CN101035905A - 用于制备质粒dna的改良大肠杆菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种菌株及其制备方法，具体涉及一种具有出人意料效果的与基因组DNA和RNA相关的纯化质粒DNA的菌株及其制备方法。本发明优选的一个实施例中，在发酵/收获过程中，裂解与核酸酶去除宿主核酸是一个整体的部分，因此，增加了产量和纯度，同时简化了下游的纯化过程，减少了污染物的产生，从而降低了制备成本。

Description

用于制备质粒DNA的改良大肠杆菌菌株
关于联邦政府赞助研究或研发的声明
本发明部分的由政府支持，基金号1 R43 GM072141-01，由美国国立卫生研究院授予。政府对本发明享有一定的权利。
本发明享受2004年8月16日提交的专利申请序列号.#美国60/602074的优先权。
技术领域
本发明涉及一种共价闭合环状(ccc)重组DNA分子的制备，如质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒载体及其杂种，更具体的是涉及一种从发酵产生的核酸分子污染物中提纯所述DNA分子的方法。
背景技术
本发明涉及一种共价闭合环状(ccc)重组DNA分子的制备，上述分子在生物工程、转基因生物体、基因治疗、治疗性种痘、农业和DNA疫苗中有广泛的用途。
便于了解本发明，在此引入对本发明前的现有技术的检索。大肠杆菌质粒在科研和工业上的应用具有很长的历史，它是单一的最重要的重组DNA分子来源。今天，在生物工程产物(基因药物和DNA疫苗)不断出现的情况下，质粒DNA开始变得更加重要了，进入了临床试验，甚至进入了医药市场。质粒DNA疫苗可应用于：病毒、细菌或寄生虫疾病的预防性疫苗；制备应激免疫球蛋白的免疫制剂；传染病的治疗性疫苗；癌症疫苗等。获得质粒的基本方法(通过细菌发酵)，众所周知的是通过碱裂解提纯得到(Birnboim，HC，Doly J.1979，Nucleic Acids Res.，7：1513-1523)。首先，将发酵获得的细菌细胞糊状物悬浮和裂解(使用含氢氧化钠和十二烷基磺酸钠的组合物)，然后加入乙酸盐(如乙酸钾)中和，使细菌DNA和大部分的细胞碎片沉淀。大部分的超螺旋质粒DNA保留在溶液中，还含有污染的细菌RNA、DNA和蛋白，如大肠杆菌内毒素(脂多糖，LPS)。
裂解方法可选高温/溶菌酶，在有非离子型去污剂存在条件下使细胞释放出完整的质粒DNA。也可以使用高压超临界流体或用有机溶剂或去污剂处理，使细胞裂解，核酸释放出来。
上述裂解方法同时也释放出细胞杂质，因此需要纯化步骤来去除。因此，在质粒DNA制备过程中使用碱裂解或热变性使细胞裂解的方法是昂贵的、效率不高的，同时产生了大量有毒的污染物。可选的，目前还没有经济有效的裂解方法。
通过过滤将可溶片断分离，再经过一系列的纯化步骤，包括RNase降解、色谱法(离子交换凝胶过滤、羟基磷灰石柱层析、凝胶过滤、疏水作用、反相层析、HPLC等)、膜渗滤、有机萃取、选择性沉淀等。
可参考的现有技术表明，裂解后的质粒提取下游过程使基因组DNA浓度下降到0.01-1％或更少。以下列举但没有穷尽的现有技术中的提纯方法包括了特别的降低基因组DNA步骤：用羟磷灰石达到0.01％基因组(Wils P和Ollivier，M.2004美国专利6730781)；用疏水作用色谱法达到0.05％基因组(Nochumson S，Durland R，Yu-Speight A，Welp J，Wu K和Hayes R.2001美国专利申请2001/0034435；Diogo MM，Querioz JA，Monteiro，GA，Martins SAM，Ferreira，GNM和Prazeres DMF.2000 BiotechBioeng 68：576-583)；用硫酸铵沉淀法达到1％基因组(McNeilly DS.2001美国专利号6214586)；用体积排阻色谱法达到0.2％基因组(Lemmens R，Olsson U，Nyhammar T和Stadler J.2003.J Chromatography B784：291-300)；用切向流超滤法达到＜1％基因组(Bussey LB，Adamson R和Atchley A.2000美国专利号6011148)；用差示的聚乙二醇沉淀法达到＜1％基因组(Marquet M，Horn N，Meek J和Budahazi G.1996美国专利号5591064)；用溴化十六烷三甲基铵(CTAB)和分子(gryolite)LRA吸收法(Lander RJ，Winters MA和Meacle FJ.2002美国专利申请2002/0151048)，三螺旋色谱法达到0.1％基因组(Crouzet J，Scherman D和Wils P.2001美国专利号6287762)。
将质粒DNA导入人体中存在一些问题和挑战，FDA(美国食品药品管理局)法规上指出，包括有关预防传染性疾病的质粒DNA疫苗的意见(美国食品药品管理局，生物评估与研究中心，1996，有关预防传染性疾病的质粒DNA疫苗的意见指示摘要NO.96N-0400；美国食品药品管理局，生物评估与研究中心，1998，工业指南：对人体细胞治疗和基因治疗指南)。上述文件显示了各种污染物质，并建议了对每个污染物质的进行测试来评估其含量。上述指南文件涉及内容不深，然而，提出了最大的可接受的污染RNA、DNA或蛋白的建议，尽管不为人所知。进一步的，可接受的基因组DNA的底限是0.00001％，比如针对于FDA有关重组蛋白药物的指南，在1mg DNA疫苗剂量单位的底限为100pg基因组DNA/剂量单位(FDA，1993，有关应用于生物产品的细胞系特征的指南)。上述底限与标准的大量制备的质粒制剂(0.01-5％基因组DNA)相比，低了几个数量级，该底限也不能通过现有的制备方法有效的获得。因此需要寻找一种进一步能降低基因组DNA的方法。
核酸可以在制备过程的前期被除去(如被核酸酶降解)，或在后期(如经色谱分离)除去。近期的相关研究表明，在溶菌缓冲液中使用牛胰腺核糖核酸酶(RNase A)可以降解RNA。尽管其可以有效地减少RNA的量和大小，但也带入了牛源的RNase，这是不符合法规要求的，因为它可能被朊病毒剂污染，显著地带有牛海绵状脑炎(BSE)剂。事实上，对于完全不含动物产物(APF)的细菌产品(用于人或动物)的发酵和纯化方法具有增长的需求。
目前还没有一种高效的商业应用的酶，能够专一的降解大肠杆菌基因组DNA，同时保留完整的超螺旋质粒(‘对质粒无作用’核酸酶)。偶然地，核酸酶，如ATP依赖Rec BCD核酸外切酶(Qiagen，大型质粒抽提试剂盒说明书，2003，7；Wahle，S，Schorr J和Weber M.2001美国专利6242220；Isfort RJ 1992 BioTechniques 12：798-804)被加入到部分纯化的质粒DNA制品中。另一种相关的方法，粗提的质粒制品经加热变性，所有的非环状DNA变性为单链形式，然后加入单链核酸外切酶，如SI核酸酶、绿豆核酸酶、P1核酸酶、T7核酸外切酶、Bal31核酸酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶VIII或λ核酸外切酶(Hyman ED.1992世界专利申请92/13963)。上述DNase不能直接加入到溶菌过程(有RNase存在)，因为DNase比RNase更加的敏感，其在碱性/SDS下失活。因此对于商业上大规模的质粒制备而言，应用上述方法既昂贵又不容易实施。
为了克服上述质粒DNA制备过程中添加纯化的核酸酶产生的问题，可选的已应用的方案是利用内源核酸酶来除去基因组DNA。早期的方法包括普通的DNA分解(如紫外线辐射修补缺陷型宿主(Sancar A，Hack AM和Rupp WD.1979 J Bacteriol.137：692-693)；或是电离辐射(MacPhee DG，Radford，AJ和Reanney DC.1988美国专利号4755464)，其中质粒在低损伤的情况(即比基因组小的靶)下生长而染色体不能；用内源核酸酶(如RecBCD)介入降解，基因组DNA酶切点发生断裂。更进一步报道的使用实例是利用限制性核酸内切酶来裂解基因组DNA，其中限制性核酸内切酶的活性由热敏甲基化酶控制。转移到限定温度时，甲基化酶失活，导致基因组DNA降解，然后被内源核酸外切酶消化(Hanak，J，Alexis J和WardJM.2001世界专利申请WO 01/29209)。然而，上述方法降低基因组的浓度是有限的，同时质粒是要应用到生物工程上的，缺少相关的酶切位点使上述方法没有得到普遍的应用。
已经研究出一些特别的大肠杆菌菌株，所述菌株在周质内表达重组的核酸酶，为了不干扰大肠杆菌在细胞生长过程中的基因表达。其中一个研究中，牛胰腺RNase通过一种分泌信号定位到周质，细菌溶解后，RNase和RNA混合在一起并将其降解(Cooke GD，Cranenburgh RM，Hanak JAJ，Dunnill P，Thatcher DR，Ward JM.2001 A J.Biotechnology 85：297-304)。上述系统利用碱裂解过程来去除RNA，而没有去除基因组DNA。同样还有过表达周质金黄色葡萄球菌核酸酶的系统(Cooke GD，Cranenburgh RM，Hanak JAJ，Ward JM.2003 J.Biotechnology 101：229-239；Huisman GW，Luo LZ和Peoples OP.2004美国专利申请2004/0014197；Boynton ZL，Koon JL，Brennan EM，Clouart JD，Horowitz DM，Gerngross TU和HuismanGW.1999 Pseudomonas putida.Appl.Environ.Microbiol.65：1524-1529)；或已经研究出的内源的大肠杆菌EndA周质核酸酶(Leung WS和Swartz JR.2001美国6258560)，减少蛋白或其它生物物质制品中的核酸污染。这些系统不是对质粒无作用的，需要温和的蛋白纯化和缓冲液激活。Kelly在2003年发表的文章(Kelly WJ 2003 Biotechnol Appl Biochem 37219-223)中对发酵培养中导入对质粒无作用的DNase进行了理论上的探讨，但没有提出具体的实施方式或具体的核酸酶。
已研究出有利于蛋白制备的自溶细胞系(Leung和Swartz，同上，2001)。在上述细胞系中，溶菌酶在细胞质中表达，在需要的时候通过与穿孔素(跨膜肽或蛋白)共表达，释放到周质中，其中穿孔素可以在细胞膜上形成一个通道使溶菌酶和其他的细胞质蛋白释放，从细胞质到周质。例如，现有技术中已广泛使用溶菌素/穿孔素组合物，在Young的文章中就提到了一些组合物(Young R 1992 Microbiol Molec Reviews，56430-481)，并在本发明中作为参考。噬菌体λ溶菌蛋白也被应用于蛋白制备的自溶细胞系中(Leung和Swartz，同上2001)。
自溶的条件，如碱裂解或热裂解，不能选择性地变性基因组DNA。溶菌的产物具有很大的粘性，给后续的过程带来一些问题。对于蛋白的制备，不需要加入特别的核酸酶，或在细胞株里胞质周围表达(如endA核酸酶，Leung和Swartz，同上，2001；金黄色葡萄球菌核酸酶，Cooke等，同上，2003，Huisman等，同上，2005，Boynton等，同上，1999)，来降低细胞溶解后的粘性。上述系统不能被应用到质粒的制备中。
上述制备质粒DNA的纯化方法是昂贵的、效率低的，同时产生了大量的有毒污染物。残留的基因组DNA浓度极大的超过了商业产品可接受的标准。上述限制使质粒DNA制备过程在商业应用上承受着成本和纯度的压力。
在现有文献中，仍然保留着对了经济有效的去除基因组DNA方法的需求。因此，需要一种简单的、更少花费的纯化方法，能降低成本和有毒化学物质。
发明内容
本发明涉及制备DNA的方法，具体是将一种或多种对质粒无作用的核酸酶的基因插入大肠杆菌基因组中，基因表达产物以蛋白分泌到周质空间。当质粒或DNA复制子在上述细胞内增殖，核酸酶被再次导入到细胞质中，降解除了所需复制子外的核酸，这有利于提纯复制子。在本发明的一个优选实施例中，所述核酸酶为嵌合酶。在另一个优选的实施例中，嵌合酶为一种DNA酶和至少一种RNA酶的部分作为融合伙伴。在另一个优选的实施例中使用的是一种融合噬菌体T5 D15核酸外切酶与RNaseA或RNaseS融合的嵌合酶。在一个优选的制备方法中，通过信号肽或其他等同方法将核酸酶定位到周质，当细胞自溶时细菌基因组DNA和/或RNA被降解，导入的复制子DNA不被降解，从而有利于提纯复制子。在另一个优选的实施例中，细胞自溶可以通过使用胞内表达的噬菌体溶菌蛋白，或使用抗生素。本发明包括含有至少一种对质粒无作用核酸酶的细菌菌株，含有或不含融合伙伴，以及质粒，其中对质粒无作用的核酸酶有利于质粒提纯。
发明简述
本发明的目的是提供一种组合物和质粒提纯方法。另一个目的是提供一种在纯化质粒DNA中降低核酸杂质的方法。另一个目的是降低质粒DNA纯化的生产成本。另一个目的是降低质粒DNA纯化中的有毒废物。同时描述了改善的质粒制备过程，与现有技术的过程相比改善在于：降低了缺口(开环)或线性质粒而增加质粒的质量；使用紧凑的制备步骤简化了制备；通过去除多个制备步骤简化了制备；通过去除多个制备步骤降低了成本；在质粒提纯中通过降低核酸杂质增加了质粒的质量，使进入下游制备前就去除了关键的杂质；通过从最终的质粒产物中去除基因组DNA增加法规依从度；通过去除动物产物来源物质增加法规依从度，如核糖核酸酶A；通过消除有毒污染物增加法规依从度。
本发明的目的和优点将通过附图及下面的描述得到进一步的阐述。
附图说明
图1.T5核酸外切酶酶解变性的质粒和大肠杆菌基因组DNA电泳图。
图2.表示pVEXSapIStuffer载体。
图3.显示定向扩增和克隆cDNA序列到pVEX载体的方法。
图4.pVEXSapIOmpAStuffer载体示意图。
图5.表示pVEXBSapIOmpAStuffer载体。
图6.显示pVEXBOmpARNase载体。
图7.pVEXBOmpAT5RNase载体示意图。
图8.显示T5RNase核酸外切酶去除基因组DNA。质粒DNA样品凝胶电泳照片，如图所示，使用和不使用优选的T5外切酶和RNase基因。
图9.S-肽和S-蛋白结合制备RNaseS-T5融合体图示。
图10.显示融合核酸酶水解核酸。
图11.显示用S肽T5+S蛋白和T5RNase组合去除RNA。
图12.表示用S肽T5+S蛋白组合去除RNA和基因组DNA。
图13.描述了大肠杆菌细胞质内容物通过PhiX174基因E孔释放。
图14.显示pACYCB天然填充序列(stuffer)载体。
图15.pACYCB基因E载体示意图。
图16.显示基因E裂解蛋白介导的质粒释放。
图17.抗生素导致自溶后的核酸酶降解基因组DNA图。
图18.周质核酸酶-表达制备宿主在质粒制备中的应用示意图。
图19.胞质核酸酶-表达制备宿主在自溶质粒制备过程中的应用示意图。
发明详述
现结合附图，图1显示的是大量制备质粒样品中用T5核酸外切酶酶解变性的质粒和大肠杆菌基因组DNA：1)DNA分子量标记[最大的条带为12kb]，2)从大量制备的质粒中提取质粒样品，3)同一样品，以无T5核酸外切酶为对照进行T5核酸外切酶酶切反应，4)同一样品，用2％w/w T5核酸外切酶酶解。底端条带是超螺旋、中间条带是超螺旋二聚体和缺口单体的混合，顶端条带是缺口二聚体和基因组DNA的混合。基因组DNA和缺口质粒可从中间和顶端条带定量移除。1％w/w T5核酸外切酶酶解的结果与之类似。
在图2中，pVEXSapIStuffer载体示意图。
在图3中，描述了定向扩增和克隆cDNA到pVEX载体的方法：A)含有两个独特标记位点的质粒，由IIS类酶在酶切位点间分解得到，和B)一般的引物，含有IIS类酶识别位点(SapI)，至少含一个插入的核苷酸，和一个带有独特的无回文序列(GGG，本例中的标记位点)重叠区域。
在图4中，pVEXSapIOmpAStuffer载体示意图。
在图5中，显示了pVEXBSapIOmpAStuffer载体。
在图6中，pVEXBOmpARNase载体示意图。
在图7中，显示了pVEXBOmpAT5RNase载体。
在图8中，显示T5RNase核酸外切酶去除基因组DNA。使用和没使用优选的T5核酸外切酶和RNase基因的质粒DNA样品凝胶电泳照片结构如下：泳道1、5和9为T5RNase诱导；泳道3、7和11为无T5RNase诱导；泳道2、6和10为RNase诱导；泳道4、8和12为无RNase诱导。样品1-8是Qiagen-制备后碱裂解核酸；样品9-12是用快速-提取的总DNA；样品5-12来自4℃储存的细胞，而样品1-4来自-20℃储存的细胞。M)是DNA分子量标记。最大的条带是12kb。从顶端开始，最大分子量的条带是基因组DNA(gDNA)，下一个是超螺旋二聚体质粒DNA[pDNA(2x)]，再下一个是超螺旋单体质粒DNA(pDNA)，最远端的条带是RNA。泳道1的箭头指示去除的基因组DNA。
在图9中，使用S-肽和S-蛋白组合制备RNaseS-T5融合体图示。
在图10中，显示融合核酸酶水解核酸。
在图11中，显示用S肽T5+S蛋白和T5RNase组合去除RNA。诱导培养含有指示质粒的DH5α细胞，进行碱裂解，再用乙醇沉淀核酸，解析于1％琼脂糖胶。用SYBR Green II(Molecular Probes)后着色，检测RNA(主条带)。泳道1＝pVEXBOmpAS-肽T5+pACYCBOmpAS蛋白，泳道2＝pVEXBOmpAT5-S肽+pACYCBOmpAS蛋白，泳道3＝pVEXBPhoARNase，泳道4＝pVEXBOmpAT5RNase，泳道5＝pVEXBOmpAT5，泳道6＝pVEXBPhoA(移码)RNase(阴性对照)。
在图12中，显示了S肽-T5+S蛋白结构去除RNA和基因组DNA。培养诱导(泳道1-4和6)和无诱导(泳道5)含有指示质粒的DH5α细胞，进行碱裂解，再用乙醇沉淀核酸，解析于1％琼脂糖胶。用SYBR GreenII后着色，检测RNA和DNA。泳道1＝pVEXBOmpAS-肽T5，泳道2＝pVEXBOmpAS-肽T5+pACYCBOmpAS蛋白，泳道3＝pACYCBOmpAS蛋白，泳道4＝pVEXBPhoAS肽-T5，泳道5＝pVEXBPhoAS肽-T5+pACYCBOmpAS蛋白(无诱导)，泳道6＝pVEXBPhoAS肽-T5+pACYCBOmpAS蛋白(诱导)。泳道2箭头指示除去的RNA条带(底端)和基因组DNA条带(顶端)。从顶端开始，最大分子量的条带是基因组DNA(gDNA)，下一个是超螺旋二聚体质粒DNA[pDNA(2x)]，再下一个是超螺旋单体质粒DNA(pDNA)，最远端的条带是RNA。泳道1的箭头指示去除的基因组DNA。
在图13中，显示了大肠杆菌细胞内物质通过PhiX174E通道释放。
在图14中，显示了pACYCB天然stuffer载体。
在图15中，描述了pACYCB基因E载体。
在图16中，显示基因E裂解蛋白介导的质粒释放。培养pACYCB基因E+pDNAVACCUltra-EGFP细胞，1被诱导，2被阿拉伯糖诱导40min：A＝总核酸(细胞团)；B＝PI缓冲液提取后的总核酸(细胞团)；C＝PI(50mM Tris，10mM EDTA，pH8)提取的核酸；D＝LB(培养基)核酸；E＝PBS提取的核酸；F＝10mM Tris pH8.5提取的核酸；G＝50mM磷酸钠、0.3MNaCl pH7提取的核酸；和H＝10mM MgCl2提取的核酸。M)是DNA分子量标记。最大的条带是12kb。从顶端开始，最大分子量的条带是基因组DNA(gDNA)，下一个是超螺旋二聚体质粒DNA[pDNA(2x)]和缺口单体质粒，再下一个是超螺旋单体质粒DNA(pDNA；箭头)，最远端的条带是RNA(RNA)。
在图17中，显示了抗生素导致自溶后的基因组DNA核酸酶降解：泳道1＝DNA分子量标记；泳道2＝自溶后(pACYCBT5RNase+gWizGFP菌株)总DNA；泳道3＝自溶后(pACYCB天然stuffer+gWizGFP菌株)总DNA；泳道4＝泳道2的样品经过37℃孵育30min。箭头表示T5RNase菌株中去除的基因组DNA带。
在图18中，胞质核酸酶-表达制备宿主在质粒制备中的应用。方式1采用了细胞裂解前进行了预处理，除去基因组DNA、缺口或线性质粒、和/或RNA，而方式2采用了细胞裂解后进行后处理(或同时处理)，除去基因组DNA、缺口或线性质粒、和/或RNA。
在图19中，周质核酸酶-表达制备宿主在自溶质粒制备过程中的应用。
定义
自溶：导致细胞自我裂解的溶菌方法，例如β-内酰胺导致细胞裂解，phiX174噬菌体溶菌蛋白导致空胞产生，T4或λ噬菌体通过噬菌体溶菌素/噬菌体穿孔素共表达导致细胞裂解等。
ccc：共价闭合环状
嵌合酶：一个酶和另一个蛋白的融合，例如噬菌体T5 D15核酸外切酶和牛RNase A或其片断融合
DNA复制子：质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒载体及其杂种
假带：变性的ccc DNA
pDNA：质粒DNA
噬菌体溶菌蛋白：引起细胞自我裂解或成空壳细胞的蛋白，比如由phiX174噬菌体溶菌蛋白导致的空壳现象，或是T4或λ噬菌体通过噬菌体溶菌素-穿孔素共表达导致的细胞裂解
质粒：质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒载体及其杂种；
对质粒无作用的核酸酶：降解各种形式的DNA，但不降解包括质粒DNA的共价闭合环状(ccc)DNA的核酸外切酶
RNase：核糖核酸酶
RNaseA：牛胰腺核糖核酸酶A
T5核酸外切酶：噬菌体T5 D15核酸外切酶
本发明涉及一种在纯化质粒DNA(pDNA)中减少基因组DNA的方法，其中使用了革兰氏阴性的大肠杆菌作为生产宿主，还使用了机械发酵罐。
纯化技术中的一个主要问题是如何将pDNA与大肠杆菌基因组DNA分离。本发明提供一种分离共价闭合环状(ccc)DNA过程中减少基因组DNA的方法。已研究出一种制备质粒的经济有效的方法，就是利用核酸酶。将一种“对质粒无作用”的核酸酶分泌到周质，来保护细胞生长，核酸酶和基因组DNA接触被控制在收获时或细胞裂解时。
核酸酶制备的优选实施例
在本发明的一个优选实施例(图10)中，一种或多种具体的“对质粒无作用”的水解酶(如T5 D15核酸外切酶、RecBCD核酸外切酶、其他ATP依赖核酸外切酶、核酸外切酶III、核酸外切酶VII、或融合、杂合酶)，通过信号肽或其他等同方法被分泌到周质空间，在细胞生长和pDNA诱导/表达完成前，上述酶被隔离在周质空间。在控制下上述酶与细胞质内容物重新混合(细胞膜破裂或受控制地重新进入细胞质)，酶消化或水解不需要的细菌物质，如核酸(DNA，RNA)、蛋白、碳水化合物、脂多糖等)，从而获得纯化的质粒DNA。
也可以使用天然核酸酶。任何对质粒无作用的核酸酶都可以使用，例如RecBC(核酸外切酶V)、RecBCD核酸外切酶、与革兰氏阳性相关的RexAB或AddAB核酸外切酶、古细菌核酸外切酶(如Geobacilluskaustophilus AddAB)、其他的ATP依赖核酸外切酶、核酸外切酶III、核酸外切酶VII等。上述酶不是穷举，来自大肠杆菌、其他细菌、古细菌或真核生物的核酸酶也可以考虑。优选的是可以去除“假带”的核酸酶，如噬菌体T5 D15核酸外切酶。
另一种是对质粒无作用的嗜热核酸酶，如果该酶在生长所需的温度下具有足够低的活性，那么它可以不分泌到周质中。这提供了另外的去除基因组的方法，如在发酵时采用热处理(42-95℃)。
本发明使用“对质粒无作用”核酸外切酶的目的是消化基因组，尤其是变性的和缺口质粒DNA，而对超螺旋质粒DNA没有作用。优选的，噬菌体T5 D15核酸外切酶(T5核酸外切酶)是在质粒制备中一个候选的DNase。T5核酸外切酶不消化超螺旋质粒DNA，但不仅可消化线性单链和双链DNA(Sayers JR和Eckstein F.1990 J.Biol.Chem.265：18311-18317)，而且还消化变性环状DNA，如“假或影子带”DNA，其能保持生物活性和在限制性内切酶消化时回收(Sayers JR，Evans D和Thomson JB.1996 Anal.Biochem.241：186-189)。本发明描述了纯化的T5核酸外切酶在制备大量(1gm)质粒样品时可以被用来去除在样品中含有的所有非超螺旋DNA物质(图1)。
也可以使用嵌合酶。这可以通过将融合伙伴与核酸酶组合来实现可能性，融合伙伴本身在碱裂解或其它可应用的大量制备质粒方法中对失活或去除有抗性。所述融合伙伴可以是任何蛋白或多肽，只要是符合稳定或正确定位的需要。在一个优选的实施例中，利用了一种融合核酸酶，其中T5 D15核酸外切酶是一种“对质粒无作用”核酸外切酶，融合于融合伙伴。例如，牛胰腺RNase A在质粒制备过程中，强碱裂解环境下不失活或降解。另外，大肠杆菌表达的RNase A在碱裂解的上清液中保持活性。可选的，和硫氧化还原蛋白融合(Lu Z，DiBlaio-Smith EA，Grant KL，Warne NW，LaVallie ER，Collins-Racie LA，Follettie MT，Williamson MJ和McCoy JM1996 J Biol Chem.271：5059-5065)，和α-核素C-末端可溶区域融合(KimJS.2003，美国专利申请2003/0125522；Park SM，Ahn KJ，Jung HY，Park JH和Kim J.2004 Protein Eng.Des.Sel.17：251-60)，和从甲烷嗜热菌获得的耐热Ftr融合(de Marco A，Casatta E，Savaresi S，Geerlof A.2004 J.Biotechnol.107：125-33)或与其他的能增加融合伙伴稳定性的蛋白融合(Zhou P，Alexey L和Wagner G.2003美国专利申请2003/0092885；Sanders MC.2002.美国专利申请2002/0142384)，上述融合均是可以考虑。
进一步优选的是，在符合DNA制备程序的条件下，结合RNase和DNase活性的嵌合酶是理想的。实现上述嵌合酶的一种方法是建立含杂交酶的细菌菌株，至少含有RNase和DNase的活性，并共表达。为了成功的实现上述目标，一开始就将它们分泌到周质是必要的(保护细胞避免核酸降解)，同时也保护DNase避免在裂解中失活。
我们在此描述了在质粒制备过程中去除基因组DNA和RNA，应用了几个在定位周质的T5核酸外切酶与RNaseA或RNaseS融合的嵌合酶表达细胞系。我们也描述了上述嵌合酶在碱裂解、自溶或抽提制备质粒过程中去除内容物核酸的应用。
现有技术没有暗示或提出在制备宿主中应用T5核酸外切酶，以改进质粒DNA的制备。将RNase和DNase组合为嵌合酶也没有在现有技术中公开过。另外，质粒生产中嵌合酶的使用也没有在现有技术中公开过。本发明提供的新颖的T5核酸外切酶和RNase的融合可以同时去除两个关键的核酸污染物。除了两个重要成分的结合，RNase成分出人意料的提高了DNase活性(图12)。与没有融合的亲本结构比较，上述协同作用明显突出了融合核酸酶的优势。而且，作为单独的蛋白整体在制备细胞系和表达控制的方法上比两个没有连接的组分(如T5核酸外切酶和RNase)更容易操作。
质粒制备方法的优选实施例
在发酵培养中生产表达对质粒无作用的核酸酶的细胞。表达后，从细胞中提取质粒。提取质粒可以优先使用现有技术描述的碱裂解、热裂解或机械的裂解方法。
去除基因组DNA可以发生在裂解的前和/或中间和/或后。去除基因组可以发生在质粒抽提过程中，如渗透压休克(Baker，M，Taylor M和Uppal S.2003 WO 03/046177A1)，其中本发明所述的周质或分泌的核酸酶在从细胞中提取DNA过程中去除基因组DNA。
含有对质粒无作用的核酸酶的菌株应用于两个优选的质粒纯化方式(方式1和2，图18)。
方式1包括在细胞裂解(预处理步骤)前去除基因组DNA(和RNA，用融合核酸酶)。所述核酸酶在生产后被导入到细胞质(即内膜透化)。在有预处理(方式1)的碱裂解过程中，我们描述了使用OmpAS-肽T5+OmpAS蛋白构建物(图11-12)和OmpAT5RNase构建物(图8)除去RNA和基因组DNA。
在发酵阶段结束时和在制备开始前，可诱导的膜裂解的因子，如噬菌体穿孔素或破坏细胞膜的化学物质或去污剂，可以顺序使用来直接的选择性的把水解酶导入到细胞质中。在制备细胞糊前，所述前处理允许在在细胞内消化基础上增加一些控制。这个改进消除了保护酶不被裂解因子(在裂解前被激活)影响的需要。因此，在这个方式中内源核酸酶也可以加入到靶基因组DNA降解过程中，如RecBCD。
方式2是在没有额外的预处理步骤下进行的去除基因组DNA(和RNA，用融合核酸酶)。基因组DNA的去除可以发生在细胞制备或裂解过程中或裂解后。如果去除过程发生在裂解后，酶在细胞裂解条件中的稳定性及其随后的激活处理都是必要的。在热裂解和碱裂解的实例中，需要相应的增加耐热性或耐碱SDS的稳定性，然后用缓冲液交换除去高浓度的EDTA和SDS。我们描述了无预处理的自溶中，使用OmpAT5RNase(图17)构建物去除RNA和基因组DNA。
方式2也可以用其它的裂解方式取代，如在添加研磨剂下的机械破碎法(Wilson RC和Murphy JC.2002美国专利申请20020197637)，或微流法(冲击射流匀浆机)或玻珠研磨机(Jem KJ 2002美国专利号6455287)的机械裂解，这就不需要热稳定性或对SDS碱稳定。
在一个优选的实施例中，细胞利用自溶裂解。自溶的一个方法是加入细胞壁破坏剂来破碎细胞，如在发酵中加入β-内酰胺抗生素。也可以选择溶菌酶，或噬菌体编码肽抗生素，可由宿主菌株制备来破碎细胞。重组的溶菌酶能在细胞中以细胞质形式表达，然后在适当的时候通过与穿孔素(跨膜肽或蛋白)共表达释放到周质中，穿孔素建立了一个允许溶菌酶和其它细胞质蛋白从细胞质转到周质的通道。例如，溶菌素/穿孔素结合物已在现有技术中使用，本发明中也将这些文献作为参考使用。
与碱或热裂解不同，自溶条件下不选择性的使基因组DNA变性，裂解的产物粘性很大，对处理造成一定的麻烦。
我们在此描述了最新的自溶观察结果，例如抗生素或噬菌体介导的裂解，在对质粒无作用的核酸酶存在下，可以选择性的去除基因组DNA和降低粘性(图17)。
现有技术没有建议或暗示具有对质粒无作用的核酸酶参与的自溶。事实上，在不含有本发明提供的对质粒无作用的核酸酶情况下，可能因为存在大量的基因组DNA污染物，自溶方法在制备质粒时没有被考虑。自溶方法仅在制备无-DNA的生物-分子被采用，并且经常应用非特异性的核酸酶来降解质粒和基因组DNA。本发明的对质粒无作用的核酸酶提供了一种自溶的新应用，有利于制备大量质粒DNA。
自溶式的质粒提取方法也解决了以前存在的不溶物现象，就是说，去除了多个细胞裂解和澄清步骤。结合本发明(图19)提供的自溶纯化方法，典型的质粒纯化方法可被大大的缩短，并经济有效。在保证质量的情况下，减少了质粒纯化中的有毒因子和多个成分(步骤)。
核酸酶制备
核酸酶基因的表达可以是由组成型启动子驱动的，更优选的是，诱导型启动子。诱导型启动子优选的包括但不限于：λPR和PL，其他噬菌体启动子如T5、T7，合成的启动子如tac和trc，内源性的启动子如lac，冷休克启动子(cspA)，araBAD，静止期或饥饿启动子，生长速度(rmf)pH(cadA)或厌氧反应(nar)启动子。诱导可以通过上升温度(PL，tac)，热稳定阻遏物(λ阻遏物，lac阻遏物)存在下降低温度(cspA；冷休克启动子)，也可以是诱导物(IPTG诱导tac、trc和lac；阿拉伯糖诱导AraBAD)或是其他方法(如进入静止期，pH或氧气变化，葡萄糖或氨基酸饥饿；参考综述：Makrides SC.1996 Microbiol.Rev.60：512-538)。可选的，基因也可以被调节反义RNA诱导。
现有技术公开了几个周质或胞外定位的信号肽，在本发明中参考引用(如Choi JH和Lee SY.2004 S Appl.Microbiol.Biotechnol.64：625-635)。定位到周质的前导肽是OmpA，PhoAOmpT和PelB。
核酸酶也可以利用已知的锚定标记来锚定到细胞膜上，如“周质锚定表达”，利用前导如NlpA前导和前6个氨基酸(Harvey BR，Georgiou G，Hayhurst A，Jeong KJ，Iverson BL和Rogers GK.2004 Proc.Natl.Acad.Sci.101：9193-9198)。可选的，核酸酶也可以是从细胞分泌到培养基中，在裂解时和基因组DNA接触。
可选的，核酸酶被设计为提高活性或稳定性，或在纯化时容易分离(Collen A，Ward M，Tjerneld F和Stalbrand H.2001 J.Chromatogr.A.910：275-84)，利用定点突变，添加小肽目标标签，或定向进化(Zhao H，Chockalingam K和Chen Z.2002 Curr.Opin.Biotechnol.13：104-10)，利用分子杂交方法(Ness JE，Kim S，Gottman A，Pak R，Krebber A，Borchert TV，Govindarajan S，Mundorff EC和Minshull J.2002 Nat.Biotechnol.20：1251-5；Kurtzman AL，Govindarajan S，Vahle K，Jones JT，Heinrichs V，Patten PA.2001 Curr.Opin.Biotechnol.12：361-70)。
细胞自溶的通道蛋白系统
有两种制造膜孔的噬菌体通道蛋白类型，文献中有记载，和一个在本发明中应用的无限制的可能的通道系列在此被引用(Young 1992，同上；Wang IN，Smith DL和Young R.2000 Annu.Rev.Microbiol.54：799-825)。其中一个类型是从双链DNA噬菌体，如大肠杆菌T4和λ噬菌体，或乳酸菌噬菌体LL-H。上述通道蛋白被称为穿孔素，位于细胞质膜上，为细胞壁降解蛋白进入到周质构建通道。所述通道的范围从很小(T4 t蛋白仅适合溶菌素使其从细胞质到周质)到足够大的＞100kd蛋白，如B牛乳糖可以通过(λS；孔内径＞10-12nm，与steptinomycin O/李斯特菌溶血素O细胞毒素的大小一致)。我们也考虑使用所述孔蛋白和溶菌酶再结合本发明提供的对质粒无作用的核酸酶进行质粒制备。利用所述孔蛋白的自溶菌株已经应用在蛋白制备中(Leung和Swartz，同上，2001)，但现有技术中没有将其应用在质粒制备中。
可选的，单链DNA噬菌体，如PhiX174，产生一种单裂解蛋白(基因E)使噬菌体释放。上述蛋白和从其他单链DNA噬菌体产生的裂解蛋白可以抑制细胞壁形成，类似于盘尼西林的作用方式(参考综述：BernhardtTG，Wang IN，Struck DK和Young R.2002 Res.Microbiol.153：493-501)，基因E产物在外膜和内膜之间形成一个直径为uM大小的通道，有效地密封了周质和非溶解地倾卸细胞质物质，包括质粒DNA(Witte A和Lubitz W.1989 Eur.J Biochem.180：393-398)，进入培养基中(图13；参考综述：Young R，Wang IN和RoofWD.2000 Trends Micro.8：120-128)。phiX 174基因E系统被用来制造细菌空胞，作为抗原或DNA疫苗的传送体(alavaK，Iko FO，Riedmann E和Lubitz W.2003 Expert Rev.Vaccines 2：45-51)。用于DNA疫苗传送时，空胞填充了质粒DNA。制备空胞的方法是在预防裂解的高浓度镁(如0.1M MgSO4)培养时观察得到的。制备包括：1)在mg存在下表达基因E；2)更换细胞缓冲液；和3)降低镁浓度形成通道，释放出细胞质内容物(参考综述Jalava等，同上，2003)。
细菌空胞还没有被评估用来制备质粒DNA，并且完整的释放质粒以前也没有过(Witte和Lubitz，同上，1989)。
用于核酸酶和或自溶基因表达的宿主菌株
核酸酶基因可以在一种和目标质粒相容的质粒中，或更优选融合到基因组中。菌株的构建可在适合制备质粒的细菌菌株中进行。
有融合核酸酶表达质粒拷贝的细菌菌株可以通过各种技术实现，例如，λred gam重组子(Murphy KC 1998 J.Bad.180：2063-2071；DatsenkoKA，Wanner BL.2000 Proc.Natl.Acad.Sci(USA).；97：6640-6645)。上述技术已成功的用于recA-菌株，如一种普通的质粒制备宿主DH5a。一般地，两侧具有抗生素抗性基因的表达盒用与融合位点同源的引物序列进行PCR扩增。目标DH5a菌株用氨苄青霉素抗性的λred重组子转化，该重组子具有阿拉伯糖诱导的质粒pKD46和Red重组酶的功能。同源重组子用卡那霉素筛选，通过转到非生长温度(pKD46有一个对温度敏感的复制起始点)pKD46协助质粒制备，降低对氨苄青霉素抗性。
质粒制备
整合核酸酶基因的大肠杆菌菌株通过发酵收获可用来制备质粒DNA。现有技术(参看Carnes 2005 for a review：Carnes AE.2005 BioProcessInternational，October 2005，in press)公开了典型的发酵方法。NatureTechnology Corporation利用分批式操作和流加式操作方法，在不含动物产物分批式操作(NTC3018)和流加式操作(NTC3019)最优化的发酵培养基应用于质粒制备。上述培养基具有支持低生长率和维持质粒稳定性和完整性的特点。1100mg/L的质粒产量和OD600 120通过自动的流加式操作发酵方法获得，生长控制在一个特殊的生长率0.12/h。
我们也考虑利用精心制作的对质粒无作用的核酸酶的宿主菌株制备含丰富质粒的原料，其可从发酵培养物中用典型的质粒提取方法取得。将核酸酶菌株、高产发酵法和典型的纯化方法结合，可以提供一种经济有效的方法，来进一步降低基因组DNA水平，从而达到基因治疗和DNA疫苗应用可接受的水平。
实施例
通过以下具体实施例进一步描述本发明制备方法。提供的实施例仅用来描述而不是用来限制本发明范围。
实施例1：pVEX表达载体
pVEXSaplstuffer蛋白表达载体如图2所示。所述质粒具有一个pBR322复制起始点(删除了ROP)和一个氨苄青霉素抗性标记。
上述载体具有一个可诱导Tac启动子，开启大肠杆菌的相关基因表达。表达被laclq基因产物(质粒编码)抑制，加入IPTG开始诱导表达。
目的基因克隆到由SapI类IIS克隆位点组成“填充序列(stuffer)”中，所述位点可产生ATG和TAA粘性末端，如图3所示。从克隆或基因组DNA用带有一般定位标记和独特序列特异性序列的引物进行扩增获得基因拷贝。目的基因内部的SapI位点一般不会影响，因为只有1/16机会内部的SapI位点可与一个定位标记匹配。
上述质粒的衍生物，PvexSaplHNtagstuffer N末端HN标记与目的基因融合，其后有一个肠激酶酶切位点。上述标记吸附在固定金属亲和色谱(IMAC)树脂，类似与组氨酸标记，提供亲和纯化。基因用引物进行PCR扩增，将SapI位点合并到末端，在SapI(New England Biolabs，Beverley NJ)酶切后产生5’AAG(肠激酶酶切位点的最后的赖氨酸残基)和3’TAA 3个碱基粘性末端。
实施例2：pVEXSapIOmpA分泌载体的构建
OmpA分泌信号肽通过以下方法构建到pVEXstuffer载体中。编码OmpA分泌信号肽的寡核苷酸经过退火，克隆到pVEXSapI stuffer的NcoI位点，形成pVEXSapIOmpA stuffer。上述合成的克隆表达OmpA前导肽引导目的蛋白到胞质中。OmpA前导肽被切除，留下带有2个氨基酸前导(Ala-Thr)的目的蛋白，其位于目的基因Met密码子前。所述载体见图4所示。细胞质构建物可以通过包含目的基因的NcoI/XhoI片段的转化作用转变成分泌构建物，从而进入载体。OmpAHNtagstuffer，编码一个N末端HN标记，可以通过以上描述正确构建，使用NcoI消化pVEXSapIHNtagstuffer产生退火的单插入。
实施例3：pVEXOmpAHNRNase表达载体的构建
牛胰腺RNase基因从牛基因组DNA中经PCR扩增得到。所有PCR优选用Pfu DNA聚合酶(为了避免增加多余的碱基到钝片段末端)，使用标准的PCR方法。
400 bp PCR产物经SapI酶解，凝胶电泳提取100和300bp片断(内含SapI位点)，使用标准的克隆方法将其克隆到经SapI酶解的pVEXOmpAHNstuffer载体中。重组体(pVEXOmpAHNRNase)测序验证。
实施例4：T5核酸外切酶的克隆
从噬菌体T5(ATCC11303-B5)PCR扩增T5核酸外切酶基因，克隆，确认序列。提纯900bp长度的片段后作为模版进行PCR HNstuffer相容的片段。提纯上述片段后进行末端补平，克隆到pW2.0载体的SmaI位点，pW2.0载体是带有修饰的多接头的pUC19衍生物。分离出pW2.0-T5和pW2.0-HNT5克隆，测序验证。
实施例5：pVEXBOmpAstuffer表达载体的构建
构建的第二个表达系统具有较低泄漏表达和较低全面诱导表达。上述载体，pVEXBSapIOmpAstuffer含有AraBAD启动子，加入阿拉伯糖时被诱导，与含有亲本pVEXSapIOmpAstuffer载体的IPTG诱导的tac启动子相对。
从DH5a基因组DNA中扩增得到AraBAD启动子和侧翼araC阻遏子。上述扩增产物(1.3kb)经AarI酶解，克隆到EcoRI/XhoI酶解后的pVEX载体中。上述合成的克隆在stuffer下游含有AraBAD操纵子。用XhoI和EcoRI切除AraBAD区，用dNTP和大肠杆菌DNA聚合酶I大片断(klenow)将粘性末端补平。将1.3kb片断克隆到pVEXSapIOmpAstuffer(bp 247-3108)和pVEXSapIOmpAHNtagstuffe载体的2.8kb骨架片断中。所述骨架片断由凝胶电泳提取MluI和XbaI酶解后的载体，用klenow和dNTP将末端补平，再经小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理得到。上述合成的克隆经过限制性酶切AraBAD定位的筛选，序列验证。最后的构建物，pVEXBSapIOmpAstuffer(图5)和pVEXBSapIOmpAHNtagstuffer，用Ara C阻遏子和ara BAD启动子取代了laclq基因和tac启动子。
实施例6：pVEXBOmpAHNRNase的构建
HNRNase基因是用NcoI/XhoI酶解pVEXOmpAHNRNase获得的，然后转到经NcoI/XhoI酶解的pVEXBSapIOmpAHNtagstuffer载体中。
实施例7：pVEXBOmpARNase表达载体的构建
用包含AarI的引物对完整质粒进行PCR扩增，HNtag从pVEXBOmpAHNRNase中除去。PCR扩增产生载体长度的PCR片断。用AarI裂解纯化的PCR产物产生相容的粘性末端(引物中双下划线标注的)，在连接时产生精确的去除HN标记。分离出pVEXBOmpARNase克隆(图6)，进行限制性消化和序列验证。
实施例8：pVEXBOmpAT5RNase表达载体的构建
用包含AarI的引物对整个质粒进行PCR扩增，HNtag从pVEXBOmpAHNRNase中除去。然后T5核酸外切酶被克隆到上述缺口质粒中。PCR扩增pfpVEXBOmpAHNRNase得到载体长度的PCR片断。用T5-特异性引物进行pW2.0T5的PCR扩增，产物为900bp的T5基因。用AarI裂解纯化的PCR产物产生相容的粘性末端，在连接时产生精确的去除HN标记和插入T5基因。分离出pVEXBOmpAT5RNase克隆(图7)，进行限制性消化和序列验证。
实施例9：在质粒制备中用T5RNase降解基因组DNA
DH5a  细胞系含有pVEXBOmpARNase(RNase)或pVEXBOmpATSRNase(T5RNase)质粒，在含有5mM MgSO4的LB液体培养基中37℃培养，加入阿拉伯糖到浓度为0.2％，在对数中期(大约为0.5OD600/mL)时蛋白被诱导表达。在29℃诱导培养4hr后收获。对照的未诱导的培养物在同样条件下生长。细胞被成团并贮存于-20℃或4℃过夜。
-20℃保存的细胞解冻后，在37℃培育10分钟。从4℃开始的细胞无额外的预处理。在RNase诱导的细胞中观察到了裂解，而在没有诱导或T5RNase诱导的细胞里没有观察到。
核酸降解有两种方法检验。第一个方法是，用威廉姆斯等的(Williams，J.A.，Langeland，J.A.，Thalley，B.，Skeath，J.B.和Carroll，S.B.(1994)，Production and purification of polyclonal antibodies against proteins expressedin E.coli.DNA Cloning：Expression Systems，IRL Press)快速筛选方案从4℃细胞中抽提总DNA。简略地，将细胞重悬在细胞裂解缓冲液(10mMTris pH8.0，100mM NaCl，10mM EDTA)，用苯酚抽提，RNase处理，加入示踪染料后进行1％琼脂糖凝胶电泳分辨DNA。另一个方法是，总核酸(包括RNase)用Qiagen小剂量(miniprep)缓冲液(P1，P2，N3)和方案分离，除了RNase没有加到P1缓冲液中(Qiagen QIAprep minprep说明书，2002年3月)。离心取上清液，37℃孵育10min，加入3倍体积量95％乙醇沉淀核酸，离心收集核酸沉淀物，用70％乙醇冲洗后，再用含有10mMMgSO4的Qiagen缓冲液EB(10mM Tris，pH8.5)重悬浮。样品在37℃孵育10min，加入示踪染料，1％琼脂糖凝胶电泳分辨核酸。
结果(见图8)显示了在碱裂解制备质粒过程中，“对质粒无作用”的T5RNase融合体特异性的降解了基因组DNA。冻融时，诱导细胞不被裂解，继续生产(在诱导后持续繁殖)。注意，泳道1和5中是诱导T5RNase的碱裂解完整的去除染色体DNA条带(大条带＞12kb)，对照是没有诱导的和RNase。-20℃保存的样品中没有观察到质粒DNA的降解(对比泳道1和3；泳道1保留的大条带是超螺旋二聚体)，而去除了整个基因组DNA，同时观察到在4℃制备的样品中有部分的质粒DNA降解。上述结果表明不同的预处理(4℃过夜孵育与-20℃的样品冻融后37℃孵育10min相比)产生不同的核酸酶进入细胞质的结果。在泳道9中T5RNase总核酸提取物中也观察到部分的基因组DNA降解，但不如碱裂解纯化的预处理的样品那么完全。扫描凝胶，计算泳道1-4的条带，确定其含量。表1总结了上述结果。由于观测的细胞裂解，RNase诱导的泳道的基因组DNA浓度低。与没有T5RNase诱导的样品相比，在T5RNase诱导的样品中基因组DNA降低了50倍，而质粒的浓度没有任何的下降。这表明利用融合核酸酶可以降低质粒制备过程中的基因组DNA量。
表1：图8中泳道1-4电泳带的含量
带 泳道1 泳道2  泳道3  泳道4
超螺旋单体质粒 27103 31328  21726  27180
超螺旋二聚体质粒 2160 1409  3615  558
基因组DNA 824 5967  42406  23671
实施例10：RNaseS-T5的融合
使用S-肽S-蛋白系统制备T5核酸外切酶融合的对质粒无作用的其它嵌合酶，也可以用来去除基因组DNA和RNA。在此我们描述了构建和验证上述融合体，证明了其在质粒制备中的应用。上述融合体不仅保留了RNase活性，同时还增强了DNase活性，具体如下。
已公开了将异源蛋白融合到RNase A S-肽的N末端，然后与RNase AS-蛋白结合，获得RNase A酶活性。RNase A S-肽是牛胰腺RNase A的N末端20个氨基酸片断，通过枯草杆菌蛋白酶酶切获得；C末端片断(21-124)是S-蛋白。S-肽和S-蛋白具有很高的亲和力(3.1×10-11M，pH8.3)，如同RNase S具有与天然的RNase7类似的酶活性。S-标记系统(McCormick M和Mierendorf R.1994 InNovations 1：4-7)是一种蛋白纯化系统，已经被用来功能性RNase与异源蛋白的融合。S-标记是S-肽N末端的15个氨基酸残基，并且在其与异源蛋白融合时，与S-蛋白相互作用激活RNase活性。S-标记(和S-肽)具有高溶解性，在大肠杆菌中高表达，在融合时两个末端都与S-蛋白产生强的亲和力。根据与S-蛋白(S-标记Western Blot)或功能性RNase S(S-标记快速分析)的重组体结合产生的试剂，可通过商业途径从Novagen购买到，其可以快速的检测和量化S-标记，或S-肽、融合体。图9描述了利用上述系统制备融合核酸酶的方法。
pVEXB OmpA-S-蛋白融合了OmpA分泌前导序列(信号序列)和RNase的S-蛋白片断。建立了两种构建体，一个编码OmpASprotein(16-124)，另一个编码OmpASProtein(20-124)。两者在有机体内都表现出一样的功能。设计上述构建体是为了在周质分泌过程中切除OmpA前导肽后，释放出精确的S-蛋白片断。上述构建体的表达产物被转到pACYC177(和pVEX相容)进行共表达研究。pACYC177的拷贝数比pVEX低，因此产生的S-蛋白比S-肽少。这是设计好的，因为S-肽是有利于S-蛋白折叠的。
S-肽(为了与S-蛋白结合)与T5核酸外切酶通过N末端融合(S-肽-T5)，产生一个分泌S-肽-T5融合载体(pVEXBOmpA S-肽-T5)或C末端融合产生一个分泌T5-S肽的载体(pVEXBOmpA T5-S肽)。OmpA或PhoA分泌前导序列用来精确的释放天然的S-肽N末端。
共表达时，S肽和S蛋白片断被设计成与RNase结合，如RNaseS，保留RNase功能，以及融合T5核酸外切酶中保留的DNase功能。
实施例11：质粒纯化RNaseS-T5融合
全面的去除基因组DNA的策略，以使用RNaseS-T5为例，参见图10。表达和分析优选实施例9描述的T5RNase的方法。在表达上述融合体(图11-12)的细胞系中观察去除基因组DNA和RNA的效果。OmpA S肽-T5构建体，在任一OmpAS蛋白构建体(16-124或20-124)存在情况下，与单独的构建体比较减少了基因组DNA和RNA。OmpATS-S肽构建体对蛋白水解敏感(降解条带由SDS-PAGE分析检测到)，如同期望的，与OmpAS肽-T5构建体相比，减少RNase和DNase活性。所有其它的T5或S肽-T5构建体对蛋白水解稳定(SDS-PAGE检测观察到一个期望大小的条带)。上述结果表明通过与RNase S结合提高了T5核酸外切酶的活性，同时保持了RNase的活性。
实施例12：PhiX174基因E表达载体的构建
在AraBAD控制下PhiX174基因E蛋白克隆到质粒中，所述质粒与现存高拷贝pUC起始点的质粒(如gWiz-GFP，pDNAVACCUltra-EGFP)和pBR322起始点的质粒(如pVEXBT5RNase)相容。
pVEXB-天然(native)填充序列(stuffer)
pVEXSapIstuffer载体用XbaI和MluI消化。粘性末端用Klenow和dNTP补平和热变性。末端用小牛肠磷酸酶去磷酸化。2.8kb片断从1.5kb片断中用凝胶纯化。pVEXB载体用EcoRI和XhoI消化。粘性末端用Klenow和dNTP补平。从4.3kb片断中凝胶纯化的1.3kb片断，1.3kb片断含有araB启动子。将步骤1和2获得的片断连接、转化和用Amp筛选。通过限制性酶切和序列验证选择正确方向的克隆(pVEXB-Native stuffer)。
pACYCB-天然(图14)和OmpA stuffer载体
从pVEXBOmpAstuffer获得的盒和天然填充序列表达载体转化到pACYC载体中，在起始点载体(如pVEX和pDNAVACCUltra载体)基础上和pUC和pBR322共表达。CIP处理，获得凝胶纯化XmnI消化的pACYC-RIL质粒(片断A)。pVEXBOmpAstuffer和pVEXBnativestuffer，用EcoRI消化(用Klenow和dNTP补平)，纯化较小的片断(pVEXBOmpAstuffer大小为2703，1466，片断B1；pVEXBnative stuffer略小，片断B2)。片断A、B1(pVEXBOmpAstuffer)或A和B2(pVEXBnativestuffer)混合、连接。连接产物转化到DH5a感受态细胞中，在氯霉素琼脂平板上挑选。克隆和插入方向通过限制性酶切验证。
pACYCB基因E(图15)
phiX174基因E蛋白用10ng phiX174基因组DNA作为模板进行PCR扩增。用5×45C退火、25×55C退火、72C延伸1分钟和95C变性30秒。pACYC-Bnative stuffer经SapI消化，纯化获得两个片断(4375，282，34)。PCR片断也用SapI消化。上述3个片断混合、连接。连接产物转化到DH5α，在LB+氯霉素+葡萄糖(0.2％)(加入葡萄糖降低渗漏表达)。pACYCB phiX174基因E载体经限制酶切确认，测序验证。
实施例13：由基因E诱导的细胞空壳释放高拷贝pUC起始点质粒
用带有纯化质粒的Z感受态(Zymos)大肠杆菌细胞转化得到细胞系，使其在含有抗生素和0.2％葡萄糖(降低来自阿拉伯糖启动子基因E的渗漏表达)的琼脂平板上生长。上述细胞系在含有34ug/mL氯霉素(含有基因E表达质粒的菌株)和/或50ug/mL卡那霉素(含有pDNAVACCUltra质粒的菌株)或100ug/mL氨苄青霉素(含有pVEX质粒的菌株)的LB培养基37℃培养，当处于对数中期(大约为0.5OD 600/mL)时诱导。阿拉伯糖诱导为加入阿拉伯糖浓度从100×母液到最后的0.2％浓度。用于凝胶分析的培养基提取物通过1)用澄清培养基或2)苯酚氯仿抽提方法之一获得，乙醇沉淀后用TE(20×浓度)溶液悬浮。用于凝胶分析的细胞团通过将细胞团悬浮在缓冲液(10-20×浓度)，在合适的温度和周期内孵育，再经过苯酚氯仿抽提获得。上清液可以直接用于凝胶电泳分析。细胞团的总核酸用细胞裂解缓冲液抽提获得，如Williams等描述，同上，1994，使用10-20倍浓度(相比于培养基最初的体积)的细胞裂解缓冲液，不含RNase。上述提取物用于琼脂凝胶电泳分析核酸，用1/10,000稀的SYBR GreenII(Sigma)着色，显示RNA和DNA。
通过基因E裂解蛋白表达释放核酸
构建和评估以下3个细胞系：1)pACYC-B-基因E、2)pACYC-B-基因E+pDNAVACCUltra-GFP和3)pDNAVACCultra-GFP。pDNAVACCultra是一个高拷贝卡那霉素抗性的pMB1起始点质粒，与pACYC质粒相容。
细胞为以下之一：A)没有诱导；或B)用0.2％阿拉伯糖诱导；或C)在0.2M MgSO4(抑制空胞发生)存在下用0.2％阿拉伯糖诱导。诱导30分钟后，等份收获细胞。上清液用于凝胶电泳分析核酸，用1/10,000稀的SYBR Green II(Sigma)着色，显示RNA和DNA。从1.5mL细胞获得的细胞团用100uL TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)悬浮，室温放置1hr，离心收集细胞团。TE细胞提取物按照上述方法用凝胶电泳分析。
在诱导后质粒(pDNAVACCultra-GFP)的PhiX174基因E释放到LB中，观察提取物的上清液。RNA和基因组DNA也被释放出来了。从诱导的样品(没有MgSO4)的细胞中大部分的质粒释放到培养基和TE提取物中。如果基因E在0.2M MgSO4存在下被诱导，质粒没有释放到LB中，但是在TE提取缓冲液中有更低Mg浓度时有释放。上述试验表明在基因E和高拷贝质粒存在下发生了培养空胞现象，质粒释放依赖基因E的诱导。在pDNAVACCUltra单独的细胞系中没有质粒释放，表明质粒释放依赖phiX 174基因E产物。因此，在培养基加入0.2M MgSO4可以阻止质粒释放到培养基。这允许收获细胞，用缓冲液交换除去镁离子，使质粒释放。
对phiX174基因E诱导释放pDNAVACCultra-GFP质粒进行时间过程。从细胞中释放完整的质粒需要30-40分钟的诱导。
从phiX174基因E+pDNAVACCultra-GFP无诱导和诱导的细胞团得到的质粒用PI、TE、PBS、EB(10mM Tris，pH8.5)、BB(50mM PO4，300mM NaCl)或10mM MgCl2提取。质粒、RNA和基因组DNA在所有所述条件(图16)下提取。使用PI或EB，提取到大部分的质粒，只有少量的质粒留在细胞团里(比较泳道B2和B1，图16)。在EB中释放质粒证明EDTA不是质粒释放必需的。其优点在于，在后续的过程中可以不用加入EDTA诱导LPS释放。
在有关质粒、基因组DNA和完整的RNA的提取中观察到一些区别。例如，少量RNA用BB、10mM MgCl2和PBS提取，而少量质粒和基因组DNA用10mM MgCl2提取。上述盐和阳离子效应可被优化以提高释放的质粒的纯度。
通过在无诱导、诱导和诱导+10或30mM精胺条件下的质粒释放结果，确认在精胺存在下pDNAVACCultra-GFP释放phiX174基因E。质粒和基因组DNA释放到LB可被30mM精胺抑制，部分的可被10mM精胺抑制。30mM精胺处理的细胞团或任何洗脱液中没有检测到RNA。精胺处理过的细胞对用PI、TE或EB提取质粒时稳定，但用PBS、BB(50mMPO4、300mM NaCl)或10mM MgCl2提取经30mM精胺处理的细胞得到部分质粒。被诱导的细胞室温过夜孵育后，观察到上述3种诱导条件下质粒都释放到培养基中。精胺存在下更多的RNA被释放(或包涵)，在LB中过夜诱导后只观察到极少量的粘性质粒。上述结果表明在培养基中储存时释放的质粒是稳定的。
在PI或50mM Tris、10mM MgCl2，pH8.0)室温、37℃、55℃和65℃30min孵育细胞团，检测phiX174基因E介导的质粒释放。质粒的释放和完整性在室温、37℃或55℃不受影响，在PI中65℃时部分裂解，产生粘性质粒和基因组。在PI、室温而不是Tris/mg中，37℃孵育时观察到部分RNA的降解。
总之，这些结果证明基因E裂解蛋白诱导的质粒释放对于从细胞高产量地释放完整质粒是可行的。质粒释放可由改变萃取缓冲液的离子强度/pH、带有或不带有精胺、或其它培养基因素而控制。释放到培养基或萃取缓冲液时，质粒是稳定的。这还证明细胞可被交换缓冲液至不同缓冲液，以在各条件下优化酶去除基因组DNA/RNA。然而，使用该方法可释放高水平的基因组DNA/RNA。
实施例14：在基因E裂解蛋白诱导的细胞空壳中去除基因组DNA和RNA
核酸酶去除RNA和基因组DNA
构建和评估以下5个细胞系：1)pACYC-B-基因E、2)pACYC-B-基因E+pDNAVACCUltra-GFP、3)pDNAVACCultra-GFP、4)pACYC-B-基因E+pVEXBT5RNase和5)pVEXBT5RNase。pVEXBT5RNase是一个中等拷贝的抗氨苄青霉素pMB1起始点质粒，与pACYC质粒相容，含有一个阿拉伯糖诱导的核酸酶，该酶降解RNA和基因组DNA，对超螺旋质粒不起作用。
无诱导或在诱导后生长70min(0.2％阿拉伯糖，诱导基因E和T5RNase)的培养物，和在培养上清液中的核酸，和细胞团的渗压休克，用凝胶电泳进行测定。含有PhiX174基因E裂解蛋白和pVEXBT5RNase的被诱导细胞系，当T5RNase被诱导时，更多的降低了基因组DNA释放到培养基中。在渗压休克细胞团(5mM MgSO4，数据未列出)观察到同样的效果。在本试验中利用无诱导作为对照，从无诱导的细胞中释放的基因组是由于裂解蛋白的渗漏表达，导致空壳细胞在较高的OD600值。上述结果表明T5RNase的共表达破坏了基因E释放的基因组DNA，可以被用来，提高释放质粒的纯度和降低裂解产物的粘性。
实施例15：用PhiX17基因E蛋白介导的自溶制备质粒DNA
对于质粒制备，表达孔蛋白的基因需要完整的插入到基因组中。孔蛋白基因的表达可由诱导型启动子驱动。诱导型启动子优选的包括但不限于：λPR和PL，其他噬菌体启动子如T5、T7，合成的启动子如tac和trc，内源性的启动子如lac，冷休克启动子(cspA)，araBAD，静止期或饥饿启动子，生长速度(rmf)pH(cadA)或厌氧反应(nar)启动子。诱导可以通过上升温度(PL，tac)，降低温度(cspA；冷休克启动子)，热稳定因子(λ阻遏物，乳糖操纵子阻遏物)，也可以是诱导物(IPTG诱导tac、trc和lac；阿拉伯糖诱导AraBAD)或是其他方法(如进入静止期，pH或氧气变化，葡萄糖或氨基酸饥饿；参考综述：Makrides SC.1996)。可选的，基因也可以被调节反义RNA诱导。已经建立了各种可诱导PhiX17基因E表达系统，被热(C1857调节突变的λPR；Jechlinger W，Szostak MP，Witte A和Lubitz W.1999 FEMS Micro.Lett.173：347-352)、冷(C1857结合lac或噬菌体调节子调节突变的λPR，Jechlinger W，Szostak MP和Lubitz W.1998 Gene 218：1-7)或化合物(乳糖或IPTG+lacPO/Ptac或3MBZ+xylS抑制子-PTol)等因子调节。
基因E表达产物可诱导质粒释放到培养基中。向培养基中直接加入缓冲液可以提高释放度或敏感度。通过过滤或离心去除细胞碎片，留下质粒在澄清培养液中。在澄清培养液中的基因组DNA和RNA可以用核酸酶(即可以是融合到菌株基因组中，在细胞里表达的；也可以是加入外源的)去除。
可选地，RNA和基因组DNA杂质可以用已知的方法去除，例如用热或碱裂解处理选择性的变性或降解澄清培养液。本例中，从澄清培养液中选择在空壳后去除基因组DNA和RNA比在细胞完成了裂解时好，同时也降低了如LPS的细胞成分的释放。从细胞释放质粒也可以在不含金属螯合剂下进行，如EDTA，进一步降低了LPS从空壳细胞脱落。表面活性剂如PEG或CTAB，或者二价阳离子如CaCl2，可以被用来从基因组和RNA杂质中选择性的纯化质粒DNA。上述基因组DNA和RNA去除方法已公开在现有技术中。
另外在基因E诱导前后，质粒释放可被改变膜强度的试剂(如0.2mMMgSO4)延缓，或者增加DNA紧密性的试剂(如精胺)。收获最后细胞群，将缓冲液换成有利于质粒释放的(例如MgSO4的情况，通过降低Mg浓度实现)。
实施例16：用抗生素介导的自溶制备质粒DNA
对另一种可选的利用抑制细胞壁抗生素的自溶方法进行验证。pVEXB0mpAT5RNase结构中的T5Rnase盒转到pACYCB结构中。培养pACYCBTSRNase或pACYCBNative填充序列(对照)，每一个都用gWizGFP质粒共转化，在LB+50ug/mL卡那霉素+34ug/mL氯霉素+4mM MgSO4中生长，在对数中期加入阿拉伯糖到终浓度为0.2％，30℃ 1hr进行蛋白诱导表达，分别加入氨苄青霉素和头孢霉素(Fluka)(B内酰胺抗生素)到终浓度100和10ug/mL，诱导细胞自溶。30℃振荡过夜培养，利于裂解和核酸降解。通过离心去除细胞碎片，在苯酚氯仿抽提去除蛋白后，用琼脂凝胶(SYBR green II着色)电泳测定上清液的核酸。在T5RNase菌株中基因组DNA被显著地去除了，而对照中不明显。基因组DNA残余通过孵育(37℃ 30min)去除。尽管在长期的裂解产物诱导时提高了温度，但没有观察到有质粒的减少。正如期望的，与对照细胞系相比，T5RNase细胞系的裂解产物的粘性显著地降低了。
上述结果描述了将对质粒无作用的核酸酶与不同的自溶方法结合来制备质粒的一般方式。
因此读者可以看到，本发明提供的对质粒无作用的核酸酶和相关制备方法提供了各种组合和方法，用于改进质粒制备。
上述描述包含的多个实施例，不应认为是对本发明的限制，而是优选实施例之类的范例。其他方式也可以实现本发明。例如去除基因组DNA，可以使用内源核酸外切酶(recBCD)，已经观察到利用限制性核酸内切酶降解染色体(Hanak和Ward，2001)，或伽马射线(MacPhee等，1988)；产生的末端然后被内源核酸酶降解。在这种情况下，(放射过夜)导致染色体断裂后的细胞可以继续生长。上述方法在利用胞内核酸外切酶活性来去除DNA存在不足，但可以利用本发明提供的对质粒无作用的核酸内切酶来极大地提高效率。
因此，本发明的范围不应限制于所描述的实施例，而是由所附的权利要求及其法律上等同的要求决定。

Claims (14)

1.一种用于制备共价闭合超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
A)将编码一种或多种对质粒无作用的核酸酶的基因导入大肠杆菌基因组中；和B)定位从所述导入基因序列产生所述核酸酶，通过信号肽或等同方法将所述酶定位到周质空间中；和C)将所述大肠杆菌细胞在有DNA复制子存在的条件下培养，所述的复制子如质粒、粘粒或细菌人工染色体的复制子；和D)将所述核酸酶导入到细胞质的内容物中，从而大肠杆菌基因组DNA被降解，而导入的复制子DNA不被降解；和E)从所述细菌内容物中提纯导入的复制子DNA；
藉此所述的方法增加了质粒的纯度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述对质粒无作用的核酸酶包括一种或多种嵌合酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述对质粒无作用的核酸酶包括DNA酶和作为融合伙伴的至少部分RNA酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述对质粒无作用的核酸酶包括噬菌体T5D15核酸外切酶与RNaseA融合的嵌合酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述对质粒无作用的核酸酶包括噬菌体T5D15核酸外切酶与RNaseS融合的嵌合酶。
6.一种用于制备共价闭合超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
A)将编码一种或多种对质粒无作用的核酸酶的基因导入大肠杆菌基因组中；和B)定位从所述导入基因序列产生所述核酸酶，通过信号肽或等同方法将所述酶定位到周质空间中；和C)将所述大肠杆菌细胞在有DNA复制子存在的条件下培养，所述的复制子如质粒、粘粒或细菌人工染色体的复制子；和D)使所述细胞自溶，从而大肠杆菌基因组DNA被降解，而导入的复制子DNA不被将解；和E)从所述细菌内容物中提纯导入的复制子DNA；
藉此所述的方法增加了质粒的纯度。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述对质粒无作用的核酸酶包括一种或多种嵌合酶。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述对质粒无作用的核酸酶包括噬菌体T5D15核酸外切酶与RNaseA融合的嵌合酶。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述对质粒无作用的核酸酶包括噬菌体T5D15核酸外切酶与RNaseS融合的嵌合酶。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述对质粒无作用的核酸酶包括DNA酶和作为融合伙伴的至少部分RNA酶。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述自溶以噬菌体溶菌蛋白进行。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述自溶以抗生素进行。
13.一种包括一种或多种细菌菌株的组合物，其含有：
A)至少一种对质粒无作用的核酸酶，如T5D15核酸外切酶，带有或不带有一种或多种融合伙伴；和B)至少一种质粒，其中对质粒无作用的核酸酶用来提高从纯化获得的质粒的纯度。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述对质粒无作用的核酸酶为T5 D15核酸外切酶。
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