10×FastDigest buffer 1μl
(3)将步骤(2)中经消化后连接产物质粒pR5C-R转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的质粒载体。
6质粒p16R5CY-R的构建
(1)设计正向引物prom-5’和反向引物prom-3’，所述正向引物prom-5’，其核苷酸序列如下所示5’-GCTAGCTCAGTCCTAGGGACTATGCTAGCATGGTAGAAATCAATAATCAA-3’，prom-3’的核苷酸序列如下所示5’-GCATAGTCCCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAACCAAAATCCCTTAACG-3’，利用上述引物对将常量表达启动子如SEQ ID NO:1所示的序列插入步骤5制备的质粒pR5CY-R质粒上的OsmY前导肽序列与溶菌酶R基因表达单元的上游，得到的质粒命名为p16R5CY-R，PCR反应体系如下表13所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表13 PCR反应体系
(2)将连接产物转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的质粒载体。
7质粒pR5CY-S的构建
(1)设计正向引物pR5C-S-5’和反向引物pR5C-S-3’，所述正向引物pR5C-S-5’，其核苷酸序列如下所示5’-TTGACCTCTGCCGTCGCGACCGGCTCTGCCTACGCGGATACCCTGGAAAGCA-3’，pR5C-S-3’的核苷酸序列如下所示5’-CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGGGCCCTTAGTTTTTGCAGCCCATC-3’，根据RF克隆方法，利用上述引物对将步骤2获得的核酸酶基因序列克隆至pR5C-OsmY质粒上，接在OsmY蛋白膜间质信号肽序列的下游(编码膜间质定位信号肽的基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)，替换膜间质定位信号肽下游的osmY基因序列，得到的质粒命名为pR5CY-S，PCR反应体系如下表14所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表14 PCR反应体系
质粒pR5C-OsmY 5ng
步骤2的核酸酶PCR产物 20ng
Forward Primer,10μM 1μl
Reverse Primer,10μM 1μl
Pfu buffer(5X) 4μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 6.5μl
(2)采用DpnI消化步骤(1)中的PCR产物中的pR5C-OsmY质粒载体，反应体系如下表15，反应条件：37℃放置2个小时。
表15DpnI消化反应体系
步骤(1)的PCR产物 10ng
DpnI 1μl
10×FastDigest buffer 1μl
(3)将连接产物转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的质粒载体。
8质粒p16R5CY-RS的构建
(1)以步骤7获得的pR5CY-S质粒载体为模板，设计正向引物pR5CY-RS-5’和反向引物pR5CY-RS-3’，pR5CY-RS-5’核苷酸序列如下所示5’-GAAGCGGGCGGAACGGTCAGAGAGATTGATGTATGAGGAGATAGCAATGGCTATGACAAGACTG-3’，pR5CY-RS-3’核苷酸序列如下所示5’-CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGGGCCCTTAGTTTTTGCAGCCCATC-3’，利用上述引物通过PCR扩增得到该载体pR5CY-S的带有OsmY蛋白膜间质信号肽序列的核酸酶基因片段，同时通过引物pR5CY-RS-5’在上述扩增得到的基因片段的5’端加上串联连接序列，所述串联连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，PCR反应体系如下表16所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表16 PCR反应体系
pR5CY-S质粒载体 5ng
Forward Primer,10μM 1μl
Reverse Primer,10μM 1μl
Pfu buffer(5X) 4μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 10.5μl
(2)根据RF克隆方法，将上述步骤(1)扩增得到的片段克隆至步骤6制备的p16R5CY-R质粒载体上，获得的质粒命名为p16R5CY-RS，反应体系如下表17，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表17 PCR反应体系
p16R5CY-R质粒载体 5ng
步骤(1)的PCR产物 20ng
Forward Primer,10μM 1μl
Reverse Primer,10μM 1μl
Pfu buffer(5X) 4μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 6.5μl
(3)采用DpnI消化步骤(2)中的PCR产物中的p16R5CY-R质粒载体，反应体系如下表18，反应条件：37℃放置2个小时。
表18 DpnI消化反应体系
步骤(2)的PCR产物 10ng
DpnI 1μl
10×FastDigest buffer 1μl
(4)将连接产物转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的质粒载体，获得所述的重组表达质粒p16R5CY-RS，其核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示。
实施例2菌体转入质粒p16R5CY-RS后的生长情况
本实施例将实施例1制备的重组表达质粒p16R5CY-RS转入菌体中，检测转入上述质粒后菌体的生长情况，具体包括如下步骤：
1.构建作为对照的空载体
以实施例1制备的p16R5CY-RS质粒为模板，设计正向引物vec-5’和反向引物vec-3’，引物vec-5’核苷酸序列如下所示5’-CGGCTCTGCCTAAGGGCCCGAACAAAAAC-3’，引物vec-3’核苷酸序列如下所示5’-TTTTGTTCGGGCCCTTAGGCAGAGCCGGT-3’，通过PCR构建得到将原p16R5CY-RS质粒上的溶菌酶R基因和核酸酶基因表达单元删除的无表达单元的空载体命名为p16R5CY-vec，PCR反应体系如下表19所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表19 PCR反应体系
p16R5CY-RS质粒载体 5ng
Forward Primer,10μM 1μl
Reverse Primer,10μM 1μl
Pfu buffer(5X) 4μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 10.5μl
将获得的产物转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的质粒载体。
2.质粒载体的转化
将步骤1中的质粒p16R5CY-vec和实施例1中制备的质粒p16R5CY-RS分别转入BL21(DE3)菌株感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，利用含有氯霉素的LB固体培养基进行抗性筛选，分别得到转入p16R5CY-RS质粒的BL21(DE3)菌株BL21(DE3/p16R5CY-RS)和转入p16R5CY-vec质粒的BL21(DE3)菌株BL21(DE3/p16R5CY-vec)。
3.转化子的培养以及检测
挑取步骤2中的两种转化子接入LB液体培养基中，然后向上述培养基中加入最终质量浓度为17μg/ml氯霉素，于37℃培养过夜，培养12个小时，次日，分别将上述培养的菌液以LB液体培养基的体积的10％(V/V)接种到LB液体培养基中，温度为37℃、200rpm转速下进行摇床培养，分别在培养1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、9小时和24小时这8个时间点，同时取样测量两种菌液在600nm处的光密度值(分光光度计由上海光谱提供，型号为SP-752PC)，BL21(DE3/p16R5CY-vec)和BL21(DE3/p16R5CY-RS)均各有三组平行样品进行检测。
4.结果
检测的数据见下表20所示，根据表20的数据，以光密度值为纵坐标，以时间(h)为横坐标绘制生长曲线图，如图2所示，BL21(DE3/p16R5CY-RS)的生长速率与BL21(DE3/p16R5CY-vec)菌株的无区别，表明p16R5CY-RS质粒在菌体内表达溶菌酶与核酸酶对菌体生长无影响。
表20两种转化子的菌液的光密度值
实施例3质粒p16R5CY-RS的破菌效率以及核酸的降解
本实施例检测使用质粒p16R5CY-RS对宿主细胞的破菌效率以及核酸的降解情况，具体包括如下步骤：
1.取实施例2中步骤2中获得的BL21(DE3/p16R5CY-RS)菌体接种到LB液体培养基中，然后向上述培养基中加入终质量浓度为17μg/ml氯霉素，于37℃、200rpm转速下进行摇床培养12个小时。
2.取步骤1中的培养的菌液分别加至两个离心管中，每管1mL，离心去除上清培养基，获得菌体沉淀，分别取100μL的去离子水和100μL的处理液(所述处理液为含有体积浓度为10％甘油和体积浓度为2.5％氯仿的水溶液)重悬上述两离心管中的菌体沉淀，充分混合后，室温静置10分钟。结果如图3A所示，与用水重悬的对照相比，使用处理液重悬后的菌液变的澄清，菌体已破碎，并且使用枪头吹吸菌液，液体无黏着感，说明释放出来的大段核酸已被降解。
3.将步骤2中采用处理液处理后的菌体破碎液离心，离心后基本未见沉淀物。使用SDS制样缓冲液，分别对步骤2中采用处理液处理前即破碎前的菌液、破碎后的上清和沉淀制样，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测全菌体、破碎后上清和沉淀中的蛋白量，结果如图3B所示，沉淀中只有两条较明显的蛋白条带，切胶进行质谱鉴定(赛默飞高场静电场轨道阱质谱仪Orbi-Elite)，质谱检测结果见下表21，结果显示为两条蛋白条带为外膜蛋白(OmpF、OmpC和OmpA)，说明外膜碎片和外膜蛋白残留在沉淀中，除此之外其余的可溶蛋白基本都在上清中。可见，使用质粒p16R5CY-RS对宿主细胞破碎程度较好，胞质内的所有蛋白基本都被释放出来。
表21质谱结果
鉴定蛋白名称 分子量 匹配分数 肽段覆盖率
OmpC 40kDa 16574 56.9％
OmpA 37kDa 1977 57.2％
OmpF 37kDa 1099 35.9％
实施例4质粒p16R5CY-RS的应用
本实施例考察质粒p16R5CY-RS与目的蛋白表达质粒pET28a-rTEV共同转入感受态细胞中后，质粒p16R5CY-RS对于目的蛋白表达质粒的降解效率，以及对目的蛋白表达质粒的表达产物的影响。
1.构建目的蛋白表达质粒pET28a-rTEV
(1)合成重组烟草蚀纹病毒蛋白酶rTEV基因
根据Genebank中的记载的重组烟草蚀纹病毒蛋白酶rTEV基因(Genebank登录号：NC_001555.1)，设计如下引物对F-tev-1-5’和R-tev-1-3’，tev-2-5’和R-tev-2-3’，F-tev-3-5’和R-tev-3-3’，F-tev-4-5’和R-tev-4-3’，F-tev-5-5’和R-tev-5-3’，F-tev-6-5’和R-tev-6-3’，F-tev-7-5’和R-tev-7-3’，F-tev-8-5’和R-tev-8-3’，F-tev-9-5’和R-tev-9-3’，F-tev-10-5’和R-tev-10-3’，F-tev-11-5’和R-tev-11-3’，F-tev-12-5’以及R-tev-12-3’，上述引物见下表22，通过overlap PCR从头合成重组烟草蚀纹病毒蛋白酶rTEV基因，反应体系见下表23，反应条件及过程如下：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持1min；步骤5，循环步骤2至4，共30个循环；步骤6，于72℃保持10min。合成的重组烟草蚀纹病毒蛋白酶rTEV基因序列如SEQ ID NO:8所示。
表22通过overlap PCR合成rTEV基因的引物序列
表23重叠延伸PCR反应体系
Pfu buffer(5X) 4μl
Forward Primer,10μM 1μl
Reverse Primer,10μM 1μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 11.5μl
(2)设计正向引物pET-rTev-5’和反向引物pET-rTev-3’，所述正向引物pET-rTev-5’，其核苷酸序列如下所示5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATCATG-3’，pET-rTev-3’的核苷酸序列如下所示5’-GTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGTCGCTTCCTTAACTGG-3’，根据RF克隆方法，利用上述引物对将步骤(1)获得的重组烟草蚀纹病毒蛋白酶rTEV基因克隆至pET28a质粒上，得到的质粒命名为pET28a-rTEV，PCR反应体系如下表24所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表24 PCR反应体系
质粒pET28a 5ng
Pfu buffer(5X) 4μl
Forward Primer,10μM 1μl
Reverse Primer,10μM 1μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 10.5μl
(3)采用DpnI消化步骤(2)中的PCR产物中的pET28a质粒载体，反应体系如下表25，反应条件：37℃放置2个小时。
表25 DpnI消化反应体系
步骤(2)的PCR产物 10ng
DpnI 1μl
10×FastDigest buffer 1μl
(4)将连接产物转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的质粒载体。
2.质粒pET28a-rTEV与质粒p16R5CY-RS共同转化
将步骤1中的质粒pET28a-rTEV和实施例1中制备的质粒p16R5CY-RS共同转入BL21(DE3)菌株感受态细胞中，利用含氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基进行抗性筛选得到双转入质粒pET28a-rTEV和质粒p16R5CY-RS的菌株。
3.转化子的培养
将步骤2中获得的菌株接入TB液体培养基中，加入终浓度为17μg/ml氯霉素和终浓度为50μg/ml卡那霉素，于37℃培养过夜。次日，取上述培养的菌液1mL接种至200mL的TB液体培养基中，温度为37℃、200rpm转速下进行摇床培养，约4小时加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，然后在28℃、200rpm转速下进行摇床培养过夜。同时设置对照，取BL21(DE3)菌株感受态细胞按照上述步骤进行培养。
4.菌体破碎
将步骤3中过夜诱导后的菌液均分为两份，每份100ml，进行离心后将上清培养基去除，保留沉淀(菌体)。其中一份离心后的沉淀用5ml的rTEV酶切缓冲液(所述rTEV酶切缓冲液为含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，0.5mM EDTA，以及1mM的DTT(二硫苏糖醇)的水溶液)重悬，然后使用高压破碎仪进行破碎(1000MPa，破碎三次)，离心后去除沉淀保留上清破碎液，记为上清破碎液A，备用。另一份离心后的沉淀使用5ml含有体积浓度10％甘油和体积浓度2.5％氯仿的rTEV酶切缓冲液重悬，室温放置十分钟，离心后去除沉淀保留上清破碎液，记为上清破碎液B，备用。步骤3中的对照培养的菌液按照上述上清破碎液A的制备步骤进行操作，得到上清破碎液(对照释放物，对照释放物不含有表达的rTEV酶，只是正常的细菌破碎物)。
5.重组烟草蚀纹病毒蛋白酶rTEV的酶切效率
(1)首先构建并大量表达一个可被rTEV酶切的底物蛋白。在本实施例中使用FtsZ-AtpE融合蛋白，两者之间含有rTEV酶切序列，作为rTEV酶切底物。该融合蛋白的全氨基酸序列见SEQ ID NO：10。构建该融合蛋白表达质粒的过程如下：设计如下引物对ftsZ-5’(其核苷酸序列如下所示5’-AATCTAGCCCTAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATGTTTGAACCA ATGG-3’)和ftsZ-tev-3’(其核苷酸序列如下所示：5’-GCCCTGAAAATACAGGTTTTCATCAGCTTGCTTACG-3’)，tev-c-5’(其核苷酸序列如下所示：5’-GAAAACCTGTATTTTCAGGGCATGGAAAACCTGAATATG-3’)和c-3’(其核苷酸序列如下所示：5’-GTGCGCCATTTTTCACTTCACAGGTCAAGCTTATTAGCCGCTGCCA CCGC-3’)，以大肠杆菌基因组为模板(利用全式金生物技术有限公司的基因组提取试剂盒获得)，分别扩增ftsZ基因和atpE基因。其PCR反应体系如表26所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持1min；步骤5，循环步骤2至4，共35个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表26 PCR反应体系
DNA基因组 2ng
Forward Primer,10μM 2μl
Reverse Primer,10μM 2μl
Pfu buffer(5X) 10μl
dNTP 5μl
Pfu DNA聚合酶 1μl
(2)然后利用上述的引物ftsZ-5’和c-3’，通过重叠延伸PCR构建ftsZ-atpE融合基因(所述ftsZ-atpE融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示)。PCR反应体系如表27所示，反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持1.5min；步骤5，循环步骤2至4，共35个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表27重叠延伸PCR反应体系
(3)将步骤(2)得到的ftsZ-atpE融合基因片段，通过RF克隆方法，克隆至质粒pASK-IBA43plus(商业化质粒，可从IBA公司购买)的阅读框内。RF克隆反应体系如表28所示,反应程序：步骤1，于98℃保持2min；步骤2，于98℃保持20s；步骤3，于55℃保持20s；步骤4，于72℃保持3min；步骤5，循环步骤2至4，共18个循环；步骤6，于72℃保持10min。
表28 RF克隆反应体系
质粒pASK-IBA43plus 5ng
Pfu buffer(5X) 4μl
ftsZ-atpE融合基因片段 5μl
dNTP 2μl
Pfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 7.5μl
(4)采用DpnI消化上述所得PCR产物中的pASK-IBA43plus质粒载体，反应体系如下表29，反应条件：37℃放置2个小时。
表29 DpnI消化反应体系
步骤(3)的PCR产物 10ng
DpnI 1μl
10×FastDigest buffer 1μl
(5)将连接产物转化到感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，测序，选择测序结果正确的用于表达FtsZ-AtpE融合蛋白的质粒pASK-ftsZ-atpE。
(6)将步骤(5)得到的质粒pASK-ftsZ-atpE转化入Trans 10感受态细胞中(购于北京全式金生物技术有限公司)，利用含氨苄青霉素的LB固体培养基进行抗性筛选得到转入质粒pASK-ftsZ-atpE的菌株。
(7)将步骤(6)获得的菌株接入TB液体培养基中，加入终浓度为100μg/ml氨苄青霉素，于37℃培养过夜。次日，取上述培养的菌液1mL接种至200mL的TB液体培养基中，温度为37℃、200rpm转速下进行摇床培养，约4小时加入终浓度为50ng/ml的脱水四环素进行诱导，继续摇床培养过夜。
(8)将上述过夜诱导后的菌液离心后将上清培养基去除，保留沉淀(菌体)，用5ml的rTEV酶切缓冲液(所述rTEV酶切缓冲液为含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，0.5mM EDTA，以及1mM的DTT的水溶液)重悬，然后使用高压破碎仪进行破碎(1000MPa，破碎三次)，表达的FtsZ-AtpE融合蛋白为包含体，均处于沉淀中。去除上清破碎液，使用5ml的8M脲重悬沉淀将其进行溶解。然后按照体积比1:8的比例，稀释至rTEV酶切缓冲液中，得到浓度约为1mg/ml的FtsZ-AtpE融合蛋白，作为酶切底物，此蛋白被rTEV酶切后分子量会减少约8kDa。所述FtsZ-AtpE融合蛋白经过测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
(9)将上述底物溶液按照体积比1:3的比例稀释后，取4份上述稀释液，每份取40μL，其中1份作为空白对照，其余3份分别加入10μL步骤4所获得的上清破碎液A(高压破碎释放物)、上清破碎液B(p16R5CY-RS释放物)和对照释放物，于30℃反应1小时，将所得反应液分别利用SDS上样缓冲液制样，同时分别将高压破碎释放物、p16R5CY-RS释放物和对照释放物利用SDS上样缓冲液制样作为对照，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测rTEV酶的释放情况与rTEV酶活性情况。结果如图4所示，利用本发明的方法获得的菌体破碎程度与使用高压破碎仪相近，释放的rTEV酶具有较好的酶切活性，反应1小时可见明显的酶切产物，约为高压破碎仪释放上清中酶活的一半。而酶活低于高压破碎仪释放上清的原因可能来自于氯仿造成rTEV酶一定程度上失活。
6.工具质粒的降解
取两份步骤3中的培养菌液，加至离心管中，每管1ml，进行离心，离心后将上清培养基去除，保留沉淀(菌体)，一管加入100μL的处理液(所述处理液为含有体积浓度为10％甘油和体积浓度为2.5％氯仿的水溶液)重悬，另一管加入250μL的抽提质粒试剂盒(购自于北京全式金生物技术有限公司)中的重悬缓冲液重悬，将上述两个重悬液均按照上述提质粒试剂盒的使用说明书进行质粒的提取。完成后通过琼脂糖凝胶电泳进行核酸的检测，结果如图5所示，使用本发明的质粒破菌后，无法抽提出原有的工具质粒p16R5CY-RS，核酸已被降解。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 北京大学
<120> 一种重组表达质粒及其制备方法、用途
<130> HA201502035
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 1
ttgacagcta gctcagtcct agggactatg ctagc 35
<210> 2
<211> 477
<212> DNA
<213> λ噬菌体R溶菌酶基因(Lambda phage R lysozyme gene )
<400> 2
atggtagaaa tcaataatca acgtaaggcg ttcctcgata tgctggcgtg gtcggaggga 60
actgataacg gacgtcagaa aaccagaaat catggttatg acgtcattgt aggcggagag 120
ctatttactg attactccga tcaccctcgc aaacttgtca cgctaaaccc aaaactcaaa 180
tcaacaggcg ccggacgcta ccagcttctt tcccgttggt gggatgccta ccgcaagcag 240
cttggcctga aagacttctc tccgaaaagt caggacgctg tggcattgca gcagattaag 300
gagcgtggcg ctttacctat gattgatcgt ggtgatatcc gtcaggcaat cgaccgttgc 360
agcaatatct gggcttcact gccgggcgct ggttatggtc agttcgagca taaggctgac 420
agcctgattg caaaattcaa agaagcgggc ggaacggtca gagagattga tgtatga 477
<210> 3
<211> 801
<212> DNA
<213> 粘质沙雷菌的核酸内切酶(Serratia marcescens endonuclease)
<400> 3
atgcgcttta acaacaagat gttggccttg gccgccctgc tgttcgccgc gcaggcgtcg 60
gccgataccc tggaaagcat tgataactgc gcggtgggct gcccgaccgg cggcagcagc 120
aacgtgagca ttgtgcgcca tgcgtatacc ctgaacaaca acagcaccac caaatttgcg 180
aactgggtgg cgtatcatat taccaaagat accccggcga gcggcaaaac ccgcaactgg 240
aaaaccgatc cggcgctgaa cccggcggat accctggcgc cggcggatta taccggcgcg 300
aacgcggcgc tgaaagtgga tcgcggccat caggcgccgc tggcgagcct ggcgggcgtg 360
agcgattggg aaagcctgaa ctatctgagc aacattacct cgcagaaaag cgatctgaac 420
cagggcgcgt gggcgcgcct ggaagatcag gaacgcaaac tgattgatcg cgcggatatt 480
agcagcgtgt ataccgtgac cggcccgctg tatgaacgcg atatgggcaa actgccgggc 540
acccagaaag cgcataccat tccgagcgcg tattggaaag tgatttttat taacaacagc 600
ccggcggtga accattatgc ggcgtttctg tttgatcaga acaccccgaa aggcgcggat 660
ttttgccagt ttcgcgtgac cgtggatgaa attgaaaaac gcaccggcct gattatttgg 720
gcgggcctgc cggatgatgt gcaggcgagc ctgaaaagca aaccgggcgt gctgccggaa 780
ctgatgggct gcaaaaacta a 801
<210> 4
<211> 84
<212> DNA
<213> 大肠杆菌的OsmY基因膜间质信号肽基因序列(E.coli OsmY Membranemesenchyme signal peptide)
<400> 4
atggctatga caagactgaa gatttcgaaa actctgctgg ctgtaatgtt gacctctgcc 60
gtcgcgaccg gctctgccta cgcg 84
<210> 5
<211> 78
<212> DNA
<213> 大肠杆菌的OsmY基因前导肽基因序列(E.coli OsmY leading peptide gene)
<400> 5
atggctatga caagactgaa gatttcgaaa actctgctgg ctgtaatgtt gacctctgcc 60
gtcgcgaccg gctctgcc 78
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 6
ggagatagca 10
<210> 7
<211> 3725
<212> DNA
<213> 重组表达质粒(p16R5CY-RS)
<400> 7
ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 60
atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 120
gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 180
cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 240
ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 300
atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 360
ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 420
accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 480
aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 540
atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 600
ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 660
tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 720
tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 780
aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 840
gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 900
actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 960
gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1020
agcgctagcg gagtgtatac tggcttacta tgttggcact gatgagggtg tcagtgaagt 1080
gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg 1140
atatattccg cttcctcgct cactgactcg ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg 1200
gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg 1260
gaagtgagag ggccgcggca aagccgtttt tccataggct ccgcccccct gacaagcatc 1320
acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1380
cgtttccccc tggcggctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg 1440
tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag ttccgggtag 1500
gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc 1560
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc accactggca 1620
gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg gttaaggcta 1680
aactgaaagg acaagttttg gtgactgcgc tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga 1740
gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga 1800
gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc tcaaacgtta agggattttg gtttgacagc 1860
tagctcagtc ctagggacta tgctagccaa agggctaaca ggaggaatta accatggcta 1920
tgacaagact gaagatttcg aaaactctgc tggctgtaat gttgacctct gccgtcgcga 1980
ccggctctgc ctaaggagat agcaatggta gaaatcaata atcaacgtaa ggcgttcctc 2040
gatatgctgg cgtggtcgga gggaactgat aacggacgtc agaaaaccag aaatcatggt 2100
tatgacgtca ttgtaggcgg agagctattt actgattact ccgatcaccc tcgcaaactt 2160
gtcacgctaa acccaaaact caaatcaaca ggcgccggac gctaccagct tctttcccgt 2220
tggtgggatg cctaccgcaa gcagcttggc ctgaaagact tctctccgaa aagtcaggac 2280
gctgtggcat tgcagcagat taaggagcgt ggcgctttac ctatgattga tcgtggtgat 2340
atccgtcagg caatcgaccg ttgcagcaat atctgggctt cactgccggg cgctggttat 2400
ggtcagttcg agcataaggc tgacagcctg attgcaaaat tcaaagaagc gggcggaacg 2460
gtcagagaga ttgatgtata aggagatagc aatggctatg acaagactga agatttcgaa 2520
aactctgctg gctgtaatgt tgacctctgc cgtcgcgacc ggctctgcct acgcggatac 2580
cctggaaagc attgataact gcgcggtggg ctgcccgacc ggcggcagca gcaacgtgag 2640
cattgtgcgc catgcgtata ccctgaacaa caacagcacc accaaatttg cgaactgggt 2700
ggcgtatcat attaccaaag ataccccggc gagcggcaaa acccgcaact ggaaaaccga 2760
tccggcgctg aacccggcgg ataccctggc gccggcggat tataccggcg cgaacgcggc 2820
gctgaaagtg gatcgcggcc atcaggcgcc gctggcgagc ctggcgggcg tgagcgattg 2880
ggaaagcctg aactatctga gcaacattac cccgcagaaa agcgatctga accagggcgc 2940
gtgggcgcgc ctggaagatc aggaacgcaa actgattgat cgcgcggata ttagcagcgt 3000
gtataccgtg accggcccgc tgtatgaacg cgatatgggc aaactgccgg gcacccagaa 3060
agcgcatacc attccgagcg cgtattggaa agtgattttt attaacaaca gcccggcggt 3120
gaaccattat gcggcgtttc tgtttgatca gaacaccccg aaaggcgcgg atttttgcca 3180
gtttcgcgtg accgtggatg aaattgaaaa acgcaccggc ctgattattt gggcgggcct 3240
gccggatgat gtgcaggcga gcctgaaaag caaaccgggc gtgctgccgg aactgatggg 3300
ctgcaaaaac taagggcccg aacaaaaact catctcagaa gaggatctga atagcgccgt 3360
cgaccatcat catcatcatc attgagttta aacggtctcc agcttggctg ttttggcgga 3420
tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa 3480
cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa 3540
gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc 3600
caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 3660
tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc 3720
gaagc 3725
<210> 8
<211> 726
<212> DNA
<213> 重组烟草蚀纹病毒蛋白酶rTEV基因(rTEV gene)
<400> 8
atgggtcatc atcatcatca tcatcatgga gaaagcttgt ttaaggggcc gcgtgattac 60
aacccgatat cgagcagcat ttgtcatttg acgaatgaat ctgatgggca cacaacatcg 120
ttgtatggta ttggatttgg tcccttcatc attacaaaca agcacttgtt tagaagaaat 180
aatggaacac tggtggtcca atcactacat ggtgtattca aggtcaagga caccacgact 240
ttgcaacaac acctcgttga tgggagggac atgataatta ttcgcatgcc taaggatttc 300
ccaccatttc ctcaaaagct gaaatttaga gagccacaaa gggaagagcg catatgtctt 360
gtgacaacca acttccaaac taagagcatg tctagcatgg tgtcagacac tagttgcaca 420
ttcccttcag gtgatggcat attctggaag cattggattc aaaccaagga tgggcagtgt 480
ggcagtccat tagtatcaac tagagatggg ttcattgttg gtatacactc agcatcgaat 540
ttcaccaaca caaacaatta tttcacaagc gtgccgaaaa acttcatgga attgttgaca 600
aatcaggagg cgcagcagtg ggttagtggt tggcgattaa atgctgactc agtattgtgg 660
gggggccata aagttttcat ggtgaaacct gaagagcctt ttcagccagt taaggaagcg 720
acttga 726
<210> 9
<211> 1428
<212> DNA
<213> FtsZ-AtpE的核苷酸序列(FtsZ-AtpE)
<400> 9
atgtttgaac caatggaact taccaatgac gcggtgatta aagtcatcgg cgtcggcggc 60
ggcggcggta atgctgttga acacatggtg cgcgagcgca ttgaaggtgt tgaattcttc 120
gcggtaaata ccgatgcaca agcgctgcgt aaaacagcgg ttggacagac gattcaaatc 180
ggtagcggta tcaccaaagg actgggcgct ggcgctaatc cagaagttgg ccgcaatgcg 240
gctgatgagg atcgcgatgc attgcgtgcg gcgctggaag gtgcagacat ggtctttatt 300
gctgcgggta tgggtggtgg taccggtaca ggtgcagcac cagtcgtcgc tgaagtggca 360
aaagatttgg gtatcctgac cgttgctgtc gtcactaagc ctttcaactt tgaaggcaag 420
aagcgtatgg cattcgcgga gcaggggatc actgaactgt ccaagcatgt ggactctctg 480
atcactatcc cgaacgacaa actgctgaaa gttctgggcc gcggtatctc cctgctggat 540
gcgtttggcg cagcgaacga tgtactgaaa ggcgctgtgc aaggtatcgc tgaactgatt 600
actcgtccgg gtttgatgaa cgtggacttt gcagacgtac gcaccgtaat gtctgagatg 660
ggctacgcaa tgatgggttc tggcgtggcg agcggtgaag accgtgcgga agaagctgct 720
gaaatggcta tctcttctcc gctgctggaa gatatcgacc tgtctggcgc gcgcggcgtg 780
ctggttaaca tcacggcggg cttcgacctg cgtctggatg agttcgaaac ggtaggtaac 840
accatccgtg catttgcttc cgacaacgcg actgtggtta tcggtacttc tcttgacccg 900
gatatgaatg acgagctgcg cgtaaccgtt gttgcgacag gtatcggcat ggacaaacgt 960
cctgaaatca ctctggtgac caataagcag gttcagcagc cagtgatgga tcgctaccag 1020
cagcatggga tggctccgct gacccaggag cagaagccgg ttgctaaagt cgtgaatgac 1080
aatgcgccgc aaactgcgaa agagccggat tatctggata tcccagcatt cctgcgtaag 1140
caagctgatg aaaacctgta ttttcagggc atggaaaacc tgaatatgga tctgctgtac 1200
atggctgccg ctgtgatgat gggtctggcg gcaatcggtg ctgcgatcgg tatcggcatc 1260
ctcgggggta aattcctgga aggcgcagcg cgtcaacctg atctgattcc tctgctgcgt 1320
actcagttct ttatcgttat gggtctggtg gatgctatcc cgatgatcgc tgtaggtctg 1380
ggtctgtacg tgatgttcgc tgtcgcgggt agcggtggca gcggctaa 1428
<210> 10
<211> 475
<212> PRT
<213> FtsZ-AtpE融合蛋白(FtsZ-AtpE)
<400> 10
Met Phe Glu Pro Met Glu Leu Thr Asn Asp Ala Val Ile Lys Val Ile
1 5 10 15
Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ala Val Glu His Met Val Arg Glu
20 25 30
Arg Ile Glu Gly Val Glu Phe Phe Ala Val Asn Thr Asp Ala Gln Ala
35 40 45
Leu Arg Lys Thr Ala Val Gly Gln Thr Ile Gln Ile Gly Ser Gly Ile
50 55 60
Thr Lys Gly Leu Gly Ala Gly Ala Asn Pro Glu Val Gly Arg Asn Ala
65 70 75 80
Ala Asp Glu Asp Arg Asp Ala Leu Arg Ala Ala Leu Glu Gly Ala Asp
85 90 95
Met Val Phe Ile Ala Ala Gly Met Gly Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Pro Val Val Ala Glu Val Ala Lys Asp Leu Gly Ile Leu Thr Val
115 120 125
Ala Val Val Thr Lys Pro Phe Asn Phe Glu Gly Lys Lys Arg Met Ala
130 135 140
Phe Ala Glu Gln Gly Ile Thr Glu Leu Ser Lys His Val Asp Ser Leu
145 150 155 160
Ile Thr Ile Pro Asn Asp Lys Leu Leu Lys Val Leu Gly Arg Gly Ile
165 170 175
Ser Leu Leu Asp Ala Phe Gly Ala Ala Asn Asp Val Leu Lys Gly Ala
180 185 190
Val Gln Gly Ile Ala Glu Leu Ile Thr Arg Pro Gly Leu Met Asn Val
195 200 205
Asp Phe Ala Asp Val Arg Thr Val Met Ser Glu Met Gly Tyr Ala Met
210 215 220
Met Gly Ser Gly Val Ala Ser Gly Glu Asp Arg Ala Glu Glu Ala Ala
225 230 235 240
Glu Met Ala Ile Ser Ser Pro Leu Leu Glu Asp Ile Asp Leu Ser Gly
245 250 255
Ala Arg Gly Val Leu Val Asn Ile Thr Ala Gly Phe Asp Leu Arg Leu
260 265 270
Asp Glu Phe Glu Thr Val Gly Asn Thr Ile Arg Ala Phe Ala Ser Asp
275 280 285
Asn Ala Thr Val Val Ile Gly Thr Ser Leu Asp Pro Asp Met Asn Asp
290 295 300
Glu Leu Arg Val Thr Val Val Ala Thr Gly Ile Gly Met Asp Lys Arg
305 310 315 320
Pro Glu Ile Thr Leu Val Thr Asn Lys Gln Val Gln Gln Pro Val Met
325 330 335
Asp Arg Tyr Gln Gln His Gly Met Ala Pro Leu Thr Gln Glu Gln Lys
340 345 350
Pro Val Ala Lys Val Val Asn Asp Asn Ala Pro Gln Thr Ala Lys Glu
355 360 365
Pro Asp Tyr Leu Asp Ile Pro Ala Phe Leu Arg Lys Gln Ala Asp Glu
370 375 380
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Met Glu Asn Leu Asn Met Asp Leu Leu Tyr
385 390 395 400
Met Ala Ala Ala Val Met Met Gly Leu Ala Ala Ile Gly Ala Ala Ile
405 410 415
Gly Ile Gly Ile Leu Gly Gly Lys Phe Leu Glu Gly Ala Ala Arg Gln
420 425 430
Pro Asp Leu Ile Pro Leu Leu Arg Thr Gln Phe Phe Ile Val Met Gly
435 440 445
Leu Val Asp Ala Ile Pro Met Ile Ala Val Gly Leu Gly Leu Tyr Val
450 455 460
Met Phe Ala Val Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly
465 470 475

Claims (10)

1.一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒包含：溶菌酶基因和核酸酶基因；所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列。
2.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒中的启动溶菌酶基因和核酸酶基因表达的启动子序列选自：质粒J61002的常量表达启动子或质粒pSB1A2的常量表达启动子。
3.根据权利要求1或2所述的重组表达质粒，其特征在于，所述溶菌酶基因选自大肠杆菌素E7基因、λ噬菌体溶菌酶R基因或PhiX174噬菌体溶菌酶E基因；所述核酸酶基因序列选自大肠杆菌RecBCD核酸外切酶基因、粘质沙雷菌的核酸内切酶基因、T5噬菌体Dl5核酸外切酶基因或大肠杆菌endA核酸酶基因；所述编码膜间质定位信号肽的基因序列选自大肠杆菌的osmY基因、surA基因或dsbA基因。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒，从5’端到3’端依次包括抗性基因表达盒、复制子序列、启动子、溶菌酶基因序列、膜间质定位信号肽基因序列、核酸酶基因序列和终止子序列。
5.一种构建1-4任一项所述的重组表达质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别将溶菌酶基因序列、核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列克隆至选定的质粒载体上，获得所述重组表达质粒；
(2)将步骤(1)中获得的所述重组表达质粒转化至感受态细胞中，筛选、测序，选择测序结果正确的质粒载体。
6.一种重组表达质粒组合物，其特征在于，包括：至少一个包含溶菌酶基因的重组表达质粒；和至少一个包含核酸酶基因的重组表达质粒，所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列。
7.含有权利要求1-4任一项所述的重组表达质粒的生物材料。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括载体、宿主菌、工程菌、细胞、表达盒或利用权利要求1-4任一项所述的重组表达质粒进行细胞破碎所获得的裂解液。
9.权利要求1-4任一项所述的重组表达质粒、权利要求6所述的重组表达质粒组合物或权利要求7-8任一项所述的生物材料在细胞破碎中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌细胞。
CN201711307979.7A 2017-12-11 2017-12-11 一种重组表达质粒及其制备方法、用途 Active CN108220317B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711307979.7A CN108220317B (zh) 2017-12-11 2017-12-11 一种重组表达质粒及其制备方法、用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711307979.7A CN108220317B (zh) 2017-12-11 2017-12-11 一种重组表达质粒及其制备方法、用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108220317A true CN108220317A (zh) 2018-06-29
CN108220317B CN108220317B (zh) 2021-04-16

Family

ID=62653498

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711307979.7A Active CN108220317B (zh) 2017-12-11 2017-12-11 一种重组表达质粒及其制备方法、用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108220317B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101035905A (zh) * 2004-08-16 2007-09-12 自然科技公司 用于制备质粒dna的改良大肠杆菌菌株
CN106755033A (zh) * 2016-11-18 2017-05-31 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种大肠杆菌菌影载体pPBA1100‑DLS‑ES及其制备方法
EP3234147A1 (en) * 2014-12-19 2017-10-25 Adagene Inc. Methods and systems for autoinduction of protein expression

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101035905A (zh) * 2004-08-16 2007-09-12 自然科技公司 用于制备质粒dna的改良大肠杆菌菌株
EP3234147A1 (en) * 2014-12-19 2017-10-25 Adagene Inc. Methods and systems for autoinduction of protein expression
CN106755033A (zh) * 2016-11-18 2017-05-31 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种大肠杆菌菌影载体pPBA1100‑DLS‑ES及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIDINGER W等: "Escherichia coli ghost production by expression of lysis gene E and Staphylococcal nuclease.", 《APPL ENVIRON MICROBIOL》 *
付立霞: "嗜水气单胞菌非质粒依赖性菌蜕疫苗的研制及评价", 《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》 *
杨运桂等: "新型大肠杆菌裂解系统在重组蛋白回收中的应用", 《生物化学与生物物理学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108220317B (zh) 2021-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Korneli et al. Getting the big beast to work—systems biotechnology of Bacillus megaterium for novel high-value proteins
EP3262061B1 (en) Peptides for facilitating secretion and uses thereof
WO2023045682A1 (zh) 一种提高多肽可溶性表达产量的方法
CN113122490B (zh) 双基因缺陷型工程菌及其在提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的应用
CN113234699A (zh) α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用
CN106086025B (zh) 一种具有启动子功能的dna片段及其应用
Reed et al. Biotechnological applications of bacterial protein secretion: from therapeutics to biofuel production
Fodor et al. Modular broad-host-range expression vectors for single-protein and protein complex purification
CN110305855B (zh) 天麻GeCPR基因及其应用
CN116286931B (zh) 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用
CN109321618B (zh) 一种通过糖多孢红霉菌sace_5717基因提高红霉素产量的方法
WO2023103578A1 (en) A genetically engineered bacterium and a preparation method and use thereof
CN108220317A (zh) 一种重组表达质粒及其制备方法、用途
CN113249288B9 (zh) 一种表达glp-1类似物的重组菌及其应用
CN105602914B (zh) 一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其应用
Borne et al. Engineering of a new Escherichia coli strain efficiently metabolizing cellobiose with promising perspectives for plant biomass-based application design
CN110951760B (zh) 一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用
US11203760B2 (en) Gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 and the method for obtaining thereof
CN103757048A (zh) 无抗药基因的酵母-细菌穿梭载体的构建和应用
CN102277327B (zh) 过表达RimL的大肠杆菌及其在制备N-乙酰化胸腺素α中的应用
CN108795832B (zh) 一种内源l-门冬酰胺酶ii基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用
Yang et al. A natural antisense transcript regulates muc D gene expression and biofilm biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa
CN107119051B (zh) 一种巨大芽孢杆菌具有启动子功能的dna片段及其应用
CN117051043B (zh) 一种基于环状rna编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素及其应用
CN112812191B (zh) 一种提高酶可溶性表达的融合标签及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant