TWI450965B - 含甘露糖啟動子之載體及甘露糖啟動子 - Google Patents

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Description

含甘露糖啟動子之載體及甘露糖啟動子
本發明係關於可於原核宿主細胞中表現之載體，其包含一可經由甘露糖誘發之啟動子，作為異源性表現一編有例如多胜肽，如重組蛋白，密碼之核酸。
尤其，本發明係關於在一宿主細胞中進行異源性表現之新載體，其等包含甘露糖操縱子之啟動子區域，該啟動子區域可經由剪接操作方式與一轉錄單元相連接，其包含一與所述之宿主細胞不同源之核酸序列，而所述核酸序列之表現係由該甘露糖操縱子之啟動子區域所控制。此外，本發明還關於使用該等載體進行異源性表現編有例如多胜肽，如重組蛋白，密碼之核酸。
許多系統已被描述於原核細胞中進行異源性表現編有多胜肽(結構基因)之核酸。有關於此，宿主細胞被一載體所轉化，該載體包含感興趣結構基因之核酸序列，並可經由剪接操作方式與一啟動子相連接，其係一可使結構基因被轉錄之核酸序列。該啟動子先經由適當之誘發被活化，然後才可進行結構基因之轉錄。誘發可進行於陰性或陽性之對照下。
於陰性對照之誘發中，有一抑制劑與啟動子結合並遏止結構基因被轉錄。如有一適當之誘發劑存在時，則可將此抑制劑去活化，使可進行轉錄。
於陽性對照之誘發中，啟動子因與一活化劑結合而被活化，其中，該活化劑與啟動子之結合係由一適當之誘發劑所主導。
典型之誘發劑可為一些受質，其為原核宿主需要作為新陳代謝之用，例如不同類型之單糖。
本發明係關於陽性誘發之系統，其中，於一適當之受質，亦 即誘發劑，之存在下，一活化劑與啟動子結合，其可啟動經由剪接方式與所述之啟動子連接之基因之轉錄。
直到目前為止，大多數於原核宿主系統中之異源性基因表現系統係完全建立於一組數目有限之細菌性啟動子之上。因此，可被作為誘發劑使用之受質數目亦同樣有限。
此外，異源表現系統之產率係取決於可獲得之經轉化原核宿主細胞之數目多寡而定。因此，需要能生長至高細胞之密度，亦即係能使細胞快速繁殖而不會於細胞分裂時失去該載體之原核宿主系統。
 本發明概要
根據本發明，該等及其他目的，正如將於下列說明中顯而易見，可經由下列之方式所達成，即提供一些新載體，其等包含甘露糖操縱子之啟動子區域，該啟動子區域可經由剪接操作方式與一轉錄單元相連接，其包含一與所述之宿主細胞不同源之核酸序列，而所述核酸序列之表現係由該甘露糖操縱子之啟動子區域所控制。
本發明亦提供所述新載體之用途，其可於一原核宿主細胞中調控一核酸之異源性表現；一經分離及純化，可於宿主中表現之核酸序列，其包含一甘露糖操縱子之啟動子區域；一經所述之載體或所述經分離及純化之核酸序列所轉化之原核宿主細胞；一方法，其使用所述之載體或所述經分離及純化之核酸序列於一宿主中製造一多胜肽；及使用經由所述之載體或所述經分離及純化之核酸序列所轉化之原核宿主細胞於發酵，尤其係於高細胞密度之發酵上。
其他之目的及優點，對於彼等習知技藝人士而言，將由審閱 下列針對隨附其後之說明圖示之詳細說明，及依附於其後之申請專利範圍而變得顯而易見。
本發明詳細說明
如本文中所使用，茲提供下列定義以利於本發明之瞭解。
「可於宿主中表現之載體」或「表現載體」係為一多核酸之結構體，其係以重組之方式或由合成之方式產生，且具有一系列特定能使一特殊核酸序列於宿主細胞中進行轉錄之核酸元件。通常，此載體包括有一轉錄單元，其包含一特定待轉錄之核酸序列，其可剪接之操作方式與一啟動子相連接。可於宿主中表現之載體例如可為一獨立存在或自行複製之質體、黏質體、噬菌體、病毒及反轉錄病毒等。
「宿主」、「宿主細胞」及「重組宿主細胞」等術辭於本文中可彼此相互交替使用，且表示一原核細胞，於該細胞中已被引入一或數種本發明之載體或經分離及純化之核酸序列。如眾人所瞭解，上述之術辭不僅意指特定之受試細胞，而且亦指該種細胞之後代或潛在可能之後代。因為有些改變會因突變或環境之影響於後繼之世代中出現，故，該等細胞之後代事實上不會與親代之細胞相同，然而卻仍被包括於本文中所使用之該術辭之範圍內。
「包含」該術辭一般係以包括之意思被使用，此即係允許一或數種其他特徵或組成份之存在。
本文中所使用之「啟動子」意思係指一控制轉錄單元進行表現之核酸序列。一「啟動子區域」係為一具有調控功能之區域，其能於細胞中與RNA(核酸)聚合酶結合，並啟動一位於下游(3’方向)編碼序列之轉錄。於該啟動子之區域內可發現數個負責與RNA聚合酶結合之蛋白質之結合區(共有序列)，諸如推定之-35框盒及Pribnow框盒(-10框盒)。此外，該啟動子區域還可包含該等調控 性蛋白質之轉錄起始位置點及結合位置。
「甘露糖操縱子」之意思係指枯草芽胞桿菌 之甘露糖操縱子。
於甘露糖操縱子中被鑑別出三種基因(Kunst F.N.et al.,“The complete genome sequence of gram-positive bacteriumBacillus subtillis ”,Nature 390,pages 249 to 256(1997))。
第一個基因，manP ，編有一甘露糖特殊酵素組成(傳輸蛋白)之密碼，其屬於果糖通透酶家族之成員。第二個基因，manA ，編有一甘露糖-6-磷酸鹽異構酶之密碼，而第三個基因，yjdF ，之功能尚不清楚。位於此三個基因同方向之上游處有一調控性之基因，manR ，其編有ManR之密碼，為甘露糖操縱子之活化蛋白。
由三個基因manP-manA-yjdF (以下通稱為“manP ”)組成之甘露糖操縱子係由manP 啟動子所控制，其本身受正向之調控。另一啟動子，manR 啟動子，負責表現manR ，其對於與甘露糖有關之manP 啟動子之誘發十分重要。
manR 啟動子之區域還包含一該manR 基因之代謝產物調節蛋白之結合位置(代謝產物反應元件(cre ))。
「cre 序列」係指一位於該等代謝基因上游處(5’方向)之核酸序列。該cre 序列與一代謝產物控制蛋白(CCP)結合，其抑制於碳代謝產物抑制(CCR)中之代謝基因之表現。
「甘露糖操縱子之啟動子區域」之意思係為該啟動子區域，其在有或無cre 序列下調控manP 及manR 等基因之表現。
本文中所提及之「manP 啟動子」至少包含-35區域、Pribnow框盒及ManR蛋白之結合位置。
本文中所提及之「manR 啟動子」至少包含推定之-35區域、Pribnow框盒、ManR蛋白之結合位置及，可依選擇，一cre序列。
D-甘露糖，亦可被稱為「甘露糖」，係為葡萄糖之一2-表異構 物，且存在於甘露聚醣(mannan)及異甘露聚醣(heteromannan)等多醣、醣蛋白及許多其他之醣接合物中。
「CcpA」係指「代謝產物控制蛋白A」，其為一總調控蛋白，並能活化或抑制有些代謝操縱子之活化。於甘露糖操縱子之情形中，CcpA係經由與cre 序列結合而扮演一抑制性之角色。
「加強子」係指一核酸序列，其作用在加強促進一轉錄單元進行轉錄，而其與該轉錄單元之特性，該轉錄單元序列之位置或序列之方向無關。本發明之載體可依選擇將加強子包括在內。
本文中所使用之「轉錄單元」係指一核酸序列，其在正常情況下被轉錄成一單股之RNA分子。該轉錄單元可含一基因(單順反子)或二個基因(雙順反子)或更多之基因(多順反子)，其等編有於功能上相關多胜肽分子之密碼。
一核酸序列「可經由剪接操作方式被連接」，當其被置入另一核酸序列之功能關係中時。例如，可經由剪接操作方式將一啟動子與一編碼序列相連接，若該啟動子能對該序列之轉錄產生作用時；或例如可經由剪接操作方式將一轉錄起始區域，如核糖體結合位置，與一編有一多胜肽密碼之核酸序列相連接，若放置該區域有利於該多胜肽被轉譯時。核酸序列之連接可於合宜之限制酶剪切位置上經由接合反應完成之。若沒有此類之剪切位置時，則可依據常用之作法使用合成之由寡聚核苷酸組成之轉接序列或連結序列。
於本發明中所指之「核酸」或「核酸序列」或「經分離及純化之核酸或核酸序列」可為DNA、RNA或DNA/RNA之雜交體。若當該核酸或該核酸序列位於一載體上時，則其通常係為DNA。於本文中所稱之DNA可為任何之聚去氧核苷酸序列，其例如包括有雙股DNA；單股DNA；雙股DNA，其中一或雙股係由二個或 二個以上之片段所組成；雙股DNA，其中一或雙股具有一連續磷酸二酯之骨幹結構；DNA，其含一或數個單股之部分及一或數個雙股之部分；雙股DNA，其中DNA之雙股完全互補；雙股DNA，其中DNA之雙股僅有部份互補；圓形DNA；共價閉合式DNA；直線形DNA；共價交聯式DNA；cDNA；由化學試劑合成之DNA；半合成之DNA；生物合成之DNA；由天然分離得到之DNA；由酵素分解後得到之DNA；經剪切後得到之DNA；經標記之DNA，如經放射性元素標記之DNA及經螢光染劑標記之DNA；DNA，其含一或數個非自然存在之種類或核酸。DNA序列可由標準化學反應之技術，如磷酸三酯法，或經由自動化之合成方法及PCR(聚合酵素鏈鎖反應)方法加以合成。而經純化及經分離之DNA亦可利用酵素之技術加以製備。
於本發明中所指之RNA可例如為單股之RNA；cRNA；雙股RNA；雙股RNA，其中一或雙股係由二個或二個以上之片段所組成；雙股RNA，其中一或雙股具有一連續磷酸二酯之骨幹結構；RNA，其含一或數個單股之部分及一或數個雙股之部分；雙股RNA，其中RNA之雙股完全互補；雙股RNA，其中，RNA之雙股僅有部份互補；共價交聯式RNA；由酵素分解後得到之RNA；經剪切後得到之RNA；mRNA；由化學試劑合成之RNA；半合成之RNA；生物合成之RNA；由天然分離得到之RNA；經標記之RNA，如經放射性元素標記之RNA及經螢光染劑標記之RNA；RNA，其含一或數個非自然存在之種類或核酸。
「變異型」或「一序列之變異型」之意思係指一核酸序列，其與參考序列不同之處在於保留核酸被取代，其中一或數個核酸被另外具有相同特徵之核酸所取代。變異型亦包含退化之序列，具有經刪除或插入片段之序列，只要該等經改變之序列呈現出與 參考序列相同之功能(功能相等)。
如本文中所使用之術辭「多胜肽」、「胜肽」、「蛋白質」、「多胜肽類」及「胜肽類」等可彼此相互交替使用，且表示一系列之氨基酸殘基於二個相鄰殘基之α-氨基及羧基之間彼此藉由胜肽鍵相互連接於一起。
「經分離及純化之核酸序列」該術辭之意思係指該狀態，其中，該核酸之序列將與本發明一致。該核酸序列將不含或大體上不含該等核酸序列於自然狀態下所結合之物質，例如於該等核酸序列之自然環境中所發現與該等核酸序列並存之其他核酸，或製備該等核酸序列之環境(例如細胞培養)，當此製備係以重組技術於活體內或活體外進行時。
「轉化」、「經轉化」或「將一核酸輸入一宿主細胞中」等術辭係表示任何之方法，其中一細胞外之核酸，如一載體，於有或無伴隨物質之下進入一宿主細胞。「細胞被轉化」或「經轉化之細胞」等術辭係表示該細胞或其子代細胞，於其等細胞中已被輸入細胞外之核酸，因此含該細胞外之核酸。核酸被輸入細胞中，而使該核酸可與染色體結合成一體之片段形式或以染色體外之元件之形式進行複製。將適當之宿主細胞以例如一表現載體之轉化可利用習知之方法加以完成，例如顯微注射法、電穿孔轉化法、粒子撞擊法等，或利用化學方法，例如由磷酸鈣促成之轉化反應，其被敘述於例如Maniatis et al.1982,Molecular Cloning,A laboratory Manual,Cold Spring Habor Laboratory中或於Ausubel et al.1994,Current protocols in molecular biology,John Wiley and Sons中。
「異源性核酸序列」或「與宿主細胞不同源之核酸序列」係指一核酸序列，其例如編有一對於宿主細胞而言為外來之表現產 物，如多胜肽(「異源表現」或「異源產物」)之密碼，亦即係一核酸序列，其源自不同於宿主細胞之供應細胞或一以化學方法合成之核酸序列，其例如編有一對於宿主細胞而言為外來之表現產物，如多胜肽之密碼。若當該宿主細胞為一特殊之原核細胞種類時，則該異源性之核酸序列較佳者為源自一生物不同之屬或科，更佳者為源自一生物不同之目或綱，尤其源自一生物不同之門，最特別源自一生物不同之界。
於將源自不同於宿主細胞之供應細胞之異源性核酸序列輸入宿主細胞之前，可利用突變、插入、刪除或取代該異源性核酸序列之單一核苷酸或數個核苷酸之方式將其改變，只要該等經改變之序列呈現出與參考序列相同之功能(功能相等)。本文中所指之異源性核酸序列亦包含源自不同界之生物，例如源自真核細胞(真核細胞起源)，例如人類之抗體，其已被使用於噬菌體之展示庫中，且該等抗體之核酸序列之單一核苷酸或數個核苷酸已依據原核宿主細胞「密碼子之用法」被加以修改。
於本發明之含意中，「異源性核酸序列」或「與宿主細胞不同源之核酸序列」亦包含一由宿主所衍生出之核酸序列，其編有一於自然情況下表現於該宿主中之多胜肽之密碼，其中，該核酸序列被插進本發明之載體上，並且受本發明甘露糖操縱子之啟動子區域之控制。
「轉錄起始區域」係為一訊號區域，其促使轉錄被啟動，且其包含核糖體結合位置之序列，諸如Shine Dalgarno序列。
通常，轉錄起始區域位於轉錄起始位置之下游處，且可經由剪接之操作方式將其與待表現之基因連接於一起。
「轉錄終止區域」係指一序列，其使RNA聚合酶終止進行轉錄。轉錄終止區域通常係一轉錄單元之部份，其可避免其他附近 基因不需要之轉錄或避免從其他潛在可能啟動子之轉錄，且可增加mRNA之安定性。
「抗體」係指一類經抗原刺激後由免疫系統之B細胞所產生之血漿蛋白質。哺乳動物(即人類)之抗體係為IgG、M、A、E及D等類型之免疫球蛋白。使用於本發明之術辭「抗體」包括，但不侷限於，多株抗體、單株抗體、抗獨特型抗體及自體抗體，其存在於自體免疫之疾病中，例如糖尿病、多發性硬化症及風濕性關節炎，及嵌合抗體等。
於另一面向，本發明提供一可於宿主細胞中表現之載體，其包含有一甘露糖操縱子之啟動子區域，其可以剪接之方式與該宿主細胞呈異源性之核酸序列之轉錄單元相接，而所述核酸序列之表現係由所述之甘露糖操縱子之啟動子區域所調控。
根據本發明之載體較佳者為一具有自主性或自行複製之質體、黏質體、噬菌體、病毒或反轉錄病毒。有許多宿主/載體之組合體可被使用於表現本發明之核酸序列。
有用之表現載體，例如可由染色體之核酸序列、非染色體之核酸序列及/或經由人工合成之核酸序列之片段所組成。
適用之載體包括對宿主範圍具專一性之載體，諸如例如分別針對枯草芽胞桿菌 及大腸桿菌 具有專一性之載體，及對宿主範圍具廣闊性之載體，例如針對革藍氏陽性細菌及革藍氏陰性細菌有效之載體。
可被使用者還有「低度複製」、「中度複製」及「高度複製」之質體等。
例如，於枯草芽胞桿菌 中，pAMbeta1係為一低度複製之質體，數種中度複製之質體係為pBS72衍生之質體，及pUB110係為一高度複製之質體。
根據本發明，甘露糖操縱子之啟動子區域分別包含manR 啟動子區域及manP 啟動子區域。
於圖一中顯示源自枯草芽胞桿菌 之核酸序列，其包含manR 之C-端部份，介於manR 及manP 間之間隔區域，緊接其後係作為報導基因之溶葡萄球菌酶(lysostaphin)基因lys 。
本發明之核酸序列，其包含manP 之啟動子區域，較佳者為含圖一從鹼基對-80至lys 基因之起譯密碼子之核酸序列(SEQ ID NO.1)，及更佳者為含圖一從鹼基對-80至包括鹼基對-1在內，亦即位於鹼基對+1上轉錄起始位置A之上游處之核酸序列(SEQ ID No.2)。
於圖二及於圖三中顯示源自枯草芽胞桿菌 之核酸序列，其包含manR 啟動子區域，位於鹼基對+1上之轉錄起始位置G，一推定之cre 序列，介於鹼基對+1及manR 間之轉錄起始區域，及manR 之部份，其中manR 被lacZ 所取代。本發明之核酸序列，其包含manR 之啟動子區域，較佳者為含圖三從鹼基對-122至lacZ 基因之起譯密碼子之核酸序列(SEQ ID NO.3)，更佳者為含圖三從鹼基對-122至鹼基對+7，亦即包含推定之cre 序列在內之核酸序列(SEQ ID NO.4)，及尤其含圖三從鹼基對-122至鹼基對-1，亦即位於鹼基對+1上之轉錄起始位置G上游處之核酸序列(SEQ ID NO.5)。
manP 及manR 二者之啟動子區域皆包含ManR之結合位置。本發明亦包含一與SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5其中任意一者互補之序列及其等之變異型。
本發明中所使用之甘露糖操縱子之啟動子區域，例如manP 之啟動子區域、manR 之啟動子區域(含或不含cre 序列)及依據SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5等序列之啟動子區域，一與其等序列互補之序列或其等序列之變異型通常係源自枯草芽胞桿菌 之甘露糖 操縱子或源自其他原核生物，尤其係芽孢桿菌科之生物，之於功能上相等之啟動子區域。其他原核生物於功能上相等之啟動子區域包含一可經由D-甘露糖所誘發之啟動子區域，亦即一啟動子區域，其於甘露糖之存在下比無甘露糖之下具有更高之表現活性。
於許多原核生物，例如厚壁菌門(Firmicutes)，如枯草芽胞桿菌 中，甘露糖操縱子與D-甘露糖之新陳代謝有關。
枯草芽胞桿菌 可將許多不同之單糖作為碳源使用。六碳醣，如葡萄糖及D-甘露糖，主要係經由磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)：碳水化合物磷酸轉移酶系統(PTS)被細胞所吸收。於該PTS系統中，每個六碳醣同時被磷酸化，並於細胞吸收時被送入細胞中。一特殊之單糖受質之吸收及利用係由碳代謝產物抑制(CCR)所支配。於葡萄糖，枯草芽胞桿菌 較佳之單糖受質，之存在下，其他受質之吸收及利用之基因，如甘露糖操縱子之轉錄即受抑制。
枯草芽胞桿菌 中與葡萄糖有關連之CCR之機制已廣泛地被研究，並於目前技術水準中為人所熟悉(Stülke J.et al.,“Regulation of carbon catabolism inBacillus species ”,in Annu.Rev.Microbiol.54,2000,pages 849-880)。
根據本發明之轉錄單元通常還包含一轉譯起始區域，其位於所述轉錄單元之轉譯起始點(起譯密碼子)之上游處，其中該轉譯起始區域可經由剪接操作方式與該核酸序列相連接。該轉譯起始區域通常位於直接鄰近轉錄單元之轉譯起始點之上游處，其可為ATG、GTG或TTG。
轉譯起始區域可為甘露糖操縱子中manP 基因或manR 基因之轉錄單元之轉譯起始區域。甘露糖操縱子中manP 基因或manR 基因之轉譯起始區域可部份或完全被另一轉譯起始區域所取代。例 如，可使用tufA (延長因子Tu)及gsiB (壓力蛋白；Jürgen et al.,1998,Mol.Gen.Genet.258,538-545)之轉譯起始區域，二者皆源自枯草芽胞桿菌 。
下文中分別呈現tufA 及gsiB 之核酸序列，其中起譯密碼子以粗體字表示，限制酶之剪切位置被標示於序列之下方並突顯Shine-Dalgarno序列之位置。
tufA ：
gsiB ：
經由適當之選擇轉錄起始區域，其可增強mRNA之安定性，其係基因表現中一項重要之特徵。mRNA安定性之特徵係其特殊之半衰期。
除轉錄起始區域以外，轉譯起始點及，可依選擇，位於該起始點後之該基因之數個密碼子，例如5至6個密碼子，亦可分別被取代，如上文中所示之tufA 及gsiB 之核酸序列。
轉譯起始區域此外還可包含一編有訊號序列密碼之序列，其可經由剪接操作方式與本發明之異源性核酸序列相連接。該訊號序列通常位於直接鄰近該轉譯起始點之下游處，其可為該轉錄單元之ATG、GTG或TTG等。
若使用的係一雙順反子或多順反子轉錄單元之時，則可應用不同或相同之訊號序列，其以剪接操作方式與每個順反子相連 接。較佳者為於此情形中使用不同之訊號序列。該訊號序列可為一原核細胞或一真核細胞之訊號序列。通常係使用原核細胞之訊號序列。
於本發明表現載體中所應用編有訊號序列密碼之DNA序列可由購買方式取得或由化學合成方法製備而得。例如，訊號序列可依據例如敘述於Beaucage & Caruthers,1981,Tetrahedron LeHs.22,1859-1862中之固相亞磷酸醯胺三酯(phosphoramidite trimester)方法合成而得，如Van Devanter et al.,Nucleic Acid Res.12：6159-6186(1984)中所述。寡聚核苷酸可利用非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳或陰離子交換高效能液相層析儀加以純化，其方法如Pearson & Reanier,J.Chrom.255：137-149(1983)中所述。
通常，轉錄單元還包含一轉錄終止區域。
較佳者為，使用強力之轉錄終止區域以避免啟動子從轉錄單元「讀穿」進入位於其左右二側之質體序列中及從其他質體啟動子「讀穿」進入該轉錄單元中。此外，於該種轉錄終止區域之存在下亦觀察到mRNA變得比較安定。
強力之轉錄終止區域適用之範例有源自枯草芽胞桿菌 168之tufA 3’-區域之核酸序列5’-CGAGACCCCTGTGGGTCTCG-3’，其可由購買取得。
根據本發明，可使用一異源性之核酸序列，其編有一對於宿主細胞為外來者之表現產物之密碼。若該宿主細胞為原核細胞種類，如枯草芽胞桿菌 或大腸桿菌時，則該感興趣之核酸序列較佳者為源自另一鋼別之細菌，如γ-變形細菌綱，例如源自例如伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)，特別係源自一不同門之細菌，例如古菌(archea)，最特別係源自一真核細胞生物，例如哺乳動物，特別係源自人類。然而，該異源性之核酸序列亦可依據宿主細胞「密 碼子之用法」被加以修改。根據本發明之異源性核酸序列通常係為一感興趣之基因。該感興趣之基因較佳者為編有一異源性多胜肽，例如一結構性、調控性或治療性之蛋白質，或結構性、調控性或治療性之蛋白質與其他蛋白質(「標籤蛋白」)之N-(胺基)或C-(羧基)端融合蛋白質，例如綠色螢光蛋白或其他融合蛋白之密碼。該異源性之核酸序列亦可編有一轉錄產物之密碼，該產物可以RNA之形式，例如以反義RNA之形式被使用。
蛋白質可以一不溶性之聚集物或以一可溶性蛋白質之形式被合成，其存在於該宿主細胞之細胞質或壁膜間隙之中，及/或細胞外之液體基質中。較佳者為，該蛋白質係以一可溶性蛋白質之形式被合成，其存在於該宿主細胞之壁膜間隙中，及/或細胞外之液體基質中。
該感興趣之異源性蛋白質可起源自人類、哺乳動物或原核細胞。其他之蛋白質係為抗原，例如源自微生物致病菌，病毒及細菌二者，及源自腫瘤之醣蛋白及碳水化合物。其他之蛋白質還有酵素，如凝乳酶、蛋白水解酶、聚合酶、脫氫酶、核酸水解酶、葡聚醣水解酶、氧化酶、α-澱粉水解酶、氧化還原酶、脂肪水解酶、醯胺酶、腈水合酶、酯水解酶或腈水解酶。
於本發明中，訊號序列與該異源性之核酸序列於該表現載體內之排列順序及距離係可被改變。於一些較佳之實施例中，該訊號序列係位於編有例如該感興趣多胜肽之密碼之核酸序列之5’端(上游處)。訊號序列與該編有例如該感興趣多胜肽之密碼之核酸序列可被零至大約一千個氨基酸所分隔。於一些較佳之實施例中，該訊號序列與該編有例如該感興趣多胜肽之密碼之核酸序列彼此直接相鄰，亦即係被零個核苷酸所分隔。
較佳者為，本發明之載體包含一依據SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5等序列其中任意一序列之核酸序列，與其等序列互補之序列及其等序列之變異型序列。
於本發明中亦包含使用根據本發明之載體於一原核細胞之宿主中進行一核酸序列經調節之異源性表現。
表現係經由添加一適當之誘發劑所啟動。甘露糖操縱子之誘發劑係甘露糖或甘露糖之一種衍生物，其能誘發甘露糖操縱子之manR 之啟動子區域或manP 之啟動子區域。該表現可由該原核宿主細胞所能取得之誘發劑之數量所調控。
於又另一面向上，本發明提供一經分離及純化之核酸序列，其包含一甘露糖操縱子之啟動子區域。較佳者為，該經分離及純化之核酸序列包含甘露糖操縱子之manP 之啟動子及/或manR 之啟動子。更佳者為，該經分離及純化之核酸序列包含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5等序列其中任意一序列。該經分離及純化，包含一甘露糖操縱子之啟動子區域之核酸序列可經由剪接操作之方式與一轉錄單元相連接，其包含一編有一多胜肽密碼之核酸序列，其中，該編有多胜肽密碼之核酸序列之表現係受該甘露糖操縱子之啟動子區域所控制。
根據本發明經分離及純化之核酸序列亦可包含調節基因manR全部或其中一部份之序列。
至少該manR 啟動子經分離及純化之核酸序列可能包含一cre 序列。
本發明經分離及純化之核酸序列可依照標準PCR之實驗方法及於目前技術水準中所熟悉之方法加以分離。本發明經分離及純化之核酸序列還可包含一或數個調控性之序列，如目前技術水準中所熟悉，例如一加強子，其通常被使用於加強表現由該核酸序列所編碼之產物。
為挑選可被本發明之載體或經分離及純化之核酸序列成功且穩定轉化之宿主細胞，可將一編有具可選擇性標記蛋白(例如抵抗抗生素)密碼之基因連同該感興趣之核酸序列一起送入宿主細胞中。該編有具可選擇性標記蛋白密碼之基因可位於該載體上或位於該經分離及純化之核酸序列上，或可依選擇以分開之形式，例如於分開之載體上同時送入宿主細胞中。可被使用之各種具可選擇性之標記蛋白包括有彼等蛋白，其賦予宿主細胞具有抗拒抗生素，如觀黴素(spectinomycin)、潮黴素(hygromycin)、胺苯甲青黴素(ampicillin)及四環黴素(tetracyclin)之能力。抗生素之用量可依需要作調整以創造選擇性之條件。通常使用一具可選擇性之標記蛋白。
若該載體為一穿梭載體時，則可選用一與該適用宿主細胞共同具有之標記蛋白。例如，若該載體為一可於大腸桿菌 及枯草芽胞桿菌 中複製之穿梭載體時，則可使用編有糞腸球菌(Enterococcus faecalis )觀黴素-腺苷醯轉移酶(adenyltransferase)密碼之抵抗性標記蛋白之基因，其賦予宿主細胞抗拒觀黴素之能力。
此外，報導基因，如螢光蛋白質亦可隨著該感興趣之核酸序列一起送入宿主細胞中以對轉化之效率進行測定。
適用之報導基因例如有彼等編有加強螢光蛋白(eGFP )密碼之基因及編有β-半乳糖水解酶密碼之lacZ 基因。此二種報導基因皆可由購買取得，且廣泛地被使用。
本發明之另一面向係提供一經由本發明之載體所轉化之原核宿主細胞，其中，該載體包含甘露糖操縱子之啟動子區域。較佳者為，該載體包含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5等序列其中任意一序列，與其等序列互補之序列及其等序列之變異型序列。
有許多種原核宿主細胞皆有助於被根據本發明甘露糖操縱子 之可由甘露糖誘發之啟動子區域之轉化。此等宿主包括有革蘭氏陽性細胞菌株，例如芽胞桿菌(Bacillus )及鏈黴菌(Streptomyces )，或革蘭氏陰性細胞菌株，例如大腸桿菌及假單胞菌(Pseudomonas )。較佳者為，該宿主細胞係為一革蘭氏陽性之細胞菌株，特別係厚壁菌門，最特別係該宿主細胞係為一芽胞桿菌。
可被使用之芽胞桿菌例如有枯草芽胞桿菌 (B.subtillis )、解澱粉芽胞桿菌 (B.amyloliquefaciens )、地衣芽胞桿菌 (B.lichenifor-mis )、納豆芽胞桿菌 (B.natto )、巨大芽胞桿菌 (B.megaterium )等菌株。較佳者為，該宿主細胞係為一枯草芽胞桿菌，例如B.subtillis 3NA 及B.subtillis 168 。
可被使用之大腸桿菌例如有TG1、W3110、DH1、XL-1藍色及Origami等菌株，其等可由購買取得。
適當之宿主細胞例如可向菌種保存中心，例如向位於德國布朗施威格(Braunschweig)之德國微生物及細胞培養保存股份有限公司(DSMZ)購買取得。
例如，芽胞桿菌係由芽胞桿菌遺傳庫中心所取得。
宿主細胞可能或不可能代謝甘露糖。一通常能吸收並代謝甘露糖之宿主細胞，如枯草芽胞桿菌 ，可被修改成缺少一或數種與甘露糖吸收及/或新陳代謝有關之功能。經由例如抑制或阻斷一編有一蛋白質密碼之基因，例如編有甘露糖-6-磷酸鹽異構酶密碼之manA 基因之表現即可實現缺少一或數種與甘露糖吸收及/或新陳代謝有關之功能。而此種修改可藉由已知之技術被做到，諸如由跳躍基因所提供之致突變性或基因剔除突變等方式。
通常，原核宿主細胞與所選擇之訊號序列相對應，例如若當使用芽胞桿菌之訊號序列時，則宿主細胞通常係同芽胞桿菌科之成員，更佳者為，該宿主細胞為一芽胞桿菌之菌株。
較佳者為使用一宿主細胞，其具有一磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統(PTS)。尤其係該具有一PTS系統之宿主細胞係為一芽胞桿菌目，尤其係芽胞桿菌屬及更佳者為枯草芽胞桿菌 種之微生物，或一腸桿菌目(Enterobacteriales)，較佳者為腸桿菌屬及更佳者為大腸桿菌種之微生物。
CCR之主要元件為代謝產物控制蛋白A(CcpA)，其可與cre 序列相結合，例如與SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4等序列中推定之cre 序列相結合。當CcpA處於結合狀態時，則各基因，此處為manR ，之轉錄即受壓制。
當缺乏葡萄糖及於一誘發劑，如D-甘露糖之存在下時，不會出現因受CcpA之結合而被抑制之情形，且經由調控性蛋白(ManR)與甘露糖操縱子啟動子區域各個結合位置相互結合而啟動甘露糖操縱子基因之轉錄。
本發明作者意外發現ManR不僅為manP 啟動子區域之調控性蛋白，而且亦為manR 自己本身之調控因子。
此外，本發明還提供一方法用於在一宿主細胞中製造一多胜肽，該方法包含下列之步驟：a)建構一載體，b)以所述之載體轉化一原核細胞宿主，c)於適當之條件下，使所述之多胜肽於一細胞培養之系統中被表現，d)從該細胞培養之系統中回收所述之多胜肽。
所使用之載體，其建構及使原核細胞宿主之轉化皆如上文中所定義，其中，該載體所包含之異源性核酸序列編有一多胜肽之密碼。
於培養試管、搖瓶或細菌發酵槽中可應用作為細胞培養系統 之連續式或非連續式之培養，例如批次培養或饋料批次培養。
於培養宿主細胞時，可使用目前技術水準所習知之常用培養基，例如複合培養基，如「營養酵母菌肉汁培養基」、一含甘油之培養基，其如Kortz et al.,1995,J.Biotechnol.39,59-65所述、一礦物鹽培養基，其如Kulla et al.,1983,Arch.Microbiol,135,1所述、一用於大腸桿菌發酵之批次培養基，其如Wilms et al.,2001,Biotechnol.Bioeng.73,95-103所述或LB-培養基，其如Bertram et al,1051,J.Bacteriol.62,293-300所述。
培養基包含一適當之碳源，例如單糖，如葡萄糖，作為宿主細胞生長之受質。作為受質使用之碳源與誘發劑不同。
培養基於適當之情況下可加以改變，例如添加其他成份，諸如緩衝劑、鹽類、維他命、氨基酸、抗生素或其他之微量營養素，其等一般為習知技藝人士所熟知。
於培養細胞時亦可使用不同之培養基或數種培養基所組合之培養基。
較佳者為，作為基礎培養基使用之培養基不應含誘發劑以便於達到對甘露糖操縱子嚴密之調控。
誘發劑可於培養之細菌達到一測定之參數後才開始添加。該等測定之參數例如有光密度(OD)，其表示培養細菌之細胞濃度，或不同於誘發劑之碳源濃度。
例如，於本發明之方法中，誘發劑可於培養之細菌達到適當之OD值，其由該特殊之培養系統所決定，之後才被添加。就於搖瓶中進行之批次培養而言，其典型之測定參數OD600 大約為0.3或更高之數值。
通常，誘發劑，如甘露糖於原核宿主細胞之培養基中之含量被調整至大約為10公克/公升，較佳為至約為5公克/公升，更佳為至約為2公克/公升。
然而，誘發劑之添加量可依據任意一特定之發酵方法之要求做調整。
誘發劑添加之方式(即誘發制度)可依據特殊培養系統加以選擇。
由添加之方式可進一步調控宿主細胞之生長速率及表現速率。
例如，可於適當之時間區段以不連續或連續之方式添加甘露糖。於不連續之方式(即衝擊性誘發)中，誘發劑可於誘發點上僅僅添加一次，或於適當之時間間隔上添加二次或數次。適用之方式係由該培養系統決定，且可容易被習知技藝人士所決定。
例如，於連續性之方式中，甘露糖可固定之速率或降低/增加之速率被添加。
連續性之添加還可於一選定之培養時間間隔內實施，例如於該培養菌之指數生長期間所選定之時間間隔。
此外，亦可合併使用不連續或連續之誘發制度。
根據本發明一饋料批次培養之實施例中，於該批次培養中，細胞被培養至一介於20至30OD600 之細胞濃度，然後將該培養菌轉換至饋料階段，其中添加由主要碳源及甘露糖所組成之混合物。於該饋料階段中，可改變主要碳源對甘露糖之比例，其適用之比例從3：1至1：3。藉由改變主要碳源對甘露糖之比例可將表現速率加以控制。
適當之pH值例如從6至8，較佳者為從7至7.5；適當之培養溫度介於10與40℃之間，較佳者為介於30與37℃之間。
細胞通常被培養所花費之時間至所表現之產物及/或生物質量累積至最大量為止，較佳為介於1小時至20天之間，更佳為介於5小時至3天之間。
於生物質量之產率方面，被表現產物之產量乃取決於所使用 之培養系統。
於搖瓶培養中，通常所表現之產物，其產量為0.5公克/公升培養基，可經由以本發明之載體所轉化之宿主細胞製造而得。而當利用發酵槽以批次及/或饋料批次方式進行培養時，可得到產量通常超過0.5公克/公升發酵液，較佳為超過1公克/公升，更佳為超過1.3公克/公升之表現產物。
此外，於使用本發明宿主細胞之本發明發酵方法中，可得到從至少10至30OD600 ，尤其至少50OD600 ，而大約250OD600 或更高之數值較佳，至少500OD600 更佳及至少1000OD600 之高細胞密度最佳。尤其於一根據本發明之饋料批次培養中，可得到介於50OD600 至達到超過1000OD600 之間之細胞密度。
明白地說，1OD600 相當於平均大約每公升含0.322公克之乾燥物質。故，100個OD600 值相當於每公升含32.2公克之乾燥物質，且500OD600 則相當於每公升含161公克之乾燥物質。
而且，根據本發明之宿主細胞容許高度之複製率而不會失去載體。
經於宿主細胞表現後，所表現之產物，例如一感興趣之多胜肽可由該宿主細胞之培養液中回收而得。為取得所表現產物之最大產率，細胞通常於培養結束之時被收集並被溶解，例如利用溶菌酶處理，超音波震盪或法式擠壓破裂法等方式溶解細胞。因此，多胜肽通常首先係以宿主細胞之粗溶解液之形式被取得。然後再以目前技術水準所熟悉之標準蛋白質純化方法，其中包括不同之沈澱、分子篩色層分析法、離子交換色層分析法、等電點聚焦法、凝膠電泳法、親和性及免疫親和性色層分析法，純化該粗多胜肽。此類為人所熟悉且經常性使用之方法例如於Ausubel et al.,supra.,及Wu et al.(eds.),Academic Press Inc.,N.Y.；Immunochemical Methods in Cell And Molecular Biology中有所敘述。例如，於進行純化以重組方式製成之免疫球蛋白時，可應用免疫親和性色層分析法進行其等之純化，其方法係將粗免疫球蛋白通過一含樹脂之管柱，其中，該樹脂上已接合上許多可專一性結合所表現免疫球蛋白之標的分子。
本發明亦關於一些用於在原核宿主細胞中進行細胞內異源性表現編有例如多胜肽密碼之核酸序列之方法及手段。尤其，本發明亦關於一些載體及使用該等載體於本發明之原核宿主細胞中進行細胞內表現一異源性之多胜肽。
於細胞內之表現中，多胜肽係於細胞質內被表現，且不會從細胞質被輸送至非細胞質之地方。多胜肽係以包涵體之形式或可溶之形式被表現於細胞質中。從細胞中，尤其係從細胞萃取液中分離及純化多胜肽之方法亦係為人所熟悉。
本發明之甘露糖啟動子之優點係其等可被嚴密地調控，並可被一常見且無毒性，因此對於工業上有用處之化合物所誘發。
此外，本發明之甘露糖啟動子及含該甘露糖啟動子之載體於細胞內非常安定，且甚至於細胞經多次之複製後亦不會流失。因此，以根據本發明所轉化之宿主細胞所進行之高細胞密度之發酵係可行。
習知技藝人士將評估於本文中所述之發明係容許被改變及修改，但有特別說明者除外。然而，必須理解者為本發明包括所有該等不偏離本發明之精神及基本特徵之改變及修改。本發明亦包括所有於本說明書中以個別或整體之方式所提及或指示之步驟、特徵、組成及化合物，及包括任何與所有之組合或任何二種或二種以上所述之步驟或特徵。本發明之揭露因此必須被認為係於所有之面向上進行說明，且並不受限於此說明，本發明之範圍係由 所依附之申請專利範圍所指明，且所有出現於同等性之含意及範圍內之改變皆意圖涵蓋於本文中。所有於本說明書中所引用之參考文獻，皆被納入本文之參考文獻中作為本說明書之揭示內容。
依據下列之範例將更加完全之明瞭前述之說明。然而，該等範例僅用於說明實施本發明之方法，而並無意限縮本發明之範圍。
I)分離及鑑別甘露糖操縱子manR啟動子及manP啟動子之啟動子區域
若沒有另外說明時，使用下列之材料及方法：
細菌菌株及生長條件
大腸桿菌JM109(Yanisch-Perron C.et al.,Gene 33,1985,103-119)及枯草芽胞桿菌 3NA(Michel J.F.etal.,J.Appl.Bacteriol.33,1970,220-227)被使用作為選殖及表現之主要宿主細胞。令大腸桿菌 於37℃下生長於LB液體培養基中(Luria S.E.et al.,Virology 12,1960,348-390)及生長於被添加每毫升100微克ampicillin或spectinomycin之LB瓊膠平板培養基上。此外，令枯草芽胞桿菌 37℃下生長於LB液體培養基中及碳(C)或硫(S)之基礎培養基上(Martin-Verstraete I.et al.,J.Mol.Biol.214,1990,657-671)。液體培養基及瓊膠平板培養基分別被添加每毫升100微克之spectinomycin，每毫升10微克之kanamycin或每毫升5微克之erythromycin。於進行誘發甘露糖啟動子時，添加經無菌過濾或經高溫高壓滅菌之D-甘露糖至末濃度為0.2%(重量/體積)為止。
材料
所有化學藥品皆向Sigma-Aldrich(德國Taufkrichen)、Fluka(德國Buchs)或Merck(德國Darmstadt)購買取得。人工合成之DNA 寡聚核苷酸係向Eurofins MWG Operon(德國Ebersberg)購買取得。限制酶及DNA修飾酶係向Roche Applied Science(德國Mannheim)或New England Biolabs(德國Frankfurt am Main)購買取得。PCR係由高保真度之DNA聚合酶，其係向Fermentas(德國ST.Leon-Rot)購買取得，於一由Biozyme購買取得之MiniCycler機器上進行。
DNA之製備及轉化
從大腸桿菌 及枯草芽胞桿菌 或從瓊脂凝膠中分離DNA係利用Qiagen(德國Hilden)或Roche(德國Mannheim)之DNA製備套組試劑及依據製造商所提供之說明下所完成。於所有本發明之範例中皆使用標準之分子技術。
大腸桿菌 係依據Chung C.T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1989,2172-2175中所述之方法由質體DNA所轉化。枯草芽胞桿菌 則係依據修改後之「巴黎方法」(Harwood C.R.Molecular Biological Methods for Bacillus,1990,John Wiley & Sons Ltd.,England)由質體DNA所轉化。
β-半乳糖水解酶活性之測量
於37℃下，將0.1毫升之待測細胞(其被置於0.9毫升之Z-緩衝溶液中)以10微升之甲苯處理30分鐘。然後依據Miller之方法(Miller J.H.,1972,experiments in molecular genetics,Cold Spring Harbor,NY)，於22℃下以鄰-硝基苯-β-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-galactopyrano-side)測定β-半乳糖水解酶之活性。
所使用之寡聚核苷酸
實驗1：
分離攜帶甘露糖操縱子啟動子區域之DNA片段，並測定 manR啟動子及manP啟動子之轉錄起始位置點。
利用Qiagen(德國Hilden)之DNeasy血液及組織套組試劑分離枯草芽胞桿菌 168之染色體DNA。
利用PCR及使用s4693/s4694等引子從所取得之DNA上擴增一長度大約為2300個鹼基對，具有含推定manR 啟動子之完整manR 基因及介於manR 及manP 間之間隔區域之DNA片段。
所取得長度大約為2300個鹼基對之DNA片段被使用在用於測定manR 啟動子及manP 啟動子轉錄起始位置點之引子延長試驗中。
為分離用於引子延長之mRNA，由大腸桿菌 載體pIC20HE(Alten-buchner et al.,1992,Methods Enzymol.216,457-466)及由枯草芽胞桿菌 載體pUB110(MacKenzie et al.,1986,plasmid 15,93-103)建構一穿梭因子。該載體含lys 基因為報導基因，其編有模仿葡萄球菌(Staphylo-coccus simulans )之成熟型溶葡萄球菌酶之密碼(Recsai et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,1127-1131)。
將該長度為2300個鹼基對之DNA片段選殖至該高度複製之pUB110衍生質體位於該溶葡萄球菌酶基因之上游處。所生成之質體被命名為pSUN178.4，並被送入枯草芽胞桿菌 3NA中。
使含pSUN178.4質體之枯草芽胞桿菌 3NA生長於含kanamycin之LB培養基中。當達到指數生長期時，以0.2%之甘露糖誘發該培養之細菌。經37℃下生長1小時後，將經誘發及未經誘發之細胞加以收集。接著利用Qiagen-RNeasy Mini套組試劑分離全部之RNA。
使用於5’-端以Cy5標記之引子s5006、s5007、s5097及s5098。
引子s5006及s5007分別與由溶葡萄球菌酶基因起譯密碼子起算從鹼基對+21至鹼基對+50之片段及從鹼基對+76至鹼基對+105 之片段進行雜交。引子s5097及s5098則分別與由manR 基因起譯密碼子起算從鹼基對+81至鹼基對+101之片段及從鹼基對+131至鹼基對+153之片段進行雜交。
同樣之引子被使用於pSUN178.4質體DNA之定序反應，其被做為長度標準品。此外，分別使用AMV-反轉錄酶及T7-DNA聚合酶於反轉錄及DNA之定序上。反轉錄及定序之產物然後被分析於一變性之聚丙烯醯胺定序凝膠(GE healthcare)上。所有其他試劑皆由Amersham Pharmacia Biotech AutoRead Sequencing kit所提供。
manP -啟動子之轉錄起始位置點係利用引子s5006所測得。預備pSUN178.4質體與相同引子之DNA序列反應，並將其於同樣之變性凝膠上展開以作為比較。圖一顯示manP 啟動子周圍之DNA序列，其中，突顯位於A(腺嘌呤核苷酸)上之轉錄起始位置點。被推定之-10及-35框盒係以斜體字表示，manR 基因之尾端及lys 基因之起始端係由箭頭標記所標示，限制酶Bgl -II、Xba I、Af lII及Nde I之剪切位置被標示於序列之下方。
manR 啟動子之轉錄起始位置點係利用RNA分離及DNA定序所測得，該測定係依據上文中所述之方法進行，即針對於manP -啟動子，但除使用引子s5098以外，其與manR 基因結合。
於圖二及圖三中顯示manR 啟動子區域之DNA序列，其中突顯位於G(鳥糞嘌呤核苷酸)上之轉錄起始位置點，被推定之-10及-35框盒係以斜體字表示，lys 基因及manR 基因之起始端分別由一箭頭標記所標示。限制酶剪切位置及一經推測之cre 序列被標示於該序列之下方。
當細胞受甘露糖之誘發時，由manR 啟動子，尤其係由manP 啟動子之轉錄會強烈地增加，此可由引子延長試驗中非常強烈之 訊號觀察到。
所有使用之引子被呈示於上文表1中。
實驗2
根據實驗1之方法所進行之引子延長試驗定位出manP 啟動子之轉錄起始位置點係靠近介於manR 基因及manP 基因起點之間間隔區域之3’-端。於測定manP 之啟動子區域時，以PCR擴增法逐步更精確地縮短長度為2300個鹼基對之DNA片段，然後將所得到不同長度之序列片段以選殖方式接回相同之基本表現載體上，接著進行表現之研究。
a)建構基本表現載體
建構一表現載體，其具有不含啟動子之lacZ 為報導基因。該表現載體被設計成一穿梭載體之形式，其能於枯草芽胞桿菌 及大腸桿菌 中複製，並且被命名為pSUN272.1。
報導基因lacZ 係以限制酶Nde I及Xma I由質體pLA2上切割出(Haldimann A.et al.,2001,J.Bacteriol.183,6384-6393)，然後被接進質體pJOE5531.1中，該質體係為一可經由鼠李糖(rhamnose)誘發之表現載體pWA21之衍生載體(Wegerer et al.,2008,BMC.Biotechnol.8,2)，其於Xma I之位置上含枯草芽胞桿菌tufA 轉錄終結子。於此質體中，於Afl II/Mun I等限制酶之剪切位置之間插入一對寡聚核苷酸s4956/4957以於lacZ 基因之上游處加入相同之tufA 轉錄終結子。故，該等終結子避免由質體啟動子「讀穿」進入lacZ 基因中及由lacZ 基因「讀穿」進入二側之質體序列中。針對於大腸桿菌 及枯草芽胞桿菌 二者之抗spectinomycin基因spc 係以寡聚核苷酸S4833/4835從質體pDG1730上被擴增(Geurout-Fleury et al.,1996,Gene 180,57-61)，然後被插入前面所得到之質體中。此外，藉由刪除一BspH I/Hind III之片段以縮短大腸桿菌 之載體部份。接 著將一含枯草芽胞桿菌 pMTLBS72複製原點之EcoR I/Sph I片段(Lagodich et al.,2005,Mol.Biol.(Mosk)39,345-348)接進該質體中。
藉由Afl II及Nhe I之切割及黏接，將實驗1中所取得長度為2300個鹼基對之DNA片段插進pSUN272.1中lacZ 基因前之位置，結果得到表現載體pSUN279.2，該質體之圖譜如圖四中所示。
所有使用之引子被呈示於上文表1中。
b)測定載體pSUN279.2之表現效率
將上文a)中所取得之質體pSUN279.2及pSUN272.1送入枯草芽胞桿菌 3NA中。後者係作為背景對照。使攜帶一或另一質體之枯草芽胞桿菌 3NA菌株於添加spectinomycin之LB培養基中生長，然後於達到指數生長期時將0.2%之甘露糖、0.2%之甘露糖加上0.2%之葡萄糖或無單糖(無誘發對照)添加至該等培養之細菌中以進行誘發。經一小時之誘發後，依據Miller之方法測定該等細胞β-半乳糖水解酶之活性。結果呈示於圖五及圖七中。
未經誘發，含pSUN279.2之枯草芽胞桿菌 之培養菌顯現出一相當高基礎水準之β-半乳糖水解酶活性。甘露糖之存在造成β-半乳糖水解酶之活性又增加4倍，而以甘露糖加上葡萄糖誘發之活性則呈下降，但仍超過基礎水準相當之幅度。此等結果明確指出於pSUN279.2上所觀察到之啟動子活性係源自介於manR 及manP 間之區域，或源自manR 上游之區域或源自於二者。
因此，藉由切除如圖四中所示pSUN279.2介於Sfo I及Nru I間之2300個鹼基對之DNA片段，manR 之上游區域及manR 之大部分皆從pSUN279.2中被刪除，結果得到質體pSUN284.1。
於圖六中顯示所得到pSUN284.1之核酸序列。
將枯草芽胞桿菌 3NA以質體pSUN284.1進行轉化，接著依據 上述之方法測定表現效率。該結果呈示於圖五中。由圖五中可見，於枯草芽胞桿菌 3NA中之去除manR 之載體pSUN284.1，相較於於枯草芽胞桿菌 3NA中之pSUN279.2，顯現出僅有大約一半基礎水準之β-半乳糖水解酶活性，而於甘露糖之誘發下載體pSUN284.1甚至顯現出活性較強烈之增加，但於葡萄糖之存在下卻又再度顯現出較強烈之下降。此等結果證明manP 啟動子位於manR 及manP 之間，並顯示出manR 之染色體複製體即足以調控所有於該等低度複製質體上之manP 啟動子複製體。
c)manP 啟動子區域之定位
於進行manP 啟動子區域之定位時，除該經縮短之pSUN284.1之DNA片段外，由該長度為2300個鹼基對之DNA片段經由於manP 啟動子之轉錄起始位置點上游處不同之位置上於如圖六所示之限制酶切割位置上及限制酶之切割下製備進一步縮短之序列片段。
由manP 之轉錄起始位置點上游處往下刪除至鹼基對-81及鹼基對-80產生第二個經刪除之序列，其包含SEQ ID NO.1。另外一刪除係由manP 之轉錄起始位置點上游處往下進行至鹼基對-41及鹼基對-40(第三個經刪除之序列)。
以類似於上述2b)中質體pSUN284.1建構之方式建構含第二個經刪除序列之質體pSUN290及含第三個經刪除序列之質體pSUN297.5，其方法係將由引子對s4802/s5203及引子對s5262/s5203所擴增出之PCR產物分別插入經由限制酶EcoR V及Nhe I切割之pSUN272.1中。
將質體送入枯草芽胞桿菌 3NA中，並依據上文b)中所述之方法進行培養。經一小時之誘發後，依據上文b)中所述之方法測定該等細胞β-半乳糖水解酶之活性。該試驗之結果呈示於圖七中。
如圖七中所示，於含pSUN290及pSUN284.1之菌株當中沒有任何一者於關於甘露糖誘發lacZ 基因方面顯示出顯著之差異性。然而，於包含攜帶第三個經刪除序列之pSUN297.5之枯草芽胞桿菌 3NA中，甘露糖之誘發作用卻完全被消除，且基礎表現水準近乎等於0。由此等結果可得到結論，即manP 甘露糖啟動子區域之ManR結合位置位於由manP 轉錄起始位置點算起之鹼基對-80及鹼基對-35之間。
實驗3：manR 啟動子之測定
a)cre 序列之鑑別
因大多數之CCR係通過代謝產物控制蛋白A(CcpA)居間導引，故利用Clone Manager程式中DNA序列對比功能於整個甘露糖操縱子中進行個別結合位置(cre 序列)之研究。cre 共同序列5’-WWTGNAARCGNWWWCAWW-3’被作為序列對比使用。
只有於manR 之啟動子區域中發現一如圖二及圖三中所示之推測cre 序列，其位於-10框盒之下游處。
本發明之SEQ ID NO.3包含起自鹼基對-122往下至lacZ 基因之起譯密碼子之區域，SEQ ID NO.4包含起自鹼基對-122至鹼基對+7(包含在內)之區域，及本發明之SEQ ID NO.5包含起自於圖三所示之序列之鹼基對-122至鹼基對-1(包含在內)之區域。
b)manR 啟動子表現效率之評估
為評估manR 啟動子表現之效率，依據上文中所示之方式建構一表現載體，如pSUN284.1，並被命名為pSUN291。於建構該載體時，用引子對s5208/s5209及作為模板之線形化質體pSUN279.2擴增一含推測之manR -啟動子及大約600個位於manR 基因上游處之鹼基對DNA片段，並將其於限制酶Kpn I及Afl III之切割及黏接下插進質體pSUN272.1之lacZ 之前端處。
該DNA之序列呈示於圖三中。
將質體pSUN291送入枯草芽胞桿菌 3NA中，並依據上文於實驗2b)中所述之方法測定β-半乳糖水解酶之活性。
該試驗之結果呈示於圖五中。於此，基礎表現水準已經相當高，且於添加0.2%甘露糖後表現又再增加大約3倍。添加葡萄糖造成β-半乳糖水解酶之活性被壓制到幾乎為基礎表現水準。
此結果指出manR 啟動子並非一微弱之結構性啟動子，而係會受甘露糖及CCR之調控。
c)manR 啟動子區域之定位
如於實驗2c)中進行manR DNA序列啟動子區域進一步之定位時，由含藏於pSUN291中之DNA序列經由於manP 啟動子之轉錄起始位置點上游處不同之位置上於如圖三所示之限制酶切割位置上及限制酶之切割下製備不同長度之序列片段。
經由切除如圖三中所示至轉錄起始位置點G上游處往下至鹼基對-100及鹼基對-99產生第一個經刪除之序列。第二個刪除序列係經由切除轉錄起始位置點G上游處往下進行至鹼基對-83及鹼基對-82。
依照實驗2c)之方法，將所得到之第一個及第二個刪除序列接進pSUN272.1中，所生成之質體分別被命名為pSUN384.1及pSUN385.2。
將每種質體送入枯草芽胞桿菌 3NA中，並依據實驗2b)中所述之方法進行培養。經一小時之誘發後，依據實驗2b)中所述之方法測定該等細胞β-半乳糖水解酶之活性。該試驗之結果呈示於圖八中。相較於pSUN291，pSUN384.1於關於甘露糖誘發lacZ 基因方面沒有顯著之差異性。然而，於包含攜帶第二個經刪除序列之pSUN385.2之枯草芽胞桿菌 3NA中，甘露糖之誘發作用卻完全被 消除，且基礎表現水準近乎等於0。由此等結果可得到結論，即manR 啟動子區域之ManR結合位置位於由manR 轉錄起始位置點算起之鹼基對-99及鹼基對-35之間。
II)使用甘露糖操縱子之啟動子區域於高細胞密度之發酵中
實驗4：轉化作用
利用一攜帶本發明啟動子區域之模型宿主於測試其生長及表現之能力。使用依據如圖六中所示如質體pSUN284.1中所介紹及如於實驗2c中所使用之manP 啟動子區域核酸序列建構如下文中所示之質體pMW168.1，並以轉化之方式將其送入作為宿主之枯草芽胞桿菌 3NA中。
a)質體pMW168.1之建構
如實驗2a)中所示，除不以lacZ 而使用eGFP 為報導基因以外，設計一能於枯草芽胞桿菌 及大腸桿菌 中複製之穿梭載體。同時manP 之轉錄起始區域亦以gsiB 基因之轉錄起始區域取代之(Stress protein；Jürgen et al.,supra)。
此外，eGFP 之起譯密碼子及緊跟於該起譯密碼子後面之六個密碼子亦被取代。
所得到之啟動子區域及轉錄起始區域之圖示結構呈示於下文中：
所示者為基因(箭頭)及區域(框盒)之排列，及一些有關限制酶之剪切位置。
大致而言，質體pMW168.1係由下列流程圖中所示之步驟所製得。
於該流程圖中，所使用之載體DNA、插片DNA及互補性寡聚核苷酸之名稱皆如框盒中所示；於PCR產物方面，引子對及模板DNA皆如括號中所示；所使用之限制酶皆示於其各別之位置上。
所有選殖之步驟係以大腸桿菌 JM109所進行。
所使用之質體有pUC 18，其為一陽性篩選及PCR產物之選殖載體，含抗ampicillin之能力(Yanosch-Perron et al.,supra)；pWA21，其為一適用於大腸桿菌 之表現及選殖載體，含抗ampicillin之能力(Wegerer et al.,2008,BMC Biotechnol.8,2)；pSUN202.4，其為一由pUB 110所衍生之載體，具有manP 啟動子區域及抗ampicillin 及kanamycin 之能力，係為適用於大腸桿菌 及枯草芽胞桿菌 之穿梭載體；及pSUN266.1，其為一由pUC 18所衍生之載體，具有介於ter-序列及spc 之間之嵌入位置及含抗ampicillin之能力。
所使用引子對之序列呈示於下表中：
包括起譯密碼子及緊跟於該起譯密碼子後面之密碼子在內之轉錄起始區域之取代係於使用互補性寡聚核苷酸及經由Bgl II、Afl II及BamH I等單一限制酶剪切位置下所進行。該載體之建構起始於以枯草芽胞桿菌 之tufA 轉譯起始區域分別經由互補性寡聚核苷酸s5019及s5020取代載體pWA21(Wegerer et al.,supra)之T7基因10之轉錄起始區域。於進一步之選殖步驟中，該轉錄起始區域又被gsiB 之轉錄起始區域所取代。最後之質體pMW168.1含rep 基因且包括pUB110之ori+在內。
圖九中呈示pMW168.1之質體圖譜。
b)結構安定性之分離及測定
將枯草芽胞桿菌 3NA以質體pMW168.1轉化，然後測定細胞分裂(分離)時質體結構之安定性及質體穩定之增殖。
將經由質體pMW168.1轉化之枯草芽胞桿菌 3NA先於LBSPC -培養基中培養，然後將其轉移至無選擇壓力之LB0 -培養基中進行培養。
培養係於37℃下進行。於指數生長期結束時，將每個培養菌接種至新鮮之LB0 -培養基中。重複此步驟，直到得到100個世代 為止，計算依據所測得之OD值，其係於轉移至新鮮之培養基時依據由Harwood et al.,1990,Molecular Biological Methods For Bacillus,John Wiley & Sons Ltd.所修改之方法所得到。
結果呈示於圖十中。
經大約15個世代後，有超過99.9%之細胞及甚至於經20個世代後有大約90%之細胞仍攜帶此載體。只有自大約第25個世代起，有愈來愈多之細胞流失掉此載體。
於測定質體結構安定性時，由20個經15個世代之菌落中分離質體。從每個分離得到之質體取大約0.5微克與從作為對照組之大腸桿菌 所分離得到之pMW168.1利用瓊脂凝膠電泳進行比較。結果於質體與對照組之電泳中並未觀察到有差異性之存在，顯示無出現結構上之變異。
此等結果顯示質體pMW168.1不僅於結構上具有高度之安定性，且亦具有穩定之分離，其係為發酵中所需要。
實驗5：發酵
將經由含eGFP 報導基因之質體pMW168.1所轉化之枯草芽胞桿菌 3NA進行六輪發酵，其中，實施不同之誘發制度，並於線上以觀察到eGFP 螢光訊號之方式進行監測。
所使用之發酵培養基係已知使用於大腸桿菌 高細胞密度發酵之培養基，如於Wilms et al.,2001,Biotechnol.Bioeng.73,95-103中所揭露，及如下文中所示。
材料及方法
大致上，使用亦適用於發酵實驗之標準分子技術，若無其他之說明時。
光密度
使用Amersham Bioscience公司之Ultrospec 1100pro型之分 光光度計，依據製造商所提供之使用方法於600nm下進行測量光密度(OD)。
乾燥生物質量濃度之測定
使用Ohaus公司之MB 835 Halogen型之濕度測量計測量乾燥生物質量之濃度Cx 。
以分光光度計測量螢光
以TECAN公司之GENios型多功能判讀機分析eGFP之表現及螢光，其中，使用判讀機軟體X Fluor 4(version V4.11)，其具有下列之測量參數：
發酵槽中之線上螢光測量
於發酵進行期間，應用螢光探針(Micropack HPX-2000,High Power Xenon Lightsource of Ocean Optics,Inc.；S2000 fiber optic spectrometer)線上監測eGFP之表現。
測量參數呈示如下：激發過濾片485nm，發射過濾片535nm，過濾片0.6)。使用Ocean Optics SpectraSuite軟體作為數據之記錄及儲存。
螢光係以相對螢光單位(RFU)表示。於取得4.000RFU前不久之時間，將積分時間由50毫秒改成25毫秒，然後再改成10毫秒。於此等情形中，測量值分別增加2及5倍。
預培養菌之培養
將一顆菌落置於一LB瓊脂平板培養基上，並於5毫升含0.02 %(重量/體積)之酪蛋白胺基酸(CA)及抗生素之Spizizen基礎培養基(SMM)中隔夜培養。將1毫升之隔夜培養物添加至20毫升含0.02%(重量/體積)之酪蛋白胺基酸(CA)及抗生素之SMM中，並於37℃下於一250毫升之錐形瓶中培養5至6小時(預培養菌1)。
將10毫升之預培養菌1添加至200毫升含每公升5公克葡萄糖之批次培養基中，並於37℃下於一1公升之錐形瓶中培養至8小時(預培養菌2)。於接種至發酵槽時，使用OD600 介於1.2至2.2之預培養菌2。
發酵
大致上，發酵係依據Wilms et al.,2001,Biotechnol.Bioeng.73,95-103之原理下進行。
當作為碳源之葡萄糖完全被用盡時，批次模式即立刻被轉換成饋料模式。
經由於饋料批次階段中以指數方式添加饋料溶液下，可得一固定之生長速率為μ=0.10h-1 ，同時避免代謝產物經由葡萄糖之壓制，因葡萄糖被細胞直接消耗掉。
蛋白質分析
所收集到細胞之粗蛋白萃取物係經由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳方法所分析，其中，聚丙烯醯胺凝膠含3%之上層凝膠及12%之分離凝膠，其等之組成如下：
此處使用Biometra公司之雙迷你凝膠鑄膠槽鑄造凝膠。
於進行蛋白質變性時，將12微升之蛋白質混合物與3微升之5 x SDS-應用緩衝溶液混合，並於95℃下於一Eppendorf公司之Thermomixer(加熱混合器)中醞釀反應5分鐘。經冷卻至室溫後，將樣本以離心方式分離，並將其全部放置於凝膠上。
於上層凝膠中進行分離時，所使用之電流為10毫安培，並於溴酚(bromophenol)之前端抵達上層凝膠後將電流增加至20毫安培。於分離時所使用者有1 x SDS-電泳緩衝溶液及Roth公司之長度標準品ROTI®-Mark。當溴酚之前端完全離開膠體後，電泳即告結束。為偵測不同之蛋白質色帶，將凝膠及Coomassie染劑溶液於室溫下醞釀反應30分鐘，接著再以脫色溶液於室溫下繼續處理30分鐘。為將殘留之淡藍色背景從凝膠中去除，將凝膠置入7.5%之醋酸中醞釀數小時。
緩衝溶液之組成及染劑溶液及脫色溶液之組成如下所示：
其中，TRIS係為三(羥甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)amino-methane)；SDS係為十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate)；APS係為過硫酸銨(ammonium persulfate)；TEMED係為N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine)；EDTA係為乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)。
基因表現之誘發
於誘發基因表現時，有數種添加誘發劑溶液之方式(誘發制度)被進行評估：
1.於一特定之時間點添加單一份量(衝擊性誘發)
2.衝擊性誘發結合另外一次經一段時間間隔之誘發，其中，- 該額外之添加係以固定之速率逐步增加用量或- 該額外之添加係以指數增加速率之方式進行，3.當達到一特定之細胞密度後開始添加誘發劑溶液。
分別以2M之氫氧化鈉水溶液及1M之氫氯酸水溶液調整pH值。於瓊膠平板培養基，另外再添加BD公司之Euroagar15公克/公升。所有培養基皆於121℃下以滅菌釜滅菌大約30分鐘。
發酵第1輪：衝擊性誘發
發酵第1輪係於一30公升之反應槽(Bioengineering之D598及D596)內進行。批次體積為8公升。由於取決於OD600 ，故接種200至400毫升之預培養菌2以將起始之OD600 調整至0.1。
於進行批次培養階段，溫度為30℃隔夜，並於經過12小時後，將溫度增加至37℃。於整個發酵階段中，加入24%(體積/體積)氨水將pH值調整至大約7.0。通氣率可上調至30公升/分鐘。於批次培養階段開始進行時，通氣率為10公升/分鐘。
饋料培養基I及II之組成被呈示於下表3中。
培養基I及II係按其等之與總體積之比例，亦即係4.2：1.0(相對應於總饋料F中有80.8%之培養基I及19.2%之培養基II)被添加。
於饋料批次階段開始時之誘發時，0.2%(重量/體積)之D-甘露糖係以一次性份量之方式被添加。
圖十一a及圖十一b中分別顯示乾燥生物質量之濃度及受監測之螢光訊號。
於該圖中，乾燥生物質量之濃度Cx 係以對數之方式與培養時間繪製對應點。批次培養階段及饋料批次培養階段係以垂直線做分隔。
於535nm發射波長所監測得之螢光訊號與培養時間繪製對應點。箭號表示誘發點。
由圖十一a，得到之結果為最大之乾燥生物質量(DM)濃度為82.75公克之DM/公升，其相對應於大約970公克之DM，以11.7公升之反應體積計算。
於總共71.5公克之誘發劑中，D-甘露糖於第1次添加中被消耗掉16公克。
於整個饋料批次培養階段中，比生長率μ為0.10小時-1 。
如圖十一b中所示，螢光訊號於第一次添加D-甘露糖後強烈增加，並於該饋料批次培養階段之前五個小時達到一大約為2,200RFU之最大值。然後，該訊號便持續下降。吾人假設此種表現之 降低係因誘發劑被消耗及/或係因增加細胞量後所造成之遮蔽效應。於37小時後加入另外一次之0.5%(重量/體積)之甘露糖造成螢光訊號又一次新的增加，其達到2,100RFU之數值。
發酵第2輪：固定速率之合併式誘發
重複如第1輪中相同之程序，除添加誘發劑之方式經改變外。如於第1輪中，0.2%(重量/體積)之D-甘露糖溶液係於饋料批次培養階段之起始時間點以一次性之份量之方式被添加。而第二部份之誘發劑則係於RFU達到第1輪螢光訊號曲線之轉折點，1,500，時立即開始進行添加。
於進行第二個添加步驟時，20%(重量/體積)之甘露糖溶液係以固定之速率被添加，其逐步增加數量，平均速率為0.39公克/分鐘，直到所有第二部份被添加完畢為止。
於圖十二a及圖十二b中呈示結果，其顯示乾燥生物質量濃度及螢光訊號曲線，誘發方式與圖十一a及圖十一b中相同。於圖十二b中以箭頭示出添加第一個部份之時間點及添加第二個部份之開始及結束之時間點。
由圖十二a之結果可見，最大之乾燥生物質量濃度為67.6公克之DM/公升，其相對應於大約804公克之DM，以11.9公升之反應體積計算。總共(第一次及第二次添加)有70公克之D-甘露糖被添加。
相較於第1輪，生物質量之產率減少17%。此與於進行饋料批次培養階段時較低之比生長率，μ=0.09小時-1 有關，而比生長率於進行批次培養階段時為0.43小時-1 。
由圖十二b之結果可見，於25小時後達到大約4,900RFU之最大螢光訊號，然後持續下降至大約2500RFU。
相較於第1輪，於第2輪中表現率可增強120%，其中生物質 量之濃度微微下降。
發酵第3及第4輪：指數速率之合併式誘發
於第3及第4輪中使用一3.7公升之小型實驗室發酵槽(Bioengineering公司之小型實驗室發酵槽)。批次體積(批次培養基加上接種液)總共為1.5公升。由於取決於OD600 ，故接種100至200毫升之預培養菌2以將起始之OD600 調整至0.1。於批次培養及饋料批次培養二階段中之溫度為37℃。於進行發酵時，以24%(體積/體積)之氨水將pH值調整至7.0。於發酵期間，將通氣率固定於2公升/分鐘。氧氣之輸入係由攪拌器之旋轉速度做調整。發酵之壓力於開始時為1.3巴，然後被增加至1.5巴以增強所需要氧氣之輸入。當碳源，葡萄糖，完全被消耗完畢後，批次培養操作被轉換成饋料批次培養操作。
不像第2輪，於第3及第4輪中，誘發劑係以指數方式增加之速率被添加。此外，含葡萄糖之培養基I與含誘發劑之培養基II一同被添加。饋料培養基I與II之組成如下表4中所示：
所有饋料培養基I及II之組成份皆分開被滅菌釜所滅菌。
因組成份溶解度之關係，二種培養基之pH值皆以85%(體積/體積)之磷酸調整至3.3。
於時間t之總饋料係由下列之公式所計算： 其中m=維持係數．(0.04公克公克-1 小時-1 )
Yx/s =生物質量相關於受質之比產率係數(葡萄糖為0.5)
Cx0 =於饋料批次培養階段開始進行時之生物質量濃度
V0 =於饋料批次培養階段開始進行時之反應槽體積(=批次體積)
Cs0 =於饋料溶液中之葡萄糖濃度
於計算時，假設D-甘露糖以可比較之葡萄糖產率係數YX/S 被枯草芽胞桿菌 所消耗。
於小型實驗室發酵槽(KLF)中，培養基I及II可分開被供應，並且可改變其組成之比例。
a)第3輪發酵
於圖十三a及圖十三b中顯示生物質量濃度及受監測之螢光訊號，該等圖示之誘發方式與第1輪中相同。
於饋料批次培養階段開始進行時，加入一份量之0.2%(重量/體積)之甘露糖溶液(總共16公克甘露糖)，且培養基I與II以指數方式之饋料係以50：50(間隔I)之比例開始。當斜率下降時，含甘露糖之培養基II之份量被增加至60%且總饋料F(培養基I及II)被增加至125%以維持以葡萄糖為主之生長(間隔II)。經2小時後，再度被監測到斜率下降，並將培養基II之份量增加至66.6%且同時將總饋料F增加至150%(間隔III)。當全部培養基II被消耗完畢後，發酵持續以提供培養基I之方式進行，其中培養基I之總饋料比例為100%(圖十中未顯示)。
於下列表5中總結第3輪之進度及數據：
總共添加50公克之甘露糖。
分別各於第12小時、第20小時及第24小時取樣進行SDS凝膠上之表現分析，其係依據總共10OD600 之細胞之可溶性蛋白質組成部份。
所得到SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳之結果顯示如下：
自左邊起顯示：(M)長度標準品(ROTI® -Mark)，(1)於12小時後，未經誘發；(2)於20小時後，經8小時之誘發；(3)於24小時後，經12小時之誘發。
於20及24小時後，清楚之色帶出現於大約27kDa處，其顯示有eGFP之表現(箭頭所指)。
b)第4輪發酵
重複如第3輪中相同之程序，除培養基II(甘露糖)饋料體積被增加至總共1.0公升以外。
於圖十四a及圖十二b中顯示生物原料濃度及螢光訊號，其中誘發方式與第1輪中相同。
進度及數據總結於下列表6中：
總共添加200公克之甘露糖。
為補償於發酵大約15小時後所觀察到氮之缺口，故額外以固定之速率添加磷酸氫二銨。
於間隔II中達到最大之RFU值，10000，其然後於間隔II之過程中降至7800RFU。
a)第5及第6輪之發酵：無衝擊性之誘發
二者發酵反應皆於一30公升之發酵槽中進行。
於此二輪中，以葡萄糖指數增加饋料速率使細胞生長至高細胞密度，其中，該饋料速率於達到高細胞密度時被置換成固定供應甘露糖。
所使用之饋料培養基I、II及III顯示於下表7中：
第5輪之發酵
培養基I及II係按其等與總體積之比例，亦即係以4.2：1.0， 依指數方式增加速率之方式被添加。當達到高細胞密度時，由培養基I與II組成之饋料即被由培養基II與III以比例為20：80所組成之饋料以固定之體積，其相對應於先前培養基I與II之最後指數饋料速率之體積，所取代。
於圖十五中顯示螢光訊號，其中誘發方式與第1輪中相同。
吾人假設於大約17小時之發酵後於圖十五中所出現之螢光訊號最小增加係因為短時間缺少培養基III之緣故。
第5輪之進度及數據總結於下列表8中：
b)第6輪之發酵
重複如第5輪中相同之程序，除添加總共600公克之甘露糖，並於達到高細胞密度時以固定之速率添加由培養基II與III所組成之饋料前以0.2%(重量/體積)之甘露糖溶液(總共16公克甘露糖)進行衝擊性之誘發以外。
於圖十六中顯示螢光訊號，其中誘發方式與第1輪中相同。
第6輪之進度及數據總結於下列表9中：
第1輪至第6輪之評估
有關最大螢光時之評估，乾燥生物質量濃度CX 、反應槽體積VR 、所消耗之甘露糖及從誘發開始所經之時間等項目被加以測定並被總結於下表10中：
依據於表10中所顯示每一輪之製程數據，計算出有關每公升及小時最大之螢光RFU之生產率。此外，表現速率係由相對螢光所表示，其係由依據絕對生物質量(公克DM)及誘發劑之濃度(公克甘露糖/公升)之最大螢光所計算得到。
結果顯示於下表11中：
此等結果清楚顯示使用攜帶甘露糖啟動子之質體之本發明可成功地被使用於高細胞密度之發酵製程，且表現可藉由添加誘發劑，D-甘露糖，進行正向之調控。
此外，藉由誘發制度，可依據需求將發酵之重點改變成使分別於生物質量、表現產物之產出及誘發劑之消耗上達到最大。
就經變得更容易之下游製造工程而言，具合併衝擊性誘發及根據第3輪之指數饋料之誘發劑制度係特別有利。
此處，所產生相對於生物質量之高度表現產物使得進一步之處理程序，如純化步驟等，會更加有效率，並且於時間及金錢上會比較節省。
 圖示簡要說明
於圖一 中係顯示枯草芽胞桿菌 之核酸序列，其被使用於繪製甘露糖傳輸蛋白(manP )啟動子之轉錄起始位置點，並突顯轉錄起始點位於一腺嘌呤核苷酸上，用斜體字表示經推定之-35及-10之框盒，甘露糖受體(manR )基因之尾端及溶葡萄球菌酶(lys )基因之起始端係由箭頭標記所標示，限制酶Bgl II、Xba I、Afl II及Nde I之剪切位置被標示於序列之下方；於圖二 中係顯示該啟動子之核酸序列，其包含甘露糖受體(manR )基因之啟動子，並突顯轉錄起始點位於一鳥糞嘌呤核苷酸上，用斜體字表示經推定之-35及-10之框盒，甘露糖受體(manR )基因之起始端係由一箭頭標記所標示，且限制酶Hind III之剪切位置及推測之cre 序列被標示於該序列之下方；於圖三 中係顯示由枯草芽胞桿菌 所取得之核酸序列，其包含甘露糖受體(manR )基因啟動子之啟動子區域，分別被包含於pSUN291、pSUN384.1及pSUN385.2之中，lacZ 基因之起始點係由一箭頭標記所標示，且限制酶之剪切位置被標示於序列之下方；於圖四 中係顯示根據本發明之表現載體pSUN 279.2之質體圖譜；於圖五 中係顯示枯草芽胞桿菌 3NA之β-半乳糖水解酶之活性，其中，該菌株中分別含根據本發明之pSUN 279.2、pSUN 284.1 及pSUN 291之質體；於圖六 中係顯示由枯草芽胞桿菌 所取得之核酸序列，其包含枯草芽胞桿菌 之甘露糖傳輸蛋白(manP )基因啟動子之啟動子區域，包括甘露糖受體(manR )之C(羧基)-端，介於甘露糖受體(manR )基因及甘露糖傳輸蛋白(manP )基因之間之基因間隔區域，此處被一報導基因lacZ 所取代，轉錄起始位置點，-35及-10框盒由粗體字標示，manR 基因之尾端及lacZ 基因之起始點係由一箭頭標記所標示，且限制酶之剪切位置被標示於序列之下方；於圖七 中係顯示枯草芽胞桿菌 3NA之β-半乳糖水解酶之活性，其中，該菌株中含質體pSUN 279.2及其他質體，其等含於圖六中所示不同長度之核酸序列之片段；於圖八 中係顯示枯草芽胞桿菌 3NA之β-半乳糖水解酶之活性，其中，該菌株中含pSUN 291、pSUN 384.1及pSUN345.2之載體，其等具有如圖三中所示之核酸序列；於圖九 中係顯示根據本發明之表現載體pMW 168.1之質體圖譜；於圖十 中係顯示pMW 168.1於枯草芽胞桿菌 3NA中質體安定性試驗之結果所繪製之曲線圖，其中，該圖係由含質體之細胞百分比部份對應世代代數之對應點繪製而成；於圖十一至圖十四 中係顯示數個曲線圖，其等以對數方式顯示乾燥之生物質量濃度對應發酵第1輪至第4輪之進行時間對應點繪製而成之曲線圖，其中，該圖係由螢光訊號(RFU)對應發酵第1輪至第4輪發酵時間之對應點繪製而成；及於圖十五及圖十六 中係顯示由螢光訊號對應發酵第5輪及第6輪發酵時間之對應點繪製而成之曲線圖。
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Claims (22)

  1. 一種載體，其可於一原核之宿主細胞中進行表現，該載體包含枯草芽胞桿菌 甘露糖操縱子之一可經由甘露糖誘發之啟動子，其可經由剪接之操作方式與一轉錄單元相連接，該單元包含一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，其中，該可經由甘露糖誘發之啟動子係選自manP 啟動子及manR 段動子。
  2. 根據申請專利範圍第1項之載體，其中該載體含該調節性基因manR 完整或部份之序列。
  3. 根據申請專利範圍第1項或第2項之載體，其中該manP 啟動子包含一由SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、或一與該等序列互補之序列所選出之序列。
  4. 根據申請專利範圍第1項或第2項之載體，其中該manR 啟動子包含一由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5、一與該等序列互補之序列所選出之序列。
  5. 根據申請專利範圍第1項或第2項之載體，其中該載體含該異源性核酸序列之上游，一代謝產物之反應元件。
  6. 根據申請專利範圍第1項或第2項之載體，其中該載體含一轉錄終止序列，其位於該異源性核酸序列之下游。
  7. 根據申請專利範圍第8項之載體，其中該轉錄終止序列係源自枯草芽胞桿菌tufA 基因3’-端之區域。
  8. 根據申請專利範圍第1項或第2項之載體，其中該載體係為一可於大腸桿菌 及枯草芽胞桿菌 中複製之穿梭載體。
  9. 根據申請專利範圍第1項或第2項之載體，其中該載體包含質體pUC18之複製原點及/或pBS72之複製單元或rep 基因，加上質體pUB110之複製原點。
  10. 根據申請專利範圍第1項或第2項之載體，其中該異源性核酸 序列編有一抗體或其一片段之密碼。
  11. 根據申請專利範圍第1項或第2項之載體，其中manP 基因或manR 基因之轉錄起始區域被另外基因之轉錄起始區域所取代。
  12. 根據申請專利範圍第11項之載體，其中manP 基因或manR 基因之轉錄起始區域被tufA 基因或gsiB 基因之轉錄起始區域所取代。
  13. 一種經分離及純化之枯草芽胞桿菌 甘露糖操縱子之一可經由甘露糖誘發之啟動子之核酸序列，或該等序列互補之序列，其中，該可經由甘露糖誘發之啟動子係選自manP啟動子及manR啟動子。
  14. 根據申請專利範圍第13項之經分離及純化之核酸序列，其中該序列包含從SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.5中任一序列，或該等序列互補之序列。
  15. 一種經由根據申請專利範圍第1項或第2項之載體所轉化之原核宿主細胞。
  16. 一種根據申請專利範圍第13項或第14項之核酸序列所轉化之原核宿主細胞。
  17. 根據申請專利範圍第15項或第16項之原核宿主細胞，其中該原核宿主細胞係受碳代謝產物抑制所支配，且包含一磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統。
  18. 根據申請專利範圍第15項或第16項之原核宿主細胞，其中該原核宿主細胞係呈革藍氏陽性。
  19. 根據申請專利範圍第15或第16項之原核宿主細胞，其中該宿主細胞係屬於厚壁菌門。
  20. 一種用於在原核宿主細胞中製造多胜肽之方法，該方法包含下 列之步驟：根據申請專利範圍第1項至第12項中任一項建立一載體，將所述之載體使一原核宿主細胞轉化，藉由將經轉化之宿主細胞置入一細胞培養基中並於適當之條件下生長之方式使所述之多胜肽被表現，由該細胞或細胞之培養液中回收此多胜肽。
  21. 根據申請專利範圍第20項之方法，其中首先使該等宿主細胞於一不同於誘發劑之碳源之存在下生長，然後於第二步驟中再於誘發劑之存在下生長，其中，該誘發劑為根據申請專利範圍第1項或第2項所述載體之manP啟動子及manR啟動子之誘發劑，及其中，該不同於誘發劑之碳源非根據申請專利範圍第1項或第2項所述載體之manP啟動子及manR啟動子之誘發碳源。
  22. 一種根據申請專利範圍第1項至第12項中任一項之載體或根據申請專利範圍第13項至19項中任一項之經分離及純化之核酸序列之用途，其於一原核宿主細胞中調控一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列之表現。
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