CN101193906A

CN101193906A - 细菌宿主细胞中甘露糖醇诱导的启动子系统

Info

Publication number: CN101193906A
Application number: CNA2006800201108A
Authority: CN
Inventors: J·C·施耐德; B·罗斯内
Original assignee: Dow Global Technologies LLC
Current assignee: Peliken Technology Holdings Ltd
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-06-06
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2026-06-06
Also published as: WO2006133210A2; CA2610405C; US7476532B2; MX2007015355A; WO2006133210A3; AU2006255060A1; EP1888763B1; US20090162899A1; US8017355B2; US20060292671A1; BRPI0611112A2; CN101193906B; JP5176114B2; KR20080018937A; EP1888763A4; KR101304921B1; EP1888763A2; AU2006255060B2; PL1888763T3; JP2008545436A

Abstract

本发明提供了在细菌宿主中产生重组肽的方法，所述方法使用了甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或甘油诱导型启动子，其中产生肽的宿主细菌细胞已经被变得不能降解或代谢甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、或其衍生物或类似物。本发明提供了已经被基因工程改变，从而能抑制甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、或其其衍生物或类似物的代谢或降解的细菌细胞。本发明使用甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或甘油作用于诱导型启动子，以诱导靶多肽的表达，从而允许在发酵过程中使用廉价且稳定的碳源诱导物，用于产生重组肽。

Description

细菌宿主细胞中甘露糖醇诱导的启动子系统

相关申请的交叉文献

本申请要求于2005年6月6日提交的美国临时专利申请No.60/687,763的优先权。

技术领域

本发明涉及重组肽产生领域。尤其是，本发明提供了重组肽的改进的产生过程，所述方法使用了甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，其中从启动子表达肽的宿主细胞已经被改变，没有代谢或降解用于诱导启动子的甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇的能力。此外，本发明提供了改进的细菌宿主细胞，用于产生重组肽，其中细菌细胞已经被改变，没有代谢或降解甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其类似物或衍生物的能力。

背景技术

使用细菌细胞产生重组肽在商业上越来越重要。开发细菌表达系统的目的之一是快速、有效且大量地产生高质量的靶多肽。用于该表达系统的理想的宿主细胞能有效地使用碳源生长，有效地产生靶多肽，在发酵反应中快速地生长到高细胞密度，当被诱导时仅仅表达靶多肽，并且允许以廉价且有效的方式诱导靶多肽。

产生理想宿主细胞的一个问题是克服发酵过程中靶多肽的低效且低水平的产生。控制靶肽的表达，直到达到最优的宿主细胞密度和发酵条件，允许更有效且更大量地产生多肽。这样做的原因是多重的，包括更有效的使用碳源，和降低宿主细胞的扩大的代谢压力。

在发酵过程中控制靶多肽表达的一种方式包括使用可诱导型的或可调节的启动子，以控制肽的表达。启动子是调节核酸序列，通常位于期望的肽编码序列的上游，指导核酸的转录。启动子通常分为组成型启动子或可调型启动子。可调型启动子包括：(1)可激活的启动子，这些启动子是没有活性的，直到激活子肽结合到5’调节区上；和(2)可阻抑型启动子，当5’调节区通过阻抑肽结合时，这些启动子是没有活性的。这些基因或操纵子通过不止一种机理调节。

可诱导型或可调型启动子是以有效方式产生高水平重组肽的一个主要成分，因为这样的可调节启动子允许细胞密度在诱导肽产生之前达到最佳水平。理想启动子的特性可包括：紧密阻抑，这样就会在生长阶段产生很少的靶肽或者不产生靶肽；加入诱导物之后的强启动子活性；低诱导成本；诱导物在细胞培养基中的稳定性，这样在发酵过程的肽累积阶段，仅需要添加一次诱导物；启动子诱导物通过细胞膜的简便途径，这样诱导物的外部浓度与细胞内部的内部浓度直接相关，并且与肽产生线性相关；以及能与其它启动子串联使用的能力。该理想的启动子允许重组肽有效地且廉价地以高水平被诱导。

已经发现在产生重组肽的细菌发酵过程中广泛使用的一种可调节启动子是Iac启动子，及其衍生物，尤其是tac和trc启动子。在使用Iac型启动子的商业发酵系统中，诱导物异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)几乎被普遍使用。然而，IPTG很昂贵，而且必须小心地控制，这是因为它对生物系统有显著毒性。目前，标准的IPTG制剂能以大约18美元/克或大约125美元/10克的价格获得。此外，标准IPTG制剂可能含有二恶烷，这是一种毒素。可以在市场上获得不含二恶烷的IPTG，但成本是标准IPTG价格的两倍。进一步，在发酵中，或者在从发酵纯化的蛋白质中存在IPTG，会引起环境和健康调节问题，这对人类、动物和其它生物微生物产生了IPTG毒性危险。

由于与IPTG相关的毒性和成本，可选的可诱导型的启动子系统已经被建议用于细菌发酵过程，产生重组肽。例如，高温诱导的启动子，如λP_R和λP_L，色氨酸饥饿如trp，1-阿拉伯糖如araBAD，磷酸盐饥饿如phoA，萘啶酮酸如tetA，渗透摩尔浓度如proU，葡萄糖饥饿如cst-1，四环素如tetA，pH如cadA，厌氧条件如nar，T4感染如T4 gene32，烷基-或卤代-苯甲酸盐如Pm，烷基-或卤代-甲苯如Pu，水杨酸盐如Psal，和氧如VHb，都已经鉴定为IPTG可诱导型启动子的备选物。例如，参见Makrides，S.C.(1996)Microbiol.Rev.60，512-538；Hannig G.&Makrides，S.C.(1998)TIBTECH 16，54-60；Stevens，R.C.(2000)Structures 8，R177-R185；J.Sanchez-Romero&V.De Lorenzo，GeneticEngineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts forIndustrial and Environmental Processes，in Manual of IndustrialMicrobiology and Biotechnology(A.Demain&J.Davies，eds.)pp.460-74(1999)(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer，Vectors toexpress foreign genes and techniques to monitor gene expression forPseudomonads，Current Opinion in Biotechnology，12：439-445(2001)；和R.Slater&R.Williams，The Expression of Foreign DNA in Bacteria，inMolecular Biology and Biotechnology(J.Walker&R.Rapley，eds.)pp.125-54(2000)(The Royal Society of Chemistry，Cambridge，UK)。这些类型的启动子存在几个问题。例如：高温诱导可能对细胞有害，并且由于设备限制对大规模发酵不实用；氧操纵可能影响发酵的细胞生长密度方面的整个动力学，从而降低了理想的条件；使用甲苯或类似类型的潜在有毒性的化学物品可能要求进一步的纯化，以确保最终产品中不存在这些化合物；以及pH可能影响相关肽在宿主中正确地折叠的效率或者被溶解，从而使得纯化的成本更高且更加困难。

在细菌发酵过程中使用可通过廉价且无毒性的碳源诱导的启动子仍然有吸引力。该启动子的一个潜在优势是，细菌宿主可能具有有效地摄取诱导物的内源机理。可用作诱导物的潜在碳源包括麦芽糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、蔗糖、甘油、甘露糖、醋酸盐和乳糖。其它潜在的碳源诱导物包括醇形式的碳糖，如甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇。

甘露糖醇作为潜在的诱导物

甘露糖醇是甘露糖的醇形式，是许多细菌，包括假单胞菌的廉价碳源。该操纵子涉及甘露糖醇在荧光假单胞菌(P.fluorescens)中的摄取和降解，具有七个基因，这七个基因中的四个基因(mtlEFGK)编码甘露糖醇/葡萄糖醇/阿拉伯糖醇摄取和转运中涉及的蛋白质，这七个基因中的三个基因(mtlDYZ)编码甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇的分解代谢中涉及的蛋白质。参见Brunker等人的(1998)“Structureand function of the genes involved in mannitol，arabitol，and glucitolutilization from Pseudomonas fluorescens DSM50106，”Gene 206(1)：117-126和图1。

Brunker等人已经进一步鉴定了一个序列，该序列与大肠杆菌σ70启动子的共有序列相似，为90bp，在荧光假单胞菌DSM50106操纵子mtlE的第一个基因的起始密码子上游。参见图2。含有该推定启动子的660bp片段被克隆在荧光素酶基因的上游，鉴于该启动子，就会赋予大肠杆菌甘露糖醇诱导型表达。阿拉伯糖醇诱导基因的表达至相同水平，葡萄糖醇诱导表达至最高水平的一半。

然而，碳源可诱导型启动子的益处不是没有其局限性的。与使用碳源可诱导型启动子相关的一个潜在问题是，宿主细胞代谢诱导物且降低诱导物效率的能力，或者要求在诱导过程中不断地添加宿主细胞至培养基中。此外，诱导物可能危及发酵工艺的碳源使用参数，并且恒定的诱导物流量(flux)可能导致低于期望的肽生产收率。诱导过程中不断地添加诱导物至培养基中的要求进一步的缺点在于，增加了发酵工艺的成本。

发明内容

本发明提供了细菌细胞，和用于在细菌宿主中产生重组肽的方法，该方法使用了甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，该启动子可操作地连接在编码靶多肽的核酸上。在一个实施方案中，细菌宿主细胞可用作表达系统。在一些实施方案中，细胞已经被改变，不能降解或者代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇。由于细菌细胞缺乏代谢或降解碳源的能力，所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物，所以这些碳源可用于诱导多肽的表达，其中编码多肽的核酸可操作地附着在甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子上，没有宿主细胞连续代谢或者降解的诱导物。因此，该诱导物在发酵过程中能提供连续且稳定的诱导水平，不要求在培养基中加入额外的诱导物。

在一些实施方案中，提供了包括核酸构建物的细菌细胞，该核酸构建物包括甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，其可操作地连接在编码相关肽的核酸序列上。可选择地，一个实施方案包括含有一种核酸构建物或多种核酸构建物的细菌细胞，该构建物包括不止一个甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子，所述启动子可操作地连接到相关的相同或不同的一种肽或多种肽上。在其它实施方案中，至少一个启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子，并且表达相关的重组肽的细菌细胞已经被遗传操纵，以抑制甘露糖醇的降解或者代谢。可选地，启动子能通过甘油以及甘露糖醇诱导，并且表达相关的重组肽的细菌细胞已经被遗传操纵，以抑制甘露糖醇的降解或者代谢。

本发明中使用的启动子能通过碳源糖、醇或其衍生物诱导。典型地，启动子能通过甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇诱导。可选地，启动子也能通过甘油诱导。在一些实施方案中，启动子可以是甘露糖醇可诱导型的启动子。在其它实施方案中，启动子包括内源细菌甘露糖醇操纵子的推定启动子，是通过甘露糖醇衍生物或类似物诱导的。在其它实施方案中，甘露糖醇启动子能通过选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇、甘油、或其衍生物或类似物的碳源诱导。

在其它的实施方案中，启动子包括荧光假单胞菌mtlEFGKDYZ操纵子的推定启动子。然而在进一步的实施方案中，启动子进一步包括核酸序列，其作为mtl激活蛋白(MtlR)结合区域。在一些实施方案中，启动子的核酸序列选自Seq.ID.Nos 1-13。在一个实施方案中，启动子的核酸序列包括Seq.ID.No.9或Seq.ID.No.12。在一个实施方案中，核酸序列包括荧光假单胞菌MB101 mtlE基因上游的至少299个连续核苷酸。在其它的实施方案中，启动子是与荧光假单胞菌mtlEFGKDYZ操纵子的推定启动子的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。其它实施方案包括，其中启动子是与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，启动子是与选自Seq.ID.Nos.9或12的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，启动子是与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或者与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列杂交的核酸序列。在一个实施方案中，启动子是与选自Seq.ID.Nos.9或12的核酸序列杂交的核苷酸序列，或者与选自Seq.ID.Nos.9和12的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，杂交在高度严谨性条件下进行。

本发明的实施方案也包括细菌细胞，这些细菌细胞已经被改变，不能代谢或降解作为表达系统的、用于相关重组肽的碳源。碳源可选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物。在一些实施方案中，突变是通过至少一个编码酶的基因的突变或者缺失进行的外源基因操纵的结果，所述酶是用作诱导物的碳源的代谢或者降解所需要的。在其它实施方案中，突变的或缺失的一个(或多个)基因是编码甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇或其衍生物或类似物的代谢或者降解中所需要的一种(或多种)基因。在另一个实施方案中，突变的或缺失的一个(或多个)基因是甘露糖醇或其衍生物或类似物的代谢中所需要的一种(或多种)基因。在进一步的实施方案中，基因选自mtl操纵子。例如，突变的或缺失的基因可选自mtlD、mtlY或mtlZ。在一个备选的实施方案中，突变或缺失包括mtlD、mtlY和mtlZ(mtlDYZ)中的至少两种的组合。在一个实施方案中，细胞包括至少mtlD的突变或缺失。在其它实施方案中，细胞包括mtlD、mtlY和mtlZ(mtlDYZ)中的每一个的突变或缺失。

在一些实施方案中，细菌细胞或者表达系统选自能表达核酸的任何细菌细胞，所述核酸可操作地连接到碳源可诱导型的启动子上。在一个实施方案中，细菌细胞选自假单胞菌及其密切相关的细菌。在一个实施方案中，细菌细胞是假单胞菌属。在某些实施方案中，细菌细胞是荧光假单胞菌。在其它实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌。

本发明的实施方案也提供了用于在细菌宿主细胞中产生重组肽的方法，该方法使用了碳源可诱导型的启动子。其它实施方案提供了在大规模细菌发酵过程中使用的备选启动子，它们由低成本的碳源化合物诱导。本发明的其它实施方案提供了改进的细菌宿主细胞，用于从碳源诱导的启动子表达重组蛋白质。

本发明进一步提供了用于产生重组肽的方法，所述方法包括：提供已经被变得不能降解或者代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物的细菌细胞；用至少一种核酸构建物转化细胞，所述构建物包括至少一种核酸，该核酸编码至少一个可操作地连接在至少一个碳源可诱导型的启动子上的相关的肽，其中诱导物选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇、甘油或其衍生物或类似物；以及在促进肽表达的条件下培养细胞。在某些实施方案中，相关肽的表达以与诱导物浓度直接相关线性方式被控制。在一些实施方案中，至少一个启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子，诱导物是甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、甘油或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，至少一个启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子，诱导物是甘油或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，至少一个启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子，其中细菌细胞已经被变得不能代谢或者降解甘露糖醇，诱导物是甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、甘油或其衍生物或类似物。

在其它实施方案中，本发明提供了编码肽的核酸的表达，所述核酸可操作地连接在启动子上，启动子由甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇或甘油、或其类似物诱导，与其它可诱导型的启动子一起在细菌细胞中使用，该细菌细胞已经被改变，缺乏降解或代谢甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇或其类似物或衍生物的能力。在其它实施方案中，其它可诱导型的启动子可操作地与甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子串联连接在一起。在其它实施方案中，启动子之间彼此独立，且可操作地连接到编码相关肽的独立的核酸上。本发明的其它实施方案包括使用多个启动子，包括至少一个甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，其中启动子是彼此独立的，且可操作地连接到编码相关的不同肽的核酸上。在这些实施方案中，启动子可以被不同地诱导，或者在不同时间，或者以不同的表达水平，例如，使用诱导物浓度梯度来控制表达水平。

附图说明

图1示意性说明了甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇降解的途径，如Brunker等人的(1998)“Structure and function of the genesinvolved in mannitol，arabitol，and glucitol utilization fromPseudomonas fluorescens DSM50106，”Gene 206(1)：117-126中描述的。

图2示意性说明了DSM50106中的荧光假单胞菌甘露糖醇(mtl)操纵子的结构，鉴定了启动子(粗体)中的推定-10和-35位点，和反相同源性(inverted homology)(箭头)的区域，如Brunker等人的(1998)“Structure and function of the genes involved in mannitol，arabitol，andglucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM50106，”Gene206(1)：117-126中描述的。该mtlK激活子存在于远离mtl操纵子的位点。

图3示意性说明了MB101和其它假单胞菌中的甘露糖醇操纵子的比较。该图显示了四个不同的假单胞菌菌株中mtl操纵子的比对(alignment)，这四个菌株为荧光假单胞菌MB101、荧光假单胞菌DSM50601、荧光假单胞菌Pf0-1和铜绿假单胞菌PA0-1。该mtlR基因，其编码mtl操纵子的转录激活物，在除MB101之外的所有情况中，直接位于mtl操纵子的上游，在此情形中，该基因位于几个kB上游；而在DSM50601中，在此情形中，该基因在基因组中的未知位置发生。

图4示意性说明了各种假单胞菌中，mtlE的基因组上游区域的比较。MB101、DSM50106、荧光假单胞菌Pf0-1和铜绿假单胞菌PA0-1的mt1E基因的上游区域被比对。在这四个菌株中最佳同源性的区域通过小写字体表示。-35和-10区域，推定核糖体结合位点(RBS)和起始密码子用下划线标记。虚线框表示甘露糖醇诱导所要求的最小序列。

图5示意性说明了CopGFP报道基因前面的mtl启动子片段的克隆。MB101 mtlE基因上游的299bp区域(SEQ.ID.No.9)用引物mtlE3(SEQ.ID.No.14)和mtlE4(SEQ.ID.No.15)通过PCR扩增克隆(参见表8)，以产生pDOW1365-1，使用Herculase热稳定DNA聚合酶(Stratagene)和MB214(来源于MB101的菌株)基因组DNA作为模板。

图6示意性说明了来自mtlE上游区域的不同片段的活性比较。携带有pDOW1365-1、pDOW1377、pDOW1369、pDOW1378或pDOW2212(没有CopGFP基因)的菌株DC283ΔmtlDYZ，被斑状接种在补充了尿嘧啶的、含有1％甘露糖醇的M9琼脂平板上。荧光蛋白质的诱导通过暴露于蓝光确定。这四个菌株之间的两个15-bp的同源性区域(参见图4)通过阴影框标明。-35和-10区域被标明，用于克隆每个序列的引物注解在空心框的边缘上，这表示CopGFP报道基因上游克隆的区域。

图7示意性说明了甘露糖醇对在标准产品培养基上培养的野生型菌株背景中的从Pmtl表达的CopGFP的效果。菌株DC283 pDOW1365-1在摇瓶培养基中培养，该培养基含有9.5％(v/v)甘油和尿嘧啶补充物。在24h EFT(实心正方形)，在一个组中加入甘露糖醇1％(w/v)，或者不加入(空心三角形)。随着时间推移，监控诱导后的荧光。在标准化为OD₆₀₀＝1的样品上测量荧光。

图8示意性说明了在具有不同甘油浓度的培养基中，甘露糖醇对于从野生型菌株背景中的Pmtl的表达CopGGP的效果。菌株DC283pDOW1365-1在含有2％(正方形)、5％(三角形)或者9.5％(圆形)甘油的摇瓶培养基中培养。培养物未诱导(空心符号)或者用1％甘露糖醇在20h EFT诱导(实心符号)。随着时间推移，不断监控诱导后的荧光。针对标准化至OD₆₀₀＝1的样品测量荧光。

图9示意性说明了mtlDYZ缺失载体pDOW1373-3的载体图谱。该载体pDOW 1373-3设计为通过等位基因交换诱变删除mtlDYZ基因。使用MB214基因组DNA作为模板，扩增mtlDYZ侧翼区域，通过重叠延伸技术使用拼接将mtlDYZ侧翼区域结合在一起，使用了引物man1(SEQ.ID.No.18)和man2(SEQ.ID.No.19)用于区域上游，man3(SEQ.ID.No.20)和man4(SEQ.ID.No.21)用于区域下游。引物man2和man3含有互补的重叠部分。将结合的产物克隆到pDOW1261/Srfl中，以产生pDOW1373-3。用引物H3seq(SEQ.ID.No.22)和man4筛选菌落；对具有期望的1170bp产物的那些菌落测序，以确保未引入PCR来源的突变。

图10示意性说明了菌株DC283ΔmtlDYZ的培养和碳源(甘露糖醇或葡萄糖)使用。培养物在具有1％碳源的M9培养基中培养，补充了尿嘧啶(250μg/ml)和脯氨酸(250μg/ml)。随着时间推移，不断监控诱导后的葡萄糖(空心圆)和甘露糖醇(空心三角形)浓度，以及600nm(实心三角形用于甘露糖醇，实心圆用于葡萄糖)处的光学密度。

图11示意性说明了在用1％甘露糖醇诱导后的甘露糖醇降解缺陷的菌株中，甘油浓度对从Pmtl表达CopGFP的效果。菌株DC283ΔmtlDYZ/pDOW1365-1在摇瓶培养基中培养，该培养基甘油的初始浓度为2％(正方形)、5％(三角形)或9.5％(圆环)，补充了尿嘧啶。培养物或者用1％甘露糖醇在22h EFT(实心符号)诱导，或者不诱导(空心符号)。随着时间监控诱导后的荧光。针对标准化至OD₆₀₀＝1的样品测量荧光。

图12示意性说明了mtlDYZ缺失突变体和野生型在各种碳源中的Pmtl活性的比较。在甘露糖醇降解缺陷的菌株(D283ΔmtlDYZ/pDOW1365-1)(实心符号)和野生型(DC283/pDOW1365-1)(空心符号)中比较Pmtl活性，在甘油初始浓度为5％(正方形)或9.5％(三角形)(a)或10％葡萄糖(圆环)(b)的摇瓶培养基中进行。培养物用1％甘露糖醇在24h EFT诱导，随着时间推移不断监控诱导后的荧光。针对标准化至OD₆₀₀＝1的样品测量荧光。

图13示意性说明了用不同浓度的甘露糖醇诱导后的Pmtl活性。将不同数量的甘露糖醇(0、0.01％、0.1％、0.5％、1％)作为诱导物在25h EFT加入至用9.5％甘油和补充的尿嘧啶(三角形)培养的D283ΔmtlDYZ/pDOW1365-1中，或者加入至用12.5％葡萄糖(正方形)培养的D283ΔmtlDYZ/pDOW1365-1 pDOW1339中。针对标准化至OD₆₀₀＝1的样品，随着时间推移不断监控诱导后的荧光。

图14示意性说明了用甘油诱导后的葡萄糖培养的培养物中的Pmtl活性。在含有12.5％葡萄糖的摇瓶培养基中，培养菌株DC283 ΔmtlDYZ/pDOW1365-1pDOW1339。于12h EFT加入不同浓度的甘油(0、0.1％、0.5％、1％、2％、5％、9.5％)，针对标准化样品(如上)，随着时间推移不断监控荧光。对17小时(正方形)或35小时(三角形)的荧光水平绘图。

图15示意性说明了使用不同浓度诱导物的流式细胞分析。通过流式细胞分析用不同水平的甘露糖醇(参见图13)(a)或甘油(参见图14)(b)诱导的葡萄糖培养的培养物的细胞的荧光，结果在直方图中叠加显示。X轴是荧光，y轴是每一荧光值的细胞数量。为了比较，用2％甘露糖醇诱导后的荧光包括在(b)中。

图16示意性说明了在20-L玉米糖浆(葡萄糖)或者甘油发酵桶培养物中的CopGFP Pmtl的甘露糖醇进行的诱导。显示了在具有玉米糖浆(葡萄糖)(菱形)或者甘油(正方形)的20L发酵桶中培养的菌株DC283ΔmtlDYZ/pDOW1365-1 pDOW1339(＝DC390)的光学密度(A)和荧光(B)分析。用1％甘露糖醇于20.5h EFT诱导培养物，并且针对标准化样品，随着时间推移不断测量在575nm处的光学密度和荧光。

图17示意性说明了，在20-L玉米糖浆(葡萄糖)或者甘油发酵桶培养物中，甘露糖醇进行诱导的从Pmtl表达CopGFP的流式细胞分析。具有玉米糖浆(葡萄糖)(上)或者甘油(下)的20L发酵桶中培养的菌株DC283ΔmtlDYZ/pDOW1365-1pDOW1339(＝DC390)的流式细胞分析。用1％甘露糖醇于20.5h EFT诱导培养物。去除样品用于诱导后0和48hr的流式细胞分析。在每一个荧光值，直方图的x轴是荧光，y轴是细胞数量。

具体实施方式

本发明提供了在细菌宿主中产生重组肽的方法，该方法使用了甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或甘油可诱导型的启动子，其中产生肽的宿主细菌细胞已经被变得(rendered)不能降解或代谢甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇或其衍生物或类似物的细菌细胞。本发明提供了细菌细胞，这些细菌细胞已经被基因工程改变，以抑制甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物的代谢或降解。在某些实施方案中，甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或甘油可作用于可诱导型的启动子，诱导靶多肽的表达，从而允许在发酵过程中使用廉价且稳定的碳源诱导物，用于产生重组肽。由于细菌细胞缺乏代谢或者降解甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇的能力，所以如果这些碳源被用作诱导物，那么诱导物不能连续地被宿主细胞代谢或者降解，因此在发酵过程中能提供连续且稳定的诱导水平，而不要求在培养基中加入额外的诱导物。在一些实施方案中，细菌细胞已经被变得不能降解或代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物，并且可操作地连接到编码相关肽的核酸序列上的启动子能通过甘油以及甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物诱导。

1.甘露糖醇可诱导型的启动子

在本发明中使用的启动子是核酸序列，典型地大于25个核酸，位于编码相关肽的核酸序列的上游。这些启动子通常具有一个-35区域，这通常是一个5-6核酸序列，从相关肽的转录起始位点上游的大约35个碱基对开始。相关肽的转录起始位点通常编号为+1。

在本发明中，使用了能通过碳源诱导的可诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子能通过选自甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、甘油或其衍生物或类似物的碳源诱导。在一些实施方案中，启动子是甘露糖醇或甘露糖醇衍生物可诱导型的启动子。在其它实施方案中，启动子是内源细菌甘露糖醇操纵子的推定启动子。在一些实施方案中，启动子是荧光假单胞菌mtlEFGKDYZ操纵子的推定启动子，和相关的调节区。在本发明的其它实施方案中，甘露糖醇可诱导型的启动子能通过甘露糖醇之外的碳源诱导。这些碳源包括，但不限于，甘露糖醇、阿拉伯糖醇和甘油。在一些实施方案中，碳源是甘油。

在一些实施方案中，本发明的甘露糖醇可诱导型的启动子包括假单胞菌天然mtl操纵子启动子的-35区域，其通过15-20核苷酸连接物，连接在天然启动子的-10区域上游。在其它实施方案中，连接物是17-18个核苷酸长度。在另一个实施方案中，-35区域包括核酸序列5’-TTGTCA-3’。仍然在另一个实施方案中，-10区域包括核酸序列5’-TGTAAT-3’。仍然在另一个实施方案中，启动子包括-35区域5’-TTTGTC-3’，连接到15-20核苷酸之间的核苷酸序列上，该核苷酸进一步连接到-10区域5’-TGTAAT-3’上。

在可选的实施方案中，甘露糖醇可诱导型的启动子包括核苷酸序列，该序列包括5’-TTGTCACAACCCCGTTTGAAGGCTGTAAT-3’(SEQ.ID.NO.1)(表1)。在另一个实施方案中，启动子包括核苷酸序列，该序列包括5’-TTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAAT-3’(SEQ.ID.NO.2)(表1)。仍然在另一个实施方案中，启动子包括一个核苷酸序列，该序列包括5’-TTGTCAGCCCTGCGTCAGAAGGCTGTAAT-3’(SEQ.ID.NO.3)(表1)。仍然在另一个实施方案中，启动子包括核酸序列5’-TTGTCGGTTGCGTGACGCGCCTGTGTAA-3’(SEQ.ID.No.4)(表1)。

在一些实施方案中，本发明的甘露糖醇可诱导型的启动子进一步包括用作激活子肽或者阻抑物肽结合位点的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列用作激活子肽结合位点。在其它实施方案中，激活子位点是内源假单胞菌MtlR蛋白结合位点的核酸序列。在其它实施方案中，激活子位点是来自内源荧光假单胞菌MtlR蛋白结合位点的核酸序列。

在一些实施方案中，激活子结合位点包括核酸序列5’-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAGCGTGCTCCCAAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.5)(表2)。在另一个实施方案中，激活子结合位点包括核酸序列5’-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTCCAAGTGCTCCCAAGGAT-3’(SEQ.ID.No.6)(表2)。可选地，激活子结合位点包括核酸序列5’-CCGAGTGCAAAAAAGTATCGATTCAAGTGCTAGGGATGAT-3’(SEQ.ID.No.7)(表2)。在另一个实施方案中，激活子结合位点包括5’-GGCGGTGCAAAAAAGTATCGGTCGAAGTGCAGTCGAGGCT-3’(SEQ.ID.NO.8)(表2)。

在其它实施方案中，本发明的甘露糖醇可诱导型的启动子包括SEQ.ID.No.9，一个内源假单胞菌mtl操纵子的299碱基对区域(表3)。在另一个实施方案中，本发明的甘露糖醇启动子包括SEQ.ID No.10，一个内源假单胞菌mtl操纵子的203碱基对区域(表3)。仍然在另一个实施方案中，本发明的启动子包括SEQ.ID No.11，一个内源假单胞菌mtl操纵子的126碱基对区域(表3)。在另一个实施方案中，本发明的启动子包括SEQ.ID No.12，一个内源假单胞菌mtl操纵子的147碱基对区域(表3)。在其它实施方案中，本发明的启动子包括SEQ.IDNo.13，一个内源假单胞菌mtl操纵子的77碱基对区域(表3)。

表1.甘露糖醇可诱导型的启动子-35至-10核酸区域

5’-TTGTCACAACCCCGTTTGAAGGCTGTAAT-3’	SEQ.ID No.1
5’-TTGTCACAACCCCGTTTGAAGGCTGTAAT-3’	SEQ.ID No.1	5’-TTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAAT-3’	SEQ.ID No.2
5’-TTGTCAGCCCTGCGTCAGAAGGCTGTAAT-3’	SEQ.ID No.3	5’-TTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAAT-3’	SEQ.ID No.2
5’-TTGTCAGCCCTGCGTCAGAAGGCTGTAAT-3’	SEQ.ID No.3	5’-TTGTCGGTTGCGTGACGCGCCTGTGTAA-3’	SEQ.ID No.4

表2：甘露糖醇可诱导型的启动子激活子结合核酸区域

5’-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAGCGTGCTCCCAAGGAT-3’	SEQ.ID.No.5
5’-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAGCGTGCTCCCAAGGAT-3’	SEQ.ID.No.5	5’-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTCCAAGTGCTCCCAAGGAT-3’	SEQ.ID.No.6
5’-CCGAGTGCAAAAAAGTATCGATTCAAGTGCTAGGGATGAT-3’	SEQ.ID.No.7	5’-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTCCAAGTGCTCCCAAGGAT-3’	SEQ.ID.No.6
5’-CCGAGTGCAAAAAAGTATCGATTCAAGTGCTAGGGATGAT-3’	SEQ.ID.No.7	5’-GGCGGTGCAAAAAAGTATCGGTCGAAGTGCAGTCGAGGCT-3’	SEQ.ID.No.8

表3：甘露糖醇诱导型启动子mtl操纵子核酸区域

GAGCGTGGGAACGATCAAGTGTTAAACACTGCACTGAGGATCGTTCCCGCGCTCCGCGTGGGCATGCATACCGTGACGCTCTGCGTCACCTGGGGACGCAGAGCGTCCCTAGCGGCGTTACCACGCGGAGCGTGGGAACGATCAGGTGGTCGACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAATCAACGCACACTCTTCCTGACTCCTTGTAGGAAGACACAACAACAATAACCGTCCTTCTGTAGCCCTCTGGGCGCGGAA	SEQ.ID.No.9
	SEQ.ID.No.9	TGAGCAGGAAAATCTGTACGGTTTCGCGCCCTTCGCCATGCTGAAACGCCCTTCCCTGCGGTTATCGCGCCAATCCCGAGTGCAAAAAAGTATCGATTCAAGTGCTAGGGATGATTTGTCAGCCCTGCGTCAGAAGGCTGTAATCAGTGCACATTCTTCCCCCGCCGGAAGAACACAAAAACAATAACTGTCCTTCTGCCCCC	SEQ.ID.No.10
TAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAATCAACGCACACTCTTCCTGACTCCTTGTAGGAAGACACAACAACAATAACCGTCCTTCTGTAGCCCTCTGGGCGCGGAA	SEQ.ID.No.11		SEQ.ID.No.10
	SEQ.ID.No.11	ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAATCAACGCACACTCTTCCTGACTCCTTGTAGGAAGACACAACAACAATAACCGTCCTTCTGTAGCCCTCTGGGCGCGGAA	SEQ.ID.No.12
ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAATCAACGCAC	SEQ.ID.No.13		SEQ.ID.No.12

其它实施方案包括，其中启动子是与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，启动子是与选自Seq.ID.Nos.9或12的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

在一个实施方案中，启动子是在高度严谨条件下，与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或者在高度严谨条件下，与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列杂交的核酸序列。在一个实施方案中，启动子是在高度严谨条件下，与选自Seq.ID.No.9或Seq.ID.No.12的核酸序列杂交的核苷酸序列，或者在高度严谨条件下，与选自Seq.ID.Nos.9或12的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

该申请中列举的序列可以是同源的(具有类似的同一性)。核酸和/或核酸序列，当它们天然地或者人工地，来自共同的祖先核酸或者核酸序列时，是同源的。例如，任何天然发生的核酸可通过任何可利用的诱变方法修饰，以便在核酸序列中包括一个或者多个变化。同源性通常从两个或者多个核酸(或其序列)之间的序列类似性推断。在确定同源性中有用的序列之间的类似性的准确百分比随着正在讨论中的核酸变化，但通常情况下，用仅仅25％的序列类似性就可确定同源性。更高水平的序列类似性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高，也可以用于确定同源性。此处描述了确定序列类似性百分比(例如使用缺省参数的BLASTN)的方法，这些方法通常都可以获得。

当比较核苷酸序列时，两个序列中的核酸序列，当比对其最大一致性时，如果它们相同，那么这两个序列被认为是“同一的”。两个序列之间的比较通常通过比较一个比较窗口内的序列来进行，以便鉴别且比较具有序列类似性的局部区域。此处所用的“比较窗口”，指至少大约20个连续位置的片段，通常30到大约75个，40到大约50个，其中在两个序列被最佳比对后，一个序列可以与具有相同数量的连续位置的参考序列进行比较。

用于比较的序列的最佳比对可使用生物信息软件(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)Lasergene套件中的Megalign程序进行，使用缺省参数。该程序包含在下述参考文件中描述的几个比对图：Dayhoff，M.O.(1978)，A model of evolutionary change in proteins-Matrices fordetecting distant relationships。In Dayhoff，M.O.(编著)Atlas of ProteinSequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，Washington D.C.Vol.5，Suppl.3，pp.345 358；Hein J.(1990)UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes pp.626 645，Methods inEnzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS5：151 153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4：11 17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor 11：105；Santou，N.Nes，M.(1987)，Mol.Biol.Evol.4：406 425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，Calif；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.，Sci.USA 80：726 730。

可选地，用于比较的序列的最佳比对可通过如下算法进行：Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2：482的局部同一性算法，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同一性比对算法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的类似性搜索方法，这些算法(Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)的计算机化实现，或者通过检查进行。

适合确定序列同一性和序列类似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，分别在Altschul等人的(1977)Nucl.AcidsRes.25：3389 3402和Altschul等人的(1990)J.MoI.Biol.215：403 410中有所描述。BLAST和BLAST 2.0可用，例如此处描述的参数，来确定本发明的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获得。对于氨基酸序列，可用记分矩阵计算累积得分。当发生如下情况时，暂停每一方向上的匹配字串的延伸：累积比对得分从其最大获得值下降了数量X；由于一个或者多个负得分残基比对的累积，累积得分达到零或者零下；或者到达任意一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。

在一种方法中，“序列同一性的百分比”通过在至少20个位置的比较窗口内，比较两个最佳比对的序列来确定，其中当与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包括添加或者缺失)比较时，比较窗口中的核苷酸序列部分可包括20％或更低的添加或者缺失(即间隙)，通常是5到15％，或者10到12％。百分比通过两个序列中同一核酸残基发生位置的数量来计算，以得到匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以参考序列(即窗口大小)中的总位置数量，并且将该结果乘以100，就可得到序列同一性的百分比。

严谨杂交条件通常指这样的条件：(1)使用低离子强度和高洗涤温度，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃，或者(2)在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺。本技术领域熟练的技术人员能确定并且适当地改变这些严谨条件，以得到清晰且可检测的杂交信号。例如，严谨性通常通过增加杂交过程中存在的盐含量，并且洗涤，降低温度来降低，或者使用其组合来降低。例如参见Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，New York，(1989)。如果序列之间有至少85％，优选地至少90％同一性，严谨杂交条件包括允许杂交发生的条件。在高度严谨条件下，将形成高度互补的核酸杂交；不会形成没有足够互补程度的杂交。因此，检验条件的严谨性决定了形成杂交的两个核酸链之间需要的互补数量。

II.宿主细胞

本发明也提供了细菌细胞，这些细菌细胞已经被遗传修饰，以降低其代谢或降解碳源的能力，所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物，碳源可作用于可诱导型的启动子，来诱导表达。遗传修饰可以是编码酶的一个或者多个基因，该酶在代谢或者降解碳源中涉及的代谢途径中有效，所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物，作用于可诱导型的启动子来诱导表达。优选地，宿主细胞有对编码与诱导物的代谢或降解相关的酶活性的基因的遗传修饰，而与诱导物的转运相关的基因不受影响，从而允许转运到细胞中，随后不会降解或者代谢。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞选自假单胞菌，及其密切相关的细胞。在一些实施方案中，细菌细胞是荧光假单胞菌细胞。

选择在本发明中使用的细菌宿主细胞可被改变至缺乏代谢或者降解任何诱导物的能力，所述诱导物作用于可诱导型的启动子，表达相关肽。例如，在选择甘露糖醇作为诱导物的情况下，宿主细胞可被改变得缺乏表达代谢甘露糖醇要求的酶，或者能代谢甘露糖醇的任何有效的替换酶的能力。在一些实施方案中，可通过改变宿主细胞的基因组，使其不能代谢或者降解诱导物，这样细胞不能从其基因组表达诱导物的代谢或者降解中涉及的功能酶。这一改变可通过改变编码代谢或降解一种酶或多种酶的基因的细胞的基因组编码序列来进行。在其它实施方案中，编码序列改变将通过引入如下步骤来完成：改变编码序列阅读框的插入或者缺失突变；改变足够数量的密码子的取代或者倒位突变；和/或删除足够大的群体的连续密码子的缺失突变，因而能产生非功能酶。

可根据本技术领域已知的多种方法中的任意方法，只要其有效，来制备这样的敲除菌株。例如，含有期望核酸缺失序列的同源靶基因序列5’和3’的同源重组载体可被转化到宿主细胞中。理想地，一旦同源重组，就可以产生期望的靶酶促基因敲除。

基因敲除方法学的特定实例在本技术领域是熟知的。例如，先前已经描述了通过插入多核苷酸进行的基因灭活。例如，参见DL Roeder& A Collmer，Marker-exchange mutagenesis of a pectate lyase isozymegene in Erwinia chrysanthemi，J Bacterid.164(1)：51-56(1985)。可选地，期望表型(如不能代谢特定碳源)的转座子诱变和选择可用于分离细菌菌株，其中靶基因已经被插入灭活。例如参见K Nida & PP Cleary，Insertional inactivation of streptolysin S expression in Streptococcuspyogenes，J Bacteriol.155(3)：1156-61(1983)。可使用盒子诱变构建基因中的特定突变或缺失，例如，JA Wells等人在Cassette mutagenesis：anefficient method for generation of multiple mutations at defined sites，Gene34(2-3)：315-23(1985)中描述的；其中在选择的基因部分产生了定向突变或者随机突变，然后通过同源重组整合到基因的染色体拷贝中。

在本发明的其它实施方案中，细菌细胞被变得缺乏代谢碳源必需的酶，该碳源用作重组肽表达的诱导物。在一些实施方案中，细菌细胞被变得缺乏代谢碳源甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇或其衍生物必需的酶。在一些实施方案中，细菌细胞被构建而缺乏来自内源甘露糖醇操纵子-mtl的基因编码的酶活性。在另一个实施方案中，细菌细胞被构建，而缺乏内源mtlD基因或其同源物编码的酶活性。在一个可选的实施方案中，细菌细胞被构建，而缺乏内源mtlY基因或其同源物编码的酶活性。仍然在另一个实施方案中，细菌细胞被构建，而缺乏内源mtlZ基因或其同源物编码的酶活性。可选地，细菌细胞可被构建，而缺乏mtlDYZ基因或其同源物编码的酶的任意组合的活性。在其它实施方案中，细菌细胞被构建，而缺乏内源mtlD、mtlY和mtlZ基因编码的酶活性。

在一个备选的实施方案中，细菌细胞可以是天然突变体，其中突变体不能降解或者代谢用于重组肽表达的诱导物的碳源，这是由于在这样的代谢的碳源降解所必需的内源基因中天然发生的突变。

此外，本发明进一步提供了细菌细胞，包括含有编码相关的至少一个肽的核酸序列的核酸构建物，所述至少一个相关肽可操作地连接到至少一个碳源可诱导型的启动子上，其中碳源可诱导型的启动子是甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子。在一些实施方案中，碳源可诱导型的启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子。在其它实施方案中，甘露糖醇可诱导型的启动子能通过甘油诱导。

可选地，细菌细胞包括第一个核酸构建物，其具有编码至少一个相关肽的核酸序列，所述至少一个相关肽的核酸序列可操作地连接到至少一个碳源可诱导型的启动子上，和第二个核酸构建物，其具有编码相关的至少一个相关肽的核酸序列，所述至少一个相关肽可操作地连接到至少一个碳源可诱导型的启动子上。在一些实施方案中，碳源可诱导型的启动子是甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子。多个启动子位于相同的核酸构建物上，或者位于独立的核酸构建物上。在发酵过程中，相关肽的表达能以不同方式诱导，包括在不同时间或者以不同表达水平诱导。在某些实施方案中，与本发明的甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子组合使用的可诱导型的启动子(和相关诱导物)包括，例如lac(IPTG)、lacUV5(IPTG)、tac(IPTG)、trc(IPTG)、P_syn(IPTG)、trp(色氨酸饥饿)、araBAD(1-阿拉伯糖)、lpp^a(IPTG)、lpp-lac(IPTG)、phoA(磷酸盐饥饿)、recA(萘啶酮酸)、proU(摩尔渗透压浓度)、cst-1(葡萄糖饥饿)、tetA(四环素)、cadA(pH)、nar(厌氧条件)、PL(热变换至42℃)、cspA(热变换至20℃)、T7(热诱导)、T7-lac操纵子(IPTG)、T3-lac操纵子(IPTG)、T5-lac操纵子(IPTG)、T4 gene32(T4感染)、nprM-lac操纵子(IPTG)、Pm(烷基-或卤代-苯甲酸酯)、Pu(烷基-或卤代-甲苯)、Psal(水杨酸盐)、ant(邻氨基苯甲酸)、ben(苯甲酸酯)或者VHb(氧)启动子。例如参见Makrides，S.C.(1996)Microbiol.Rev.60，512-538；Hannig G.& Makrides，S.C.(1998)TIBTECH 16，54-60；Stevens，R.C.(2000)Structures 8，R177-R185。例如参见：J.Sanchez-Romero & V.DeLorenzo，Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains asBiocatalysts for Industrial and Environmental Processes，in Manual ofIndustrial Microbiology and Biotechnology(A.Demain & J.Davies，eds.)pp.460-74(1999)(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer，Vectorsto express foreign genes and techniques to monitor gene expression forPseudomonads，Current Opinion in Biotechnology，12：439-445(2001)；和R.Slater & R.Williams，The Expression of Foreign DNA in Bacteria，inMolecular Biology and Biotechnology(J.Walker & R.Rapley，eds.)Pp.125-54(2000)(The Royal Society of Chemistry，Cambridge，UK)。

细菌细胞中含有的核酸构建物能以游离方式维持，或者可以整合到细胞的基因组中。

细菌微生物

本发明提供了细菌细胞，这些细菌细胞缺乏碳源代谢必需的酶，所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物，碳源被用于诱导相关肽的表达，其中编码相关肽的核酸序列可操作地连接到碳源可诱导型的启动子上，碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物。本发明预期使用能表达重组肽的任何细菌细胞。这样的细胞在本技术领域是熟知的。在一些实施方案中，宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。在另一个实施方案中，细胞选自假单胞菌或密切相关的细胞。在其它实施方案中，细菌细胞是荧光假单胞菌。在一些实施方案中，细菌细胞可缺乏碳源代谢必需的酶，所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物。

假单胞菌和密切相关的细菌，如此处所用的，是用此处定义为“革兰氏阴性变形菌亚群1”的组共同延伸的。“革兰氏阴性变形菌亚群1”更特别地被定义为属于，描述为落入命名为“革兰氏阴性杆菌和球菌”分类学“部分(Part)”的科和/或属的变形菌群，由R.E.Buchanan and N.E.Gibbons(eds.)，Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology，pp.217-289(8th ed.，1974)(The Williams & Wilkins Co.，Baltimore，MD，USA)(下文为“Bergey(1974)”)命名。表4给出了该分类学“部分”中罗列的微生物的科和属。

表4.部分“革兰氏阴性杆菌和球菌”中

罗列的科和属(Bergey(1974)中)

科I.假单胞菌科	葡糖杆菌属(Gluconobacter)假单胞菌属(Pseudomonas)黄单胞菌属(Xanthomonas)动胶菌属(Zoogloea)
科I.假单胞菌科		科II.固氮菌科	氮单胞菌属(Azomonas)固氮菌属(Azotobacter)拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)德克斯菌属(Derxia)
科III.根瘤菌科	土壤杆菌属(Agrobacterium)根瘤菌属(Rhizobium)	科II.固氮菌科
科III.根瘤菌科	土壤杆菌属(Agrobacterium)根瘤菌属(Rhizobium)	科IV.甲基单胞菌科	甲基球菌(Methylococcus)甲基单胞菌属(Methylomonas)
科V.盐杆菌科	盐杆菌属(Halobacterium)盐球菌属(Halococcus)	科IV.甲基单胞菌科	甲基球菌(Methylococcus)甲基单胞菌属(Methylomonas)
科V.盐杆菌科	盐杆菌属(Halobacterium)盐球菌属(Halococcus)	其它属	醋杆菌属(Acetobacter)产碱菌属(Alcaligenes)包特氏菌属(Bordetella)布氏杆菌属(Brucella)弗朗西斯氏菌属(Francisella)栖热菌属(Thermus)

“革兰氏阴性变形菌亚群1”包括其下分类的所有变形菌，以及将根据形成分类学“部分”中使用的标准分类的所有变形菌。结果是，“革兰氏阴性变形菌亚群1”不包括，例如，所有的革兰氏阳性细菌；那些革兰氏阴性细菌，如肠杆菌科，该细菌落在Bergey(1974)分类学的其它19个“部分”之下；Bergey(1974)“部分”的整个“科V.盐杆菌科”，该科已经被认为是古细菌的非细菌科；和Bergey(1974)“部分”中罗列的栖热菌属(Thermus)，该属已经被认为是细菌的非变形菌属。

“革兰氏阴性变形菌亚群1”进一步包括属于Bergey(1974)“部分”中定义的属和科(和先前被称作这些属和科的种)的那些变形菌，已经给这些属和科给出了其它的变形菌分类学名称。在一些情况下，这些重命名导致创造了整个新的变形菌属。例如，通过对属于Bergey(1974)中定义的假单胞菌属(和先前被称作假单胞菌属的种)的微生物重新分组，创造了嗜酸菌属(Acidovorax)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、海单胞菌属(Oceanimonas)、劳尔氏菌属(Ralstonia)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。同样地，例如，通过对属于Bergey(1974)中定义的黄单胞菌属(Xanthomonas)(和先前被称作黄单胞菌属的种)的微生物重新分组，创造了鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(和从其得到的芽单胞菌属(Blastomonas))。类似地，例如，通过对属于Bergey(1974)中定义的醋杆菌属(Acetobacter)(和先前被称作醋杆菌属的种)的微生物重新分组，创造了酸单胞菌属(Acidomonas)。这些随后重新指定的种也包括在此处定义的“革兰氏阴性变形菌亚群1”中。

在其它情况下，落入Bergey(1974)“部分”中定义的属和科中的变形菌种被简单地重新分类在其它现有的变形菌属之下。例如，在假单胞菌属的情况下，Pseudomonas enalia(ATCC 14393)、生黑色腐败假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)和腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)已经分别重新分类为Alteromonas haloplanktis、Alteromonas nigrifaciens和Alteromonasputrefaciens。类似地，例如，食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)(ATCC11996)已经被分别重新分类为食酸丛毛单胞菌(Comamonasacidovorans)和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)；而且生黑色腐败假单胞菌(ATCC 19375)和向被巴斯德菌(Pseudomonaspiscicida)(ATCC 15057)已经被分别重新分类为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)和杀鱼假单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)。这些随后重新指定的变形菌种也包括在此处定义的“革兰氏阴性变形菌亚群1”中。

“革兰氏阴性变形菌亚群1”也包括已发现的变形菌种，或者已经被重新分类，属于或者分类到Bergey(1974)“部分”的变形菌科和/或属中的变形菌种。关于变形菌科，“革兰氏阴性变形菌亚群1”也包括分类为属于如下科中的任意科的变形菌：假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、固氮菌科(Azotobacteraceae)(现在通常称作同义词，假单胞菌科的“固氮菌组”)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)和甲基单胞菌科(Methylomonadaceae)(现在通常称作同义词，“甲基球菌科(Methylococcaceae)”)。因此，除了此处描述的那些属，落入“革兰氏阴性变形菌亚群1”中的进一步的变形菌属包括：1)嗜氮根瘤菌属(Azorhizophilus)的固氮菌群细菌；2)纤维弧菌属(Cellvibrio)、寡源杆菌属(Oligella)和Teredinibacter属的假单胞菌科细菌；3)螫合杆菌属(Chelatobacter)、剑菌属(Ensifer)、Liberibacter(也被称作“Candidatus Liberibacter”)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的根瘤菌科细菌；和4)甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基暖菌属(Methylocaldum)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)和甲基球形菌属(Methylosphaera)的甲基球菌科细菌。

本发明的实施方案包括，其中宿主细胞选自如上定义的“革兰氏阴性变形菌亚群1”。

在另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群2”。“革兰氏阴性变形菌亚群2”被定义为下述属的变形菌群(所有数量的已列出目录、可公开获得且已保藏的菌株，保藏号表示在圆括号中，除非另外说明，所有菌株保藏在ATCC)：酸单胞菌属(Acidomonas)(2)；醋杆菌属(Acetobacter)(93)；葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)(37)；短波单胞菌属(Brevundimonas)(23)；拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌属(Derxia)(2)；布氏杆菌属(Brucella)(4)；土壤杆菌属(Agrobacterium)(79)；螯合杆菌属(Chelatobacter)(2)；剑菌属(Ensifer)(3)；根瘤菌属(Rhizobium)(144)；中华根瘤菌属(Sinorhizobium)(24)；芽单胞菌属(Blastomonas)(1)；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(27)；产碱菌属(Alcaligenes)(88)；包特氏菌属(Bordetella)(43)；伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(73)；劳尔氏菌属(Ralstonia)(33)；噬酸菌属(Acidovorax)(20)；嗜氢菌属(Hydrogenophaga)(9)；动胶菌属(Zoogloea)(9)；甲基杆菌属(Methylobacter)(2)；甲基暖菌属(Methylocaldum)(1，保藏在NCMB)；甲基球菌属(Methylococcus)(2)；甲基微菌属(Methylomicrobium)(2)；甲基单胞菌属(Methylomonas)(9)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)(1)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)(9)；嗜氮根瘤菌属(Azorhizophilus)(5)；固氮菌属(Azotobacter)(64)；纤维弧菌属(Cellvibrio)(3)；寡源杆菌(Oligella)(5)；假单胞菌属(Pseudomonas)(1139)；弗朗西斯氏菌属(Francisella)(4)；黄单胞菌属(Xanthomonas)(229)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(50)；和海单胞菌属(Oceanimonas)(4)。

“革兰氏阴性变形菌亚群2”的例证性宿主细胞，包括但不限于，如下细菌(圆括号里所示为例证性菌株的ATCC或其它保藏号码)：甲醇酸单胞菌(Acidomonas methanolica)(ATCC 43581)；纹膜醋酸杆菌(Acetobacter aceti)(ATCC 15973)；氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)(ATCC 19357)；缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)(ATCC 11568)；印度拜耶林克氏菌(Beijerinckia indica)(ATCC 9039和ATCC 19361)；德克斯氏菌(Derxia gummosa)(ATCC 15994)；羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)(ATCC 23456)；牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)(ATCC 23448)；根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(ATCC 23308)；放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)(ATCC 19358)；发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(ATCC 11325)；Chelatobacter heintzii(ATCC 29600)；Ensifer adhaerens(ATCC 33212)；豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(ATCC10004)；费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)(ATCC 35423)；Blastomonas natatoria(ATCC 35951)；少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)(ATCC 29837)；固氮粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 8750)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)(ATCC 25416)；皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)(ATCC 11228)；黄色氢噬胞菌(Hydrogenophaga flava)(ATCC33667)；生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)(ATCC 19544)；Methylobacterluteus(ATCC 49878)；Methylocaldum gracile(NCIMB 11912)；嗜甲烷菌(Methylococcus capsulatus)(ATCC 19069)；Methylomicrobium agile(ATCC 35068)；甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica)(ATCC35067)；Methylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaera hansonii(ACAM 549)；敏捷氮单胞菌(Azomonas agilis)(ATCC 7494)；Azorhizophilus paspali(ATCC 23833)；褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)(ATCC 9043)；混合纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)(UQM2601)；尿道寡源杆菌(Oligella urethralis)(ATCC 17960)；绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858)；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(ATCC 6223)；嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637)；野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)(ATCC 33913)和Oceanimonas doudoroffii(ATCC 27123)。

在另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群3”。“革兰氏阴性变形菌亚群3”被定义为下述属的变形菌群：短波单胞菌属；土壤杆菌属；根瘤菌属；中华根瘤菌属；芽单胞菌属；鞘胺醇单胞菌属；产碱菌属；伯克霍尔德菌属；劳尔氏菌属；噬酸菌属；噬氢菌属；甲基杆菌属；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌属；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌属和海单胞菌属。

在另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群4”。“革兰氏阴性变形菌亚群4”被定义为下述属的变形菌群：短波单胞菌属；芽单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；伯克霍尔德氏菌属；劳尔氏菌属；嗜酸菌属；噬氢菌属；甲基杆菌属；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌属；寡养单胞菌属；黄单胞菌属和海单胞菌属。

在另一个实施方案中，宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群5”。“革兰氏阴性变形菌亚群5”被定义为下述属的变形菌群：甲基杆菌属；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌属；寡养单胞菌属；黄单胞菌属和海单胞菌属。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群6”。“革兰氏阴性变形菌亚群6”被定义为下述属的变形菌群：短波单胞菌属；芽单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；伯克霍尔德氏菌属；劳尔氏菌属；嗜酸菌属；噬氢菌属；氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；寡养单胞菌属；黄单胞菌属和海单胞菌属。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群7”。“革兰氏阴性变形菌亚群7”被定义为下述属的变形菌群：氮单胞菌属；嗜氮根瘤菌属；固氮菌属；纤维弧菌属；寡源杆菌属；假单胞菌属；Teredinibacter；寡养单胞菌属；黄单胞菌属和海单胞菌属。

宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群8”。“革兰氏阴性变形菌亚群8”被定义为下述属的变形菌群：短波单胞菌属；芽单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；伯克霍尔德氏菌属；劳尔氏菌属；嗜酸菌属；噬氢菌属；假单胞菌属；寡养单胞菌属；黄单胞菌属和海单胞菌属。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群9”。“革兰氏阴性变形菌亚群9”被定义为下述属的变形菌群：短波单胞菌属；伯克霍尔德氏菌属；劳尔氏菌属；嗜酸菌属；噬氢菌属；假单胞菌属；寡养单胞菌属和海单胞菌属。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群10”。“革兰氏阴性变形菌亚群10”被定义为下述属的变形菌群：伯克霍尔德氏菌属；劳尔氏菌属；假单胞菌属；寡养单胞菌属和黄单胞菌属。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群11”。“革兰氏阴性变形菌亚群11”被定义为下述属的变形菌群：假单胞菌属；寡养单胞菌属和黄单胞菌属。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群12”。“革兰氏阴性变形菌亚群12”被定义为下述属的变形菌群：伯克霍尔德氏菌属；劳尔氏菌属；假单胞菌属。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群13”。“革兰氏阴性变形菌亚群13”被定义为下述属的变形菌群：伯克霍尔德氏菌属；劳尔氏菌属；假单胞菌属和黄单胞菌属。

宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群14”。“革兰氏阴性变形菌亚群14”被定义为下述属的变形菌群：假单胞菌属和黄单胞菌属。

宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群15”。“革兰氏阴性变形菌亚群15”被定义为假单胞菌属的变形菌群。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群16”。“革兰氏阴性变形菌亚群16”被定义为下述假单胞菌种的变形菌群(圆括号中所示为例证性菌株的的ATCC或其它保藏号码)：Pseudomonas abietaniphila(ATCC 700689)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC10145)；产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909)；败血症假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)(ATCC 33660)；香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)(ATCC 13674)；变黄假单胞菌(Pseudomonas flavescens)(ATCC 51555)；门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(ATCC 25411)；硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)(ATCC 33634)；食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)(ATCC 8062)；假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(ATCC 17440)；食树假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)(ATCC 14235)；稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)(ATCC 33636)；蘑菇假单胞菌(Pseudomonasagarici)(ATCC 25941)；Pseudomonas alcaliphila；海洋细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas alginovora)；Pseudomonas andersonii；铁角蕨假单胞菌(Pseudomonas asplenii)(ATCC 23835)；Pseudomonas azelaica(ATCC 27162)；Pseudomonas beijerinckii(ATCC 19372)；Pseudomonasborealis；北城假单孢菌(Pseudomonas boreopolis)(ATCC 33662)；Pseudomonas brassicacearum；食丁酸假单胞菌(Pseudomonasbutanovora)(ATCC 43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC 55703)；桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)(ATCC 33663)；绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446，ATCC 13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973)；Pseudomonas lundensis(ATCC 49968)；腐臭假单胞菌(Pseudomonastaetrolens)(ATCC 4683)；乌蔹霉假单胞菌(Pseudomonas cissicola)(ATCC 33616)；Pseudomonas coronafaciens；Pseudomonasditerpeniphila；伸长假单胞菌(Pseudomonas elongata)(ATCC 10144)；弯曲假单胞菌(Pseudomonas flectens)(ATCC 12775)；产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)；Pseudomonas brenneri；Pseudomonascedrella；皱缩假单胞菌(Pseudomonas corrugata)(ATCC 29736)；Pseudomonas extremorientalis；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC 700871)；边缘假单胞菌(Pseudomonasmarginalis)(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；Pseudomonasmucidolens(ATCC 4685)；Pseudomonas orientalis；Pseudomonasrhodesiae；产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)(ATCC 9890)；托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii)(ATCC 33618)；Pseudomonasveronii(ATCC 700474)；Pseudomonas frederiksbergensis；弯曲假单孢菌(Pseudomonas geniculata)(ATCC 19374)；Pseudomonas gingeri；Pseudomonas graminis；Pseudomonas grimontii；Pseudomonashalodenitrfificans；Pseudomonas halophila；栖木谨假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)(ATCC 19867)；Pseudomonas huttiensis(ATCC 14670)；Pseudomonas hydrogenovora；Pseudomonas jessenii(ATCC 700870)；Pseudomonas kilonensis；Pseudomonas lanceolata(ATCC 14669)；Pseudomonas lini；划界假单胞杆菌(Pseudomonasmarginata)(ATCC 25417)；臭味假单胞菌(Pseudomonas mephitica)(ATCC 33665)；脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)(ATCC19244)；穿孔素假单胞菌(Pseudomonas pertucinogena)(ATCC 190)；Pseudomonas pictorum(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；Pseudomonas fulva(ATCC 31418)；蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)(ATCC 700476)；Pseudomonas mosselii；栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)(ATCC 43272)；Pseudomonasplecoglossicida(ATCC 700383)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(ATCC 12633)；Pseudomonas reactans；多刺假单胞菌(Pseudomonasspinosa)(ATCC 14606)；巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)；浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)(ATCC 43273)；斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588)；扁桃假单胞菌(Pseudomonasamygdali)(ATCC 33614)；洋榛假单胞菌(Pseudomonas avellanae)(ATCC 700331)；番木瓜假单胞菌(Pseudomonas caricapapayae)(ATCC 33615)；菊苣假单胞杆菌(Pseudomonas cichorii)(ATCC10857)；无花果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae)(ATCC 35104)；褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)；苦楝假单胞(Pseudomonasmeliae)(ATCC 33050)；丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(ATCC19310)；绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)(ATCC 13223)；Pseudomonas thermocarboxydovorans(ATCC 35961)；Pseudomonasthermotolerans；Pseudomonas thivervalensis；Pseudomonasvancouverensis(ATCC 700688)；Pseudomonas wisconsinensis和Pseudomonas xiamenensis。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群17”。“革兰氏阴性变形菌亚群17”被定义为本技术领域已知为“荧光假单胞菌”的变形菌群，包括那些属于，例如下述假单胞菌种的亚群：产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)；Pseudomonas brenneri；Pseudomonascedrella；皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)；Pseudomonasextremorientalis；荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii；边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens；Pseudomonas orientalis；Pseudomonasrhodesiae；产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)；托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii)和Pseudomonas veronii。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群18”。“革兰氏阴性变形菌亚群18”被定义为荧光假单胞菌种所有亚种、变体、菌株和其它亚种单元，包括那些属于，例如属于下述的菌种(圆括号中所示为例证性菌株的ATCC或其它保藏号码)：荧光假单胞菌生物型A，也称作生物变型1或生物变型I(ATCC 13525)；荧光假单胞菌生物型B，也称作生物变型2或生物变型II(ATCC 17816)；荧光假单胞菌生物型C，也称作生物变型3或生物变型III(ATCC 17400)；荧光假单胞菌生物型F，也称作生物变型4或生物变型IV(ATCC 12983)；荧光假单胞菌生物型G，也称作生物变型5或生物变型V(ATCC 17518)；荧光假单胞菌生物变型VI；荧光假单胞菌Pf0-1；荧光假单胞菌Pf-5(ATCCBAA-477)；荧光假单胞菌SBW25和荧光假单胞菌subsp.cellulosa(NCIMB 10462)。

宿主细胞可选自“革兰氏阴性变形菌亚群19”。“革兰氏阴性变形菌亚群19”被定义为荧光假单胞菌生物型A的所有菌株的群。该生物型的一个菌株是荧光假单胞菌菌株MB101(参见Wilcox的美国专利5,169,760)及其衍生物。

在一些实施方案中，宿主细胞是假单胞菌目的任意变形菌。在其它实施方案中，宿主细胞是假单胞菌科的任意变形菌。

在其它实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群1”。在一些实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群2”。在其它实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群3”。在其它实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群5”。对于一些实施方案，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群7”。然而，在其它实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群12”、“革兰氏阴性变形菌亚群15”、“革兰氏阴性变形菌亚群17”、“革兰氏阴性变形菌亚群18”和/或“革兰氏阴性变形菌亚群19”。

可在本发明中使用的其它的荧光假单胞菌菌株包括，荧光假单胞菌Migula和荧光假单胞菌Loitokitok，具有如下ATCC标号：[NCIB8286]；NRRL B-1244；NCIB 8865菌株CO1；NCIB 8866菌株CO2；1291[ATCC 17458；IFO 15837；NCIB 8917；LA；NRRL B-1864；吡咯烷；PW2[ICMP 3966；NCPPB 967；NRRL B-899]；13475；NCTC10038；NRRL B-1603[6；IFO 15840]；52-1C；CCEB 488-A[BU 140]；CCEB 553[IEM 15/47]；IAM 1008[AHH-27]；IAM 1055[AHH-23]；1[IFO 15842]；12[ATCC 25323；NTH11；den Dooren de Jong 216]；18[IFO 15833；WRRL P-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO 15832]；143[IFO15836；PL]；149[2-40-40；IFO 15838]；182[IFO 3081；PJ 73]；184[IFO15830]；185[W2 L-1]；186[IFO 15829；PJ 79]；187[NCPPB 263]；188[NCPPB 316]；189[PJ227；1208]；191[IFO 15834；PJ 236；22/1]；194[Klinge R-60；PJ 253]；196[PJ 288]；197[PJ 290]；198[PJ 302]；201[PJ368]；202[PJ 372]；203[PJ 376]；204[IFO 15835；PJ 682]；205[PJ 686]；206[PJ 692]；207[PJ 693]；208[PJ 722]；212[PJ 832]；215[PJ 849]；216[PJ 885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO 15831；PJ 187]；NRRL B-3 178[4；IFO 15841]；KY 8521；3081；30-21；[IFO 3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU 2183；FERM-P 3328]；P-2563[FERM-P2894；IFO 13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRL B-4290；PMW6[NCB 11615]；SC 12936；A1[IFO 15839]；F 1847[CDC-EB]；F 1848[CDC 93]；NCB 10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；Nl；SC15208；BNL-WVC；NCTC 2583[NCB 8194]；H13；1013[ATCC 11251；CCEB 295]；IFO3903；1062或者Pf-5。

III.核酸构建物

提供核酸构建物用于本发明，该构建物包括编码相关肽的核酸，所述相关肽可操作地连接到碳源可诱导型的启动子上。在一些实施方案中，至少一个碳源可诱导型的启动子包括在核酸构建物中，并且可操纵地连接到编码编码至少一个相关肽的核酸上。在其它实施方案中，碳源可诱导型的启动子是甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇或其衍生物。相关肽可以是单体。在一个可选的实施方案中，碳源可诱导型的启动子可操作地连接到编码不止一个单体的核酸序列上。在其它实施方案中，不止一个甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子包括在核酸构建物中，其中启动子串联共价连接在一起，并且可操作地连接到编码相关肽的核酸上。在另一个实施方案中，不止一个甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子包括在核酸构建物中，其中每一个启动子是分离的，并且可操作地连接到编码相关肽的核酸上。在一些实施方案中，相关肽可以是相同的肽或者不同的肽。

在另一个实施方案中，核酸构建物可含有一个甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，和不通过甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇或其衍生物诱导的另一个启动子。甘露糖醇诱导的启动子串联共价连接在一起，或者独立，并且可操作地连接到编码相关肽的独立的核酸上。例如，一个启动子可以是甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，其它启动子可以是lac(IPTG)、lacUV5(IPTG)、tac(IPTG)、trc(IPTG)、P_syn(IPTG)、trp(色氨酸饥饿)、araBAD(1-阿拉伯糖)、lpp^a(IPTG)、lpp-lac(IPTG)、phoA(磷酸盐饥饿)、recA(萘啶酮酸)、proU(摩尔渗透压浓度)、cst-1(葡萄糖饥饿)、tetA(四环素)、cadA(pH)、nar(厌氧条件)、PL(热变换至42℃)、cspA(热变换至20℃)、T7(热诱导)、T7-lac操纵子(IPTG)、T3-lac操纵子(IPTG)、T5-lac操纵子(IPTG)、T4 gene32(T4感染)、nprM-lac操纵子(IPTG)、Pm(烷基-或卤代-苯甲酸酯)、Pu(烷基-或卤代-甲苯)、Psal(水杨酸酯)、ant(邻氨基苯甲酸)、ben(苯甲酸酯)或者VHb(氧)启动子。例如，参见Makrides，S.C.(1996)Microbiol.Rev.60，512-538；Hannig G.& Makrides，S.C.(1998)TIBTECH 16，54-60；Stevens，R.C.(2000)Structures 8，R177-R185。例如，参见：J.Sanchez-Romero & V.De Lorenzo，Genetic Engineering of NonpathogenicPseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and EnvironmentalProcesses，in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology(A.Demain & J.Davies，eds.)pp.460-74(1999)(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer，Vectors to express foreign genes and techniques tomonitor gene expression for Pseudomonads，Current Opinion inBiotechnology，12：439-445(2001)；和R.Slater & R.Williams，TheExpression of Foreign DNA in Bacteria.in Molecular Biology andBiotechnology(J.Walker & R.Rapley，eds.)PP.125-54(2000)(The RoyalSociety of Chemistry，Cambridge，UK)。

其它元件

其它调节元件可包括在核酸表达构建物中。这样的元件，包括但不限于，例如转录增强子序列、翻译增强子序列、其它启动子、激活子、翻译起始和终止信号、转录终止子、顺反子调节物、多顺反子调节物、标识序列，如核苷酸序列“标识”和“标识”肽编码序列，其有助于被表达多肽的鉴别、分开、纯化或者分离，包括His-tag、Flag-tag、T7-tag、S-tag、HSV-tag、B-tag、Strep-tag、聚精氨酸、聚胱氨酸、聚苯基丙氨酸、聚天冬氨酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、环麦芽糖糊精葡糖酸转移酶、CTP：CMP-3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸胞苷转移酶、trpE或trpLE、抗生物素蛋白、链菌抗生物素蛋白、T7 gene 10、T4 gp55、葡萄球菌肽A、链球菌肽G、GST、DHFR、CBP、MBP、半乳糖结合域、钙调蛋白结合域、GFP、KSI、c-myc、ompT、ompA、pelB、NusA、泛素和hemosylinA。

本发明的编码肽的基因，除肽编码序列之外，包括下述调节元件，可操作地连接到其上：启动子、核糖体结合位点(RBS)、转录终止子、翻译起始和终止信号。有用的RBSs可从可在本发明的表达系统中用作宿主细胞的任何种获得，优选地从选择的宿主细胞获得。许多特定的和多种保守的RUBs是已知的，例如那些在如下文献中描述并且被如下文献参考的文献中的RUBs：D.Frishman等人，Starts of bacterialgenes：estimating the reliability of computer predictions，Gene 234(2)：257-65(8 Jul 1999)；和B.E.Suzek等人，A probabilistic method foridentifying start codons in bacterial genomes，Bioinformatics 17(12)：1123-30(Dec 2001)。此外，可使用天然或合成的RBSs，例如如下文献中描述的RBSs：EP 0207459(合成的RBSs)；O.Ikehata等人，Primarystructure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of aRhodococcus species and its expression in Escherichia coli，Eur.J.Biochem.181(3)：563-70(1989)(AAGGAAG的天然RBS序列)。在本发明中有用的方法、载体以及翻译和转录元件，和其它元件在如下文献中有描述，例如Gilroy的美国专利No.5,055,294和Gilroy等人的美国专利No.5，128,130；Rammler等人的美国专利No.5,281,532；Barnes等人的美国专利Nos.4,695,455和4,861,595；Gray等人的美国专利No.4,755,465；以及Wilcox的美国专利No.5,169,760。

载体

通常，核酸构建物将包括在表达载体中，并且将包括复制起点和允许细菌宿主细胞转化的和可选择标记物。相关的重组肽以适当的相位与翻译起始和终止序列装配，并且在某些实施方案中，能指导翻译多肽的分泌的前导序列也包括在核酸构建物中。任选地，根据本发明，重组肽序列可编码融合多肽，包括赋予期望特性的N末端鉴别肽，例如稳定性或者被表达重组产物的简单纯化。在某些实施方案中，载体能以游离方式(染色体外)维持，或者可被插入到宿主细菌细胞的基因组中。

在表达重组肽中，细菌使用的有用的表达载体的构建通过将编码期望靶肽的结构DNA序列，与合适的翻译起始和终止信号一起，插入到具有碳源可诱导型启动子的可操作的阅读框中进行。载体包括一个或多个表型可选择的标记物，和一个复制起点，以确保载体的保持，如果期望，以便在宿主中提供扩增。可选地，载体进一步提供了允许整合到宿主细胞的基因组中的序列。根据本发明，用于转化的合适宿主包括任何能表达碳源可诱导型启动子驱动的重组肽的细菌细胞。在一些实施方案中，细菌包括埃希氏菌属(Escherichia)和假单胞菌属中不同的种。

用于在宿主细胞中表达重组肽的本技术领域熟知的载体，和这些载体中的任意载体，可被修饰，并且用于表达本发明的相关重组肽。这样的载体包括，例如质粒、粘粒和噬菌体表达载体。可被修饰以用于本发明的有用的质粒载体的实例，包括但不限于，表达质粒pBBR1MCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO1600和RSF1010。进一步的实例可包括pALTER-Ex1、pALTER-Ex2、pBAD/His、pBAD/Myc-His、pBAD/gIII、pCal-n、pCal-n-EK、pCal-c、pCal-Kc、pcDNA2.1、pDUAL、pET-3a-c、pET 9a-d、pET-11a-d、pET-12a-c、pET-14b、pET15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21a-d(+)、pET-22b(+)、pET-23a-d(+)、pET24a-d(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET28a-c(+)、pET-29a-c(+)、pET-30a-c(+)、pET31b(+)、pET-32a-c(+)、pET-33b(+)、pET-34b(+)、pET35b(+)、pET-36b(+)、pET-37b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a-c(+)、pET-42a-c(+)、pET-43a-c(+)、pETBlue-1、pETBlue-2、pETBlue-3、pGEMEX-1、pGEMEX-2、pGEXlλT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P、pHAT10/11/12、pHAT20、pHAT-GFPuv、pKK223-3、pLEX、pMAL-c2X、pMAL-c2E、pMAL-c2g、pMAL-p2X、pMAL-p2E、pMAL-p2G、pProEX HT、pPROLar.A、pPROTet.E、pQE-9、pQE-16、pQE-30/31/32、pQE-40、pQE-50、pQE-70、pQE-80/81/82L、pQE-100、pRSET和pSE280、pSE380、pSE420、pThioHis、pTrc99A、pTrcHis、pTrcHis2、pTriEx-1、pTriEx-2、pTrxFus。这样的有用的载体的其它实例包括如下文献描述的那些载体，例如N.Hayase，Appl.Envir.Microbiol.60(9)：3336-42(1994年9月)；A.A.Lushnikov等人，Basic Life Sci.30：657-62(1985)；S.Graupner & W.Wackernagel，Biomolec.Eng.17(1)：11-16.(2000年10月)；H.P.Schweizer，Curr.Opin.Biotech.12(5)：439-45(2001年10月)；M.Bagdasarian & K.N.Timmis，Curr.Topics Microbiol.Immunol.96：47-67(1982)；T.Ishii等人，FEMS Microbiol.Lett.116(3)：307-13(1994年3月1日)；I.N.Olekhnovich& YK.Fomichev，Gene 140(1)：63-65(1994年3月11日)；M.Tsuda & T.Nakazawa，Gene 136(1-2)：257-62(1993年12月22日)；C.Nieto等人，Gene 87(1)：145-49(1990年3月1日)；J.D.Jones & N.Gutterson，Gene61(3)：299-306(1987)；M.Bagdasarian等人，Gene 16(1-3)：237-47(1981年12月)；H.P.Schweizer等人，Genet.Eng.(NY)23：69-81(2001)；P.Mukhopadhyay等人，J.Bact.172(1)：477-80(1990年1月)；D.O.Wood等人，J.Bact.145(3)：1448-51(Mar 1981)和R.Holtwick等人，Microbiology 147(Pt2)：337-44(2001年2月)。

在细菌宿主细胞中有用的表达载体的进一步的实例包括表5中罗列的那些表达载体，正如来自所表明的复制子：

表5.有用的表达载体的一些实例

复制子	载体
复制子	载体	pPS10	pCN39，pCN51
RSF1010	pKT261-3	pPS10	pCN39，pCN51
	pKT261-3	pMMB66EH
	pEB8	pMMB66EH
	pEB8	pPLGN1
	pMYC1050	pPLGN1
	pMYC1050	RK2/RP1	pRK415
pJB653			pRK415
pJB653	pRO1600		pUCP
pBSP			pUCP

表达质粒，RSF1010，已经被描述，例如F.Heffron等人在Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 72(9)：3623-27(1975年9月)，和K.Nagahari & K.Sakaguchi在J.Bact.133(3)：1527-29(1978年3月)中。质粒RSF1010及其衍生物可在本发明中用作载体。本技术领域熟知的，RSF1010的有用的衍生物的例证包括，例如pKT212、pKT214、pKT231和相关质粒，以及pMYC1050和相关质粒(例如参见Thompson等人的美国专利Nos.5,527,883和5,840,554)，如pMYC1803。质粒pMYC1803来自RSF1010-基质粒pTJS260(参见Wilcox的美国专利No.5,169,760)，该质粒携带有可调节的四环素抗性标记物，和来自RSF1010的复制和活动基因座(mobilization loci)。其它例证性的有用的载体包括在Puhler等人的美国专利No.4,680,264中描述的那些载体。

在其它实施方案中，表达质粒被用作表达载体。在另一个实施例方案中，RSF1010或其衍生物被用作表达载体。仍然在另一个实施方案中，pMYC1050或其衍生物或pMYC1803或其衍生物被用作表达载体。

IV.重组多肽在细菌宿主细胞中的表达

本发明的实施方案表达肽生产中有用的重组肽的方法。通常，该过程提供了核酸构建物的表达，该构建物包括编码至少一个重组多肽的核酸，该重组多肽核酸可操作地连接到至少一个甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子上，其中核酸构建物在宿主细胞中表达，该宿主细胞已经被变得缺乏代谢或降解甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物的能力。在一些实施方案中，可诱导型的启动子可以是甘露糖醇可诱导型的启动子或其衍生物。在其它实施方案中，宿主细胞被变得缺乏代谢或降解甘露糖醇的能力，甘露糖醇被用作启动子诱导中的诱导物。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞可以是假单胞菌、或密切相关的细菌细胞。在其它实施方案中，宿主细胞可以是荧光假单胞菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞缺乏代谢或降解甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或其衍生物或类似物的能力，并且表达编码至少一个重组多肽的核酸，该重组多肽可操作地连接到至少一个甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、或甘油可诱导型的启动子上。

该方法通常包括：

a)提供宿主细胞，优选地是大肠杆菌或荧光假单胞菌，正如本发明中描述的，

b)用至少一个核酸表达载体转染宿主细胞，该载体包括至少一个相关的重组多肽，该重组多肽可操作地连接到至少一个甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子上，和在足够的培养基中培养宿主细胞；以及

c)在培养基中添加甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇、或其类似物或衍生物，以能够诱导相关肽表达的量添加，其中宿主细胞被变得不能降解或代谢添加的甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇、或其类似物或衍生物；以及

d)表达相关的靶重组多肽。

该方法可进一步包括e)用至少一个核酸表达构建物转染宿主细胞，该构建物包括一个额外的可诱导型启动子，其可操作地连接到至少一个相关肽上。此外，该方法进一步包括f)分离至少一个重组肽。该方法也可包括g)纯化至少一个重组肽。

可选地，该方法可包括在步骤c)中，添加甘油或其衍生物或类似物至培养基中，以能够诱导相关肽的量添加，其中宿主细胞已经被变得不能降解或者代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇、或其类似物或衍生物。

在一些实施方案中，可诱导型的启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子。在其它实施方案中，甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子也能通过甘油诱导。

其中该方法进一步包括e)用至少一个核酸表达构建物转染宿主细胞，该构建物包括一个额外的可诱导型的启动子，其可操作地连接到至少一个相关肽上，该相关肽可以是与核酸编码的肽相同或不同的相关肽，所述核酸可操作地连接到甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子上。其它可诱导型的启动子可以是，例如lac或tac家族启动子，包括Plac、Ptac、Ptrc、PtacII、PlacUV5、lpp^a、lpp-PlacUV5、lpp-lac、nprM-lac、T71ac、T51ac、T31ac和Pmac、trp(色氨酸饥饿)、araBAD(1-阿拉伯糖)、phoA(磷酸盐饥饿)、recA(萘啶酮酸)、proU(摩尔渗透压浓度)、cst-1(葡萄糖饥饿)、tetA(四环素)、cadA(pH)、nar(厌氧条件)、PL(热变换至42℃)、cspA(热变换至20℃)、T7(热诱导)、T4 gene32(T4感染)、Pm(烷基-或卤代-苯甲酸酯)、Pu(烷基-或卤代-甲苯)、Psal(水杨酸盐)、ant(邻氨基苯甲酸)、ben(苯甲酸酯)或VHb(氧)启动子。

在一些实施方案中，在肽，或不止一种相关肽的产生中，本发明可使用不止一种甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子。在其它实施方案中，多个启动子可具有不同的序列，每一个启动子能基于所使用的特定序列，以不同的速率用相同的碳源诱导。例如，甘露糖醇可诱导型的启动子序列能表达相关肽，其表达高于基于不同固有特性或修饰的具有不同核酸序列的甘露糖醇可诱导型的启动子。可选地，，除了启动子序列，可包括增强子元件，其对启动子序列的表达速率的不同影响基于增强子元件与各自启动子的间隙或连接，不管启动子序列相同还是不同。

在本发明的实施方案中，甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子与lac或tac家族启动子一起用在细菌宿主细胞中，lac或tac家族启动子例如包括Plac、Ptac、Ptrc、PtacII、PlacUV5、lpp-lac、nprM-lac、T71ac、T51ac、T31ac和Pmac。

在一些实施方案中，表达系统能以至少0.1g/L到至少80g/L的总多肽生产率表达靶多肽。在其它实施方案中，重组多肽以至少0.3g/L、0.4g/L、0.7g/L、1.0g/L、1.5g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L或至少80g/L的水平被表达。

在一个实施方案中，至少一个重组肽能在细菌细胞中被表达，该细菌细胞不能降解或者代谢甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇，其中使用甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、或甘油或其衍生物或类似物诱导重组多肽的表达。可选地，不止一种重组肽可在本发明的细胞中被表达，其中编码重组肽的核酸可包含在相同的载体中，或者可选地，包含在多个载体中，并且可操作地连接到不止一个启动子上，包括至少一个甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子。

仍然在另一个实施方案中，编码不同靶多肽的核酸构建物可保持在细菌宿主细胞中，该细菌宿主细胞不能降解或者代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物，其中甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇、或甘油被用于诱导靶多肽的表达。在这些实施方案中，编码第一个相关肽的第一个核酸，和编码第二个相关肽的第二个核酸，通过使用不同的启动子彼此独立地调节，其中至少一个启动子是甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子。这些多个靶基因表达系统，使每一个肽的表达的独立调节和最优化成为可能。在一些实施方案中，一个被表达的肽能调制其它相关肽的表达或所得到的肽特性。

这样的多个靶基因系统的实例，包括但不限于：(1)其中靶基因中的一个基因的表达产物与其它靶基因本身互相作用的系统；(2)其中靶基因中的一个基因的表达产物与其它靶基因的表达产物互相作用的系统，例如，肽及其结合肽，或者βn肽的α-和β-多肽；(3)其中两个基因的两个表达产物均与第三组分相互作用的系统，例如，宿主细胞中存在的第三组分；(4)其中两个基因的两个表达产物均参与共同的生物催化途径的系统；和(5)其中两个基因的两个表达产物功能独立于彼此，例如双克隆抗体表达系统。

在上面罗列的类型(1)的多个靶基因的系统的一个实例中，第一个靶基因能编码期望的靶肽，其中第一个靶基因在可调节的启动子的控制下；然后第二个靶基因能编码调节第一个靶基因的启动子中涉及的肽，例如第二个靶基因能编码第一个靶基因的启动子激活子肽或阻抑物肽。在一个实例中，其中第二个基因编码用于第一个基因的启动子调节肽，第二个基因的编码序列可在甘露糖醇可诱导型的启动子的控制下。在一些实施方案中，第二个基因将是维持在细胞中的独立的DNA构建物的一部分，作为具有至少10、20、30、40、50或超过50个拷贝数量的高拷贝数构建物，被维持在宿主细胞中，或者已经被插入到细胞的基因组中。

在双重靶基因系统的另一个实例中，第二个靶基因可编码辅助第一个靶基因产物的折叠的肽，或者辅助指导相关肽至细胞区室(例如侣伴蛋白质)的肽。例如，第一个靶基因产物可以是通常以错误的折叠形式在细菌宿主细胞中表达的肽。可选地，第一个靶基因产物可以是通常以不可溶形式在细菌细胞中表达的肽。第二个靶基因，在这些情况下，可编码辅助适当地折叠第一个靶基因的蛋白，或者适当地指导蛋白至细胞(例如周质)中的特定位置的蛋白质。这些肽和蛋白的实例，包括但不限于：cbpA、htpG、dnaK、dnaJ、fkbP2、groES、groEL、htpG或cbpA、HSP70蛋白、HSP110/SSE蛋白、HSP40(DNAJ-相关的)蛋白、GRPE样蛋白、HSP90蛋白、CPN60和CPN10蛋白、胞质陪伴蛋白、HSP100蛋白、小热休克蛋白(small HSPs)、Calnexin和钙网织蛋白、PDI和硫氧还蛋白相关的蛋白、肽基脯氨酸异构酶、亲环蛋白PPIases、FK-506结合蛋白、小小菌素PPIases、个体陪伴蛋白、蛋白质特异性侣伴蛋白、或分子内侣伴蛋白。可以在本发明中表达的其它蛋白包括折叠调制物，在“Guidebook to Molecular Chaperones andProtein-Folding Catalysts”(1997)ed.M.Gething，Melbourne University，Australia中对其进行了一般描述。

转化

可以使用本技术领域熟知的任何转化方法完成具有一个(或多个)载体的宿主细胞的转化，并且细菌宿主细胞作为完整细胞或者原生质体(即包括胞质体)可以被转化。例证性的转化方法包括穿孔方法，例如电穿孔、原生质体融合、细菌接合和二价阳离子处理，例如氯化钙处理或者CaCl₂/Mg2⁺处理，或者本技术领域熟知的其它方法。例如参见Morrison，J.Bact，132：349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology，101：347-362(Wu等人编著，1983)，Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编著，1994))。

选择

优选地，选择不能被成功转化的细胞用于下述转化，并且在发酵过程中连续使用。选择标记物可以是营养缺陷型选择标记物或者传统的抗生素选择标记物。当细胞为多种营养化合物缺陷型时，可以在培养基中培养该营养缺陷型细胞，所述培养基补充了所有那些营养化合物，直到用原养型恢复载体转化。在选择标记物是抗生素抗性基因的情况下，将相关的抗生素加入到培养基中，以选择未转化的和回复突变体细胞，正如本技术领域所熟知的。

发酵

正如此处所用，术语“发酵”包括如下的实施方案，其中使用了真正的发酵，和其中使用了其它非发酵的培养物模式的实施方案。发酵能以任何规模进行。在一些实施方案中，发酵培养基可以选自富集培养基、基本培养基、矿物盐培养基；可以使用富集培养基，但优选地，避免使用富集培养基。在另一个实施方案中，选择了基本培养基或者矿物盐培养基。

矿物盐培养基包括矿物盐和碳源，例如葡萄糖、蔗糖、或甘油。矿物盐培养基的实例包括，例如M9培养基、假单胞菌培养基(ATCC179)、Davis和Mingioli培养基(参见BD Davis & ES Mingioli，in J.Bact.60：17-28(1950))。用于产生矿物盐培养基的矿物盐包括那些选择如下的矿物盐，例如磷酸钾、硫酸铵或氯化铵、硫酸镁或氯化镁，和微量矿物质如氯化钙、硼酸盐，和铁、铜、锰、和锌的硫酸盐。矿物盐培养基中不包括有机氮源，如蛋白胨、胰化蛋白胨、氨基酸、或酵母提取物。相反，使用了无机氮源，可以选自，例如铵盐、氨水和气态氨。典型的矿物盐培养基含有葡萄糖作为碳源。与矿物盐培养基相比，基本培养基也能含有矿物盐和碳源，但可以，例如用低水平的氨基酸、维生素、蛋白胨或其它成分补充，尽管这些成分以非常低的水平添加。

理想地，所选择的培养基允许高细胞密度培养(HCDC)，用于细菌细胞的培养。HCDC可从分批过程开始，随后是两相补料分批培养。在分批部分中无限培养后，在3个双倍时间(3 doubling times)的周期内，以降低的特定速率控制培养，其中生物量浓度可增加几倍。这些培养过程的进一步的细节描述在Riesenberg，D.；Schulz，V.；Knorre，W.A.；Pohl，H.D.；Korz，D.；Sanders，E.A.；Ross，A.；Deckwer，W.D.(1991)“High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specificgrowth rate”J Biotechnol：20(1)17-27中。

根据本发明的表达系统能以任何发酵形式培养。例如，此处可使用分批、补料分批、半连续和连续发酵模式。

根据本发明的表达系统在任何规模(即体积)的发酵中的转基因表达中有用。因此，例如可使用微升规模、厘升规模和分升规模发酵体积；并且可使用1升规模和更大规模的发酵体积。在一些实施方案中，发酵体积可以是1升，或者高于1升。在其它实施方案中，发酵体积可以是或者高于5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1,000升、2,000升、5,000升、10,000升或50,000升。

在本发明中，转化的宿主细胞的生长、培养和/或发酵在允许宿主细胞存活的温度范围内进行，优选地，温度范围在大约4℃到大约55℃之间，包括4℃和55℃。

细胞密度

在本发明的实施方案中，本发明使用了假单胞菌和密切相关的细菌。假单胞菌，尤其是荧光假单胞菌，可以在高细胞密度中培养。所以，根据本发明的荧光假单胞菌表达系统可提供大约20g/L或更高的细胞密度。同样地，根据本发明的荧光假单胞菌表达系统可提供至少大约70g/L的细胞密度，以生物量/升的形式表示，生物量被测量为干燥细胞重量。

在一些实施方案中，细胞密度至少是20g/L。在另一个实施方案中，细胞密度至少是25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L或者至少150g/L。

在其它实施方案中，诱导时的细胞密度可以在20g/L到150g/L之间；20g/L到120g/L之间；20g/到80g/L之间；25g/L到80g/L之间；30g/L和80g/L之间；35g/L和80g/L之间；40g/L和80g/L之间；45g/L和80g/L之间；50g/L到80g/L之间；50g/L到75g/L之间；50g/L到70g/L之间；40g/L到80g/L之间。

重组肽的表达水平

根据本发明的表达系统可表达转基因多肽，以5％到80％总细胞肽的水平(％tcp)表达。在一些实施方案中，表达水平可以是或者高于5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％tcp。

分离和纯化

可以用本技术领域熟知的标准技术分离根据本发明产生的重组肽，且纯化到相当纯度，这些技术包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、镍层析、羟基磷灰石层析、反相层析、凝集素层析、制备电泳、去污剂增溶、具有这类物质作为柱层析的选择性沉淀、免疫纯化方法和其它方法。例如，具有已确定的分子粘附特性的肽能可逆地融合配体。用适当的配体，肽可以选择性地吸附到纯化柱上，然后以相对纯的形式从柱上被释放。然后通过酶活性去除融合肽。此外，可使用免疫亲和柱或Ni-NTA柱纯化肽。例如，如下文献中描述了一般的技术，R.Scopes，Peptide Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag：N.Y.(1982)；Deutscher，Guide to Peptide Purification，Academic Press(1990)；美国专利No.4,511,503；S.Roe，PeptidePurification Techniques：A Practical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等人，Peptide Methods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)；AK Patra等人，Peptide Expr Purif，18(2)：p/182-92(2000)；和R.Mukhija等人，Gene 165(2)：p.303-6(1995)。例如参见Ausubel等人(1987以及定期增刊)；Deutscher(1990)“Guide to Peptide Purification，”Methods in Enzymology，182卷，和该系列中的其它卷；Coligan等人(1996以及定期增刊)的Current Protocols in Peptide ScienceWiley/Greene，NY；以及制造商关于使用肽纯化产物的文献，例如Pharmacia，Piscataway，NJ.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。与重组技术一起使用允许融合到适当的片段上，例如融合到FLAG序列或可通过蛋白酶去除的序列融合的等价序列上。例如参见，Hochuli(1989)Chemische Industrie 12：69-70；Hochuli(1990)“Purification ofRecombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent”in Setlow(ed.)Genetic Engineering，Principle and Methods.12：87-98，Plenum Press，NY；和Crowe等人(1992)QIAexpress：The High Level Expression & PeptidePurification System QIAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。

所表达肽的检测通过本技术领域已知的方法实现，例如包括放射性免疫测定、Western印迹技术或者免疫沉淀。

可用多种方法从重组细胞培养物回收且纯化重组产生的且表达的肽，例如在必要的时候，高效液相层析(HPLC)可用于最终的纯化步骤。

本发明中被表达的某些肽可形成不可溶的集合物(“包涵体”)。几种方法适用于从包涵体纯化肽。例如，包涵体的纯化通常涉及通过破坏宿主细胞提取、分离和/或纯化包涵体，例如通过在50mM TRIS/HCLpH 7.5、50mM NaCl、5mM MgCl₂、1mM DTT、0.1mM ATP和1mMPMSF的缓冲液中培养。细胞悬浮液通常通过弗氏压碎器2-3次进行裂解。细胞悬浮液也可使用Polytron(Brinknan Instruments)被均质化，或者在冰上超声处理。溶解细菌的备选方法对本技术领域的熟练技术人员是显而易见的(例如参见Sambrook等人，如上文；Ausubel等人，如上文)。

如果需要，包涵体可被溶解，并且溶解的细胞悬浮液通常被离心，以去除不需要的不可溶物质。形成包涵体的肽可用适合的缓冲液通过稀释或者渗析复性。合适的溶剂，包括但不限于，尿素(大约4M到大约8M)、甲酰胺(至少大约80％，基于体积/体积)和盐酸胍(大约4M到大约8M)。尽管盐酸胍和类似试剂是变性剂，但该变性不是不可逆的，并且一旦去除(例如通过渗析)或者稀释变性剂，就会发生复性，从而会再次形成免疫和/或生物活性肽。其它合适的缓冲液对本技术领域的熟练技术人员是已知的。

可选地，可以从宿主周质纯化重组肽。在宿主细胞溶解后，当重组肽输出到宿主细胞的周质中时，除了本技术领域熟知的其它技术，细菌的周质部分可通过冷渗透休克分离。为了从周质分离重组肽，例如，可离心细菌细胞以形成粒状沉淀。将粒状沉淀重悬于含有20％蔗糖的缓冲液中。为了溶解细胞，可离心细菌，并且将粒状沉淀重悬于冰冷的5mM MgSO₄中，在冰浴中保持大约10分钟。离心细胞悬浮液，轻轻倒出且保留悬浮液。可通过本技术领域的熟练技术人员熟知的标准分离技术，从宿主肽分离悬浮液中存在的重组肽。

初始盐分馏可从相关的重组肽分离许多不需要的宿主细胞肽(或者来自细胞培养基的肽)。一个这样的实例是硫酸铵。硫酸铵通过有效地降低肽混合物中的水量沉淀肽。然后肽基于它们的溶解度沉淀。肽越疏水，就越有可能以较低硫酸铵浓度沉淀。典型的方法包括在肽溶液中添加饱和的硫酸铵，以便所得到的硫酸铵浓度在20-30％之间。该浓度将沉淀最疏水的肽。然后丢弃沉淀物(除非相关肽是疏水的)，并且将硫酸铵加入到上清液中，至已知能沉淀相关肽的浓度。然后将沉淀物溶解在缓冲液中，如果需要，或者通过渗析或者渗滤去除过量的盐。依赖于肽溶解度的其它方法，如冷乙醇沉淀，对本技术领域的技术人员是熟知的，且可用于分馏复杂的肽混合物。

重组肽的分子量可通过不同孔径(例如Amicon或微孔膜)的膜，使用超滤，从更大和更小的肽分离。作为第一个步骤，通过膜超滤肽混合物，该膜的孔径具有比相关肽的分子量更小的分子量截留。然后针对分子截留大于相关肽的分子量的膜，对超滤的渗余物进行超滤。重组肽通过膜进入到过滤物中。然后按照如下描述对过滤物进行层析法分离。

重组肽也可基于其大小、净表面电荷、疏水性和对配体的亲和性，从其它肽分离。此外，针对肽产生的抗体可共轭到柱基质上，肽被免疫纯化。所有这些方法在本技术领域是熟知的。对本技术领域的技术人员显而易见的是，层析技术可以任何规模，使用许多不同制造商(例如Pharmacia Biotech)的设备进行。

复性和重折叠

不可溶的肽可复性或重折叠，以产生二级和三级肽结构构象。必要时，在完成重组产物的构造中，可使用肽重折叠步骤。可使用本技术领域已知的试剂实现重折叠和复性，以促进肽的解离和结合。例如，可以用二硫苏糖醇培养肽，随后用氧化谷胱甘肽二钠盐培养，随后用含有重折叠试剂如尿素的缓冲液培养。

重组肽也可被复性，例如，通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或者50mM醋酸钠，pH 6缓冲液加200mM NaCl透析。可选地，肽可以被重折叠，同时固定在柱上，如Ni NTA柱，通过使用线性6M-1M尿素梯度，在500mM NaCl、20％甘油、20mM Tris/HCl pH 7.4中，含有蛋白酶抑制剂。复性可在1.5小时或更多时间内进行。在复性后，可加入250mM咪唑(immidazole)洗脱肽。通过最后的渗析步骤，用PBS或50mM醋酸钠pH 6缓冲液加200mM NaCl去除Immidazole。纯化的肽于4℃储存或者-80℃冷冻。

其它方法包括，例如如下文献中描述的方法：MH Lee等人，PeptideExpr.Purif，25(1)：p.166-73(2002)；W.K.Cho等人，J.Biotechnology，77(2-3)：p.169-78(2000)；Ausubel等人(1987及其定期增刊)，Deutscher(1990)“Guide to Peptide Purification，”Methods in Enzymology，第182卷，其该系列中的其它卷；Coligan等人(1996及其定期增刊)CurrentProtocols in Peptide Science Wiley/Greene，NY，S.Roe，PeptidePurification Techniques：A Practical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等人，Peptide Methods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)。

V.重组多肽

本发明提供了在细菌宿主细胞表达系统中，相关的重组肽的产生。可在本发明中使用的重组多肽的实例包括来自原核和真核有机体的多肽。这样的有机体包括来自古细菌域、细菌域、真核域的有机体，包括来自原生生物界、真菌界、植物界和动物界的有机体。

可在本发明中使用的肽的类型，除了上面描述的蛋白和肽，包括非限定性的实例，如酶，其负责催化活细胞的上千种化学反应；角蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白，它们是结构的或者支持肽的主要类型；血红蛋白和其它气体转运肽；卵清蛋白、酪蛋白和其它营养分子；抗体，它们是免疫系统的分子；肽激素，其调节代谢；和进行机械工作的肽，如肌动蛋白和肌球蛋白，收缩性肌肉肽。

其它特定的非限定性多肽包括分子，如肾素，一种生长激素，包括人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂肽；.α.1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；血小板生成素；促卵泡生长激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子，如肽C；心房肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人尿组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；鼠性腺促素关连肽(mouse gonadotropin-associated peptide)；微生物肽，如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；肽A或D；类风湿因子；神经营养因子，如脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-.β.；心营养素(cardiotrophins)(心肌肥厚因子)，如心营养素-1(CT-I)；血小板源性生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-.β.1，TGF-.β.2、TGF-.β.3、TGF-.β.4或TGF-.β.5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合肽；CD肽，如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨生成诱导因子；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(ILs)，例如IL-I到IL-10；抗-HER-2抗体；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜肽；促衰变因子；病毒抗原，如AIDS包膜的部分；转运肽；归巢受体；地址素；调节肽；抗体；和上面所列多肽的任意多肽的片段。

根据本发明表达的重组肽可以从多核苷酸表达，其中靶多肽编码序列可操作地连接到转录和翻译调节元件上，形成功能基因，宿主细胞从该功能基因表达该肽或肽。编码序列可以是用于靶多肽的天然编码序列，如果可用，但更优选地是已经被选择、改进或最优化，以以便在所选择的表达宿主细胞中使用的编码序列：例如，通过合成基因以表现假单胞菌种如荧光假单胞菌的密码子使用偏好。所得到的该基因(或者这些基因)已经在载体内被构建，或者被插入到一个或多个载体中，然后将被转化到表达宿主细胞中。以“可表达形式”提供的核酸或多核苷酸指，含有至少一个基因的核酸或多核苷酸，所述至少一个基因能被选择的细菌表达宿主细胞表达。

分子遗传学和遗传工程技术要求的大量序列信息可广泛地公开获得。可从GenBank访问完整的哺乳动物以及人类的核苷酸序列、基因、cDNA序列、氨基酸序列和基因组，其URL地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez。其它信息也可从GeneCards获得，关于基因及其产物和生物医疗应用的电子百科全书集成信息可从Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)获得，核苷酸序列信息也可从EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/)或DNA Databank或Japan(DDBJ，http://www.ddbi.nig.ac.jp/获得；氨基酸序列信息的其它位置包括Georgetown’s peptide informationresource，其网址为(http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/和Swiss-Prot(http://au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)。

本发明在如下实施例中进行了更详细的说明。这些实施例的目的是对本发明进行例证性说明，不是对其进行限制。

实施例

材料和方法

除非另外说明，使用分子生物学领域熟知的标准的技术、载体、控制序列元件和其它表达系统元件，用于核酸操纵、转化和表达。这样的标准的技术、载体和元件可在如下文献中发现，例如：Ausubel等人(编著)，Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John Wiley& Sons)；Sambrook，Fritsch，& Maniatis(编著)，Molecular Cloning(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)；Berger & Kimmel，Methods in Enzymology 152：Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)(Academic Press)；和Bukhari等人(编著)，DNA InsertionElements，Plasmids and Episomes(1977)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY)。

除非另外说明，使用PTC225温度循环器(MJ Research，South SanFrancisco，CA，USA)，根据表6中的方法进行PCR反应。

表6.PCR方法

反应混合物(100μL总体积)		热循环步骤
反应混合物(100μL总体积)		热循环步骤				10μL	10X Herculase缓冲液^*	步骤1	1个循环	2分钟	94℃
		步骤2	35个循环	30秒	94℃	10μL	10X Herculase缓冲液^*	步骤1	1个循环	2分钟	94℃
				30秒	94℃	2μL	10mM dNTPs^*	30秒	55℃
0.25ng	每一引物			1分钟	68℃	2μL	10mM dNTPs^*	30秒	55℃
0.25ng	每一引物			1分钟	68℃	1-5ng	模板DNA	步骤3	1个循环	10分钟	70℃
1μL	Herculase DNA聚合酶^*	步骤4	1个循环	保持	4℃	1-5ng	模板DNA	步骤3	1个循环	10分钟	70℃
1μL	Herculase DNA聚合酶^*	步骤4	1个循环	保持	4℃	剩余物	蒸馏的去离子水(ddH₂O)

^*(Stratagene，La Jolla，Ca.USA，此处被称作“Stratagene”)

菌株和质粒

表7中描述了本发明实施例中所用的菌株。使用Qiagen的QIAprepSpin Miniprep Kit；Valencia，CA)制备质粒，并且通过如下新鲜铺平板细胞的电穿孔将质粒转化到荧光假单胞菌DC283或DC388中。例如参见Enderle等人(1998)“Electroporation of freshly plated Escherichia coliand Pseudomonas aeruginosa cells，”Biotechniques 25：954-958。用接种环将细胞刮到LB琼脂平板上，在500μl Milli-Q水中洗涤3次，且重悬于40μ1 Milli-Q水中。用40μl细胞混合1μl质粒DNA，转移到冰冷的电穿孔杯中。电穿孔用Gene Pulser II(Bio-Rad，Hercules，CA)进行，其场强度为2.25kV/cm。立即转移细胞至1ml SOC培养基(Invitrogen；Carlsbad，CA)中，于30℃培养1-1.5小时，随后涂抹到选择琼脂平板(M9葡萄糖加尿嘧啶)上。于30℃培养琼脂平板。

表7.荧光假单胞菌菌株

菌株基因型

名称

DC283 ΔpyrF ΔproC ΔbenAB lsc∷lacI^Q1

DC388 ΔpyrF ΔproC ΔbenAB lsc∷lacI^Q1ΔmtlDYZ

DC389 ΔpyrF ΔproC ΔbenAB lsc∷lacI^Q1ΔmtlDYZ+pDOW1365-1

DC390 ΔpyrF ΔproC ΔbenAB lsc∷lacI^Q1ΔmtlDYZ+pDOW1365-1

pDOW1339

MB214 MB101 lacI lacZYA

生长实验

甘油的所有百分比浓度表示为v/v，葡萄糖和甘露糖醇的浓度百分比表示为w/v。生长实验在1L的平底(bottom-baffled)摇瓶中的含有200ml的矿物盐培养基(含有5g/L酵母提取物和微量元素)中进行。标准培养基含有9.5％甘油，这相当于1.3M的浓度。对于一些实施方案，将甘油浓度降低到2％(＝274mM)或5％(＝685mM)。当葡萄糖用作碳源时，将不含甘油的摇瓶培养基中的25％葡萄糖溶液过滤灭菌，且加入到高压灭菌的培养基中，至葡萄糖的终浓度为5％(＝278mM)或12.5％(＝694mM)。如果需要，在摇瓶培养基中加入尿嘧啶(750μg/ml)。在M9葡萄糖(如果要求，加入尿嘧啶250μg/ml)中培养的4mL的菌株过夜培养物用作摇瓶的接种物。通过在确定的时间间隔，用Eppendorf BioPhotometer(Eppendorf AG；Hamburg，Germany)的1-cm塑料杯中测量培养物在600nm处的光学密度，监控生长。甘露糖醇启动子的诱导通常在发酵24小时四个、时，通过从20％储备溶液加入1％(＝55mM)甘露糖醇而进行。

20升发酵桶中DC390的培养

菌株DC390在矿物盐培养基中，在标准的曝气20-L研究用发酵容器中培养，如Risenberg等人(1991)”High cell density cultivation ofEscherichia coli at controlled specific growth rate，″J.Biotech.20(1)：17-27中所做描述，有微小改变。培养物于32℃培养72小时；通过加入氨水将pH维持在6.5。最初增加搅拌和喷洒气流速度，以便将溶解的氧控制在正水平，但当这些都达到时，最大程度地混合这些溶解的氧。通过发酵过程提供葡萄糖或甘油，以维持轻微过量。将补料分批高密度发酵过程划分为大约24小时的最初生长阶段，和基因表达(诱导)阶段，在该阶段当靶细胞密度在575nm处达到170OD单位时，将1％(w/v)浓度的甘露糖醇加入以起始重组基因表达。随着时间推移，不断监控光学密度和细胞荧光。最终的细胞密度依赖于碳源而变化。

荧光分析

用Spectramax Gemini microplate fluorirneter(Molecular DevicesCorporation；Sunnyvale，CA)，使用下述设置测量培养物的荧光：激发485nm，发射538nm，带通滤波器530nm。在分析之前，在1-cm杯中如上描述测量样品的光学密度(OD₆₀₀)。用摇瓶培养基在Eppendorf管中将样品稀释至OD₆₀₀＝5，然后用水直接在96孔微型平板中稀释至OD₆₀₀＝1。稀释的摇瓶培养基(1∶5)用作空白组。用Spectramax Plusmicroplate spectrophotometer(Molecular Devices Corporation；Sunnyvale，CA)测量96孔平板中的样品，在600nm处的光学密度，荧光值以RFUs-相对荧光单位表示。

对于流式细胞计量术，用甲醛如下固定培养物样品：将1mL细胞离心沉淀，重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.2)中。在通风橱中，加入37％甲醛(原液浓度)至浓度为2％。室温下将细胞培养5分钟，然后离心，且重悬于PBS中，共进行三次。调节OD₆₀₀至0.01，细胞于4℃储存，直到用于分析。将所有洗涤物作为危险废弃物收集起来。通过Cytometry Research，San Diego，CA进行流式细胞分析。使用FCS Express2软件(DeNovo Software；Thornhill，Ontario，Canada)对数据绘图。

甘露糖醇，甘油和葡萄糖浓度的分析

用带有CarboPac PA10分析柱和ED50脉冲安培检测器(PAD)(Dionex Corporation；Sunnyvale，CA)的Dionex离子色谱法确定培养液中的甘露糖醇、甘油和葡萄糖的浓度。通过离心分离细胞和培养液，悬浮液样品于-20℃储存，直到使用。用水将样品稀释几千倍，直到浓度大约为10μg/ml，并且将其用自动取样器注射到柱(注射体积25μl)上。用18mM氢氧化钠水溶液平衡柱。以1ml/min的流速，试验条件如下：18mM NaOH进行10分钟；在1分钟内增加至100mM NaOH；100mM NaOH进行1分钟；18mM NaOH进行8分钟，以达到柱条件。大概的滞留时间如下：甘油2.2分钟；甘露糖醇3.4分钟；葡萄糖12.8分钟。基于已知浓度的标准计算浓度。

实施例1：各种假单胞菌中mtl操纵子的鉴定

ERGO数据库中的荧光假单胞菌MB101基因组的BLAST搜索，使用了Brunker等人(1998)“Structure and function of the genes involvedin mannitol，arabitol，and glucitol utilization from Pseudomonasfluorescens DSM50106，”Gene 206(1)：117-126中描述的DSM50106 rntlE序列，表明MB1010具有与DSM50106中描述的操纵子类似的mtl操纵子，从RXF01195(mtlE)开始。图3所示为四个不同的假单胞菌中mtl操纵子的基因比对，这四个假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO-I、荧光假单胞菌DSM50106、荧光假单胞菌Pf0-1和荧光假单胞菌MB101。有两种类型的基因重排，在一种基因重排中，转录激活基因，mtlR，直接位于mtl操纵子的上游，在另一种基因重排中，mtlR不直接存在于mtl操纵子的上游，这是针对MB101和DSM50106的情况而言。

图4所示为MB101、DSM50106、荧光假单胞菌Pf0-1和铜绿假单胞菌PA0-1在mtlE ATG起始密码子的直接上游的区域之间的序列比对。在这四个菌株中，发现了匹配-35和-10启动子区域保守序列的优选的保守序列，其支持该区域作为mtl操纵子的启动子这个结论。此外，发现了两个优选的保守区域，一个15bp，在-35区域的上游，另一个14bp，在-10区域的下游。

实施例2：用于mtl操纵子的启动子区域的克隆

使用引物mtlE3(5’-ATATGAGCTCGAGCGTGGGAACGATCAAGTGT-3’-SEQ.ID.No.14)和mtlE4(5’-ATATCCGCGGTTCCGCGCCCAGAGGGCTAC-3’SEQ.ID.No.15)，通过PCR扩增MB1011mtlE基因(Seq.ID.No.9，表3)上游的299区域(参见表8)，并且该区域克隆在CopGFP报道基因的前面，以产生pDOW1365-1(图5)。该克隆区域包括在DSM50106和MB101之间的所有保守序列，以及比上游更远的序列。对两个pDOW1365-1克隆测序；一个(pDOW1365-1)具有与基因组参考序列(由Dow Chemical公司测序)相同的序列，而另一个具有克隆和参考序列之间的14个差异。由于这些大量的变化不可能单独由易错PCR扩增过程导致，所以我们推测出，DNA聚合酶显而易见地，在P CR扩增中的循环之间的上游区域中的四个和一半的直接重复之间，交换模板。稍微改变重复的序列，导致PCR产物中的序列多样性。

使用引物mtlE5(5’-ATATGAGCTCTAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCA-3’SEQ.ID.No.16)和mtlE4，通过PCR扩增来自相同区域(SEQ.ID.NO.11，表3)的126bp的启动子区域，并且将该区域在CopGFP基因之前克隆，以产生pDOW1369(没有给出图谱)。

使用引物mtlE6(SEQ.ID.No.17)和mtlE7(SEQ.ID.No.18)(表8)，通过PCR扩增克隆荧光假单胞菌Pf0-1(SEQ.ID.No.10)中的mtlR和mtlE之间的203bp区域，并且将其插入到CopGFP报道基因的上游，从而产生pDOW1370-7(没有给出图)。克隆的启动子区域的序列与从ERGO数据库获得的参考序列相同。

使用引物mtlE9(5’- ATATGAGCTCACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAG 3’SEQ.ID.NO.19)和mtlE4(表8)，通过PCR扩增来自相同区域(SEQ.ID.NO.12，表3)的147bp的启动子区域，并且在CopGFP基因之前克隆，以产生pDOW1377(没有给出图)。

使用引物mtlE9和mtlEll(5’-ATATCCGCGGGTGCGTTGATTACAGCCTTCAAA 3’-SEQ.ID.NO.20)(表8)，通过PCR扩增来自相同区域(SEQ.ID.NO.13，表3)的77bp的启动子区域，并且在CopGFP基因之前克隆，以产生pDOW1378(没有给出图)。

为了测量琼脂平板上的相对启动子活性，DC283，荧光假单胞菌MB101的尿嘧啶和脯氨酸缺乏突变体，用质粒转化，并且在含有250μg/mL尿嘧啶、100μM FeCl₃(以便抑制荧光绿脓菌荧光素的产生，当离子受限时，其通过细胞产生)和各种碳源的M9平板上划线，于30℃培养。通过蓝光透射仪(Dark Reader，Clare Chemical Research)检查集落。在存在甘露糖醇的情况下，仅有pDOW1365-1或pDOW1365-2中的299bp MB101片段，和pDOW1377中的147bp片段诱导CopGFP基因(参见表9和图6)——在任何测试条件下，其它片段不能表达任何CopGFP。所有片段包括-35和-10启动子区域。当用1％甘油或葡萄糖补充甘露糖醇时，pDOW1365-1构建物仍然产生CopGFP，这表明启动子不能受到任一种碳源的分解代谢物抑制。当1％甘油或1％葡萄糖是单独的碳源时，pDOW1365-1启动子没有活性。然而，当甘油以5％和9.5％(表9)的水平使用时，启动子是有活性的，这表明甘油可作为mtl启动子的偶然的诱导物。

表8.对对工程化限制酶切位点加下划线的寡核苷酸

寡核苷酸序列 SEQ.ID.

mtlE3 5’ATATGAGCTCGAGCGTGGGAACGATCAAGTGT 14

mtlE4 5’ATATCCGCGGTTCCGCGCCCAGAGGGCTAC 15

mtlE5 5’ATATGAGCTCTAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCA 16

mtlE6 5’ATATGAGCTCTGAGCAGGAAAATCTGTACG 17

mtlE7 5’ATATCCGCGGGGGGGCAGAAGGACAGTTAT 18

mtlE9 5’ATATGAGCTCACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAG 19

mtlE11 5’ATATCCGCGGGTGCGTTGATTACAGCCTTCAAA 20

man1 5’GCCGACAAGGTAGTGGTGCTCAACA 21

man2 5’TGCCCGCTCGCCTCACATCGGGAAATACTC 22

man3 5’GAGTATTTCCCGATGTGAGGCGAGCGGGCA 23

man4 5’ACCGATAGTGCCACCGCTCTGGTAG 24

H3sea 5’GTCCTGCAATTTCAGCCCGA 25

man5 5’TGTTCGACGAACCGCTGTCCA 26

man6 5’TTCAATGGTCCCCCCGGTCATTTCATA 27

表9.mtl在多种碳源上的启动子活性

菌株(mtlE上游的区域大小，宿主)	1％甘露糖醇	1％甘油	1％葡萄糖醇	1％甘露糖醇甘油	1％甘露糖醇葡萄糖醇	1％甘油
菌株(mtlE上游的区域大小，宿主)	1％甘露糖醇	1％甘油	1％葡萄糖醇	1％甘露糖醇甘油	1％甘露糖醇葡萄糖醇	1％甘油	pDOW1365-1(299bpMB101)pDOW1365-1-2(299bpMB101)pDOW1369(126bpMB101)pDOW1377(147bpMB101)	++-+	--ndnd	-ndnd	++-nd	++ndnd	+nd-nd

pDOW1378(77bp MB101)pDOW1370-7(203bp Pf0-1)pDOW1361对照(没有Cop基因)

---

ndnd-

实施例3甘露糖醇诱导

在荧光假单胞菌菌株DC283、荧光假单胞菌MB101的尿嘧啶和脯氨酸营养缺陷突变体中进行检查甘露糖醇诱导的实验。例如参见JCSchneider等人(2005)“Auxotrophic markers pyrF and proC can replaceantibiotic markers on protein production plasmids in high cell densityPseudomonas fluorescens fermentation，”Biotech Prog 21：343。用菌株DC283/pDOW1365-1进行的生长实验最初在含有9.5％甘油的标准的摇瓶培养基中进行。在细胞培养大约24小时后，加入1％甘露糖醇(55mM)以诱导CopGFP的表达，随后随着时间的推移，不断测量培养物的荧光。有趣地是，在用甘露糖醇诱导之前，细胞表现出高度荧光，并且在诱导后细胞荧光没有增加(图7)。进一步的实验表明，诱导前的荧光水平和甘露糖醇启动子的可诱导型性与培养基中甘油的数量有关。将摇瓶培养基中的甘油浓度从2％增加至5％至9.5％，导致增加了未诱导荧光的水平，并且降低了诱导荧光的水平(图8)。在含有2％甘油浓度的培养基中，CopGFP表达仅仅可通过甘露糖醇立即诱导。使用这些低水平的甘油不足以满足摇瓶分析，这是因为所有碳源在24小时内被全部消耗。

实施例4：荧光假单胞菌中mtlDYZ甘露糖醇降解的缺失

为了阻止菌株DC283降解甘露糖醇，我们从染色体上的甘露糖醇操纵子中删除了三个基因(mtlDYZ)。自杀载体pDOW1373-3(图9)被设计为可通过等位基因交换诱变删除mtlDYZ基因。使用MB214基因组DNA作为模板，扩增mtlDYZ侧翼区域，并且使用拼接通过重叠延伸技术结合这些区域，使用了引物manl(5’-GCCGACAAGGTAGTGGTGCTCAACA-3’)(SEQ.ID.No.21)和man2(5’-TGCCCGCTCGCCTCACATCGGGAAATACTC-3’)(SEQ.ID.No.22)用于上游区域，和man3(GAGTATTTCCCGATGTGAGGCGAGCGGGCA-3’)(SEQ.ID.NO.23)和man4(5’-ACCGATAGTGCCACCGCTCTGGTAG-3’)(SEQ.ID.NO.24)用于下游区域。引物man2和man3含有互补的重叠区域。将结合产物克隆到pDOW1261/Srfl中，以产生pDOW1373-3(图9)。用引物H3seq(5’-GTCCTGCAATTTCAGCCCGA-3’)(SEQ.ID.NO.25)和man4筛选菌落；对具有期望的1170bp产物的菌落测序，以确定，没有整合PCR-产生的突变。

将质粒pDOW1373-3转化到菌株DC283中，其中其不能独立地复制，通过四环素抗性选择基因组中的整合体。通过进行PCR扩增，鉴别成功地将质粒整合到mtlDYZ基因簇的上游或者下游的染色体中的转化体。然后在不存在四环素的情况下培养一些上游和下游整合体，以富集通过第二次交换(cross-over)从染色体成功地环出质粒(有或者没有mtlDYZ基因)的克隆。损失质粒导致克隆对5’-氟乳清酸具有抗性，这被用于琼脂培养基中，选择具有期望基因型的克隆。没有将质粒(和mtlDYZ基因)整合到染色体的克隆不再储存尿嘧啶营养缺陷型。使用引物man5(5’-TGTTCGACGAACCGCTGTCCA-3’)(SEQ.ID.No.26)和man6(5’-TTCAATGGTCCCCCCGG TCATTTCATA-3’)(SEQ.ID.No.27)的PCR扩增，所述引物位于用于等位基因交换而扩增的区域的外部，导致在几个分离的克隆中产生了具有期望大小(1308bp)的PCR产物，这表明从DC283染色体中成功地删除了质粒和mtlDYZ基因。相关染色体区域的PCR测序证实了，菌株DC283ΔmtlDYZ(＝DC388)中不存在mtlDYZ基因。

分析菌株DC388在M9矿物盐培养基中的生长和碳代谢，所述矿物盐培养基补充了尿嘧啶和脯氨酸(这两种物质都是250μg/ml)和1％(w/v)葡萄糖或1％甘露糖醇(w/v)，作为唯一碳源和能量的来源。在24小时内突变体在有葡萄糖的培养基中生长至OD₆₀₀为大约2.2，并且伴随着葡萄糖的衰竭。相反，在甘露糖醇作为单独碳源的培养基中，仅观察到光学密度的微小增加，并且甘露糖醇浓度不能随着时间的推移而降低(图10)。这些结果表明mtlDYZ缺失突变体具有期望的表型，不能降解甘露糖醇。

实施例5-在各种培养条件下，在mtlDYZ缺失突变体中的甘露糖醇诱导的CopGFP表达

将质粒pDOW1365-1(其携带有299bp mtl启动子控制的CopGFP基因)转化到菌株DC283ΔmtlDYZ中。在摇瓶培养基中，采用不同浓度的甘油(2％、5％、9.5％)测试所得到的构建物，菌株DC389。在甘露糖醇降解缺陷的菌株中，甘露糖醇在所有甘油浓度诱导CopGFP(图11)，尽管在野生型菌株中，只有在2％初始甘油中培养的培养物显示出立即诱导(图7)。启动子活性的量与碳源浓度正相关；使用9.5％甘油可获得最高的诱导水平。缺失去除了甘露糖醇同化作用中的第一个步骤，因此通过甘露糖醇诱导Pmtl表明，甘露糖醇，不是分解产物，是Pmtl的诱导物。

在缺失突变体和野生型菌株的并行比较中，证实了突变体菌株在有9.5％甘油的培养基中可通过甘露糖醇诱导，然而野生型菌株不行(图12a)。甘露糖醇浓度在突变体菌株中保持恒定，但在野生型菌株(没有给出数据)中下降到零。突变体生长到较低的OD₆₀₀，这归因于其不能使用甘露糖醇作为碳源，以及在突变体中到较高的CopGFP基因的表达，这对细胞生长增加了麻烦。突变体显示出比野生型表达更高的预先诱导水平，这可能是由突变体菌株不能降解酵母提取物中存在的微量诱导物的能力导致的。

当突变体菌株在作为碳源的10％葡萄糖中培养时，甘露糖醇启动子也可获得较高的诱导水平(图12b)。48小时后，葡萄糖生长的培养物经历了CopGFP活性的快速损失，这归因于培养基的酸化，以及伴随的死亡和蛋白质变性。

实施例6：用各种甘露糖醇浓度诱导后的mtl启动子活性

在先前的实验中，为了从mtl启动子诱导CopGFP表达，将1％(＝55mM)浓度的甘露糖醇加入到培养基中。在该实验中，在24小时加入至葡萄糖培养或甘油培养的培养物的甘露糖醇浓度可在0.01％到1％之间变化，以确定较低的诱导物浓度是否能用于诱导表达。诱导后的荧光随着甘露糖醇浓度的增加而增加(图13)。尽管在1％甘露糖醇可达到较高的水平，但0.01％的甘露糖醇足以导致甘油培养的和葡萄糖培养的细胞中的启动子活性的增加。

实施例7：mtl启动子的甘油诱导

在摇瓶实验中观察到，在含甘油的培养基中，野生型和突变菌株都在诱导前显示出背景荧光，但在含葡萄糖的培养基中没显示出背景荧光。甘油与甘露糖醇有结构类似性，而且应该想到，如果甘油的浓度足够高，那么甘油可作为mtl启动子的偶然诱导物。通过用菌株DC283 ΔmtlDYZ/pDOW1339 pDOW1365-1在含有12.5％葡萄糖的培养基中进行摇瓶实验，并且在诱导时间加入不同浓度甘油代替甘露糖醇，可对该假设进行试验。加入甘露糖醇作为诱导物来控制烧瓶。诱导在12h EFT进行，而不是24h EFT，以防止pH变化的干扰，这在葡萄糖培养的培养物中，在随后的时间点可能发生。

当甘油诱导物浓度为2％或者更低时，不能检测到启动子活性与未加入时的差异。在较高的甘油浓度(5％和9.5％)，在诱导后，通过17个小时，荧光增加到高于背景水平的2到3倍(图14)。该结果清楚地表明，甘油可诱导型mtl启动子活性(尽管其水平比甘露糖醇更低)，这导致了CopGFP表达，并且解释了在含有高甘油浓度的培养基中观察到的背景荧光。

实施例8：在低于饱和诱导剂浓度的情况下mtl启动子的一致诱导

用流式细胞计数分析实施例6和7的一部分摇瓶培养物，以便确定亚饱和水平的诱导物是否产生了双峰“全或无”形式的诱导，或者在所有细胞中诱导是否一致。在所测试的培养物中，用0到1％的甘露糖醇作为诱导物，或者0到9.5％甘油作为诱导物，在使用葡萄糖作为碳源的培养物中，荧光分布产生了简单的、常规形状的分布(图15)，这表明在培养物中所有细胞被诱导到类似水平。

实施例9：20-L发酵桶中的mtl启动子活性

菌株DC390(＝DC283ΔmtlDYZ/pDOW1365-1pDOW1339)在20L-发酵桶中，在有甘油或者玉米糖浆(葡萄糖)作为单独碳源的矿物盐培养基中培养。根据标准化供给方式，甘油和葡萄糖在不同时间点被频繁地穿刺加到培养基中，这依赖于细胞的摄氧速率。甘油或葡萄糖的浓度各自从来没有超过1％和0.1％，培养基的pH恒定地保持在6.5。在有甘油的培养基中，培养物达到了大约250的光学密度OD₅₇₅。当用玉米糖浆培养细胞时，最大光学密度稍微低些(OD₅₇₅为大约230)(图16a)。

在20.5小时过程发酵时间(elapsed fermentation time)(EFT)，在大约170的光学密度，用1％(w/v)甘露糖醇诱导发酵培养物。正如图中所示(图16b)，在有玉米糖浆的培养基中，细胞荧光增加到大约3000 RFUs，在有甘油的培养基中增加到大约1500 RFUs。背景荧光，荧光随着时间推移的增量，和最大RFUs都可与有12.5％葡萄糖(最大3500 RFUs)或2％甘油(最大1000 RFUs)的摇瓶实验中获得的结果(没有给出数据)比较，即抑制水平低。SDS-PAGE进行的肽分析表明在用甘露糖醇诱导后，出现了CopGFP(期望的分子大小为25 kDa)(没有给出数据)。在两个发酵桶中，正如通过流式细胞计数所评估的，培养物中细胞间的CopGFP表达被一致诱导(图17)。

实施例10：使用mtl启动子共表达折叠调制物GrpE，DnaK和DnaJ以增加人生长激素溶解度

人生长激素(hGH)，当在荧光假单胞菌中表达时，几乎完全地累积为不可溶的包涵体。基于转录剖析数据，在荧光假单胞菌的细胞质中，在作为包涵体的重组hGH的表达诱导和累积后，与不表达靶蛋白质的菌株相比，荧光假单胞菌折叠调制物(FMs)DnaK和DnaJ的表达在菌株中增加(例如参见美国临时申请No.60/591,489)。因此我们对菌株进行了遗传改造，即在质粒中mtl启动子的控制下的编码GrpE、DnaK和DnaJ的推定操纵子，以便使得hGH与FMs共同表达。

使用从MB214(DNeasy；Qiagen，Valencia，CA)分离的染色体DNA作为模板，以及使用引物RCl 99(SEQ.ID.NO：28)和RC200(SEQ.ID.NO：29)，采用PfuTurbo(Stratagene，La Jolla，CA)，按照制造商的建议，扩增grpE dnaKJ。用SpeI和XbaI(在上面的引物中加下划线的限制酶切位点)消化所得到的PCR产物(4kb)，并且连接到pDOW2236(pDOW1306-6的衍生物)上(Schneider，J.C，A.F.Jenings，D.M.Mun，P.M.McGovern和L.C.Chew(2005)，“Auxotrophic markers pyrF andproC can replace antibiotic markers on protein production plasmids inhigh-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation.”Biotech Prog 21：343-348)，以便产生在tac启动子的控制下的含有grpEdnaKJ操纵子的pDOW2240。用SpeI和HindIII消化pDOW2240，所得到的含grpEdnaKJ的4.0kb片段使用Qiaquick(Qiagen，Valencia，CA)凝胶纯化，并且连接到同样用SpeI和HindIII消化的pDOW2247(pDOW1365-1的衍生物)上。所得到的质粒，pDOW3501，含有在甘露糖醇启动子的控制下的grpEdnaKJ，通过在补充了250μg/ml尿嘧啶的M9葡萄糖平板上培养，选择转化到DC388中的克隆。最后，pDOW1426[ref？]被电穿孔到上述菌株(DC462)中，并且在M9葡萄糖平板上进行选择，这导致具有两个可诱导型质粒的菌株DC463：1)携带有P_tachGH的pDOW1426，和2)携带有P_mtlgrpEdnaKJ的pDOW3501。

表10.对工程限制酶切位点加下划线的的寡核苷酸

寡核苷酸序列 SEQ.ID.

RC199 5’ATATACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCTGACGAACAGACGCA 28

RC200 5’ATATTCTAGATTACAGGTCGCCGAAGAAGC 29

在矿物盐培养基中培养DC463的双份培养物，对每一培养物在不同时间点记录OD₆₀₀。在接种后，通过在不同时间点对hGH加入0.1mMIPTG，对GrpEDnaKJ加入0.5％甘露糖醇，实现诱导。诱导后，在0、4、8、24和48小时收集样品。在每一时间点，收获在1mL标准化的20 OD₆₀₀，使用EasyLyse^TM(Epicentre，Madison，WI)裂解，通过在14000rpm离心30分钟分离到可溶和不可溶的部分。用BioRad(Hercules，CA)2xLaemmli缓冲液结合相同体积的样品，在95℃加热5分钟，用30μL加载到BioRad 15％Tris-HCl Criterion凝胶上，使用1x TrisGlycine SDS运行缓冲液(BioRad)运行。用Simply Blue Safestain(Invitrogen，Carlsbad，CA)目测蛋白，使用加载到相同凝胶上的Prediluted BSA标准物(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)测量hGH的产量。使用Molecular Devices Personal Densitometer(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)扫描所得到的Coomassie染色凝胶，使用ImageQuant和Excel进行分析。如表11所示，GrpE DnaKJ的共表达显著地增加了hGH的溶解度，将几乎100％的靶蛋白转化到可溶部分中。其它使用同时加入IPTG和甘露糖醇重复培养和诱导DC463的实验，接近地模仿了如下所示的结果，当与GrpE DnaKJ共过度表达时，与100％不可溶的其它方式相比，在可溶部分中发现了50-100％的hGH(没有给出数据)。对同时加入IPTG和甘露糖醇，或者交错加入，都观察到这些结果，但用GrpE DnaKJ早期诱导的培养物的细胞密度也没有生长，这表明这些FMs的高水平表达有害于细胞健康。考虑到对细胞代谢的最低毒害作用和最高可溶hGH的产量，较低的表达水平可能最佳；从独立于靶蛋白调节的启动子控制这些FM基因，将允许独立地最优化表达。

表11.对与GrpE，DnaKJ共表达获得的hGH的定量

此处所列的数值是完全相同的两次摇瓶实验的平均值，以mg/ml表示，基于图x中所示的密度计量学结果。在每一泳道，仅测量了hGH对应的条带。^*EFT指过程发酵时间。

	hGH累积(mg/mL)
	hGH累积(mg/mL)					I₂₄可溶	I₂₄不可溶	I₄₈可溶	I₄₈不可溶
在24hr EFT诱导的hGH	0.05	0.51	0.03	0.95		I₂₄可溶	I₂₄不可溶	I₄₈可溶	I₄₈不可溶
在24hr EFT诱导的hGH	0.05	0.51	0.03	0.95	在24hr EFT^*诱导的hGH，GrpE DnaKJ	0.24	0.02	0.29	0.04
在24hr EFT诱导的hGH，在8hr EFT诱导的GrpEDnaKJ	0.17	0	0.21	0	在24hr EFT^*诱导的hGH，GrpE DnaKJ	0.24	0.02	0.29	0.04
在24hr EFT诱导的hGH，在8hr EFT诱导的GrpEDnaKJ	0.17	0	0.21	0	在24hrEFT诱导的GrpE，DnaKJ	0	0	0	0

Claims

1.一种表达系统，所述表达系统包括至少一个包含甘露糖醇启动子的核酸，其中该核酸序列包括至少299个连续核苷酸的区域，该区域位于荧光假单胞菌MB101 mtlE基因的上游。

2.一种分离的核酸构建物，所述分离的核酸构建物包括荧光假单胞菌基因启动子的核酸序列，其中所述核酸序列选自：

(a)SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO 12；

(c)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO 12中所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；和

(d)在高度严谨条件下，与a)、b)或c)中任意一个序列杂交的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的核酸构建物，其中所述启动子可操作地连接到编码相关肽的核酸序列上。

4.一种表达系统，所述表达系统包括权利要求3的构建物。

5.如权利要求4所述的表达系统，其中所述核酸构建物在荧光假单胞菌细胞中表达。

6.一种荧光假单胞菌细胞，所述细胞包括：

可操作地连接到碳源可诱导型启动子上的编码重组多肽的至少一个核酸构建物，所述启动子选自甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇诱导型启动子，

其中细菌细胞已经被基因工程改变，抑制了对能诱导碳源可诱导型启动子的碳源的代谢或者降解。

7.如权利要求6所述的细胞，其中所述启动子是甘露糖醇可诱导型启动子。

8.如权利要求7所述的细胞，其中所述启动子包括内源细菌甘露糖醇操纵子的推定启动子。

9.如权利要求8所述的细胞，其中所述启动子包括荧光假单胞菌mtlEFGKDYZ操纵子的推定启动子。

10.如权利要求9所述的细胞，其中所述启动子包括选自Seq.ID.No.9或Seq.ID.No.1 2的核酸序列。

11.如权利要求6所述的细胞，其中所述核酸构建物进一步包括作为mtl激活蛋白结合域的核酸序列。

12.如权利要求6所述的细胞，其中所述遗传改变是甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或其衍生物或类似物的代谢中所需要的基因的突变或者缺失。

13.如权利要求12所述的细胞，其中所述基因选自mtl操纵子。

14.如权利要求13所述的细胞，其中所述基因选自mtlD、mtlY、mtlZ或其组合。

15.一种方法，用于在荧光假单胞菌细胞中表达重组多肽，所述方法包括：

a) 提供能表达重组多肽的宿主细胞；

b) 用至少一个核酸构建物转染宿主细胞，该核酸构建物编码可操作地连接到碳源可诱导型启动子上的重组多肽，该启动子选自甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子；

c)在生长培养基中培养该宿主细胞；

d)将碳源加入到生长培养基中，以能够从碳源可诱导型的启动子诱导相关肽的表达的量添加，和

e)通过诱导碳源可诱导型启动子，表达相关的重组多肽；和

f)分离表达的重组多肽；

其中细菌细胞已经被基因工程改变，从而抑制了能诱导碳源可诱导型启动子的碳源的代谢或者降解。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述启动子是甘露糖醇可诱导型启动子。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述启动子包括内源细菌甘露糖醇操纵子的推定启动子。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述启动子包括荧光假单胞菌mtlEFGKDYZ操纵子的推定启动子。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述启动子包括选自Seq.ID.No.9或Seq.ID.No.12的核酸序列。

20.如权利要求15所述的方法，其中所述启动子进一步包括作为mtl激活蛋白结合区域的核酸序列。

21.如权利要求15所述的方法，其中所述遗传改变是甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或其衍生物或类似物的代谢中所需要的基因的突变或者缺失。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述基因选自mtl操纵子。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述基因选自mtlD、mtlY、mtlZ，或其组合。

24.如权利要求15所述的方法，其中所述细菌细胞已经被基因工程改变，抑制了甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇的代谢或者降解。